Banche dati e software per l’identificazione di interazioni fra geni

cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate

un tessuto tumorale a confronto con uno sano

Supponiamo di voler studiare le differenze nell’espressione genica fra due trascrittomi.Per esempio:

Composto esogeno

realizziamo un esperimento microarray

Cos’è un microarray?

Fasi di un esperimento microarray

• Estrazione mRNA• Retrotrascrizione e

Marcatura• Ibridazione• Scansione• Analisi dei dati

Output dell’esperimento: lista di geni differenzialmente espressi

Rank GeneSymbolAccession Number

(Transcript)Description

Differential expression (Up- or Down-regulation)

P-value

1 DUSP1 NM_004417ref|Homo sapiens dual specificity phosphatase 1

(DUSP1), mRNA0.7606655 0.0004

2 SRGAP1 BC029919gb|Homo sapiens SLIT-ROBO Rho GTPase

activating protein 1, mRNA1.0329521 0.00038

3 HES1 NM_005524ref|Homo sapiens hairy and enhancer of split 1,

(Drosophila) (HES1), mRNA0.7117039 0.00026

4 SMAD3 U68019gb|Homo sapiens mad protein homolog

(hMAD-3) mRNA, complete cds-0.4286814 0.00021

5 RHEBL1 NM_144593ref|Homo sapiens Ras homolog enriched in

brain like 1 (RHEBL1), mRNA-0.5070915 0.00018

7 FZD10 NM_007197ref|Homo sapiens frizzled homolog 10

(Drosophila) (FZD10), mRNA-0.6491815 0.00015

8 RGS16 NM_002928ref|Homo sapiens regulator of G-protein

signaling 16 (RGS16), mRNA0.6270794 0.00012

9 GPR56 NM_201525ref|Homo sapiens G protein-coupled receptor 56

(GPR56), transcript variant 3, mRNA-0.3310189 0.0001

10 ZNF831 NM_178457ref|Homo sapiens zinc finger protein 831

(ZNF831), mRNA0.3905212 0.008

11 TFPI NM_001032281ref|Homo sapiens tissue factor pathway inhibitor

(lipoprotein-associated coagulation inhibitor) (TFPI), transcript variant 2, mRNA

-0.5849317 0.0075

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

600 BTG1 NM_001731ref|Homo sapiens B-cell translocation gene 1,

anti-proliferative (BTG1), mRNA -0.3668739 0.05

Obiettivo: ricostruire la rete di interazioni fra geni per comprendere quale sia l’effetto a livello molecolare del fenomeno biologico indagatoEsempi di reti di interazione…

Ricostruzione delle interazioni

Rank GeneSymbolAccession Number

(Transcript)Description

Differential expression (Up- or Down-regulation)

P-value

1 DUSP1 NM_004417ref|Homo sapiens dual specificity phosphatase 1

(DUSP1), mRNA0.7606655 0.0004

2 SRGAP1 BC029919gb|Homo sapiens SLIT-ROBO Rho GTPase

activating protein 1, mRNA1.0329521 0.00038

3 HES1 NM_005524ref|Homo sapiens hairy and enhancer of split 1,

(Drosophila) (HES1), mRNA0.7117039 0.00026

4 SMAD3 U68019gb|Homo sapiens mad protein homolog

(hMAD-3) mRNA, complete cds-0.4286814 0.00021

5 RHEBL1 NM_144593ref|Homo sapiens Ras homolog enriched in

brain like 1 (RHEBL1), mRNA-0.5070915 0.00018

7 FZD10 NM_007197ref|Homo sapiens frizzled homolog 10

(Drosophila) (FZD10), mRNA-0.6491815 0.00015

8 RGS16 NM_002928ref|Homo sapiens regulator of G-protein

signaling 16 (RGS16), mRNA0.6270794 0.00012

9 GPR56 NM_201525ref|Homo sapiens G protein-coupled receptor 56

(GPR56), transcript variant 3, mRNA-0.3310189 0.0001

10 ZNF831 NM_178457ref|Homo sapiens zinc finger protein 831

(ZNF831), mRNA0.3905212 0.008

11 TFPI NM_001032281ref|Homo sapiens tissue factor pathway inhibitor

(lipoprotein-associated coagulation inhibitor) (TFPI), transcript variant 2, mRNA

