Gene Funzione Fenotipo??? mutante T-DNA REVERSE PCR-screening.
04 funzione del gene
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Capitolo 4
La funzione del gene
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
http://web.unife.it/progetti/genetica/Guido/index.php?lng=it&p=4
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
• Se i geni stanno sul DNA, qual è la loro relazione con le proteine?• In che modo i geni controllano le vie biochimiche?• Che rapporto c’è fra geni e malattie?• Tutto il DNA è costituito da geni? E, se non lo è, cosa fa il resto?
Domande 4
Fare le proteine non
è uno scherzo
Nelle proteine si trovano 20
amminoacidi diversi
Le proteine hanno:
1. Una struttura primaria, data dalla successione degli amminoacidi nel peptide
2. Una struttura secondaria, cioè un andamento regolare in alcuni tratti, dovuto al ripetersi periodico di amminoacidi con caratteristiche costanti. Es.: -elica, foglietto
3. Una struttura terziaria, tridimensionale, dovuta alle interazioni fra amminoacidi, e fra amminoacidi e ambiente
4. (non sempre) una struttura quaternaria, quando diversi peptidi si uniscono a formare una proteina complessa, multimerica
Che rapporti fra proteine e geni?
Analisi biochimica delle malattie metaboliche: alcaptonuria
Fenotipo: urina scura
Figura 4.2
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Ciclo vitale del fungo Neurospora crassa
Genetica biochimicaBeadle e Tatum: un gene – un enzima
Colture di Neurospora
Terreno minimo: Sali inorganici, una fonte di C (glucosio o saccarosio), una fonte di N, biotina
Terreno completo: terreno minimo + tutti gli amminoacidi, tutti i nucleotidi e vitamine
Individui prototrofi e auxotrofi (o mutanti nutrizionali)
Isolamento di mutanti
nutrizionali
Esperimenti di Beadle e Tatum
Mutanti di Neurospora auxotrofi per l’arginina, o arg-
Ceppi diversi portano la mutazione in tre diverse regioni del genoma: arg-1, arg-2 e arg-3
Mutanti arg-3 crescono solo se al terreno minimo si aggiunge arginina; mutanti arg-2 se vengono aggiunte arginina o citrullina; mutanti arg-1 se vengono aggiunte arginina o citrullina o ornitina
Esperimenti di Beadle e Tatum: un gene – un enzima
Conclusioni: arg-1, arg-2 e arg-3 codificano per tre enzimi che intervengono in successione nella conversione di un precursore in ornitina, di questa in citrullina, e di questa in arginina
arg-1 arg-2 arg-3
enzima 1 enzima 2 enzima 3
precursore ornitina citrullina arginina
Beadle e Tatum deducono le catene di rezioni biochimiche (e l’ordine di azione dei geni) dalle molecole che si accumulano nei mutanti
Figura 4.4
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Ceppi Terreno minimo + acetilomoserina
+ cistationina + omocisteina + metionina
selvatico + + + + +met-5 - + + + +met-3 - - + + +met-2 - - + + +met-8 - - - - +
Crescita di ceppi selvatici e mutanti auxotrofi per metionina
Sequenza proteica: determinabile con il metodo di Sanger
1. Si purifica la proteina, cioè la si separa da impurità e da altre specie chimiche;
2. La si degrada per mezzo di enzimi proteolitici, ognuno dei quali agisce solo se c’è uno specifico amminoacido all’estremità carbossi-terminale.
