Gli Enzimicatalizzatori biologici

rendono possibile da un punto di vista cinetico le reazioni chimiche

Sono le proteine più importanti e più specializzate

Presentano un elevato grado di specificità per il substrato

Operano in soluzioni acquose con temperature e pH blandi

Parte proteica

Coenzima

(natura organica: vitamina o altro)

Struttura generale degli enzimi

Cofattore

(ione metallico) Gruppo

Prostetico

Parte

non-proteica

Sono proteine

globulari complesse :Addotto

enzima-substrato

Addotto ES

SITO ATTIVO:

specifica

porzione

dell’enzima,

deputata al

legame con il

substrato che

porta alla

formazione

dell’addotto ES

Proprietà dei

Catalizzatori

I catalizzatori sono

sostanze capaci di

abbassare l’energia di

attivazione rendendo piú

facile la formazione

dell’addotto ES: la reazione

diviene quindi piú veloce.

favoriscono

lo stato di transizione

formando l’addotto ES

I catalizzatori abbassano

l’energia di attivazione

delle reazioni

A(S) B(P)

Gprodotti-Gsubstrati (G°’) < 0

Reazione esoergonica

Risultato:

accelerazione della

reazione globale.

Molti catalizzatori non facilitano la formazione dello stato

di transizione, ma sostituiscono la reazione ‘difficile’ con

2 o più reazioni entrambe con uno stato di transizione

facile da formare

ΔG↨

=energia di attivazione

E+S ES EP E+P

L’energia usata per

aumentare la velocità

enzimatica deriva dalle

interazioni deboli (legami

idrogeno, interazioni

ioniche e idrofobiche) che si

formano tra enzima e

substrato

ENERGIA di LEGAME

ADDOTTO

Enzima-Substrato

Adattamento

indotto

CATALISI ENZIMATICA

• velocità di una reazione (V):

numero di molecole di substrato che si

trasformano in prodotto nell’unità di tempo.

• (V) si esprime come mmol/L di prodotto

formatosi in un minuto (mM/min).

• Velocità iniziale V0

• Nelle analisi delle reazioni enzimatiche si

utilizzano soltanto le velocità di reazione

iniziali (v0), quelle che si misurano non appena

si mescolano l’enzima ed il substrato.

• In tal modo la variazione di [S] può essere

considerata trascurabile.

CINETICA ENZIMATICA

FATTORI CHE MODIFICANO LA VELOCITA’

DELLE REAZIONI ENZIMATICHE:

1) pH (curva a campana)

2) temperatura (curva bifasica a causa della

denaturazione)

3) [S] (iperbole rettangolare a causa della

saturazione)

4) inibitori

CINETICA ENZIMATICA

• Ciascun enzima ha un pH ottimale al quale la reazione

è catalizzata con la massima efficienza.

Esso in genere rispecchia il pH dell’ambiente in cui

l’enzima svolge normalmente le sue funzioni.

• La concentrazione degli H+ (pH) influenza l’attività enzimatica modificando la geometria del sito attivo e la

distribuzione delle cariche elettriche dei gruppi

coinvolti nel legame del substrato o nel processo

catalitico stesso.

• Valori di pH estremi possono anche provocare la

denaturazione dell’enzima.

CINETICA ENZIMATICA: pH

CINETICA ENZIMATICA: pH

• La velocità di reazione aumenta con

l’aumentare della temperatura fino a

raggiungere un picco.

• Un ulteriore innalzamento della

temperatura provoca una

diminuzione della velocità di

reazione a causa della

denaturazione dell’enzima.

CINETICA ENZIMATICA:

temperatura

CINETICA ENZIMATICA: temperatura

• La velocità di una reazione catalizzata da un

enzima aumenta all’aumentare della concentrazione del substrato fino a

raggiungere una velocità massima (Vmax). In

questa condizione i siti attivi dell’enzima sono

saturi del substrato

Quando tutto l’enzima è saturato con il substrato:

[ES] = [Etot]

V0 = Vmax

CINETICA ENZIMATICA:

concentrazione del substrato

L’equazione di

Michaelis-Menten

• descrive la variazione della velocità di reazione al variare della

concentrazione del substrato.

v0 = velocità iniziale della reazione

Vmax= velocità massima

Km = costante di Michaelis-Menten

[S] = concentrazione del substrato

Costante di

Michaelis e

Menten

La Km è quella concentrazione

di substrato a cui la V0 è pari a

metà della Vmax

La curva che esprime la

relazione tra V0 e S ha un

andamento iperbolico ed è

espressa algebricamente dalla

equazione di Michaelis-Menten

Caratteristiche della Km

• La Km è pari alla concentrazione di substrato alla quale

la velocità della reazione (V0) è 1/2 della Vmax.