-0.5849317 0.0075

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

600 BTG1 NM_001731ref|Homo sapiens B-cell translocation gene 1,

anti-proliferative (BTG1), mRNA -0.3668739 0.05

…ma le interazioni?Vorremmo vedere simultaneamentesimultaneamente se e come interagiscono i geni di interesse

Per sapere qualcosa in più sulle interazioni fra geni: Banche dati di pathway e ontologie

• Kegg http://www.genome.jp/kegg/- Kegg GenesInfo sui geni e sui trascritti- Kegg PathwayInfo sulle reti di trasduzione del segnale genico (pathway)

• Gene Ontology http://www.geneontology.org/Informazioni sulla classificazione ontologica dei geni\prodotti genici

Contenuti:

KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and GenomesKEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

Rappresentazione dei dati in KEGG• Entity: una molecola o un gene

- identificata, eccetto che per GENE and ENZYME, con 3 lettere + 5 numeri:

• Binary relation: una relazione fra due entity

• Network: un grafo formato da un set di entity collegate

• Pathway: una rete di co-regolazione; un network o un insieme di network

Legenda dei simboli

Un esempio di Pathway

KEGG PATHWAYE’ una collezione di diagrammi o mappe ciascuna corrispondente a una rete di co-regolazione biologica con significato funzionale.

Ogni pathway è identificato da:-3 lettere -> specifiche per ciascun organismo-5 numeri -> identificativi della mappa

Essi possono essere:- Creati e curati manualmente- Generati attraverso simulazioni computazionali

Ci sono:- Pathway di riferimento: generati dall’unione di evidenze sperimentali tratte da organismi differenti- Pathway specifici: che raccolgono le informazioni provenienti da un determinato organismo-Pathway globali: che collegano più pathway insieme

Sezioni di KEGG Pathway

1. Global Map 2. Metabolism

Carbohydrate Energy Lipid Nucleotide Amino acid Other amino acid Glycan Cofactor/vitamin Terpenoid/PK Other secondary metabolite Xenobiotics Reaction module Chemical structure

3. Genetic Information Processing 4. Environmental Information Processing 5. Cellular Processes 6. Organismal Systems 7. Human Diseases8. Drug Development

Pathway metabolici

Pathway regolatori

KEGG ORGANISMS

• Nei pathway metabolici le entity sono quasi esclusivamente enzimi

• Nei pathway regolatori le entity rappresentano quasi sempre prodotti genici, ma troviamo anche composti chimici, DNA e altre molecole

Pathway di riferimentoStandard view-generato dall’unione di evidenze sperimentali provenienti da organismi multipli

- individuato dal prefisso map

Pathway di riferimentoKEGG ORTHOLOGY (KO) view

I geni assegnati ad un KO group sono evidenziati in viola

Pathway di riferimentoEnzyme (EC) view

I geni assegnati ad un KO group sono evidenziati in viola

Pathway di riferimentoReaction (RN) view

I geni assegnati ad un KO group sono evidenziati in viola

Pathway organismo-specificogenerato da informazioni provenienti da un unico organismo o informazioni da KEGG ORTHOLOGY

I geni specifici dell’organismo coinvolto nel pathway sono colorati in verde

Pathway specifico per più organismi

Pathway organismo-specifico + drug info

I geni coinvolti in malattie sono evidenziati in rosa

I geni target di farmaci sono evidenziati in celeste

KEGG DRUGContiene informazioni su:

• Farmaci approvati in Giappone, USA ed Europa che riguardano la loro struttura chimica

• Target dei farmaci ed enzimi che li metabolizzano

• Storia della trasformazione della struttura chimica delle molecole rappresentate attraverso mappe

I farmaci sono identificati con la lettera D + 5 numeriES: Gleevec D01441

KEGG DRUG

Pathway globali – reference pathway

Pathway globale – Homo sapiens

Pathway globale – Arabidopsis thaliana

Pathway globaleHomo Sapiens + Arabidopsis Thaliana

Disease Pathway Mapsono visti come perturbazioni di processi di regime

Stadi della malattia

Vogliamo sapere se ci sono gruppi di geni differenzialmente espressi mappati nei pathway e

in quali pathway

Pathway-Express

Pathway-Express : http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

Impact Analysis: mappatura dei geni differenzialmente espressi nei pathway molecolari e valutazione della propagazione della perturbazione della trasduzione del segnale genico provocata dalla variazione di espressione genica

