Capitolo 4

La funzione del gene

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

http://web.unife.it/progetti/genetica/Guido/index.php?lng=it&p=4

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• Se i geni stanno sul DNA, qual è la loro relazione con le proteine?• In che modo i geni controllano le vie biochimiche?• Che rapporto c’è fra geni e malattie?• Tutto il DNA è costituito da geni? E, se non lo è, cosa fa il resto?

Domande 4

Fare le proteine non

è uno scherzo

Nelle proteine si trovano 20

amminoacidi diversi

Le proteine hanno:

1. Una struttura primaria, data dalla successione degli amminoacidi nel peptide

2. Una struttura secondaria, cioè un andamento regolare in alcuni tratti, dovuto al ripetersi periodico di amminoacidi con caratteristiche costanti. Es.: -elica, foglietto

3. Una struttura terziaria, tridimensionale, dovuta alle interazioni fra amminoacidi, e fra amminoacidi e ambiente

4. (non sempre) una struttura quaternaria, quando diversi peptidi si uniscono a formare una proteina complessa, multimerica

Che rapporti fra proteine e geni?

Analisi biochimica delle malattie metaboliche: alcaptonuria

Fenotipo: urina scura

Figura 4.2

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Ciclo vitale del fungo Neurospora crassa

Genetica biochimicaBeadle e Tatum: un gene – un enzima

Colture di Neurospora

Terreno minimo: Sali inorganici, una fonte di C (glucosio o saccarosio), una fonte di N, biotina

Terreno completo: terreno minimo + tutti gli amminoacidi, tutti i nucleotidi e vitamine

Individui prototrofi e auxotrofi (o mutanti nutrizionali)

Isolamento di mutanti

nutrizionali

Esperimenti di Beadle e Tatum

Mutanti di Neurospora auxotrofi per l’arginina, o arg-

Ceppi diversi portano la mutazione in tre diverse regioni del genoma: arg-1, arg-2 e arg-3

Mutanti arg-3 crescono solo se al terreno minimo si aggiunge arginina; mutanti arg-2 se vengono aggiunte arginina o citrullina; mutanti arg-1 se vengono aggiunte arginina o citrullina o ornitina

Esperimenti di Beadle e Tatum: un gene – un enzima

Conclusioni: arg-1, arg-2 e arg-3 codificano per tre enzimi che intervengono in successione nella conversione di un precursore in ornitina, di questa in citrullina, e di questa in arginina

arg-1 arg-2 arg-3

enzima 1 enzima 2 enzima 3

precursore ornitina citrullina arginina

Beadle e Tatum deducono le catene di rezioni biochimiche (e l’ordine di azione dei geni) dalle molecole che si accumulano nei mutanti

Figura 4.4

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Ceppi Terreno minimo + acetilomoserina

+ cistationina + omocisteina + metionina

selvatico + + + + +met-5 - + + + +met-3 - - + + +met-2 - - + + +met-8 - - - - +

Crescita di ceppi selvatici e mutanti auxotrofi per metionina

Sequenza proteica: determinabile con il metodo di Sanger

1. Si purifica la proteina, cioè la si separa da impurità e da altre specie chimiche;

2. La si degrada per mezzo di enzimi proteolitici, ognuno dei quali agisce solo se c’è uno specifico amminoacido all’estremità carbossi-terminale.

Sequenza nucleotidica: determinabile con il metodo di Sanger

1. Si isola un tratto di DNA;

2. Lo si replica in 4 esperimenti paralleli, ognuno dei quali si basa su un nucleotide modificato all’estremità 3’.

Sequenza nucleotidica: determinabile con il metodo di Sanger

Yanofsky: Colinearitàgene TrpA di Escherichia coli

GLU TYR LEU THR

VAL TYR LEU THR

GLU CYS LEU THR

GLU TYR ARG THR

GLU TYR LEU ILE

Diversi mutanti (1-4) non sintetizzano triptofano perché l’enzima necessario (TrpA) è modificato. La posizione dell’amminoacido alterato nei mutanti può essere determinata per sequenziamento peptidico