• La Km riflette l’affinità dell’enzima per il substrato:

Km piccola = alta affinità dell’enzima per il substrato

Km grande = bassa affinità dell’enzima per il substrato.

• Ogni enzima ha una Km caratteristica per un dato substrato.

• La Km non varia al variare della [E].

I PARAMETRI

CINETICI

POSSONO

ESSERE USATI

PER

CONFRONTARE

LE ATTIVITA’

DEGLI ENZIMI

Inibizione Enzimatica

Inibitori

ostacolano o impediscono il funzionamento degli

enzimi

Inibitore reversibile:Ha un azione

temporanea, è

possibile allontanare

l’inibitore dall’enzima,

consentendo il

regolare esplicarsi

dell’attività catalitica.

inibitore irreversibile:la ripresa dell’attività

enzimatica non è

possibile, in quanto

non è possibile in

nessun modo

allontanare l’inibitore

dall’enzima

•Aumentano o diminuiscono la loro attività catalitica in

risposta a determinati segnali

• tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis–Menten

e sono responsabili della modulazione della velocità con

cui decorre interi processi metabolici

• struttura quaternaria (due o più subunità proteiche)

• in essi esistono più siti chimicamente attivi

ENZIMI ALLOSTERICI

Enzimi regolatori

Legano Effettori o MODULATORI:

molecola che interagendo con

l’enzima in siti lontani dal sito

attivo, esercita un effetto positivo

o negativo sulla sua attività

Modificazioni covalenti

reversibili

Modificazione

allosterica

Enzimi regolatori

Enzimi allosterici:Agiscono mediante

legame non covalente

e reversibile di

Modulatori allosterici

OMOTROPICI

Il substrato è

esso stesso un

modulatore ETEROTROPICI

Il modulatore è

una molecola

diversa dal

substrato

Enzimi regolatori

Inibizione retroattivaGli enzimi allosterici possono essere inibiti dai

prodotti terminali di una via metabolica

Enzimi regolatori

un enzima regolatore controlla le quantità di sostanze che devono

essere trasformate in una via metabolica

(catalizza la reazione più lenta, in genere la prima di una serie)

modificazione covalente reversibile

Enzimi regolatori

modificazione covalente

irreversibile

(zimogeno inattivo)

Scissione proteolitica di un precursore

Enzimi regolatori

Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la

presenza di ioni metallici o di altre molecole,

talvolta legate con legami covalenti:

Coenzimi o cofattori

Cofattore:

ione o molecola NON PROTEICA la cui presenza è

indispensabile perché l’enzima possa svolgere la sua

attività catalitica. Interagiscono con l’apoezima solo

durante il ciclo catalitico.

Tra i cofattori hanno rilevante importanza gli ioni di alcuni

elementi metallici,

Ca, Mg, Mn, Zn, Cu

(tutti gli enzimi che utilizzano ATP richiedono la presenza

di ioni Mg2+).

Coenzimi e Cofattori

Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la

presenza di ioni metallici o di altre molecole,

talvolta legate con legami covalenti:

Coenzimi o cofattori

Coenzimi: sono molecole organiche (alcuni di

essi derivano da vitamine idrosolubili)

• prendono parte direttamente all’azione

catalitica dell’enzima

• spesso si ritrovano modificati chimicamente al

termine della reazione (es. NAD+ / NADH).

Coenzimi e Cofattori

Coenzimi• I coenzimi da soli sono cataliticamente inattivi ma,

unendosi all’apoenzima, formano l’enzima

cataliticamente attivo.

• Uno stesso coenzima può essere unito a diverse proteine

per cui si deduce che la specificità dell’azione

enzimatica è proprietà dell’apoenzima e non del

coenzima.

• La maggior parte dei coenzimi è strettamente legata alle

vitamine.

• Per diventare coenzima, la vitamina subisce delle

trasformazioni che vanno dalla semplice fosforilazione

(uno dei casi più comuni) a trasformazioni più complesse.

• La trasformazione della vitamina in coenzima avviene

all’interno delle cellule ed è di natura enzimatica.

• I coenzimi possono essere classificati in gruppi diversi,

in base al tipo di reazione catalizzata.