Pathway-Express : http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

35

L’Impact Factor è formato da tre contributi:- Numero di geni differenzialmente espressi mappati in un pathway rispetto al numero di geni che formano il pathwaylivello di rappresentatività della lista dei geni DE nel pathway- Fold-change dei geni differenzialmente espressi mappatientità della perturbazione del pathway provocata dai geni differenzialmente espressi- Posizione dei geni differenzialmente espressi all’interno del pathwayun gene posizionato a monte (p.es. sulla membrana cellulare o su un nodo cui fa capo una sottorete) di una cascata di segnale è “più importante” di un gene posizionato a valle

GeneOntology

Cos’è un’ontologia?An ontology is a specification of a conceptualization

that is designed for reuse across multiple applications and implementations. …a specification of a

conceptualization is a written, formal description of a set of concepts and relationships in a domain of

interest.

Peter Karp (2000) Bioinformatics 16:269

… un insieme di definizioni

Cos’è un’ontologia genica?Ontologia genica: un vocabolario di definizioni, indipendente dall’organismo, da utilizzare per descrivere i geni attraverso i loro prodotti genici (proteine)

• “trasferimento” delle informazioni funzionali fra organismi differenti a parità di complessità del genoma

• “trasferimento” delle informazioni funzionali da organismi “meno complessi” ad organismi “più complessi”

• univocità nella descrizione delle caratteristiche di un gene

Gene Ontology http://www.geneontology.org/

Consorzio

che si occupa della definizione delle ontologie geniche

per la classificazione dei geni attraverso i loro prodotti genici

http://www.geneontology.org/

Che tipo di informazione è rilevante per descrivere un prodotto genico?

• Che cosa codifica il gene?• Dove e quando il prodotto agisce?• In che cosa è coinvolto?

Funzione molecolareComponente cellulareProcesso biologico

Tre ontologie• Funzione molecolare -> definizioni che riguardano la funzione biochimica di un prodotto genico

- enzima, lega gli ioni calcio, lega i nucleotidi, etc

• Processo biologico -> definizioni che riguardano il processo di co-regolazione all’interno del quale il prodotto genico può essere inserito

- metabolismo di una molecola, glicolisi, ciclo della cellula, apoptosi

• Componente cellulare -> definizioni che riguardano il “luogo” della cellula nel quale un determinato prodotto genico può agire

- membrana cellulare, reticolo endoplasmatico

Componente cellulare

• Dove agisce un prodotto

Componente cellulare

Componente cellulare

Funzione molecolare

• Attività o compito del prodotto genico

glucose-6-phosphate isomerase activity

24th Feb 2006 Jane Lomax

insulin bindinginsulin receptor activity

Funzione molecolare

Processo biologico

-una serie di eventi a cui prende parte il prodotto

cell division

transcription

Processo biologico

regulation of gluconeogenesis

Processo biologico

limb development

Processo biologico

GO evidence codes

I geni sono associati a categorie sulla base di evidenze di diverso tipo

Statistiche di GeneOntology

Com’è organizzata un’ontologia?Ontologie

Categorie ontologiche

Ogni ontologia è strutturata in un Grafo Aciclico Diretto (DAG)

Ogni livello del grafo costituisce una categoria ontologica o GO term A ciascun GO term è associata una definizione univoca

• I GO term sono legati per mezzo di due tipi di relazioni:– is-a – part-of

Struttura di un’ontologia

cell

membrane chloroplast

mitochondrial chloroplastmembrane membrane

is-apart-of

Struttura di un’ontologia

Struttura di un’ontologia

• Ogni ontologia non è una lista di termini biologici, ma è strutturata in livelli gerarchici

gene A

Lo stesso gene può essere annotato in più di un GO term

Struttura di un’ontologia

I geni possono essere raggruppati sulla base di livelli gerarchici e percorsi definiti dall’utente

sono ammesse le parentele multiple

Struttura di un’ontologia

cell

membrane chloroplast

mitochondrial chloroplastmembrane membrane

Directed Acyclic Graph (DAG) - multiple parentage allowed

Come funziona GeneOntology?

