Proteine per la biosensoristica
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
BIOSENSORIMETODOLOGIE BIOCHIMICHE
PROTEINE
Visione di insieme dal DNA alle proteine
Struttura
Funzione biologica- strutturale
- trasporto- energeticaenzimatica
Anticorpi - Antigeni
Proteine gt Outline
Trascrizione
DNA
DeossiribosioNucleotidi (AGCT)Doppio filamento
RNA
RibosioNucleotidi (AGCU)
Singolo filamento
Trascrizione
DNA RNA
messaggero (mRNA)transfer (tRNA)ribosomale (rRNA)small interference (siRNA)micro (miRNA) hellip
RNA Polimerasi
Traduzione (1)
RNA messaggero (mRNA) gt SPLICING
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
BIOSENSORIMETODOLOGIE BIOCHIMICHE
PROTEINE
Visione di insieme dal DNA alle proteine
Struttura
Funzione biologica- strutturale
- trasporto- energeticaenzimatica
Anticorpi - Antigeni
Proteine gt Outline
Trascrizione
DNA
DeossiribosioNucleotidi (AGCT)Doppio filamento
RNA
RibosioNucleotidi (AGCU)
Singolo filamento
Trascrizione
DNA RNA
messaggero (mRNA)transfer (tRNA)ribosomale (rRNA)small interference (siRNA)micro (miRNA) hellip
RNA Polimerasi
Traduzione (1)
RNA messaggero (mRNA) gt SPLICING
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Visione di insieme dal DNA alle proteine
Struttura
Funzione biologica- strutturale
- trasporto- energeticaenzimatica
Anticorpi - Antigeni
Proteine gt Outline
Trascrizione
DNA
DeossiribosioNucleotidi (AGCT)Doppio filamento
RNA
RibosioNucleotidi (AGCU)
Singolo filamento
Trascrizione
DNA RNA
messaggero (mRNA)transfer (tRNA)ribosomale (rRNA)small interference (siRNA)micro (miRNA) hellip
RNA Polimerasi
Traduzione (1)
RNA messaggero (mRNA) gt SPLICING
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Trascrizione
DNA
DeossiribosioNucleotidi (AGCT)Doppio filamento
RNA
RibosioNucleotidi (AGCU)
Singolo filamento
Trascrizione
DNA RNA
messaggero (mRNA)transfer (tRNA)ribosomale (rRNA)small interference (siRNA)micro (miRNA) hellip
RNA Polimerasi
Traduzione (1)
RNA messaggero (mRNA) gt SPLICING
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Trascrizione
DNA RNA
messaggero (mRNA)transfer (tRNA)ribosomale (rRNA)small interference (siRNA)micro (miRNA) hellip
RNA Polimerasi
Traduzione (1)
RNA messaggero (mRNA) gt SPLICING
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (1)
RNA messaggero (mRNA) gt SPLICING
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (2)
RNA messaggero (mRNA) gt dalle triplette agli AMINOACIDI
CODICE GENETICO degenere
bull Ogni tripletta (codone) determina un unico AAbull Griglia di letturabull 4 nucleotidi gt 43 possibili combinazionibull In natura esistono 20 aminoacidi
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (3)
RNA transfer (tRNA)
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (4)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (5)
RIBOSOMI e RNA ribosomale (rRNA)
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (6)
AMINOACIDI
Sostanze organiche bifunzionali costituite cioegrave dalla funzione amminica (-NH2) e dalla funzione carbossilica (-COOH)
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFILICI
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (7)
AMINOACIDI IDROFOBICI
AMINOACIDI SPECIALI
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (8)
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione (6)
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Traduzione
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Struttura (1)
STRUTTURA SECONDARIAConformazione spaziale delle catene
Foglietti BetaAlfa Eliche
STRUTTURA PRIMARIASequenza lineare dei residui aminoacidici
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Struttura (2)
STRUTTURA TERZIARIA
Conformazione tridimensionale assunta dallrsquointerasequenza di residui aminoacidici Lrsquoambiente e la natura della struttura primaria (composizione aminoacidica) influenzano il ripiegamento delle proteine
Tipi di Legami intramolecolare
bull Legami ad Idrogenobull Ponti Disolfuro
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Struttura (2)
STRUTTURA QUATERNARIA
Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo lrsquoassociazione di due o piursquo unitarsquo polipeptidiche unite tra loro da legami deboli
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Struttura (3)
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Struttura (3)
ARCHITETTURA DELLE PROTEINE
In base alla forma si possono classificare le proteine in due grandi classi
1) Proteine fibrose bull strutture lineari semplici e regolaribull insolubili in acqua o in soluzioni saline diluite
2) Proteine globulari bull forma approssimativamente sfericabull molto solubile in acqua
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Proprietarsquo (1)