Sequenza nucleotidica: determinabile con il metodo di Sanger
1. Si isola un tratto di DNA;
2. Lo si replica in 4 esperimenti paralleli, ognuno dei quali si basa su un nucleotide modificato all’estremità 3’.
Sequenza nucleotidica: determinabile con il metodo di Sanger
Yanofsky: Colinearitàgene TrpA di Escherichia coli
GLU TYR LEU THR
VAL TYR LEU THR
GLU CYS LEU THR
GLU TYR ARG THR
GLU TYR LEU ILE
Diversi mutanti (1-4) non sintetizzano triptofano perché l’enzima necessario (TrpA) è modificato. La posizione dell’amminoacido alterato nei mutanti può essere determinata per sequenziamento peptidico
1
2
3
4
wt
Yanofsky: Colinearitàgene TrpA di Escherichia coli
GLU TYR LEU THR
MET TYR LEU THR
GLU CYS LEU THR
GLU TYR ARG THR
GLU TYR LEU ILE
1
2
3
4
wt
Corrispondenza fra le posizioni di mutazione nucleotidica e sostituzione amminoacidica
CCT ATG GAA TGT
CTT ACG GCA TAT
Welcome to OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man. This database is a catalog of human genes and genetic disorders authored and edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins and elsewhere, and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for Biotechnology Information. The database contains textual information and references. It also contains copious links to MEDLINE and sequence records in the Entrez system, and links to additional related resources at NCBI and elsewhere.
http://www.omim.org
Figura 4.5
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Malattie genetiche 1: sindrome di Tay-Sachs
Figura 4.6
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Figura 4.7
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Malattie genetiche 2: Variabilità delle emoglobine umane
Figura 4.9
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Figura 4.8
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Figura 4.10
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Figura 4.11
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Malattie genetiche 3: fibrosi cistica
Frequenza in Europa: 1/2000 nati
Figura 4.12
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Regolatore del trasporto transmembrana, CFTR
Malattie genetiche 4: Intolleranza al lattosio
(from Jobling et al, 2004)
FOETUS
Low expression
INFANT
High expression
ADULT
High expression
“lactase persistence”
ADULT
Low expression
“lactase non-persistence”
Diagrammatic representation of the level of lactose expression at different stages of development and in lactase persistent and
non-persistent adults
•Carenza di lattasi (LPH): un allele recessivo causa l’impossibilità di digerire il lattosio•Ipotesi: persistenza della lattasi frutto di selezione positiva legata al consumo di prodotti caseari
Frequenza dell’allele per la persistenza della lattasi
Lactase non-persistent allele l
High transcription
Unknown DNA binding protein
Meccanismo
Troelsen, 2005
lactmcm6
+T
Low transcription
lactmcm6C
Lactase persistent allele L
Figura 4.13
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Diagnosi prenatale: amniocentesi
Figura 4.14
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Diagnosi prenatale: analisi dei villi coriali
Tutto il DNA fa proteine?
NO:Nell’uomo, 3 miliardi di bp; 30 000 geniDimensioni medie di un gene 10 000 bpTotale geni umani 300 milioni di bp 10% del genoma
Non tutto il DNA fa proteine
E il resto?1.DNA ripetuto in varie regioni del genoma: 1.1. SINEs (Short Interspersed sequences), 1.2. LINEs (Long Interspersed sequences) 2.DNA ripetuto in tandem--GTTCCACACACACACACACACACACACACACATTA—
DNA spazzatura (junk DNA)?
DNA fingerprinting
Alec Jeffreys et al.: Hypervariable minisatellite
regions in human DNA, Nature, 314:67-73, 1985.
DNA fingerprinting: un caso di paternità
Cosa fa il DNA non codificante?
• Niente, ma male non fa
• Funzioni non chiarite nell’espressione dei geni
• Mantiene il volume cellulare
• Fa male, ma la domanda è mal posta.
Enattah et al. Nature Genetics 30:233-237 (2002)
Lattosio glucosio + galattosioLPH
Analisi del gene LCT (2q21) : nessuna variabilità associata all’intolleranza
Riassunto 04•Beadle e Tatum dimostrano in Neurospora che c’è una corrispondenza diretta un gene – un enzima• Yanofsky dimostra in E. coli la colinearità fra sequenza di nucleotidi e sequenza polipeptidica• Alterazioni della sequenza genica si riflettono in alterazioni della sequenza proteica: malattie del metabolismo•Nei vertebrati, meno del 10% del genoma codifica per proteine; il dibattito su ruolo e funzione del restante 90% è aperto•Varie regioni del DNA non codificante contengono comunque informazione importante per studi di identificazione personale (impronta digitale genetica)