Capitolo 18

La regolazione dell’espressionegenica negli eucarioti

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

http://web.unife.it/progetti/genetica/Guido/index.php?lng=it&p=4

Domande 18

1. Ancora più che nei procarioti, negli Eucarioti molti geni devono rispondere (attivandosi o disattivandosi) e in modo coordinato a variazioni ambientali: come viene regolata l’espressione genica?

2. Cosa succede ai geni che, in certi tessuti, non si esprimono mai?

3. A che livelli può essere controllata l’espressione genica?

4. Che cosa sono i piccoli RNA, e che ruolo hanno nel controllo dell’espressione genica?

Figura 18.1

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Negli Eucarioti l’espressione genica può essere controllata a molti livelli

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Il controllo della trascrizione può essere positivo o negativo

Meccanismi di controllo a livello di inizio della trascrizione

Regolazione della trascrizione negli Eucarioti

A: Fattori trascrizionali (proteine)Operano in trans: sono molecole diffusibili1.Fattori generali di trascrizione o GTF Si legano al promotore bassi livelli di trascrizione2.Attivatori Si legano al DNA. Due domini: di legame e di attivazione

alti livelli di trascrizione3. Coattivatori Si legano ai GTF o agli attivatori alti livelli di trascrizione4.Repressori

Si legano al DNA. Due domini: di legame e di repressioneMai legati a siti analoghi all’operatore inibizione della trascrizione

5. Corepressori Si legano ai GTF o agli attivatori inibizione della trascrizione

B: Sequenze regolatrici (siti del DNA)Attive solo in cis: sono siti del DNAPromotori (vicini), enhancer, silencer (lontani)

Gli elementi del promotore hanno un ruolo nel determinare se avviene o meno trascrizione al gene

Gli enhancer e i silencers determinano, legando specifiche proteine regolatrici, quanto alti saranno i livelli di trascrizione al gene

N.B. Non c’è una proteina regolatrice per ogni gene (altrimenti, metà del genoma produrrebbe proteine regolatrici per l’altra metà). Ogni gene è regolato da uno specifico complesso di proteine regolatrici: la stessa proteina regolatrice regola, in combinazione con altre proteine regolatrici, la trascrizione di diversi geni

Figura 18.8

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Figura 18.2

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Dominio C-Terminale della RNA P II

Proteina che si lega al TATA-box

Meccanismo generale di attivazione della trascrizione

Una malattia genetica: Intolleranza al lattosio

(da Jobling et al, 2004)

FOETUS

Low expression

INFANT

High expression

ADULT

High expression“lactase persistence”

ADULT

Low expression“lactase non-persistence”

Livelli di espressione della lattasi (LPH) a diversi stadi di sviluppo (gene LCT)

Frequenza di individui in grado di digerire il latte (fenotipo persistenza della lattasi)

1. Forti differenze fra popolazioni2. Conservato un lungo aplotipo ad alta frequenza

Enattah et al. Nature Genetics 30:233-237 (2002)

Lattosio glucosio + galattosioLPH

Analisi del gene LCT (2q21) : nessuna variabilità associata all’intolleranza

Cromosoma 2

Localizzazione dei siti regolatori che determinano la persistenza della lattasi

Regioni con la massima diversità ai geni per le proteine del latte bovine

Regioni con la massima frequenza di persistenza della lattasi

Figura 18.3

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Domini proteici che si legano al DNA

Tipico degli Homeo-box

Zinc-finger: struttura (C2H2)

Ci sono zinc-fingers con struttura C4 (4 cisteine) e C6 (6 cisteine)

Zinc-finger: Il recettore dell’estrogeno, ER

Un dimero di ER si inserisce nel solco maggiore del DNA, provocando l’apertura della doppia elica

Leucine-zipper

Due eliche (Jun e Fos), tenute insieme da legami idrofobici fra leucine

Figura 18.4

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Esempio 1: metabolismo del galattosio in lievito

Ci sono tre geni strutturali adiacenti e due Upstream Activating Sequences (UASG)

Questi geni non formano un operone, e hanno ciascuno il proprio promotore

Ci sono inoltre, a distanza:GAL3: produce un enzima, Gal3p, che converte il galattosio in induttoreGAL4: gene regolatore; solo in assenza di glucosio produce il fattore di trascrizione Gal4pGAL80: gene repressore, il cui prodotto Gal80p, si lega a Gal4p e ne blocca l’attività

Figura 18.4

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Esempio 1: metabolismo del galattosio in lievito

In assenza di glucosio, Gal4p forma dimeri che si legano alle UASG. Se però non c’è

galattosio, Gal80p si lega ai dimeri e impedisce loro di attivare la trascrizione

