R. RolandiUniversità di Genova, CNISM

Biofisica

Che cosa è la biofisica?

La biofisica è il campo della scienza che usa i principi della fisica e della chimica, i metodi dell’analisi matematica e della modellistica computazionale per studiare come funzionano i sistemi biologici.

Essa cerca di spiegare le funzioni biologiche in termini della struttura e delle proprietà di molecole specifiche.

Universo biologico e universo fisico

Il mondo biologico è stato creato dall’evoluzione: caso e necessità. Probabilmente il mondo biologico di cui facciamo parte non èl’unico possibile.

Le leggi biologiche non hanno la generalità delle leggi fisiche

I sistemi biologici sono sistemi “fisici” complessi. Un sistema complesso è un sistema le cui proprietà non sono direttamente deducibili dalle proprietà dei singoli costituenti

Che cosa studia la Biofisica?• Come catene di aminoacidi si ripiegano a formare precise

strutture tridimensionali aventi funzioni specifiche.• Come una singola enorme molecola di DNA si svolge per

replicare se stessa o indurre la sintesi di proteine.• Come il suono, la luce, gli odori, I sapori e la pressione

meccanica sono trasformati in impulsi nervosi che informano il cervello del mondo circostante.

• Come fanno le cellule muscolari a trasformare l’energia chimica dell’idrolisi dell’ATP in energia meccanica e movimento

• Come fa la membrana cellulare, che è impermeabile alle molecole solubili in acqua a trasportare tali molecole attraverso il suo interno idrofobico?

Lunghezza d’onda e risoluzione

Come si può ricostruire la struttura di una molecola?

Si può ricostruire la struttura atomica o molecolare dall’analisi della distribuzione spaziale di particelle diffuse per diffrazione dal

campione.

Le tecniche di diffrazione utilizzano:

Raggi X Elettroni Atomi Neutroni

Utilizzo delle grandi macchine:

Sincrotroni (Trieste, Grenoble),

Sorgenti di Neutroni (Grenoble, Oxford, Berlino)

Cosa è un sincrotrone ?

APS, USA

ESRF, Europe-France

Spring-8, Japan

Struttura molecolare di una proteina

Cristallo di mioglobina

Difrattogramma di mioglobina

Struttura della molecola di mioglobina Max Perutz and Sir John Cowdery

Kendrew, Nobel prize in Chemistry, 1962

Microscopio elettronicoA trasmissione (TEM) A scansione (SEM)

E. Ruska, premio Nobel per la fisica 1986

Isole di atomi di oro su un substrato di carbonio amorfo

(risoluzione spaziale di 0.11 nm)

Cellule in coltura foraminiferoVirus dell’erpes

pulce

Globuli rossi diatomea

Membrana cellulare

formica

Microscopio a forza atomica

(AFM)Muovendo la punta sopra il campione, si misura il piegamento della piccola leva dovuto alle forze di interazione atomiche e molecolari.Si ottiene una immagine topografica della superficie.

Segmento

di DNA

G. Binnig, C.F. Quate, Ch. Geber, Atomic ForceMicroscope, Phys. Rev. Letters, 56 (1986), 930

DNA scan size 500 nm

HPI layer battericoscan size 220 nm

Filamenti di actinascan size 2.5 μm

Fibre di collagene scan size 3.0 μm

Polisaccaridiscan size 0.8 μm

Cellule di neuroblastomacon dendriti; scan size

100 μmDa http://www.veeco.com

Caratteristiche della tecnicaAFM

• ambiente di operazione: aria, liquido o vuoto• non è necessario colorare o fissare il campione• il campione deve essere ancorato ad un substrato

e non deve avere rugosità maggiore di 10 μm• risoluzione XY: 2-10 nm, da confrontare con:

• risoluzione Z: 0.05 nm, da confrontare con: • STM <0.01 nm

•SNOM 20 nm

• SEM 3 nm

• TEM 0.4 nm

Viene generata un’immagine in falsi colori…

0 2 4 6 8 10 12

0

20

40

60

80

100

Z (n

m)

X (μm)