Le proprietagrave delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti gli amminoacidi sono elettroliti anfoteri possono essere sottoposte ad elettroforesi sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze donda della luce incidente)
Il punto isoelettrico o PI di una proteina egrave rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione Tra le tante quella che fornisce i risultati piugrave precisi egrave senza dubbio la spettrometria di massa
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Funzione (1)
Di fondamentale importanza per tutti gli essere viventi le proteine svolgono numesore funzioni
bull Strutturale
bull Immunitaria
bull Trasporto (di ossigeno metalli lipidi di membrana)
bull Energetica - Enzimatica
bull Identificazione dellidentitagrave genetica ormonale enzimatica contrattile
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Funzione (2)
STRUTTURALE
Forniscono supporto meccanico e baseper i movimenti a cellule e tessuti
Esempibull collagenebull elastinabull actinabull tubulinabull cheratina
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Funzione (3)
TRASPORTO
Generano movimenti nelle cellule e nei tessutiPossono trasportare singole molecole (ossigeno anidride carbonica) o vescicole contenenti diverse molecole
Esempibull miosinabull chinesinabull dineina
Le proteine motrici si muovono su ldquorotaierdquo formate da proteine strutturali
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Funzione (4)
ENERGETICA ndash ENZIMATICA
bull Gli enzimi sono i catalizzatori biologicibull Permettono di fare avvenire le reazioni chimiche nei sistemi biologicibull Sono in grado di fare avvenire le reazioni velocemente ebull Hanno un alta efficienzabull Sono specifici per pochissimi tipi di molecole (substrati)
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Funzione (5)
La velocitagrave di una reazione
chimica egrave indipendente
dal DG ma egrave determinata
dallrsquoampiezza della barriera
dellrsquoenergia di attivazione
I catalizzatori aumentano la
velocitagrave di reazione
abbassando questa barriera
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Funzione (6)
Nel sito attivo i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Anticorpi (1)
CATENA LEGGERAFrammento Fab
(antibody binding)
CATENA PESANTEFrammento Fc(crystallizable)
Regione Cerniera
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Anticorpi (2)
bull Quando sono introdotti in un ospite estraneogli antigeni inducono la formazione di anticorpi
bull Interazione antigeni-anticorpi Gli anticorpi egli antigeni in soluzione mostrano un comportamento di affinitagrave e legamento (concetto della chiave e della serratura)
bull Il legamento tra anticorpi e antigeni porta allaeliminazione dellimmunogeno
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Nella cellula
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi immunologici- definizione- potenzialitarsquo e limitazioni- saggi competitivi- saggi NON competitivi- saggi omogenei vs eterogenei
Saggi RadioImmunologici
ImmunoFluorescenza
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)- EMIT- CEDIA- ELISA
Metodologie biochimiche gt Outline
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (1)
I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpiantigeni che producono un segnale misurabile che puograve essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione1048708
1048708 Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (2)
POTENZIALITArsquo
bull Applicazione in tutte le aree del laboratorio
bull Estrema specificitarsquo del riconoscimento biologico
bull Buona sensibilitagrave larga gamma di prove
bull Facilmente automatizzato con applicazioni su molte piattaforme di strumentibull In molti casi non cegrave bisogno di preparazione del campione
bull Efficiente
bull Economico
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (3)
LIMITI
bull1048708 A seconda del reagente potrebbe avere un intervallo dinamico limitato
bull1048708 Reazione crociata e specificitagrave
bull1048708 Interferenze da composti nonstrutturalmente relazionati
bull1048708 Interpretazione ed elaborazione dei risultati
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (4)
SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI
Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantitagrave limitata dianticorpi
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (5)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Nei metodi non competitivi la mistura direazione comprende un eccesso di anticorpimarcati in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legatiLa quantitagrave di complesso antigeni-anticorpi egravequindi misurato per determinare la quantitagrave difarmaco presente nel campione
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (6)
SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immunologici (7)
SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI
Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggiimmunologici eterogenei richiedono laseparazione dei componenti legati e nonlegati (pe ELISA)
Nei saggi immunologici omogenei la reazionelegante egrave misurata sul posto senza laseparazione dei componenti della reazione
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi RadioImmunologici (RIA) (1)
RIA usa un marcatoreradioattivo (normalmente
125I 3H o 14C) cheemette radiazioni che
possono essere misurateda un contatore gamma
o beta1048708
Negli anni passati latendenza egrave stata di
allontanarsi dal RIA emuoversi verso tecniche
non isotopiche
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
ImmunoFluorescenza (1)
Lrsquoimmunofluorescenza egrave una delle tecniche piugrave usate tra le reazioni sierologiche di fondamentale importanza in microbiologia per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) egrave variamente legata ad un marcatore
Il marcatore egrave un fluorocromo ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile
Il fluorocromo piugrave impiegato egrave lrsquoisotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti dunque con lrsquoausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta emette luce verde
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
ImmunoFluorescenza (2)
ImmunoFluorescenza DIRETTA
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
ImmunoFluorescenza (3)
ImmunoFluorescenza NON DIRETTA
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (EIA)
Per fornire un segnale misurabile i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) egalattosidasi-B
Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento formazione di substrato colorato hellip
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (1)
Lrsquoanalita nel campioneed lrsquoanalita marcatocon G6PD competonoper siti peptidilici dello specifico anticorpo
Il legame inibiscelattivitagrave dellenzimamentre enzimi liberirestano liberi diinteragire con ilsubstrato
SAGGI EMIT
Lattivitagraveassorbimentodellenzima egrave direttamenteproporzionale allaconcentrazione di farmaco
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (2)
SAGGI CEDIA
Frammenti di enzimadellenzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio siriuniscono spontaneamente in soluzione per formareun enzima attivo
Il farmaco del campionecompete per sitipeptidilici di anticorpi
La concentrazione del farmaco egrave direttamenteproporzionale allattivitagrave dellenzima
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (3)
SAGGI ELISA
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato Antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne egrave probabilmente affetto
Trova ampio uso anche per misurare la concentrazione di Anticorpi nel plasma snaguigno come ad esempio nei test per HIV
Varianti del test ELISA
bull ELISA COMPETITIVObull ELISA NON COMPETITIVO
- metodo diretto (DAS-ELISA)- metodo indiretto
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO DIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (4)
ELISA NON COMPETITIVO INDIRETTO
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Saggi Immuno Enzimatici (5)
ELISA COMPETITIVO
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - definizione- settori di applicazione- elementi sensibili- principi di trasduzione
Esempi di Biosensori
Funzionalizzazione di superficie
Caso di studio Biosensori a base MicroCantilever
Biosensori gt Outline
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - DEFINIZIONE
Definizione IUPAC un biosensore egrave un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive o tessuti o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi linformazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi in un segnale utile analiticamente Linterazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) egrave alla base del corretto funzionamento di un biosensore
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - DEFINIZIONE
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori
Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)
bull unrsquoalta selettivitagrave frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale basata sul riconoscimento di forma specifica
bull unrsquoalta sensibilitagrave fino alle parti per miliardo (ppb)
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori
Svantaggi
bull Perdita delle funzionalitagrave nel tempo
bull Il tessuto biologico egrave fortemente influenzato dalla temperaturae dal pH (forza ionica parti acidebasiche)
bull La forza ionica modifica il sito recettore
bull Il tempo di vita del sensore egrave breve
bull Il tempo di risposta egrave determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash ELEMENTI BIO-SENSIBILI
