Come identificare i Cromosomi

Fino al 1970, i cromosomi sono stati classificati in base alle dimensioni ed alla posizione del centromero.

A – I più grandi (metacentrici)

B – Grandi (submetacentrici)

C – Medi (submetacentrici, incluso il chr.X)

D – Grandi (acrocentrici)

E – Piccoli (submetacentrici)

F – Piccoli (metacentrici)

G – Piccoli (acrocentrici, incluso il chr. Y)

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Bandeggio dei Cromosomi

L’introduzione di specifiche tecniche di colorazione (bandeggio) a permesso di:

Identificare i diversi cromosomi

Definire più accuratamente le alterazioni cromosomiche

Le tecniche di bandeggio prevedono:

Denaturazione o digestione enzimatica dei cromosomi

L’utilizzo di coloranti che si legano in maniera specifica al DNA

Il cromosoma mostra la tipica alternanza di bande chiare e scure.

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International System for human Cytogenetic Nomenclature (ISCN)

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Tipi di bandeggio

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TECNICA PROCEDURA BANDING PATTERN

Bandeggio GProteolisi limitata (trattamento con tripsina) seguita dalla colorazione Giemsa

Le bande scure sono regioni ricche in AT, le bande chiare sono ricche in GC

Bandeggio R (Reverse)

Denaturazione al calore (regioni ricche in AT) seguita dalla colorazione Giemsa

Le bande scure sono regioni ricche in GC, le bande chiare sono ricche in AT (inverso del bandeggio G)

Bandeggio QProteolisi limitata (trattamento con tripsina) seguita dalla colorazione un colorante fluorescente (Quinacrina)

Bandeggio analogo al bandeggio G (scure ricche in AT, chiare ricche in GC). Colora selettivamente anche il braccio lungo del chr. Y

Bandeggio CDenaturazione con idrossido di bario e poi colorazione con Giemsa

Colora selettivamente le regioni ricche in eterocromatina costitutiva (centromeri e regioni pericentromeriche)

Colorazione NOR Colorazione con Nitrato di ArgentoColora selettivamente i satelliti dei chr. acrocentrici 13, 14, 15, 21 e 22 ed è esclusiva di queste regioni

Bandeggio G

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Confronto tra bandeggi

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G and R-banding results show the addition of chromosomal material in the short arm ofone chromosome 9(der(9)). C-banding results show the presence of heterochromatininto the der(9).

Bandeggio C

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Colorazione NOR

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Risoluzione del Cariotipo tradizionale

Il limite di risoluzione di un’ analisi del cariotipo standard è di 4-6 Mb

Il potere di risoluzione delle tecniche di bandeggio può essere aumentato analizzando i cromosomi in condizioni di minore condensazione (prometafase):

Bassa (400 bande)

Intermedia (550 bande)

Alta (850 bande)

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Cromosoma 4 (G-banding)

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400 550 850

Cariotipo costituzionale:da quali cellule?

Il cariotipo costituzionale può essere ottenuto da qualsiasi tipo di cellula somatica nucleata

E’ fondamentale che la cellula sia in mitosi

La fonte più semplice sono le cellule nucleate del sangue

E’ sufficiente un prelievo di sangue venoso

Il linfociti hanno un elevato indice mitotico se stimolati in coltura con fitoemoagglutinina (PHA)

Fonti alternative di cellule:

Fibroblasti (da biopsia cutanea) – Una condizione di mosaicismo

Cellule del midollo osseo (biopsia midollare) – Sospetta leucemia (citogenetica oncologica)

Amniociti (prelievo di liquido amniotico) – Analisi in epoca prenatale

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Cariotipo di routine

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Blocca in metafase (depolimerizza i microtubuli del fuso mitotico)

Cariotipo di routine

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Cariotipo di routine

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Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)dei Cromosomi

L’analisi dei cromosomi mediante FISH prevede l’uso di sonde (molecole di DNA) di lunghezza variabile (2-500 Kb) marcate con un fluoroforo.

Marcatura diretta

Marcatura indiretta

Nella FISH standard la sonda è omogena

In alcune applicazioni è possibile utilizzare più sonde contemporaneamente e le immagini sono elaborate da sistemi di analisi computerizzati.

E’ possibile analizzare i nuclei in interfase.

Il chromosome painting è la forma più sofisticata di FISH

Si utilizzano cocktail di sonde specifiche per i diversi cromosomi

Le immagini rielaborate dal computer, in colori virtuali, consentono di distinguere i cromosomi e dettagliarne il bandeggio

Il limite di risoluzione è di ~ 40 Kb74

Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)dei cromosomi

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Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)dei cromosomi

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Parziale trisomia del Chr 2A. Cariotipo con tecnica

classicaB. M-FISHC.Rx-FISH

Rx-FISH (Rainbow Colors X Species)

I cromosomi umani sono ibridate con sonde colorate da cromosomi di un primate (Gibbone).

