21 Ottobre 2011,Napoli

Le cellule Stromali Mesenchimali

Le cellule staminali (stem cells, SC) sono cellule non specializzate a uno stadio precoce di sviluppo.

Hanno la caratteristica di riprodursi a lungo senza differenziarsi (auto-rinnovamento) e di dare origine a cellule progenitrici

dalle quali derivano linee cellulari differenziate (muscolari, ematiche, nervose, ecc...).

Possono dividersi e differenziarsi in un largo numero di tipi cellulari che producono i tessuti e gli organi del corpo.

Le Cellule Staminali

Proprietà delle Cellule Staminali

• Capacità di riprodursi all’infinito• Abilità a specializzarsi in diversi tipi cellulari

Divisione simmetrica

Divisione asimmetrica

Differenziamento delle cellule progenitrici

Autorinnovamento e differenziamento

Potenziale differenziativo Tipo di staminale Numero di tipi cellulari Tipi di cellule risultanti

Totipotenzialità Zigote Tutti Tutti i tipi cellulari

Pluripotenzialità Cellule embrionali coltivate Tutti, eccetto le membrane enbrionali

Cellule da tutti i foglietti germinativi

Multipotenzialità Cellule ematopoietiche Molti Muscolo scheletrico, muscolo cardiaco, fegato, cellule del

sangue

Oligopotenzialità

Precursori mieloidi Pochi Alcuni tipi di cellule del sangue

Cellule staminali mesenchimali Pochi

Condrociti, miociti, osteoblasti, adipociti, cellule endoteliali,

cellule neurali

Potenziale

• Embrionali

• Fetali

• Placentali o cordonali

• Adulte

Principali tipi di staminali

Origine

• Difficoltà nel controllare la differenziazione in vitro• Uso omologo: possibilità di risposta immunologica • Cancerogenicità• Problemi etici

Problemi nell’uso di cellule staminali non adulte

• Ematopoietiche

• Stromali o Mesenchimali• Neurali• Muscolari • Pancreatiche • Epatiche • Epiteliali

Cellule staminali adulte o somatiche

Midollo osseo: principale fonte di MSC

CD 13 Aminopeptidase N, APN, gp150 +++

CD 29 VLA-1/4 subunit (Integrin β1 chain) +

CD 44 H-CAM, Pgp-1, Hermes antigen (ECMR-III) ++

CD 49d VLA-4 subunit (Integrin 4) +

CD 54 Intercellular Adhesion Molecule, ICAM-1 +

CD 90 Thy-1 ++

CD 105 Endoglin ++

CD 14 MO2 - LPS-receptor --

CD 45 Leukocyte common antigen (LCA), T200 --

CD 71 T9 – Transferrin Receptor -

CD 106 VCAM-1 --

Carta d’Identità delle MSC

• Supporto all’ematopoiesi

• Attrazione di cellule ematopoietiche

circolanti (homing)

• Immunosoppressione

• Capacità di differenziare in cellule

tessuto-specifiche (rigenerazione

tissutale)

• Angiogenesi- Vasculogenesi

Funzioni delle MSC

Teoria della plasticità

Fattori tissutali locali (citochine, fattori di crescita) possono “riprogrammare” la cellula staminale

Alexander Jakovlevich Friedenstein(1924-1997)

Friedenstein, 1966 J EMBRYOL EXP MORPH

Osso trabecolare (Osyczka, 2002 Ann NY Acad Sci)Periostio (Nakahara 1991, J Othop Res)Grasso sottocutaneo (Zuk, 2001 Tissue Eng)Grasso viscerale (Tholpady, 2003 Anat Rec)Grasso intrapatellare (Whickham, 2003, Clin. Orthop &R.R.)Periciti (Brighton, 1992 Clin Orthop)Sangue (Zvaifler, 2000 Arthritis Res)Derma (Toma, 2001Nat Cell Biol; Young, 2001, Rec)Muscolo (Lu, 2003 BBRC)Membrana sinoviale (De Bari, 2001 Arthritis Rehum) Pancreas fetale (Hu, 2003 J lab Clin Med)Polpa dei denti (Gronthos, 2000 PNAS)Denti da latte (Miura 2003 PNAS)Legamenti Peridontali (Trubiani 2005; Int J of Immunopat & Pharm)

…origine

?