• GO è organismo indipendente- Alcuni termini, soprattutto quelli ai più bassi

livelli di gerarchia e di dettaglio, possono essere specifici per certi organismi

- photosynthesis

– Quando però essi vengono collassati insieme ai livelli con più alto ordine gerarchico la dipendenza dall’organismo scompare

Anatomia di un GO term

id: GO:0006094name: gluconeogenesisnamespace: processdef: The formation of glucose fromnoncarbohydrate precursors, such aspyruvate, amino acids and glycerol.[http://cancerweb.ncl.ac.uk/omd/index.html]exact_synonym: glucose biosynthesisxref_analog: MetaCyc:GLUCONEO-PWYis_a: GO:0006006is_a: GO:0006092

unique GO IDterm name

definition

synonymdatabase ref

parentage

ontology

GO tools

• GO mette a disposizione strumenti per fare ricerca ottimizzata nella banca dati

• Altri gruppi hanno creato strumenti con differenti propositi:

http://neurolex.org/wiki/Category:Resource:Gene_Ontology_Tools

Analisi tradizionale

Gene 1ApoptosisCell-cell signalingProtein phosphorylationMitosis…

Gene 2Growth controlMitosisOncogenesisProtein phosphorylation…

Gene 3Growth controlMitosisOncogenesisProtein phosphorylation…

Gene 4Nervous systemPregnancyOncogenesisMitosis…

Gene 100Positive ctrl. of cell prolifMitosisOncogenesisGlucose transport…

• Ricerca gene by gene

• Richiede di fare una ricerca in letteratura

• time-consuming

Analisi tradizionale

Se utilizziamo le annotazioni fornite da GO…

…il lavoro è già fatto!

GO:0006915 : apoptosis

Raggruppamento per processo

ApoptosisGene 1Gene 53

MitosisGene 2Gene 5Gene45Gene 7Gene 35…

Positive ctrl. of cell prolif.Gene 7Gene 3Gene 12…

GrowthGene 5Gene 2Gene 6…

Glucose transportGene 7Gene 3Gene 6…

Come facciamo ad ottenerlo automaticamente e….

….Esiste un modo per associare una significatività statistica a questi raggruppamenti di geni?

68

Over-representation analysis:

- Esistono gruppi di geni differenzialmente espressi rappresentati in maniera “sproporzionata” in qualche GO term?

- Questa rappresentatività “sproporzionata” è statisticamente significativa rispetto al totale dei geni che vengono annotati in quel GO term?

Quanto è probabile che gruppi di geni differenzialmente espressi vengano catalogati in un GO term “by chance”?

microarray

1000 genesexperiment

100 genes differentially regualted

mitosis – 80/100apoptosis – 40/100p. ctrl. cell prol. – 30/100glucose transp. – 20/100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

mitosis apoptosis positive control ofcell proliferation

glucose transport

Se osserviamo il numero di geni distribuiti sull’array e appartenenti alle stesse categorie, possiamo calcolare la probabilità che ci interessa:

Process Genes on array # genes expected in occurred 100 random genes

mitosis 800/1000 80 80apoptosis 400/1000 40 40p. ctrl. cell prol. 100/1000 10 30 glucose transp. 50/1000 5 20

Onto-Express

GO term significativi nell’ontologia Molecular Function

Onto-Express: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

Espansione delle ontologie e visualizzazione annidata dei GO term

Onto-Express: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

OntoExpress: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

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Molecular FunctionBiological Process

Cellular Component

Sfruttare-le reti di interazioni (gene network) fra bio-entità costruite utilizzando dati di letteratura o info da banche dati eterogenee

per comprendere quale sia l’effetto a livello molecolare del fenomeno biologico indagato

- Co-occorrenza di bio-entità (geni, proteine, parole chiave, etc) in testi

- Individuazione di connessioni fra bio-entità riportate in database di

interazioni biologiche (pathway, interazioni fra proteine, interazioni chimiche

o fisiche, co-espressione in esperimenti di espressione genica, etc.)