Faccia (001) di un cristallo di streptavidinaProfilo topografico ottenuto

sezionando l’immagine

Studio di processo in situ: fibrillogenesi della proteina HypF-N

I giorno - Scan size 670 nm, Z range 20 nm

IV giorno - Scan size5.3 μm, Z range 45 nm

IV giorno - Scan size4.8 μm, Z range 40 nm

IX giorno - Scan size3.6 μm, Z range 80 nm

XII giorno - Scan size3.9 μm, Z range 100 nm

A. Relini et al. (2004), J. Mol. Biol. 338, 943-957.

STM I giorno – Scan size 42 nm, Z range 15 nm

Manipolazione di singole biomolecolemediante AFM

dove intervengono:

• Legami covalenti (F∼1 nN)

• Legami non covalenti (interazioni idrofobiche, legami idrogeno o di Van derWaals cooperativi) (F∼100 pN)

• Forze entropiche (configurazioni del sistema) (F∼10 pN)

Misura di curva forza-distanza

Informazioni su:

• Rottura di legami molecolari (interazione ligando/recettore)

• Unfolding di proteine

• Meccanica del DNA

Rottura di legami molecolari

Esempi:interazioni ligando-recettore(avidina-biotina, antigene-anticorpo);interazione tra le basi del DNA;estrazione di lipidi da membrana;rottura di legami covalenti

da http://www.biophysik.physik.uni-muenchen.de/

Unfolding di una proteina di membrana: la batteriorodopsina

Oesterhelt et al. (2000), Science 288, 143-146

I picchi a 10, 30, 50, 70 nm riflettono l’estrazione e l’unfolding delle eliche che compongono la proteina

Manipolazione di molecole non ancorate: cristallo proteico

Ferritina (∅ ∼10 nm; 24 subunità proteiche)

monomero

Immagine AFM del cristallo a risoluzione molecolare

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,50

10

20

30

40

Cou

nts

Δz (nm)

4 m

ol. [

B]

1 m

ol. [

A]

3 m

ol. [

C]

2 m

ol. [

B]

100 120 140 160 180

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

F (n

N)

z (nm)

Esperimento

V. Mollica et al. (2000), Eur. PhysJ. E 3, 315-321.

Simulazione

Indentation on a fcc site

On top indentation

Simulazione

Δz

Δz (nm)• l’avanzamento della punta ha una distribuzione multimodale• la forza di estrazione di una singola molecola dàinformazioni sulle forze di coesione nel cristallo

R. Ferrando et al. Physical Review B. 72 (2005) 045412

Ferritin single molecule conductivityDegao Xu,Gerald D. Watt, John N. Harb, and Robert C. Davis, Nano Letters, 5 (2005), 571-577

Tapping mode AFM image of apoferritin molecules (a) and holoferritin molecules (b) deposited on a flat gold surface.

The AFM I-V measurements of single holoferritin and apoferritin. The contact force between the AFM tip and the chosenferritin was 6 nN.

Un interruttore molecolare

Porfirina

F. Moresco, G. Meyer, K.H. Rieder, H. Tang, A. Gourdon, C. Joachim, Physical Review Letters 86, 672 (2001)).

Hao Yan, Sung Ha Park, GlebFinkelstein, John H. Reif,Thomas H. La Bean, Science, 301, 2003

Fili e reti di DNA

Conduzione nervosa: potenziale d’azione

Sir John Carew Eccles, Alan Lloyd Hodgkin, AndrewFielding Huxley , Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1963

Potenziale di azione e voltage-clamp

Misure di correnti attraverso la membranacellulare: patch clamp

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991: Erwin Neherand Bert Sakmann

Correnti di singolo canale

Basi molecolari della conduzione ionica

Modelli di funzionamento dei canali al sodio e al potassio

Considerazioni finali

La struttura e le funzioni dei sistemi biologici sono descrivibili sulla base dei principi fondamentali della fisica.

L’approccio “fisico” al problema biologico è una strategia che ha portato a importanti scoperte in campo biologico e ha rivoluzionato il modo di fare biologia.

La biologia è la nuova frontiera della fisica