Voltammetria(Polarografia)

Introdotta da Heyrovsky nel 1920 mediante l’uso dell’elettrodo a “goccia di mercurio” come elettrodo di lavoro (polarografia)

Viene applicata una differenza di potenziale in modo variabile al fine di far avvenire una reazione redox all’elettrodo di lavoro. Dalla curva i-V è possibile estrapolare l’informazione analitica (concentrazione). Le tecniche voltammetriche si distinguono per il tipo di potenziale applicato all’elettrodo e sono tra le piùsensibili.

Consente l’analisi qualitativa e quantitativa di cationi, anioni e composti organici riducibili e/o ossidabili.

In voltammetria vengono utilizzati 3 elettrodi (riferimento, lavoro e controelettrodo) ed un potenziostato. Infatti, poichè E = i R, per controllare accuratamente E durante la scansione è necessario far avvenire le reazioni redox (passaggio di corrente) tra l’elettrodo di lavoro ed un controelettrodo

Il segnale di corrente (i) è proporzionale alla concentrazione di analita solo quando dipende esclusivamente dalla diffusione dell’analita alla superficie dell’elettrodo. Processi di migrazione di carica vengono repressi con l’uso di un elettrolita di supporto; quelli di convezione mediante controllo del trasporto di massa dell’analita.

δ = spessore dello strato di diffusione

A → PZ

Y

X

il = corrente limite (o di diffusione)

Equazione dell’onda i-Vconsideriamo la riduzione reversibile di una specie il cui prodotto èsolubile sia nel mercurio che in soluzione oss + ne ⇔ rid

dall’equazione di Nerst E = E0 + RT/nF ln C0oss/C0ridC0 = concentrazione all’interfaccia mercurio-soluzione

vogliamo esprimere la concentrazione in funzione della corrente, quando viene raggiunto il potenziale a cui avviene la riduzione avremo una diminuzione di C0oss ed un aumento di C0rid quindi:

C0oss = Coss – ki e C0rid = k’i

quando si raggiunge la corrente limite il:

Coss = kil e C0oss = k (il –i)

se poniamo Koss = 1/k e Krid = 1/k’ allora otteniamo l’equazione dell’onda:

E = E0 + RT/nF ln Krid/Koss + RT/nF ln (il – i)/i

per i = il/2 (il – i)/i = 0

E1/2 = E0 + RT/nF ln Krid/Koss

E1/2 = potenziale di semionda

il rapporto Krid/Koss è indipendente dalla concentrazione delle specie ed è uguale al rapporto tra i coefficienti di diffusione, se drid/doss ≈ 1 quindi

E1/2 ≈ E0 e l’equazione diventa:

E = E1/2 + RT/nF ln (id-i)/i

se in soluzione è presente anche la forma ridotta E sara’ funzione sia della corrente anodica che di quella catodica:

E = E1/2 + RT/nF ln [(il)c – i] / [i – (il)a]

E1/2 viene usato per analisi qualitativa e per il calcolo di costanti

1. la superficie si rinnova continuamente

2. lo strato di diffusione sulla superficie elettrodica è molto sottile

3. elevata sovratensione di idrogeno (campo catodico esteso)

4. campo anodico limitato (Hg22+ + 2 e ⇔ 2 Hg E0 = + 0.79)

Intervallo di potenziale utilizzabile per diversi materiali elettrodici e diversi elettroliti di supporto

In polarografia l’O2 deve essere eliminato dalla soluzione!