Vi sono due classidi processi bioricognitivi che si differenziano per il
metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore
bullRiconoscimento bioaffine il trasduttore percepisce il legame fra
recettore e ligando per dimensione forma
(es reazioni anticorpo-antigene)
bullRiconoscimento biometabolico il trasduttore percepisce le alterazioni
chimiche dovute alla reazione come cambi della concentrazione dei prodotti e
dei reagenti o come calore specifico di reazione (es reazioni enzima-
substrato)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Acusticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Spettrobull Velocitagrave dellrsquoonda
Biologicibull Biomassa (tipo concentrazione)
Chimicibull Componenti concentrazione
Magneticibull Ampiezza e fase campo magnbull Conducibilitagravebull Permittivitagrave
Otticibull Ampiezza e fase di unrsquoondabull Velocitagrave dellrsquoondabull Indice di rifrazionebull Emissivitagrave riflettivitagrave
Meccanicibull Posizione (lineare angolare)bull Accelerazionebull Forzabull Sforzotensione (Stress) pressionebull Deformazione (Strain)bull Massa densitagravebull Momento torsionebull Velocitagrave di flusso rate di massabull Forma ruvidezzabull Rigiditagrave cedevolezzabull Viscositagravebull Cristallinitagrave struttura
Radiazionebull Tipobull Energiabull Intensitagrave
Termicibull Temperaturabull Flussobull Calore specificobull Conducibilitagrave termica
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - APPLICAZIONI
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE
MicrobiologyNanotechnology
Microelectronic processing
Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
Pu
bb
lica
zio
ni (
)
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
DIAGNOSTICA BIOMEDICA
1048708 Doctors increasingly rely on testing1048708 Needs rapid cheap and ldquolow techrdquo1048708 Done by technicians or patients1048708 Some needs for in-vivo operation with feedback
Glucose-based on glucose oxidaseCholesterol - based on cholesterol oxidaseAntigen-antibody sensors - toxic substances pathogenic bacteriaSmall molecules and ions in living things H+ K+ Na+ NO CO2 H2O2DNA hybridization sequencing mutants and damage
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
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res dB
fQ
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k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
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mwwD
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2m
m
c
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Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash CARATTERISTICHE
1 LINEARITArsquo Maximum linear value of the sensorcalibration curve Linearity of the sensor must be high for the detection of high substrate concentration
2 SENSIBILITArsquo The value of the electrode response per substrate concentration
3 SELETTIVITArsquo Interference of chemicals must beminimised for obtaining the correct result
4 TEMPO DI RISPOSTA The necessary time for having 95 of the response
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
2) Intrappolamento tramite matrice
La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel) Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore per via dellrsquointerazione con la matrice ed un tempo di vita utile di 34 settimane
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
3) Intrappolamento per adsorbimento
Si basa sullrsquointerazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals legami idrogeno e legami ionici Essendo queste interazioni deboli egrave difficile quantificare la risposta e il tempo di vita utile egrave di solo un giorno Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura del pH e della concentrazione ionica
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE
4) Intrappolamento mediante legami covalenti
Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile314 mesi) Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalitagrave
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash PRINCIPI DI RILEVAMENTO
Rilevamento - esempi
Otticobull Surface Plasmon Resonance (SPR)
Elettrochimicobull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Meccanicobull Misura frequenza eo stress superficiale (MC)
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori ndash SPR
Surface Plasmon Resonance (SPR)
PrincipioPrincipio
Alla base vi ersquo il Alla base vi ersquo il riconoscimento specifico tra riconoscimento specifico tra due macromolecole (es Ab-due macromolecole (es Ab-
Ag) Ag) Il legame tra le due molecole Il legame tra le due molecole
provoca un cambiamento provoca un cambiamento dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzo su cui ersquo legato mezzo su cui ersquo legato lrsquoelemento sensibilelrsquoelemento sensibile