Figura 18.4

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Esempio 1: metabolismo del galattosio in lievito

In assenza di glucosio e in presenza di galattosio, Gal3p converte il galattosio in un induttore che si lega a Gal80p, permettendo così a Gal4p di attivare la trascrizione (NB in due direzioni diverse)

Figura 18.5

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Esempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormoni steroidei

Solo gli ormoni steroidei entrano nella cellula e intervengono direttamente sul DNA, regolando la trascrizione

Figura 18.6

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Gli ormoni steroidei si legano a specifici SHR, Steroid Hormone Receptors, e questo complesso si lega alle sequenze di regolazione dei geni controllati dall’ormone

Esempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormoni steroidei

ER: recettore dell’estrogeno

Figura 18.7

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Esempio 2: regolazione della trascrizione tramite ormoni steroidei

Le Chaperonine, fra cui Hsp90, sono normalmente legate agli SHR, ma se ne staccano in presenza di ormoni steroidei. Legato al recettore, l’ormone entra nel nucleo, dove attiva la trascrizione.

Tutti i geni-bersaglio regolati dallo stesso ormone hanno una sequenza di legame in comune.

RODOPSINAOPN1

MELANOPSINAOPN4

GLOBINA αHBA

GLOBINA βHBB

No No Sì Sì

Sì Sì No No

In ciascun tessuto, alcuni geni non vengono mai trascritti

Come avviene tutto ciò?

a. Ci sono enhancers tessuto-specifici

Figura 18.12

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b. Geni inattivi sono metilati

Contengono residui di 5-metil-citosina

Il contenuto di 5-metil-citosina è inversamente correlato al livello di espressione genica

Sostituendo alla citosina un suo analogo non metilabile, la 5-azacitidina, si attivano geni normalmente inattivi

La metil-transferasi lega gruppi metilici alle citosine nei dinucleotidi CG; regioni del genoma ricche di questi dinucleotidi si chiamano isole CpG

Regioni metilate possono essere evidenziate perché la metilazione protegge dal taglio con MspI le sequenze bersaglio dell’enzima di restrizione, CCGG

Metilazione della citosina nelle isole CpG di mammifero

Il DNA non metilato scorre sul nucleosoma, rendendo disponibili promotore e siti di regolazione

Cromatina chiusa, cromatina aperta

Il complesso SWI/SNF (switch sniff) è costituito da un numero variabile di proteine (da 8 a 18) che allontanano i nucleosomi

La metilazione è una forma di cambiamento ereditabile dell’espressione genica, che non altera la sequenza del DNA

Un altro esempio di fenomeno epigenetico è rappresentato dall’inattivazione del cromosoma X nei mammiferi

Fenomeni di questo tipo sono detti epigenetici.

Figura 18.14

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Regolazione a livello di maturazione dell’RNA: splicing alternativi

Lo strano caso delle petunie

I fiori di petunia selvatici hanno colore uniforme per l’espressione di un gene cromosomico che codifica per il pigmento.

Inserendo una seconda copia del gene, Jorgensen e colleghi contavano di ottenere una colorazione più intensa

Le petunie transgeniche così ottenute hanno invece regioni non pigmentate; questo fenomeno è stato chiamato co-soppressione

La co-soppressione è dovuta all’intervento di corti RNA con funzione di regolazione, che inattivano entrambe le copie del gene per il pigemento: sia quella portata sul cromosoma, sia quella transgenica:

Silenziamento genico

RNA interferenceLavorando su Caenorhabditis elegans, Fire e Mello dimostrano che gli mRNA possono essere distrutti da piccole molecole di RNA a doppia elica: miRNA (microRNA) e siRNA (short interfering RNA). (A. Fire et al., 1998, Nature 391:806-811)

miRNA e siRNA sono prodotti da tratti di genoma che non codificano per proteine.

In natura, l’RNA interference porta al silenziamento genico, ed è utilizzato da diversi organismi come difesa contro l’espressione di DNA virali

RNA interference

RNA interference

Nella regione UTR in 3’

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RNA interference 1: miRNAI miRNA sono codificati da geni (oltre 500 nell’uomo) presenti nel genoma di tutti gli Eucarioti multicellulari e di alcuni Eucarioti unicellulari

I geni per i miRNA sono in parte localizzati nelle regioni intrageniche, e in parte all’interno di introni

I miRNA vengono trascritti dalla RNA P II in un trascritto primario (Pre-miRNA o shRNA: Short Hairpin RNA) contenente un tratto di circa 70 nt che si ripiega a forcina