L’analisi polarografica quantitativa si basa sull’equazione di Ilkovic:

id = KC = 607 n D1/2 m2/3 t1/6 C

n = numero di elettroni, D = coefficiente di diffusione della specieelettroattiva (cm2/sec)m = velocità di gocciolamento, t = tempo di gocciolamento, m2/3 t1/6 = costante del capillare, si determina sperimentalmente

Il picco voltammetrico si forma in soluzioni quiescenti in voltammetria con elettrodi solidi

i /µ

A

-600 - 500 - 400 - 300 -200 - 100 0 100- 350

- 250

- 150

- 50

50

150

250

E / mV

Ru(NH3)63+/2+ 1 mM in KCl O.1 M

KCl 0.1M

t

E2

E1

Elettrodo di carbone vetroso vs, SCE; velocità di scansione 50 mV/s

Nella voltammetria ciclica il potenziale viene invertito ad un certo punto e viene effettuata una scansione in senso inverso. Viene utilizzata per studiare reazioni redox ha caratteristiche analitiche simili alla voltammetria lineare

La corrente misurata ad un elettrodo può essere divisa in due conponenti: la corrente capacitiva dovuta alla attrazione di cariche in soluzione da parte dell’elettrodo carico (effetto condensatore) e la corrente faradica è dovuta allo scambio di elettroni. In pratica la corrente capacitiva rappresenta il rumore della misura voltammetrica.

t

E2

E1

i

t (ms)

elettrolita di supporto (KCl)

Corrente capacitiva

analita in elettrolitadi supporto

Corrente capacitiva + faradica

Voltammetria a scansione lineare →quantità minima rilevabile 10-5mol/L, separabilità tra picchi ~ 0.2 V.

Voltammetria differenziale ad impulsi → quantità minima rilevabile 10-7- 10-8 mol/L, separabilità tra picchi ~ 0.1 V.

Voltammetria ad onda quadra →quantità minima rilevabile 10-7- 10-8mol/L, separabilità tra picchi ~ 0.1 V, tecnica estremamente rapida

In amperometria si applica un potenziale fisso all’elettrodo (nella zona della corrente di diffusione) di lavoro e si misura la variazione di corrente in presenza dell’analita. E’ necessario utilizzare delle strategie la selettività della misura.

Nell’elettrodo ad ossigeno di Clark si applica un potenziale di –0.7 V vs. Ag/AgCl ad un elettrodo di platino (od oro). La reazione all’elettrodo di lavoro è

O2 + 4e + 4H+ → 2 H2O

La selettività è garantita dalla membrana gas-permeabile (e.g. polipropilene) posta tra la cella elettrochimica e la soluzione campione.

Tecniche di ridissoluzione elettrochimica

Un analita in soluzione può essere “estratto” in un materiale elettrodico. Se la determinazione viene successivamente effettuata per via elettrochimica il metodo prende il nome di analisi elettrochimica perridissoluzione

Tali tecniche permettono di aumentare la sensibilità delle analisipolarografiche in quanto prevedono una stadio preliminare di arricchimento degli analiti sull’elettrodo di lavoro.

1° stadio → accumulo dell’analita per elettrolisi o adsorbimento per intervalli di tempo definiti e a potenziali costanti

2° stadio → ridissoluzione (stripping) dell’analita in seguito a fenomeniossidoriduttivi (p.es. scansione del potenziale in direzione anodica o catodica) con produzione di un segnale proporzionale alla concentrazione in soluzione

La tecnica più utilizzata è la voltammetria di stripping anodico (ASV)per la rivelazione di metalli in tracce (limite di rivelabilità 10-9/10-11 mol/L)

1. M2+sol + 2e → MH2. MHg → M2+sol + 2e

Voltammetria di stripping catodico (CSV)

formazione di uno strato insolubile di materiale sull’elettrodo che viene ridotto per scansione catodica del potenziale

1° step 2Hg + 2X- → Hg2X2 + 2e

2° step Hg2X2 + 2e → 2Hg + 2X-

utilizzata per anioni che formano sali insolubili con il mercurio, e sostanze organiche (p.es. contenenti zolfo) che formano compostiinsolubili con l’Hg. In alcuni casi, p. es. CuSCN e Fe(OH)3, l’Hg non ècoinvolto

Voltammetria di stripping catodico adsorbitivo (ACSV)

Lo stadio di arricchimento dell’elettrodo è di tipo non elettrolitico (adsorbimento). La tecnica è particolarmente sensibile poichél’adsorbimento è solo superficiale e tutto il materiale adsorbito èimmediatamente disponibile per la riduzione

Ampio intervallo di applicabilità da sostanze organiche (composti aromatici, antibiotici, steroidi, etc.) a ioni inorganici mediantecomplessazione

METODI SPETTROSCOPICI

Si basano sulla interazione e misura della radiazione elettromagnetica con l’analita.