Questo cambiamento ersquo Questo cambiamento ersquo valutabile dalla variazione valutabile dalla variazione dellrsquoindice di rifrazione del dellrsquoindice di rifrazione del
mezzomezzo
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori
Elettrochimico
BIOSENSING Basato sullrsquouso di enzimi specifici per lrsquoanalita
di interesse
TRASDUTTOREbull Sensori Potenziometricibull Sensori Amperometricibull Sensori Impedimetrici
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori
Elettrochimico
substrato prodotti
ENZIMI
Voltaggio Misura della correntegt proporzionale alla concentrazione del substrato
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori
Biosensori Elettrochimici per quantificazione Glucosio
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Detection of Angiogenic Growth Factor by
Microcantilever Biosensors
Riccardo CastagnaLATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Italy
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biosensori - Cantilever
bull Modello biologico - target analyte
bull Trasduttore - teoria
bull Experimental set up
bull Misure preliminari (sensibilitarsquo e selettivitarsquo)
bull Ripetibilitarsquo
bull Versatilitarsquo
bull Implementazioni
OBIETTIVOPRESUPPOSTI
PROOF OF PRINCIPLE
ldquoREAL STRATEGYrdquo
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biological Background
Angiogenesis is defined as the formation of new blood vessels by sprouting of endothelial cells (ECs) from pre-existing vessels or by intravascular subdivision coordinated by several classes of growth factors acting through cognate tyrosine kinase receptors Angiogenesis is a critical component of several human diseases including cancer diabetic microvascular and rheumatic diseases psoriasis hemangioblastoma and ischemia (Folkman Nat Rev Drug Discov 2007)
Spannuth WA et al (2008) Angiogenesis as a strategic target for ovarian cancer therapy Nat Clin Pract Oncol
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Biological Background
Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) Among these vascular endothelial (VEGF-A165) and angiopoietin-1 (ANG-1) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation survival proliferation and migration of EC
Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system
In the same cell type the same receptor induces different responces To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor
The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques So there is a demand of quantitative data
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
MC beam dynamics in vacuum
To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq of motion
2 4
2 4
( ) ( ) ( )ext
v x t v x t v x tA c EI F
t t xr para para para
+ + =para para para
Mass adsorption effect
n
n
k
mw =
Q factor
aring=i itot QQ
11Different contributionsQi ambient TED clamping internal friction surface etchellip
22
11
n
ndn
Q-=ww
3
res
res dB
fQ
f -
=D
k constantand ldquosmallrdquo dm
wwpara
-=para
2m
mwwD
-D
2m
m
c
mQ nnw=
Dmmin mnQ
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Experimental set-up
bullTemperature stability 005 degCbull Min pressure 1E-05 Torrbull Piezo-electrical actuationbull Optical lever read-out PSD lock-in bull The measurement is controlled in a Labviewreg environment
Reproducibility and repeatability in vacuum lt 02Hz (1st mode)
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Experimental procedure
bull Thermal oxidation
bull Silanization (APTES)
bull Glutaraldehyde
bull Protein AG
bull AntibodyReceptor
bull Antigen (ANG 1)
SURFACE FUNCTIONALIZATION
SENSINGPROTEIN BINDING
TARGET ANALYTE
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Surface Activation
Condensation T=60degC 1 vv in anhydrous
toluene t=7rsquo
Dry 1100degC t = 3 h thickness 190 nm then dipping in
ldquopiranhardquo solution to obtain OH groups on the surface
Stabilization of the imine (Shiffrsquos base) formed through sodium
cyanoborohydride buffer (NaBH3CN) RT t = 45rsquo
Sithermal
oxidation
SiSiO2Si
silanization
(APTES) (CH2)3NH2 +
NaBH3CN
Si (CH2)3N=CH-(CH2)3-CHO Si (CH2)3NH-CH2-(CH2)3-CHO
Glutaraldehyde (1 vv pH = 85 RT t=15rsquo)
OCH-(CH2)3-CHO
Reduced specie
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Protein binding
Antibody (Ab)Antigen (Ag)
+ CHO(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
Protein A or G
NH2
+NH - - CHO- CH2- (CH2)3 -
bull 30rsquo in pure PBS RT
bull Incubation with 5 μg of PtA diluted in 500 μl of PBS (2h RT)
bull Rinsing in pure BPS (t=30rsquo RT) and DI water (15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 50 μg of Ab diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (t=30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
bull Incubation with 500 ng of Ag diluted in 250 μl of PBS (t=1 h RT)
bull Rinsing in pure PBS (30rsquo RT) and DI water (t=15rsquo RT) to remove salts
Pt G
Pt G Pt G
ANG1
ANG1
(CH2)3NH - - CH=N- CH2 - -
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
ldquoProof of conceptrdquo and ldquorealrdquo strategies
ldquoReal systemrdquo
Probe Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody)
Target Ang-1 (56 kDa)
An approach to be used for different AbAg
ldquoProofrdquo system
ProbeTie2-Fc (165 kDa) (fusion protein)Target angiopoietin human protein (56 kDa)
Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Ligand mass as low as some tens of picograms were detected
Using different cantilever geometries and operation modes it is possible to detect different quantity of adsorbed masses always keeping a similar surface density of the species Thus a good reproducibility of all experimental steps is
achieved
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (1)
M1 600x100x2 μm3
Frequency shift for each experimental step
wwD
-D
2m
m
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation
In order to test the system specificity cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule
only non-specific binding can be present in such experiment
M1 800x100x2 μm3
ldquoProof of conceptrdquo experimental results (2)
Buffer effect
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Frequency shift for each experimental stepM1 670x70x19 μm3 M2 670x70x19 μm3
Anti-ANG-1 Surf Density 2x1012 moleculescm2
ANG-1 Surf Density 14x1012 moleculescm2
[Gupta et al PNAS 2006 12x1012 moleccm2 ]
m1 m2 15
ldquoReal strategyrdquo experimental results (1)
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
ldquoReal strategyrdquo experimental results (2)
Selectivity testsVEGF-A165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens
M1 470x50x231 μm3 M1 470x60x231 μm3
Nearly perfect selectivity
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
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100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Liquid measurement advantages bull Physiological structure and function of moleculesbull Real-time and kinetics measurementbull Reduction of salt residuals
Integration with LOC instead of fluid cell advantagesreduction reagent cost efficient portabilityrestricted dimension tolerance bench production
Liquid Measurements LOC integration
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
extff Fxtxv
EIttxv
ccttxv
mA =para
para+
parapara
++para
para+ 4
4
2
2 )()()(
)()(r
EB Eq in conjunction with NS Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected)
[Maali JAP 2005] [Sader JAP 98]
wnf =wn 1+
m f
mn
-
1
2
Qnf =
(mn +m f )
c fwnf
is the added mass per unit length
fc is damping coefficient per unit length fm
Liquid Measurements MC beam dynamics
From theoretical model and FE analysis SOI device Layer 7μm Aspect ratio 15-3
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Q factor
m1 m2 m3 m4 m5Vibrational Modes
Vibrational modes vs Processes
PIREXSU8PDMS
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Liquid Measurements Preliminary results
Liquid priliminary measurements are performed in PBS
Real time detection
4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decreseThe binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results
(Carl A K Borrebaeck BioTechnology 1992)
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Conclusions
Two biodesigns for ANG-1 detection and quantification by MC dynamic mass sensor operating in vacuum Data analysis demonstrate high sensitivity measure specificity and reproducibility
Preliminary results of MC integrated on LOC platform for real-time monitoring of GF levels
Future Works Automatic and continuous measurement (data storage and fit)
Development of an alternative actuation
Kinetics
Q-enhancement circuit
In plasma measurements
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
IP1 IP2 70 140 210 280
Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component
P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210
Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1)
75 KDa
50 KDa
Depletion of Albumin Component (DAC)
MW Plasma1X 2X 1 2 3
[ Colantonio Proteomics 2005 ]
IP1 IP2 70 140 210 280
PLASMA depleted + ANG1
SAMPLE PREPARATION clarification of PLASMA (Murin Model)
Albumin (ug)
PLASMA + ANG1
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
rh - ANG1 (ng)
Future works measurements in plasma
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
Acknowledgments
L Napione F Bussolino
Institute for Cancer Research and Treatment
Candiolo Torino
C Ricciardi G Canavese GDigregorio IFerrante SFiorilli SMarasso ARicci F Pirri
LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
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