Coenzimi derivati dalle vitamine idrosolubili

• Le vitamine sono necessarie per la sintesi di

coenzimi e devono essere ottenute con la dieta

• Piante e microorganismi sono produttori di

vitamine

• La maggior parte delle vitamine deve essere

ulteriormente trasformata per generare coenzimi

Coenzimi

Cofattori

La niacina (acido nicotinico) è un precursore di

NAD + e NADP +

NAD = Nicotinamide Adenina Dinucleotide

NADP = Nicotinamide Adenina Dinucleotide

Fosfato

NAD+ e NADP+ fungono da coenzimi in molte

reazioni di ossidoriduzione

Niacina

(Vit. B3 o PP)NAD + e NADP +

CofattoriNAD + NADH

Cofattori

Il NAD+ funziona da deidrogenante:

porta via 2 atomi di H dal substrato.

Uno viene perso sotto forma di ione

H+, l’altro viene perso come idruro

H- che si lega immediatamente

all’anello piridinico cationico

PROTEINE

RESPIRATORIE

EMOGLOBINA

&

MIOGLOBINA

→un sistema circolatorio;

→molecole trasportatrici di O2,

che permettono di superare la

limitazione imposta dalla bassa

solubilità dell’ossigeno in acqua.

Nel corso

dell’evoluzione, con il

passaggio dalla vita

anaerobia alla vita

aerobia si sono

progressivamente

differenziati due

meccanismi che sono in

grado di garantire alle

cellule dei tessuti un

flusso di O2 sufficiente e

costante:

Legano reversibilmente l’O2 (LIGANDO)

ne rendono possibile il trasporto dai

polmoni ai tessuti e l’immagazzinamento

nel muscolo.

Nei vertebrati le molecole coinvolte nel rifornimento

dell’ossigeno sono:

Emoglobina (Hb)

Mioglobina (Mb)

Proteina monomerica

(153 AA)

Immagazzinamento

dell’O2 nella cellula

80% degli AA sono

disposti ad α-elica

Mioglobina (Mb)

La Mb si trova nei muscoli e

funziona soprattutto come

deposito di O2;

Facilita la diffusione dell’ossigeno nel

muscolo che sta respirando rapidamente

Eterotetramero

Emoglobina (Hb)

costituita da 4

diverse subunità:2 subunità α2 subunità β

Trasporto dell’O2

dai polmoni alla cellula

L’Emoglobina trasporta

l’O2 dai polmoni ai tessuti

La Mioglobina lega

l’ossigeno rilasciato

dall’ Emoglobina nel

circolo

Sanguigno e ne facilita

la diffusione nel

muscolo che sta

respirando rapidamente

EME

Emoglobina Mioglobina

EME:

PROTOPORFIRINA IX

Fe2+

4 anelli pirrolici

Fe2+ al centro

EME

EME

EME

EME

EME

O2

CO

H2O

(metaemoglobina)

Fe2+ → Fe3+

EMEIl Fe2+ dell’eme può legare:

Il Fe2+ dell’eme può legare:

O2

EME

(ossiemoglobina)

Il Fe2+ dell’eme può legare:

CO

EME

(carbossiemoglobina)

I derivati carbossi-mioglobina e

carbossi-emoglobina presentano CO

(non CO2!!!) legato al gruppo eme.

Il legame con il CO è circa 300 volte più

stabile di quello con l’O2 ed è

irreversibile !

Quando nell’aria è presente 0.2% di CO

in 1 ora si ha perdita di coscienza e in

circa 4 ore si ha morte per asfissia

(circa 2/3 di Hb sono legati a CO).

Protezione dell’eme da parte della globina

Le globine che circondano l'eme in Mb ed in Hbhanno funzioni di estrema importanza:

- impediscono al ferro dell’eme di ossidarsi daFe2+ ferroso a Fe3+ ferrico;

- creano un sito attivo idrofobico, in cui si lega O2

che è lipofilo*;

- proteggono l’eme da ligandi indesiderati(esempio CO).

*la solubilità di O2 nel plasma è molto bassa; grazieall'emoglobina nel sangue c'è una concentrazione di O2

100 volte superiore a quella del plasma.

Mioglobina (Mb)

Costituita da 153 residui aa

8 α-eliche

Gruppo emeTasca idrofobica eliche E ed F

His E7: istidina distale; His F8: istidina prossimale

Deposito di O2 a livello muscolare

Muscolo a riposo: Mb lega O2 Muscolo attivo: consumo di O2

Quando diminuisce la pressione a livello dei tessuti, Mb rilascia l’O2

Legame all’ossigeno della Mb (MbO2)

Pressione

tessuti

Pressione

polmoni

P50Pressione parziale di O2 alla

quale è saturato il 50% delle

molecole

SEMISATURAZIONE

Misura dell’affinità per l’O2 Più piccola è la P50

maggiore è l’affinità

Numero di molecole

che hanno legato

l’O2 rispetto al totale

Y

Curva iperbolica

Sa

tura

zio

ne

fra

zio

na

le

1. contenuta negli eritrociti

2. trasporto di O2 dai polmoni ai tessuti (legame reversibile)

3. trasporto reversibile di CO2.

La sostituzione delle catene β (Hb adulta) con le catene (Hb fetale)

comporta differente funzionalità.

struttura quaternaria tetramerica

4 catene polipetiditiche

4 gruppi eme

HbA (α2β2):

emoglobina adulta umana

2 catene α, 2 catene β

HbF (α22):

emoglobina fetale

2 catene α, 2 catene

Emoglobina (Hb)

La struttura terziaria è simile tra subunità α e subunità β,

entrambe inoltre sono simili alla Mb, anche se le tre

catene polipeptidiche hanno solo il 18% dei residui aa in

comune

Emoglobina (Hb)

Interazioni tra subunità di tipo diverso:

Emoglobina (Hb)

Interazioni idrofobiche

Legami idrogeno

Legami ionici

Emoglobina (Hb)

L’emoglobina esiste in due forme:

ossigenata =R; deossigenata =T

Il legame di Hb con O2determina una grande modificazione della struttura

quaternaria. La proteina passa da una forma tesa T, mantenuta da interazioni

ioniche (ponti salini) fra catene laterali di aminoacidi (es. Asp-His) presenti nelle

subunità, a una forma rilassata R (ponti salini spezzati). Il fenomeno avviene in

direzione opposta quando l’emoglobina rilascia l’ossigeno.

Modificazione conformazionale:

Transizione T↔R

Le modificazioni della struttura quaternaria avvengono alle interfacce α1β2 e α2β1

Il dimero α1β1 ruota di circa 15° rispetto al dimero α2β2

deossigenata =T ossigenata =R

Modificazione conformazionale:Transizione T↔R

deossigenata =T ossigenata =R

passando da T ad R, il

Fe 2+ si sposta nel

centro del piano

dell’EME. Questo

movimento trascina

anche l’His F8 che a sua

volta trascina con se

tutta l’elica F.

deossigenata =T ossigenata =R

Modificazione conformazionale:Transizione T↔R

proteine con struttura

quaternaria possono

andare incontro a

modificazioni nella

disposizione spaziale

delle subunità

costituenti.

Allosterismo(modificazione della struttura quaternaria)

L’emoglobina è una proteina allosterica la cui struttura

quaternaria viene modificata dal legame di O2 alle 4

subunità: i 4 siti attivi cooperano positivamente, legando

O2 con affinità crescente e questo causa cambiamento

progressivo di struttura quaternaria.

Hb Hb + 4O2 = Hb(O2 )4

Curva di dissociazione dell’O2 per l’Emoglobina

sigmoidale

La quantità di

ossigeno legato si

modifica

significativamente

anche con piccole

variazioni di pO2 .

Hb lega l’O2 quando la

pressione parziale del

gas (pO2) è elevata

(polmoni) e lo rilascia

quando la pressione è

bassa (tessuti).

La mioglobina è un

ottimo sistema per

immagazzinare O2:

-si lega all’O2 anche a

basse pO2 e lo lega

strettamente.

L’emoglobina è un

ottimo sistema per

trasportare l’O2:

-si carica di O2 quando

pO2 è alta e cede O2

quando pO2 è bassa.

Hb lega O2 con affinità

crescente

Hb + 4 O2 =Hb(O2)4

La curva di

dissociazione sigmoide

indica la presenza di

interazioni

cooperative:

il legame di una

molecola influenza il

legame delle altre

Modello

simmetrico Modello sequenziale

Fattori che influenzano l’affinità dell’Hb per O2

piccole molecole e ioni, presenti negli eritrociti possono

regolare il legame di O2 ad Hb

EFFETTORI O MODULATORI ETEROTROPICI:

[H+] , CO2, acido 2,3 bisfosfoglicerico (2,3-BPG)

si legano con interazioni deboli in siti diversi da quello di

legame dell’O2

diminuiscono l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno.

MODULATORI ETEROTOPICI NEGATIVI.

L’aumento di concentrazione di questi modulatori causa

una diminuzione dell’ affinità di Hb per O2 e stabilizzano la

forma T.

Il legame di Hb con O2 è fortemente influenzato dal

pH e dalla pCO2.

Polmoni:

pH alto; pCO2 bassa:

l'affinità di Hb per O2 aumenta, O2 viene legato e H+ e

CO2 vengono rilasciato.

Aumentando il pH si rimuove il protone (H+) legato

all’Hb, stimolandone l’ossigenazione

EFFETTO BOHR

Il legame di Hb con O2 è fortemente influenzato dal

pH e dalla pCO2.

Tessuti:

pH basso; pCO2 alta:

l'affinità di Hb per O2 diminuisce, O2 viene liberato e

H+ e CO2 si legano ad Hb.

Nei tessuti Hb(O2)4 perde affinità per O2, lo rilascia a

causa delle basse pO2 e, essendo la forma

deossigenata più affine per H+, si comporta come un

ottimo tampone intracellulare (azione di alcuni

residui di istidina). L'azione tampone si accompagna

al trasporto dell'anidride carbonica.

EFFETTO BOHR

In aggiunta al trasporto di O2 dai polmoni ai tessuti,

Hb trasporta anche due prodotti della respirazione,

H+ e CO2, dai tessuti ai polmoni ed ai reni, organi

deputati alla loro escrezione.Trasporto della CO2

•CO2 liberamente disciolta nel plasma

•CO2 trasportata come bicarbonato (HCO3-)

•CO2 trasportata come carbammati(15-20%)

formatosi dalla reazione con i gruppi α– aminici

terminali non ionizzati dell’Hb

EFFETTO BOHR

Dai tessuti verso i capillari, la CO2

diffonde disciolta in acqua. Mentre negli

eritrociti, l’enzima anidrasi carbonica,

catalizza la reazione seguente:

H+ HCO3-

Si lega all’Hb che

viene indotta a

rilasciare l’O2

passano dal globulo

rosso al plasma

attraverso una

proteina di membrana

CO2 + H2O → H2CO3 → H+ + HCO3-

EFFETTO BOHR

Quindi la maggior parte di CO2 nel sangue viene

trasportata sotto forma di bicarbonato.

Gli ioni H+ si legano a 3 coppie di siti sull’Hb: la

più nota è l’His 146 delle catene β

Nei tessuti ad elevato metabolismo, come nei

muscoli in attività in cui c’è una notevole

produzione di composti acidi e di CO2, l’Hb cede

più facilmente l’O2 e lega gli H+ e la CO2.

Nei polmoni avviene esattamente il contrario.

EFFETTO BOHR

venoso

arterioso

EFFETTO BOHR

pH & pCO2

Il legame di ioni H+ induce l’Hb a rilasciare l’ossigeno nei

tessuti e a legare la CO2 prodotta dalla respirazione

muscolare.

EFFETTO BOHR

pH & pCO2

pCO2↓

pCO2↑

Influenza della pCO2

Influenza del pH

tessuti polmoni

Influenza del

2,3- BPG

2,3-bisfosfoglicerato

Il 2,3 BPG è una piccola

molecola dotata di cariche

negative che consentono il

legame a una serie di cariche

positive delle catene laterali

di AA situati sulle due catene

β, formando ponti salini e

stabilizzando la forma T

(deossigenata)

Il sito per il 2,3 BPG è

presente solo nella forma

tesa T.

Influenza del

2,3- BPG

Nell’Hb

deossigenata (T) è

presente una cavità

centrale che si

restringe

consistentemente in

Hb in forma R

(ossigenata): tale

cavità nella forma T

ospita il 2,3 BPG,

modulatore

allosterico negativo.

Influenza del

2,3- BPG

Nell’Hb

deossigenata (T) è

presente una cavità

centrale che si

restringe

consistentemente in

Hb in forma R

(ossigenata): tale

cavità nella forma T

ospita il 2,3 BPG,

modulatore

allosterico negativo.

Influenza del

2,3- BPG

EMOGLOBINA FETALE (HbF)

L'O2 rilasciato nella circolazione placentare dall’ Hb materna a certe

pressioni parziali, viene assunto dall’ Hb fetale, più affine, e ciò

soddisfa l'esigenza fisiologica di rifornimento di O2 al feto da parte

della madre.

Il significato del 2,3 BPG

appare chiaro se si confronta

la curva di saturazione dell’

HbA materna e dell’ Hb e

fetale. Gli eritrociti fetali

contengono un Hb con

struttura quaternaria α2 2.

Fra le catene il 2,3-BPG si

lega più debolmente rispetto

a quello che avviene nell’

HbA. La curva di saturazione

dell’’Hb fetale è a sinistra

rispetto a quella della HbA

materna, indicando

maggiore affinità per O2.

emoglobinopatie

Anemia falciforme

emoglobinopatie

Le talassemie

P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006