PAS : Classe di insegnamento A60

Biologia e scienze

A.A . 2013/2014 09/05/2014

Attivitá e cinetica

enzimatica

Cinetica Enzimatica

La cinetica enzimatica è misurata come velocità di conversione del substrato nel

prodotto finale, ossia quantità di prodotto generato per unità di tempo

Cinetica Enzimatica

La cinetica enzimatica è influenzata da vari fattori:

- Concentrazione del enzima

- PH nel mezzo di reazione (ogni enzima possiede un PH ottimale, generalmete intorno a

valori medi)

- Concentrazione del substrato

- Presenza di eventuali inibitori e della loro concentrazioni (gli inibitori allosterici sono

generalmente più potenti degli inibitori competitivi)

Substrato enzimatico

Quando la concentrazione enzimatica è mantenuta constante, un incremento della

concentrazione del substrato porta ad un aumento della velocità di reazione fino al

raggiungimento della velocità massima (Vmax)

(mM)

(Ab

s/t

ime

)

• La concentrazione di substrato cui la velocità di reazione

è ½ Vmax è definita come constante di Michaelis, Km

• La saturazione dei siti attivi si ha con il raggiungimento di Vmax

Inibitori enzimatici

Gli inibitori enzimatici agiscono riducendo la velocità di reazione enzimatica

- Inibitori competitivi: legame al sito attivo (linibizione competitiva può essere superata aumentando le

concentrazioni del substrato)

- Inibitori allosterici: legano l’enzima al di fuori del sito attivo (sito allosterico) inducendone un

cambiamento conformazionale

- Inibitori non-competitivi: legano l’enzima nel sito attivo ed anche il complesso enzima-substrato

NB: la cellula preferisce limitare l’attività di un enzima attraverso la modulazione delle concentrazioni di substrato

oppure mediante l’azione di enzimi con attività opposta, piuttosto che mediante l’impiego di inibitori (gli inibitori delle

ribonucleasi ne sono un raro esempio)

Fosfatasi alcalina

La fosfatasi alcalina è un enzima che si trova prevalentemente nel sangue, nell’intestino,

nel fegato e nel tessuto osseo.

Alterati livelli di questa proteina nel sangue possono essere indicativi di diversi fenomeni

patologici.

• La fosfatasi alcalina catalizza l’idrolisi di fosfati monoestere

per generare gruppi fosfato inorganici

Saggio della fosfatasi alcalina

La fosfatasi alcalina ha un’attività maggiore a PH alcalini (PH 8.0).

• Il saggio più comune per la rilevazione dell’attività della fosfatasi alcalina

prevede l’impiego di p-nitrofenil fosfato (o 4-nitrofenil fosfato),

un substrato cromogenico.

• La quantità di prodotto enzimatico formato (p-nitrofenolato) può essere

misurata mediante uno spettrofotometro

NB: nei saggi di rilevazione dei livelli di fosfatasi alcalina la quantità di

substrato prodotto è impiegata come misurazione indiretta della quantità

di enzima

Spettrofotometro

Lo spettrofotometro misura in maniera quantitativa la frazione di luce che attraversa una

determinata soluzione campione.

L’assorbanza (o densità ottica OD) è la grandezza (priva di unità di misura) utilizzata in

spettrofotometria per misurare la quantità di luce assorbita da una soluzione.

• L’assorbanza è determinata dalla formula:

A = ε x l x C

ε: coefficiente di assorbimento molare

l: cammino ottico della cuvetta

C: concentrazione di soluto (mol/L)

La differenza tra la luce incidente e la luce trasmessa determina l’assorbanza del campione

Molarità

La molarità (M) è un'unità di misura della concentrazione di una specie chimica in una

soluzione, è definita come le moli di soluto presenti in un litro di soluzione (mol/L).

La mole di una sostanza contiene tante entità elementari quanti sono gli atomi contenuti in

12 grammi dell'isotopo 12 del carbonio: tale numero è noto come numero di Avogadro, pari a

6,022 × 1023 .

Nel caso di un composto chimico, si può definire la mole come la quantità di sostanza avente

massa, espressa in grammi, numericamente uguale alla massa molecolare della singola

molecola (peso molecolare).

NB: nelle reazioni in vitro, si impiegano concentrazioni di reagenti nell’ordine del milli molare (mM) ma nei sistemi

cellulari le sonstanze (inclusi i substrati enzimatici) hanno concentrazioni nel nano o micro molare (nM, uM)

Utilizzo delle pipette Gilson

p10 p20 p200

p1000

Utilizzo di Excel

Utilizzo di Excel

Equazione di regressione logaritmica

Y = a x ln(x) + b

a: pendenza

B: intercetta

X

Y

Utilizzo di Excel

Approssimazione di Vmax

Vmax

X: tempo

Y: Abs

X

Y

• Vmax si ottiene al raggiungimento del

plateau di reazione

• La pendenza della curva (a)

rappresenta l’incremento di velocità di

reazione (reaction rate)

PEROSSISOMA: organello cellulare presente in tutte

le cellule eucariotiche, separato dal citoplasma mediante membrana, al cui interno si svolgono diverse

reazioni metaboliche tutte caratterizzate dalla formazione di H2O2.

FUNZIONE DEI PEROSSISOMI

Reazioni di ossidazione che utilizzano O2 per rimuovere H2 da un substrato organico (R) come ad esempio l’ossidazione degli acidi grassi o dell’etanolo

RH2 + O2 R + H2O2 Il perossido di idrogeno é altamente tossico per le cellule

(interferenze con ioni metallici delle proteine e mutazione del DNA) e i perossisomi lo eliminano grazie alla catalasi

2H2O2 2H2O + O2

Catalasi

REAZIONI NEI PEROSSISOMI

Degradazione degli acidi grassi a catena molto lunga Da: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21624/figure/A 4363/?report=objectonly

CATALASI • Enzima localizzato nei perossisomi • indispensabile per l’eliminazione del perossido di idrogeno all’interno della cellula • L’eliminazione del perossido di idrogeno deve essere immediata: ogni secondo una molecola di catalasi puó degradare milioni di molecole di H2O2. • La velocitá della reazione é garantita da un gruppo eme, uno per ogni subunitá della proteina. • La concentrazione dell’enzima varia a seconda dell’organismo e del tessuto (molto alta in fegato) • ph ottimale ca. 7 (variabile a seconda della specie)

ESPERIENZA DI LABORATORIO

Obiettivo:

Riconoscere l’attività enzimatica della catalasi e valutare in quali circostanze viene alterata.

In particolare vedremo:

- Attivitá della catalasi in prodotti di origine animale e vegetale

- Effetto del calore e del pH sull’attivitá enzimatica

Prodotti utilizzati e frasi di rischio

H2O2

H302 Nocivo se ingerito. H318 Provoca gravi lesioni oculari. HCl H290 Può essere corrosivo per i metalli. H314 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H335 Può irritare le vie respiratorie NH3

H221 Gas infiammabile. H280 Contiene gas sotto pressione; può esplodere se riscaldato. H314 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H331 Tossico se inalato. H400 Molto tossico per gli organismi acquatici.