Si possono dividere generalmente in metodi di assorbimento (attenuazione di un fascio di radiazione) e di emissione (radiazione emessa dall’analita in particolari condizioni sperimentali)

Più in dettaglio vengono classificati in base alla regione dello spettro elettromagnetico coinvolta

LE ONDE ELETTROMAGNETICHE

Ampiezza (A) = lunghezza del vettore elettrico al massimo dell’onda

Lunghezza d’onda (λ) = distanza tra i massimi (o i minimi) successivi

Frequenza (ν) = numero di oscillazioni del campo elettrico al secondo (1 Hz = 1 ciclo al secondo)

Velocità di propagazione (v) = νλ dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione

Nel vuoto la velocità di propagazione è massima (c ≈ 3 × 1010 cm/s). Nell’aria la velocità e simile (0.03% in meno). Quando la radiazione attraversa un altro mezzo la velocità diminuisce a spese della lunghezza d’onda, la frequenza è infatti invariata e dipende dalla sorgente di radiazioni.

_Numero d’onda ( ν ) = numero di onde per cm 1/λPotenza (P) = energia per unità di area al secondo. Correlata all’ampiezza della radiazione

La radiazione può essere trattata anche in forma particellareassimilandola a pacchetti discreti di energia (fotoni o quanti):

E = hν

h = costante di Planck = 6.63 × 10-34 Js

E = hc/ λ

Assorbimento della radiazione

SPETTROFOTOMETRIA UV/visibile

Quali elettroni danno luogo a transizioni misurabili nell’UV/visibile?

Gli elettroni in una molecola possono essere classificati in 4 tipi:

• elettroni non coinvolti in legami (E di eccitazione alte)

• elettroni di legami singoli covalenti (σ) (E troppo alte per UV/visibile)

• elettroni non leganti (tipo n) (E sufficienti per UV/visibile)

• elettroni in orbitali π (legami doppi e tripli) (E sufficienti per UV/visibile)

Le transizioni avvengono in orbitali antileganti di tipo σ∗ e π∗, le piùcomuni sono n→ π∗ e π→ π∗ .

L’intensità relativa delle bande di assorbimento è rappresentata dalle assorbività molari ε che sono una misura della probabilità che la transizione elettronica abbia luogo. La probabilità di transizioni π→ π∗ èmaggiore di transizioni n→ π∗

I gruppi che assorbono in una molecola sono chiamati cromofori.

Le variazioni spettrali vengono classificate come batocromiche (massimo spostato verso λ maggiori) e ipsocromiche (verso λ minori). Variazioni d’intensità vengono indicate come ipercromiche o ipocromiche.

Trasmittanza (T) = P/P0 T% = P/P0 × 100

Assorbanza = log P0/P = -log T

Legge di Beer (vale per soluzioni diluite) :

A = εbc

ε = assorbività (o assorbanzaspecifica) molare

b = cammino ottico

c =concentrazione

Additività delle assorbanze

xλ1

A1x(λ1) = εx(λ1) b cx A2x(λ2) = εx(λ2) b cxA1y(λ1) = εy(λ1) b cy A2y(λ2) = εy(λ2) b cy

DEVIAZIONI DALLA LEGGE DI BEER

• chimiche. Le specie assorbenti danno reazioni di associazione, dissociazione o reazione con solvente con prodotti che hanno εdiversi (p.es. un indicatore acido-base in soluzione non tamponata)

• strumentali. Dovute a radiazioni spurie e al fatto che si usa radiazione policromatica per l’assorbimento.