Un’endonucleasi (Drosha) taglia il Pre-miRNA lasciando un’estremità di 2nt sporgente all’estremo 3’

Figura 18.15

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RNA interference 2: miRNANel citoplasma, i Pre-miRNA vengono ulteriormente tagliati da un’endonucleasi, Dicer, formando filamenti in cui le due eliche sono imperfettamente appaiate

Delle due eliche, una (filamento guida) diventerà il miRNA, l’altra (filamento passeggero, o RNA*) no

Il miRNA si lega con altre proteine (slicer o Ago1) formando un precursore del complesso miRISC (RNA Induced Silencing Complex)

Figura 18.15

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RNA interference 3: miRNAIl complesso miRISC matura grazie ad Ago1, che provoca il rilascio del filamento passeggero

Il complesso miRISC riconosce l’mRNA bersaglio, vi si lega (nella 3’UTR) e ne provoca la degradazione

RNA interference 4: siRNAI siRNA non sono codificati dal genoma nucleare, ma si originano come RNA a doppia elica di 19-21 nt

Attraverso passaggi analoghi a quelli visti per miRNA (ma Slicer è rappresentato da una proteina diversa, Ago2) si forma un precursore del complesso RISC, e poi un siRISC

Il complesso siRISC riconosce l’mRNA bersaglio, vi si lega e ne provoca la degradazione

Ma, se non sono codificati nel genoma, che origine hanno gli shRNA in questo caso?

RNA interference 5: siRNAFra le molecole di shRNA non codificate dal genoma nucleare ci sono gli intermedi di replicazione di genomi virali a RNA, o trascritti ad elica singola che contengono inverted repeats e perciò possono ripiegarsi a forcina

I complessi siRISC riconoscono regioni complementari negli RNA da cui sono derivati, e portano alla loro inattivazione: sono conservati perché proteggono dall’infezione virale

In sintesi

GENE 5’ UTR 3’ UTR SITI REGOLATORI

mRNA 3’ UTR 5’ UTR AAAAA

Ci vogliono più fattori per iniziare la trascrizione di ogni gene

Ci vogliono più miRNA per silenziare ciascun mRNA

RNA interference: un filmhttp://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

Controllo dell’espressione genica attraverso meccanismi che regolano il catabolismo di RNA e proteine

La degradazione degli mRNA può avvenire tramite meccanismi dipendenti dall’adenilazione, cioè digerendo la coda di poliA fino a renderla non funzionale. Segue la rimozione del cap, dopo di che l’mRNA viene degradato a partire dall’estremità 5’.

La degradazione degli mRNA può avvenire anche tramite meccanismi indipendenti dall’adenilazione, al momento non ben compresi.

Sintesi 18

1. Negli Eucarioti l’espressione genica può essere controllata a molti livelli2. Nella regolazione della trascrizione intervengono sequenze regolatrici a

monte del gene (promotori, enhancers, silencers) e molecole diffusibili (fattori di trascrizione, attivatori, coattivatori, repressori, corepressori)

3. Queste molecole sono proteine che stabiliscono contatti col DNA grazie a domini funzionali del tipo helix-turn-helix, zinc finger e leucine zipper

4. In organismi complessi, molti geni sono disattivati tramite metilazione della citosina e altri fenomeni epigenetici

5. Esistono varie forme di controllo post-trascrizionale, di cui il principale richiede l’intervento di microRNA e siRNA: RNA interference

6. L’RNA interference causa un silenziamento post-trascrizionale dei geni, attraverso un’accelerata degradazione dei loro messaggeri

7. Ci sono infine meccanismi che regolano il catabolismo di RNA e proteine, agendo sulla loro velocità di degradazione

Looking for speech genes

Bishop (2002)

In the portions of the genome that differ between chimpanzee and human, can we find a gene or genes that are crucial for language?

Speech genes?

Famiglia KE con una grave forma di dislessia(incapacità di sviluppare un discorso articolato)

Mutazione nel gene FOXP2

Risonanza magnetica in membri della famiglia KE

Sequenza della proteina nei Primati e nel topo

Albero evolutivo di FOXP2

Abbiamo trovato il gene per il linguaggio?

Gene expression comparisons

Looking for speech genes:gene expression comparisons

Enard et al. (2002)

We have largely the same genes as chimpanzees, and these genes do the same things in much of our bodies, but not in the brain (Enard et al. 2002)

Species-specific gene expression patterns: Large changes in gene expression in the human brain.

We have largely the same genes as chimpanzees, and these genes do the same things in much of our bodies, but not in the testis (Khaitovich et al. 2005)

Species-specific gene expression patterns: Small changes in gene expression in the human brain.