Post on 16-Oct-2021
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BIOLOGIABIOLOGIAMOLECOLARE NELLAMOLECOLARE NELLA
DIAGNOSTICADIAGNOSTICAMOLECOLAREMOLECOLARE
DIAGNOSIDIAGNOSI
PRENATALEPRENATALE
Ivilli coriali e tutte le strutture placentari sono di
origine embrionale: di conseguenza la dotazionecromosomica dei singoli elementi cellulari rifletteesattamente il corredo cromosomico, o cariotipo,dell’embrione.
PRELIEVO DI LIQUIDO AMNIOTICO
PRELIEVO DI VILLI CORIALI
ANALISIDEL DNA
ASSENTE
PRESENTE
99 bp 43 bp
taglio
DIAGNOSIDIAGNOSI
ONCOLOGICAONCOLOGICA
Applicazioni della PCRApplicazioni della PCR
Individuazione di cellule cancerose tramite rivelazione di unriarrangiamento cromosomico (linfoma follicolare)
Questa PCR e’ in grado di rilevare 1 cellula cancerosa su 106 cellule normali
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ALTRI ESEMPI DI TRASLOCAZIONEALTRI ESEMPI DI TRASLOCAZIONE
CML= Leucemia Mieloide Cronica (Cromosoma Philadelphia)
Traslocazione reciproca cromosomi 9 /22
LINFOMA DI BURKITT
Traslocazione reciproca cromosomi 8/14Tali elementi neoplastici, presenti ad un
livello inferiore alla capacità di rilevazionedelle metodiche convenzionali, sono in gradodi espandersi e dare origine alla recidiva
Quota residua minima di celluleneoplastiche (tumori ematologici tipo leleucemie ed i linfomi) non eliminate dallaterapia di induzione della remissione o dallesuccessive misure terapeutiche
MRD (Minimal Residual Disease):
PCR nella diagnosi dellPCR nella diagnosi dell’’anemia anemia falciformefalciformeMstII site
CCTGAG
DETERMINAZIONE DEL SESSOGene amelogenina
6 bp
Y
X
DETERMINAZIONE DEL SESSOGene amelogenina
cromosoma Y frammento di 112 cbcromosoma X frammento di 106 cb(due frammenti distinti)
cromosoma X frammento di 106 cbcromosoma X frammento di 106 cb(due frammenti sovrapposti)
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Y X
M1 2
DETERMINAZIONE DEL SESSOGene amelogenina
50 bp
100 bp200 bp
STABILIRE RELAZIONI DIPARENTELA:
- TEST DI PATERNITA’- IDENTIFICAZIONE PERSONALE
- ORIGINE ETNICA
1. MICROSATELLITI
2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILIDELL’ mtDNA
MICROSATELLITI: (STR: Short Tandem Repeat)
Unità di ripetizione: 2-5 nucleotidi
Numero di unità: ≤ 40
Medicina LEGALE (criminologia, test di paternità)
CARATTERISTICHE DELLE SEQUENZE RIPETUTE
Altamente polimorfiche
Ereditarietà Mendeliana
APPLICAZIONI
Identificazione personale (Fingerprint)
ETEROZIGOSITA’70%
MICROSATELLITI UTILIZZATI
TH01 Tirosina Idrossilasi (int. 1) (CATT)5-12
Locus Ripetizioni
vWF Fattore vonWillebrand (int.40) (TCTA)9-15
DM1 Miotonina (3’ UTR) (CTG)5-40
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AUTORADIOGRAFIA GEL ACRILAMIDE DENATURANTE
vWF
Indagini in medicina forense
Indagini in medicina forenseSTABILIRE RELAZIONI
DI PARENTELA - ORIGINE ETNICA
1. MICROSATELLITI
2. SEQUENZA DI ZONE IPERVARIABILIDELL’ mtDNA
EREDITA’ MATERNA DELL’mtDNA
mtDNA ∼ 16600 bp
CONTROL REGION
MITOCHONDRIAL DNA
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ALLELE E APLOTIPO
ALLELI: forme alternative di un determinato gene
APLOTIPO: Il termine aplotipo si riferisce al DNAmitocondriale essendo questo genoma non sottoposto a eventidi ricombinazione. Tutti i geni e le regioni intergeniche di ungenoma mitocondriale vengono ereditati assieme, pertanto lesequenze varianti sono definite aplotipi.
Gli aplogruppi H, J, U, T, K, X, V e I sono ampiamente diffusiin Europa.
H caucasico specificoI, J, e K presenti anche in Asia e Africa
Aplogruppi in Africa: L, L1, L2, U=L3, MAplogruppi in Asia: A, F, B, D, G, E, C, MAplogruppi in America: A, B, C, D
Tuttavia, non è possibile stabilire con certezza l’origine etnica di unindividuo, perché gli aplogruppi noti sono presenti praticamente intutto il mondo. Si può parlare solo di maggiore o minore probabilità, aseconda della frequenza dell’aplogruppo nella popolazioone in esame.