ERRORE SPETTROFOMETRICO

MONOCROMATORI

Servono a selezionare la lunghezza d’onda desiderata, consistono di fenditure d’ingresso e d’uscita per eliminare le radiazioni indesiderate, un sistema di specchi per focalizzare la radiazione e un separatore di lunghezze d’onda (prisma o reticolo)

Il prisma separa le varie componenti della luce perchél’indice di rifrazione è diverso per ciascuna λ. La dispersione non è lineare (minore per λmaggiori). I reticoli presentano una supeficie

riflettente piana di alluminio che presenta un numero grande di solchi paralleli. La separazione dipende dalla distanza tra i solchi. I reticoli producono anche multipli della radiazione incidente (ordini superiori).

nλ = d (sen i + sen r)

d = distanza tra le superfici, n ordine di diffrazione, i e r = radiazione incidente e riflettente

La dispersione è lineare, vengono usati diversi tipi per l’UV/visibile e l’IR

L’ampiezza di banda effettiva del monocromatore dipende oltre che dalle caratteristiche del reticolo anche dalla fenditura d’uscita.Generalmente varia tra 1 e 20nm per applicazioni quantitative.

Molti monocromatori hanno fenditure variabili che permettono di lavorare con rivelatori di diversa sensibilità

I filtri sono caratterizzati da una λ alla quale si ha la massima trasmissione e da una ampiezza di banda. Quelli ad interferenza sono più selettivi (e piùcostosi). Quelli ad assorbimento sono costituiti da vetro colorato.

Vengono utilizzati nel sistema ottico sia in presenza che in assenza di monocromatore (p.es. alcuni lettori per dosaggi immunochimici).

Contenitori per il campione (cuvette)

RIVELATORI PER SPETTROFOMETRI

Sono di tipo fotonico (fino a λ = 2 µm); sono forniti di una superficie reattiva che in presenza di fotoni emette elettroni (fotoemissione) o li eccita in modo che possano condurre elettricità (fotoconduzione). I piùcomuni sono i fototubi, i fotomoltiplicatori e i rivelatori basati sulla tecnologia dei semiconduttori (a silicio)

ASSORBIMENTO INFRAROSSO

Lo spettro è meno risolto a λ maggiori (∆E tra i livelli energetici è minore)

Lo spettro può essere diviso in 4 zone:

•Zona di stretching dell’idrogeno (λ = 2.7 –4.0 µm)

•Zona di stretching del triplo legame (λ = 4.0-5.0 µm)

•Zona di stretching del doppio legame (λ = 5.0 –6.4 µm)

•Zona di stretching e bending del legame singolo (λ = 6.0-15 µm)

La strumentazione è paragonabile a quella di uno spettrofotometro con l’uso di materiali che non provochino interfererenze (p.es. cuvette di KBr). La sorgente è generalmente un solido riscaldato e in alcuni strumenti si usano rivelatori di calore (p.es. termocoppie) soprattutto utili nella regione a lunghezze d’onda elevate.

Alcuni strumenti più moderni (FTIR, spettrometro infrarosso a trasformata di Fourier) sono in grado di misurare contemporaneamente tutto lo spettro IR.

La spettroscopia IR viene utilizzata molto spesso a scopo qualitativo. E’uno strumento molto potente perché lo spettro IR della regione fingerprint(impronta digitale) a basse energie è praticamente unico per ogni molecole. Per l’identificazione della molecola si confronta lo spettro ottenuto con quello di molti altri spettri disponibili in banche dati. Lo spettro deve essere registrato in opportune condizioni sperimentali (con la sostanza gassosa, solida o disciolta in un solvente che non interferisce).

SPETTROSCOPIA ATOMICA

Può essere sia di emissione che di assorbimento. Il campione viene atomizzato prima della misura con varie fonti di energia termica.

E’ utilizzata per circa 70 elementi.