Interpretazione biologica di una lista di geni: data/text mining

Text mining: Individuazione della co-occorrenza di parole in un testo

Ricorrenza in un testo di coppie di elementi bio-entità:• coppie di nomi di geni• coppia gene/parola chiave

“X binds Y”, “X phosphorylates Y”, “X is involved in Y process”, “X is a marker for Y disease”, …

Ricorrenza in un testo di coppie di elementi bio-entità:• coppie di nomi di geni• coppia gene/parola chiave

“X binds Y”, “X phosphorylates Y”, “X is involved in Y process”, “X is a marker for Y disease”, …

1S) Individuazione nel testo di informazioni (contenute in titolo, testo e abstract) e metainformazioni (affiliazione, giornale, etc)data retrieving and selection

2S) Analisi grammaticale del testo per individuare i diversi tipi di parole: sostantivi, aggettivi, verbi e nomi propri parsing

3S) Conteggio del il numero di volte in cui ogni parola appare nei testiinformation extraction e indexing

4S) Assegnazione di un punteggio ad ogni testo sulla base della co-occorrenza delle parole cercate (X e Y ) quanto più è alta in un testo tanto più quel testo è attinente alla co-occorrenza considerata e attesta la relazione fra X e Yscoring

5S) Rappresentazione grafica della connessione tramite una rete

Text mining: Individuazione della co-occorrenza in un testo

Ricorrenza in un testo di coppie di elementi linguistici (bio-entità):

• coppie di nomi di geni• coppia gene/parola chiave

Ricorrenza in un testo di coppie di elementi linguistici (bio-entità):

• coppie di nomi di geni• coppia gene/parola chiave

… ma come si fa?

Text mining: Individuazione della co-occorrenza in un testo

Alcuni algoritmi sono capaci di:

-rilevare sulla base di un vocabolario il tipo di interconnessione fra le bio-entità considerate“X binds Y”, “X phosphorylates Y”, “X is involved in Y process”, “X is a marker for Y disease”, …

- dare un peso alla co-occorrenza a seconda della distanza che separa le bio-entità espressa in numero di parole

- rilevare connessioni indirette:

X è connesso a Y, Y è connesso a Z X è connesso a Z

ciò può influire sulla valutazione dell’attinenza del documento alla connessione fra le bio-entità

Cosa si può fare con il Data mining?Costruire reti di “interazioni eterogenee”

Banche dati utili:- MIPS: Munich Information center for Protein Interaction- BIND: Biomolecular Interaction Network Databases- HPRD: Human Protein Reference Database- IntAct: InterAction- Reactome- STRING:Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins- …

LetteraturaScientifica

Integrazione di informazioni eterogenee

Esistono gruppi di geni della mia lista che sono coinvolti in malattie?

Disease Ontology, GeneRIF e FunDO

Disease Ontology- Definizioni univoche e standardizzate di malattie- Integra MeSH di NCBI

Esempi da DO

Disease Ontology

GeneRIF Database

MetaMapTransfer

FunDO

Software basato sul text-mining che associa geni da GeneRIF e malattie da Disease Ontology

FunDO – Functional Disease Ontology

FunDO – Functional Disease Ontology

In quali malattie sono coinvolti?

314 geni differenzialmente espressi

GNCPro – Gene Network Central PRO

GNCPro – Gene Network Central PRO

Sottomissione di 4 geni

GNCPro aggiunge 5 geni “vicini” a quelli sottomessi per fornire nuove vie di connessione fra i geni

COREMINE

• Motore di ricerca biomedico• Fornisce set di informazioni ordinate per attinenza con l’oggetto della

query• Consente di salvare le ricerche effettuate e di creare gruppi di

discussione su temi di ricerca

COREMINE• Input data da 13 differenti categorie

• Database messi in relazione per creare l’output

COREMINE• Altre sorgenti consultabili per arricchire l’output

COREMINE

…take-home message

• Ogni banca dati fornisce un “pezzo” di informazione• Ogni strumento di navigazione fornisce una peculiare “view”

delle informazioni

• Non esiste UNA banca dati omnicomprensiva• Non esiste UNO strumento capace di collezionare tutte le informazioni frazionate nelle banche dati

• L’uso di più strumenti consente di collezionare i diversi “pezzi” di informazione• La costruzione del “puzzle” è compito di chi interpreta i dati

Esercitazionehttp://131.114.94.135/lezioni/ADO_tecnici

• Cercare i seguenti GO term: 00301820051402• Per ciascuno di essi:

- fare l’anatomia dell’ontologia evidenziando i GO term sulla base degli “is-a” o “part-of”- indicare quanti sono i prodotti genici associati a ciascun GO term a seconda dei termini di cui sono “is-a” o “part-of”- scaricare e salvare la tree view e la graph view ed indicare chi sono i GO term “padri” dei GO term considerati - indicare quali GO term dell’albero visualizzato sono “is-a” o “part-of”