Il genoma di questa specie (2n=52) ha omologia del 98% con il genoma umano

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Comparative GenomicHybridization (CGH)

Consente di evidenziare alterazioni quantitative (delezioni/duplicazioni) nei cromosomi metafasici.

Il DNA estratto da due sorgenti cellulari diverse (Campione e Controllo) è marcato con due differenti fluorofori

Entrambi i pool di sonde sono ibridati con cromosomi matafasici fissati su un vetrino

I segnali di fluorescenza lungo i cromosomi sono dosati e sovrapposti (merge) evidenziando in colori virtuali il differente dosaggio

Trova applicazione in citogenetica oncologica dove spesso si osservano cariotipi fortemente alterati.

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Array-CGH

E’ l’ulteriore evoluzione del CGH su cromosomi metafasici, ma con risoluzione molto elevata che consente di evidenziare alterazioni del numero di copie (Copy Number Variation, CNV) anche di 3.5 Kb.

Il DNA estratto da due sorgenti cellulari diverse (Campione e Controllo) è marcato con due differenti fluorofori

Entrambi i pool di sonde sono ibridati su un vetrino (microarray) su cui sono state fissate specifiche sequenze oligonucleotidiche rappresentative dell’intero genoma

I segnali di fluorescenza sono dosati e sovrapposti (merge) evidenziando in colori virtuali il differente dosaggio

Consente di ricondurre immediatamente l’alterazione osservata ad una precisa regione/sequenza del genoma.

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Array-CGH

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Array-CGH

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Polimorfismi cromosomici

I cromosomi umani possono presentare variazioni morfologiche (polimorfismi) in diversi individui.

Spesso interessano regioni costituite da DNA ripetitivo, funzionalmente inattivo e quindi non hanno alcun effetto patologico.

Rientrano nella variabilità individuale che, a diversi livelli, si osserva nel nostro genoma.

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Satelliti dei cromosomi acrocentrici

Polimorfismi cromosomici più frequenti:

Assenza dei satelliti di un cromosoma acrocentrico

Espansione del DNA satellite

Espansione delle regioni NOR

Evidenziabili con il bandeggio C o colorazione NOR.

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Variazioni dell’eterocromatinapericentromerica

Sono in genere espansioni, ma anche delezioni o inversioni.

Tutti i cromosomi, più frequente in chr. 1, 9 e 16

L’espansione dell’eterocromatinapericentromerica del chr. 9 è presente nell’8% degli individui

L’inversione della stessa regione del chr. 9 è presente nell’1.5% degli individui

Evidenziata con bandeggio C89

Polimorfismi dell’eucromatina

Sono denominati HSR (Homogeneously Staining Regions).

Bene caratterizzata la variante 9p+ (amplificazione di un segmento della banda 9p12)

Altre varianti polimorfiche descritte a 15q11.2, 16p11.2 e 8p23.1

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Copy Number Variations (CNV)

Sono una classe di varianti polimorfiche dell’eucromatina normalmente presenti nella popolazione generale.

Sono evidenziabili mediante array-CGH (per l’elevata risoluzione della tecnica)

Sono delezioni o amplificazioni di segmenti genici, in genere di piccole dimensioni (40-100 Kb fino a 3Mb)

Sono presenti in più del 1% della popolazione.

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DGVhttp://dgv.tcag.ca/dgv/app/home

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DECIPHERhttps://decipher.sanger.ac.uk/

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3 anni, figlio unico di genitori non consanguinei

Gravidanza normo decorsa (parto cesareo a termine)

Tratti dismorfici

Impianto basso delle orecchie

Strabismo occhio dx

Ipertelorismo

Fronte alta e prominente

Capelli sottili con attaccatura alta

Labbro pendente

Linguaggio assente

Comportamenti ripetitivi94

RITARDO PSICOMOTORIO

aCGH ISCAv2 8x60K(International Standard Cytogenetic Array)

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Delezione in eterozigosi (de novo) di circa 4.4Mb (chr1:167314603-171791166)

a 1q24.2-q24.3, rilevata con 65 sonde.

UCSC genome browserchr1:167.314.603-171.791.166

La delezione coinvolge circa 40 geni.

L’aploinsufficienza della regione 1q24-q25 è stata associata a difetti cognitivi, bassa statura, microcefalia, mani e piedi piccoli, dita corte, più una variabilità di altri segni e sintomi.

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