?

Tendon

(Badiavas ARCH DERMATOL 2003)

Endothelium

(Reyes JCI 2002)

Neurons

Azizi (PNAS 1999)Sancez-Ramos (EXP NEUROL 2000)

Liver

(Schwartz, JCI 2002)

BoneJaiswal

(J CELL BIOCHEM 1997)

Fat Pittenger

(SCIENCE 1999)

CartilageYoo (JBJS 1998)

Makino(JCI 1999)

Cardio m.

Muscle Ferrari

(SCIENCE 1998)

Pancreatic β-cells (Ianus, JCI 2003)

Renal epithelial cells(Kale, JCI 2003)

La potenzialità

Applicazioni terapeutiche delle ASCs

• Ferite difficili /Ustionati• PVD• Infarto miocardico• tumore• Artrite• Parkinson• Alzheimer• Diabete• Disfunzioni ematiche• Lesioni del midollo• Rigenerazione Tissutale

FETO

LIQUIDO AMNIOTICO CORDONE OMBELICALE

EMBRIONE

VILLI CORIALI MIDOLLO OSSEO

TESSUTO ADIPOSO SANGUE PERIFERICO

FONTI DI cellule MSC

MSC

ADI

PBMMP

FONTI DI cellule MSC

1. Accelerare i processi riparativi.2. Intervenire dove gli attuali approcci terapeutici non sono soddisfacenti

Obbiettivi

70% della serie leucocitaria19% della serie eritroide

Circa 1:18.000 SSCSu 64.000.000 di cellule nulceate 3555 SSC

Muschler GF: J Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25

1. Impiantare il midollo intero

2. Impiantare le cellule mononucleate isolate

3. Impiantare una popolazione delle cellule isolate

4. Impiantare le cellule dopo espansione

Prelievo Isolamento

Espansione

impianto

Fattori di crescita

Assemblaggio

Il sogno…

EU IT

IN ACCORDANCE COMPLY

Good Manufacture Practice

La normativa

Chimici

Biologici

1. Impiantare il midollo intero2. Impiantare le cellule mononucleate isolate3. Impiantare una popolazione di cellule isolate4. Impiantare le cellule dopo espansione

-Midollo

Due tipi di cellule:

Emapoietiche• Popolazione estesa• Formano linee sangue• Non formano osso?

Mesenchimali• Popolazione limitata• Formano cellule

osteoprogenitrici• Formano osso,tendine, cartilagine,muscolo,grasso

EmapoieticheMesenchimali

Concentrazione di cellule Mesenchimali Stromali

Manico ergonomicoAttacco luer

Disegno a un foro

Disegno a tre foriTacche di

profondità

5”, 12 gauge

Aghi per aspirato midollare

Aspiration to obtain osteoblast progenitor cells from human bone marrow: the influence of aspiration volume G. Muschler, C. Bohem, K. Easley. J Bone Joint Surg (Am), 1997;79-A;1699-1709

Tot cell nucleate

[Cell] nucleate/

ml Tot

Tot cell positive

ALP+

[Cell] ALP+ /ml

40 106 40 106 1451 1451

72 106 636 106 2836 1418

100 106 25 106 3526 882

1ml aspirato

2ml aspirato

4ml aspirato

Il prelievo midollo osseo dalla cresta iliaca anteriore o posteriore

Limitare il volume di aspirato a 2-4 ml per prelievo

L’ago a 3 e a 5 fori permettono di aumentare il volume di prelievo con un cospicuo risparmio di tempo senza inficiare la qualità dell’aspirato

[mononucleate] [MSC]Età Femmine Maschi Femmine Maschi<30 anni 56 106 38 106 14.843 2.829 30-49 28,5 106 37 106 3.482 1.28850-69 19 106 30 106 834 3.712>70 19,5 106 25,5 106 498 4.320

Muschler GF, Nitto H, Boehm C, Easley K. Age- and gender-related changes in the cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25

Parametri che influenzano la cellularità

Ruolo dei monociti/macrofagi nella vasculogenesi

• Creano lo spazio tissutale attraverso la degradazione locale della matrice extracellulare

• Facilitano la penetrazione dei progenitori formano tunnel (co-migrazione)

• Coadiuvano la trasformazione delle colonne cellulari in strutture tessutali complesse (vasi)