SPETTRI ATOMICI

L’assorbimento o l’emissione di energia da parte di un atomo può essere descritta nel modo più semplice con la teoria dei quanti (meccanica di Bohr) secondo cui le orbite in cui può trovarsi un elettrone sono quantizzate ed il momento angolare può differire solo di multipli interi del valore h/2π(h=costante di Planck)

mvr = nh/2π

n = numero quantico principale

l’energia associata alla transizione elettronica (assorbimento o emissione) è∆E = hν dove ν è la frequenza della radiazione spettrale

ogni possibile transizione è pertanto associata ad una luminosa nello spettro di emissione e ad una oscura nello spettro di assorbimento

∆E è legata inversamente a n2 per cui all’aumentare di n ∆E diminuisce (diminuisce la frequenza ed aumenta la lunghezza d’onda). Se l’energia fornita è sufficiente ad allontanare l’elettrone si ha la formazione di uno ione positivo (potenziale di ionizzazione).

L’intensità di una riga spettrale è dipendente dalla probabilità del corrispondente salto elettronico, quindi saranno più intense le righe con una minore energia di eccitazione, la riga di “risonanza” (più basso livello eccitato) è quindi la più intensa.

L’atomo neutro ha proprietà diverse da quello ionizzato!p.es. 213,85 Zn I è la riga dell’atomo neutro (per lo ionizzato si usa ZnII, Zn III e così via)

L’insieme delle transizioni energetiche di un atomo di idrogeno può essere rappresentato in un diagramma di Grotrianche fornisce i valori dei livelli in scala proporzionale al numero d’onda (numero di onde per unità di lunghezza)

Per atomi (e ioni) piùcomplessi la situazione si complica perchèdobbiamo prendere in considerazione anche il contributo energetico dovuto agli altri numeri quantici dovuti al momento angolare dell’elettrone (numero quantico l), allo spin(numero quantico s) e al momento magnetico (numero quantico m)

se si usano spettroscopi ad alto potere risolutivo si osserva che molte righe spettrali dei metalli alcalini sono doppie, p.es. la riga gialla del sodio è in realtà costituita da 2 righe a 589,0 e a 589,6 nm a causa dell’effetto del momento angolare di spin (s), la riga a 589,0 è 2 volte più intensa di quella a 589,6 a causa del numero quantico magnetico (m)

FOTOMETRIA DI FIAMMA

spettroscopia di emissionesorgente di eccitazione → fiammarivelatore → sistema fotoelettrico

strumentazione simile a quella spettrofotometrica ma il campione viene nebulizzato in una fiamma sotto forma di soluzione

la radiazione emessa viene risolta da un sistema ottico opportuno e l’intensità della riga prescelta misurata con il rivelatore

secondo il tipo di fiamma usata si possono eccitare vari atomi ad energia di eccitazione diversa (a 1100-1300 °C i metalli alcalini, a 3000 °C circa 50 elementi diversi)

la fotometria di fiamma èmolto utilizzata per gli elementi del I e II gruppo del sistema periodico. p.es. il limite di rivelabilità per il sodio può essere fino a 0.2 µg/L con precisione dello 0.5%

a causa delle temperature relativamente basse si ottengono degli spettri poveri di righe, per la misura del sodio (doppietto a 589 nm) e del potassio (doppietto a 768 nm) è sufficiente un filtro per isolare la radiazione desiderata, per gli altri elementi è necessario utilizzare unmonocromatore

Interferenze:

gli spettri di righe sono sovrapposti allo spettro continuo dovuto alla fiamma stessa, quindi si deve effettuare un bianco in assenza dianalita

il tipo di solvente organico utilizzato influenza la viscosità del campione e quindi la velocità alla quale viene bruciato. Inoltre i solventi organici alterano la temperatura della fiamma favorendo l’emissione ed aumentando la sensibilità

L’energia termica della fiamma può essere sufficiente a ionizzare alcuni elementi ciò influenza la curva dicalibrazione dell’elemento. Per eliminare il problema si usano dei “tamponi spettroscopici” (p.es. il cesio) a bassa energia di ionizzazione

ad alte concentrazioni di analita si ha invece autoassorbimentodella radiazione per collisione con atomi della stessa specie allo stato fondamentale

Analisi quantitativa:

interpolazione di rette dicalibrazione ottenute da soluzioni standard nel solvente o nella matrice di misura

uso di uno standard interno (p.eslitio; 671 nm) nelle ordinate della retta di calibrazione si riporta il rapporto tra le 2 righe