1

2

3

4

wt

Yanofsky: Colinearitàgene TrpA di Escherichia coli

GLU TYR LEU THR

MET TYR LEU THR

GLU CYS LEU THR

GLU TYR ARG THR

GLU TYR LEU ILE

1

2

3

4

wt

Corrispondenza fra le posizioni di mutazione nucleotidica e sostituzione amminoacidica

CCT ATG GAA TGT

CTT ACG GCA TAT

Welcome to OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man. This database is a catalog of human genes and genetic disorders authored and edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins and elsewhere, and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for Biotechnology Information. The database contains textual information and references. It also contains copious links to MEDLINE and sequence records in the Entrez system, and links to additional related resources at NCBI and elsewhere.

http://www.omim.org

Figura 4.5

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Malattie genetiche 1: sindrome di Tay-Sachs

Figura 4.6

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Figura 4.7

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Malattie genetiche 2: Variabilità delle emoglobine umane

Figura 4.9

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Figura 4.8

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Figura 4.10

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Figura 4.11

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Malattie genetiche 3: fibrosi cistica

Frequenza in Europa: 1/2000 nati

Figura 4.12

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Regolatore del trasporto transmembrana, CFTR

Malattie genetiche 4: Intolleranza al lattosio

(from Jobling et al, 2004)

FOETUS

Low expression

INFANT

High expression

ADULT

High expression

“lactase persistence”

ADULT

Low expression

“lactase non-persistence”

Diagrammatic representation of the level of lactose expression at different stages of development and in lactase persistent and

non-persistent adults

•Carenza di lattasi (LPH): un allele recessivo causa l’impossibilità di digerire il lattosio•Ipotesi: persistenza della lattasi frutto di selezione positiva legata al consumo di prodotti caseari

Frequenza dell’allele per la persistenza della lattasi

Lactase non-persistent allele l

High transcription

Unknown DNA binding protein

Meccanismo

Troelsen, 2005

lactmcm6

+T

Low transcription

lactmcm6C

Lactase persistent allele L

Figura 4.13

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Diagnosi prenatale: amniocentesi

Figura 4.14

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Diagnosi prenatale: analisi dei villi coriali

Tutto il DNA fa proteine?

NO:Nell’uomo, 3 miliardi di bp; 30 000 geniDimensioni medie di un gene 10 000 bpTotale geni umani 300 milioni di bp 10% del genoma

Non tutto il DNA fa proteine

E il resto?1.DNA ripetuto in varie regioni del genoma: 1.1. SINEs (Short Interspersed sequences), 1.2. LINEs (Long Interspersed sequences) 2.DNA ripetuto in tandem--GTTCCACACACACACACACACACACACACACATTA—

DNA spazzatura (junk DNA)?

DNA fingerprinting

Alec Jeffreys et al.: Hypervariable minisatellite

regions in human DNA, Nature, 314:67-73, 1985.

DNA fingerprinting: un caso di paternità

Cosa fa il DNA non codificante?

• Niente, ma male non fa

• Funzioni non chiarite nell’espressione dei geni

• Mantiene il volume cellulare

• Fa male, ma la domanda è mal posta.

Enattah et al. Nature Genetics 30:233-237 (2002)

Lattosio glucosio + galattosioLPH

Analisi del gene LCT (2q21) : nessuna variabilità associata all’intolleranza

Riassunto 04•Beadle e Tatum dimostrano in Neurospora che c’è una corrispondenza diretta un gene – un enzima• Yanofsky dimostra in E. coli la colinearità fra sequenza di nucleotidi e sequenza polipeptidica• Alterazioni della sequenza genica si riflettono in alterazioni della sequenza proteica: malattie del metabolismo•Nei vertebrati, meno del 10% del genoma codifica per proteine; il dibattito su ruolo e funzione del restante 90% è aperto•Varie regioni del DNA non codificante contengono comunque informazione importante per studi di identificazione personale (impronta digitale genetica)