OGMOGM
CP4 EPSPS : gene della 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasi da Agrobac terium sp. (strain CP4) che conferisce
NOS 3’ : terminatore del gene della nopalina sintasi da Agrobac terium tumefac iens
AZIENDA NOTIFICANTE: Monsanto
Specie: Glycine max (SOIA)
P- 35S : promotore del ”Cauliflower mosaic virus”
la resistenza al glifosato, ingrediente att ivo dell'erbic ida Roundup
del prodotto transgenico nel c loroplasto
CTP: sequenza di un “chloroplast transit peptide” da Petunia hybrida che funge da peptide segnale per il transito
P- 35S CP4 EPSPS NOS 3'
Evento: (GTS40-3-2)
CTP
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BIOLOGIABIOLOGIAMOLECOLARE NELLAMOLECOLARE NELLADIAGNOSTICA DELLEDIAGNOSTICA DELLEMALATTIE INFETTIVEMALATTIE INFETTIVE
- Diagnostica molecolare nell’infezione davirus dell’epatite C (HCV)
- Diagnostica molecolare nell’infezione davirus dell’AIDS (HIV-1)
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CLASSIFICAZIONE DI HIV
HIV-1= DIFFUSO PRINCIPALMENTE INEUROPA
HIV-2= DIFFUSO NELLE ZONE SUB-EQUATORIALI E TROPICALI
CLASSIFICAZIONE DI HIV-1
M= MAJOR GROUP
O= OUTLIER
N= NON-M/NON-O
HIV-1M= MAJOR GROUP
9 sottotipi: A, B, C, D, F, G, H, J and K.
Le metodologie di diagnosi dell’infezione daHCV e HIV:
Per l'identificazione dell'infezione da HIV e HCVsono disponibili varie metodiche, basate sullaidentificazione degli anticorpi prodotti dalsistema immunitario contro il virus (metodichesierologiche) oppure sulla ricerca di antigeni emolecole del virus stesso (metodichevirologiche). Ai fini della diagnosi di infezioneattualmente vengono utilizzati il test ELISA ed iltest Western-Blot.
METODICHE SIEROLOGICHE
1.ELISA
2.WESTERN BLOTTING
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METODO ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
Test Immunoenzimatico (ELISA): è la metodica utilizzata per il test discreening, in quanto di facile esecuzione e di costo limitato.Questo test ricerca gli anticorpi prodotti contro alcuni antigenivirali, (gp 41 e gp120-HIV), che dopo una prima infezionerestano nell'organismo per tutta la vita. Il test ha unasensibilità di oltre il 95%, ma in alcuni casi si possono averedelle risposte errate:
• falsi positivi: il test risulta positivo in assenza diinfezione. Può succedere in persone con malattie chealterano la funzione del sistema immunitario portandoalla produzione di anticorpi anomali (es: leucemie,linfomi, malattie autoimmuni, gravi epatopatie, ecc.);
• falsi negativi: il test risulta negativo anche sel'infezione è presente. Può succedere in persone che sisono infettate molto recentemente, ma nelle quali nonsi sono ancora formati gli anticorpi che reagiscono conil test; questo avviene solitamente nelle primesettimane (o mesi) dopo il contagio (periodo finestra).
WESTERN BLOTTING
Western Blot (WB): è un test dotato di maggiorespecificità e sensibilità, utilizzato per confermare lapositività di un test ELISA. Questa metodica permettedi evidenziare la presenza di anticorpi diretti contro lemaggiori proteine virali: il test viene definito positivoquando sono presenti almeno 2 degli anticorpiprincipali; se il test risulta dubbio o indeterminato varipetuto dopo alcuni mesi.
METODICHE VIROLOGICHE
1.ANTIGENEMIA
2.RICERCA DELL’RNA VIRALE
ANTIGENEMIA PER HIVAntigenemia p24: La proteina p24 è un antigene delcore virale, e la sua presenza nel sangue indica unostato di attiva replicazione del virus. La positivitàdell'antigenemia p24 è più frequente nel periodosuccessivo al contagio e nelle fasi più avanzate dellamalattia. Questo test attualmente non viene piùeseguito, in quanto superato per sensibilità dallaricerca dell’ RNA virale.
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RICERCA DEL VIRUS NEL SANGUEViremia (HIV-RNA, HCV-RNA)Consente di ricercare molecole di RNA virale, la cui quantità nelsangue è direttamente proporzionale al grado di attivitàreplicativa del virus. La viremia viene espressa in numero di copiedi VIRUS per ml di sangue; ci sono vari tipi di test che possonoessere utilizzati per la determinazione della viremia ma quellopiù accreditato è la Q-PCR.
Q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction): è la metodicapiù diffusa, ed ha un range di sensibilità tra 150 e 1.000.000 dicopie;
Standard curveREAL TIME PCR : STANDAR CURVE
I GENOTIPI DI HCVCARATTERIZZAZIONEDEI GENOTIPI DI HCV
Dal punto di vista metodologico esistono vari sistemi che possonoessere utilizzati per definire il genotipo virale di HCV
Le regioni NS5 ed E1 si sono dimostrate adeguate per lacaratterizzazione genotipica e la distinzione dei rispettivi sottotipivirali finora conosciuti
•L’ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICACOSTITUISCE IL “GOLD STANDARD”
•DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
•IBRIDAZIONE CON SONDE GENOTIPO SPECIFICHE
CARATTERIZZAZIONEDEI GENOTIPI DI HCV
Dal punto di vista metodologico esistono vari sistemi che possonoessere utilizzati per definire il genotipo virale di HCV
Le regioni NS5 ed E1 si sono dimostrate adeguate per lacaratterizzazione genotipica e la distinzione dei rispettivi sottotipivirali finora conosciuti
L’ANALISI DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICACOSTITUISCE IL “GOLD STANDARD”
AMPLIFICAZIONE CON PRIMERS GENOTIPOSPECIFICI
DIGESTIONE CON ENZIMI DI RESTRIZIONE
IBRIDAZIONE CON SONDE GENOTIPO SPECIFICHE