Il metodo delle aggiunte, elimina qualsiasi interferenza dovuta alla composizione del campione, glistandards vengono aggiunti al campione. La concentrazione viene determinata dal valore relativo all’intersezione della retta ottenuta con l’asse delle ascisse

ASSORBIMENTO ATOMICOE’ molto importante sia nella spettroscopia di emissione sia in quella di assorbimento conoscere il n di atomi che si trovano allo stato fondamentale (p.es. in una fiamma) gli elettroni sono statisticamente distribuiti tra i vari livelli energetici secondo l’espressione di Maxwell-Boltzmann

Nu/N0 = gu/g0 e- (Eu – E0) / kT

Nu = stato eccitato, N0 = stato fondamentale, gu e g0 = pesi statistici dei livelli (probabilità che un elettrone rimanga ad un dato livello energetico), E = energia del livello, k = costante di Boltzmann

nella fotometria di fiamma si misura una proprietà degli atomi allo stato eccitato, nell’assorbimento atomico una proprietà degli atomi allo stato fondamentale, quindi, vista la popolazione relativa di atomi, per la maggior parte degli elementi sarà più sensibile l’assorbimento atomico piuttosto che l’emissione (in fiamma!)

I metalli alcalini si possono misurare con buona sensibilità perché il limite di rilevabilità dipende dal rumore del rivelatore (fotomoltiplicatore) e della fiamma, il segnale va da zero ad una quantità finita. In assorbimento si misura la differenza di 2 segnali con rumore molto simile ed il limite di rilevabilità dipende dal rumore di entrambi.

la sorgente (di righe) più comune nell’A.A. è la lampada a catodo cavo.

Il catodo è fabbricato con l’elemento che si vuole determinare (o una lega), l’anodo è di tungsteno. Viene riempita a bassa pressione con argon o neon e si applica un potenziale tale da generare una corrente costante tra 1 e 50 mA. Il gas viene ionizzato all’anodo e accelerato verso il catodo provocando l’emissione di atomi metallici eccitati che emettono lo spettro del materiale catodico.

L’uso di una sorgente di righe in A.A. permette una maggiore sensibilità e linearità di risposta all’analita, con strumentazione meno complessa e costosa. Infatti, utilizzando una sorgente continua ed un ottimo monocromatore (banda passante di 0.01 nm, ∆λ max = 0.002nm) il rumore di fondo sarebbe in ogni caso talmente ampio da non poter essere discriminato con i fotomoltiplicatori tradizionali.

La sensibilità è definita come la concentrazione che dà un assorbimento dell’1% (assorbanza0.0044), è una misura del segnale assoluto previsto per un dato insieme di condizioni sperimentali ma non dà informazioni riguardo al rumore. Il limite di rivelazione (orivelabilità) è definito come la concentrazione relativa a due volte la deviazione standard del rumore di fondo (s/n = 2)

maggiore sensibilità per l’atmosfera inerte in cui viene atomizzato il campione, il mezzo altamente riducente (carbonio ad elevate t) e la scarsa emissione di fondo. La t max e dello stesso ordine di grandezza della fiamma. Si può lavorare con quantità minime di campione (0.1 mg). Si procede prima all’eliminazione del solvente (100 °C), poi all’incenerimento (t secondo la matrice) ed in ultima fase all’atomizzazione.

Interferenze spettrali

l’interferenza di riga spettrale è rara nell’A.A., sono più diffuse quelle di assorbimento molecolare (p.es. il CaOH interferisce sulla riga a 553.6 nm del Ba)se non c’è vaporizzazione completa del campione la radiazione può essere diffusa

Interferenze chimiche

si hanno per formazione di composti refrattari nella fiamma (p.es.pirofosfato di Ca, oppure ossidi) per reazioni con anioni presenti nel solvente. Si eliminano con l’aggiunta di opportuni reagenti al campione (p.es, cloruri di Sr e di La, o EDTA per il Ca) che vengono aggiunti anche agli standard. Altro metodo è di utilizzare una fiamma a t maggiore.

SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE A PLASMAIl “plasma” viene definito come un gas elettricamente neutro in uno stato di elevata ionizzazione e quindi composto di atomi, molecole, ioni ed elettroni liberi. Si può indurre in un flusso di argo con un forte campo elettrico (DCP, Direct Current Plasma) o un forte campo a radiofrequenza (ICP, Inductively, Coupled Plasma) . Le temperature raggiunte sono tra i 7000 e 15000 °C.

la temperatura di equilibrio del plasma varia in funzione dell’altezza della torcia, da cui dipenderà l’intensità di emissioneil campione viene prima nebulizzato e poi trasportato nel plasmamediante pompa peristaltica a flussi di 0.5-1 mL al minuto

si producono spettri ricchi di righe (pochi atomi allo stato fondamentale) e quindi bisogna discriminare la radiazione emessa con imonocromatori, per questo motivo le interferenze spettrali sono piùfrequenti

nell’ICP la corrente ad alta frequenza (27MHz) genera un campo magnetico oscillante che produce attraverso gli atomi del gas inerte un flusso di elettroni e di ioni

campo di applicabilità ampio, curve di taratura con linearità fino a 5 ordini di grandezza (p.es. da 0.01 a 1000 mg/L per il Fe). Limiti dirivelabilità paragonabili all’A.A.

rispetto all’A.A. ha il vantaggio che è possibile fare delle analisimultielemento in sequenza o utilizzando una serie di rivelatori posizionati opportunamente

SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE

E’ una spettroscopia di emissione, le molecole, eccitate mediante assorbimento di radiazione elettromagnetica, emettono radiazione. Il processo avviene in tempi rapidi (meno di 10-5 s).

La sensibilità della spettroscopia di fluorescenza èmaggiore rispetto alla spettrofotometria (da 1 a 3 ordini di grandezza).

L’applicabilità è limitata a molecole che sono in grado di fluorescere.

Lo spettro di fluorescenza è una immagine speculare di quello di assorbimento a λ maggiori (spostamento di Stokes). Le linee che si sovrappongono vengono dette di risonanza.

Quali molecole emettono fluorescenza?

Solo quelle in cui il rilassamento non radiativo ha velocità paragonabili a quelle del processo fluorescente

Il rendimento quantico Φ rappresenta il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti (o n di molecole che emettono su n che assorbono)

I composti fluorescenti sono generalmente composti aromatici, Φaumenta con il numero di anelli ed il grado di condensazione

Una sostituzione sull’anello aromatico provoca non solo una variazione delle λ di assorbimento ed emissione ma anche una variazione di Φ.

La rigidità della molecola influenza significativamente Φ. Molecole più rigide emettono con efficienza maggiore.

La fluorescenza diminuisce all’aumentare della temperatura per effetto delle collisioni molecolari.

L’intensità di fluorescenza è direttamente proporziona al potere radiante P0 della radiazione incidente

F = K’ (P0 – P)

per P0 costante F = Kc

La proporzionalità diretta viene persa per valori di assorbanza maggiori di 0.05 (90% di trasmittanza) a causa dell’autospegnimento (self-quenching).

(SPETTRO)FLUORIMETRI

Sono a doppio raggio per compensare variazioni di potere radiante; il rivelatore è a 90° rispetto alla cuvetta

I metodi in fluorescenza sono più sensibili rispetto a quelli spettrofotometrici perché aumentando la P0 della sorgente o la sensibilitàdel rivelatore si possono misurare quantità più piccole (in assorbanza no!).

I metodi possono essere diretti o indiretti. Questi ultimi basati sullo spegnimento (quenching) di fluorescenza dopo reazione con l’analita.

Nei rivelatori fluorimetrici per cromatografia si derivatizza il campione prima della separazione

VoltammetriaVoltammetria (Polarografia)

METODI SPETTROSCOPICIMETODI SPETTROSCOPICI

SPETTROSCOPIA ATOMICASPETTROSCOPIA ATOMICA

SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZASPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE