Virus oncogeni

La trasformazione cellulare da virus si accompagna ad

una infezione persistente/latente (non controllata dal

sistema immune) con espressione solo di alcuni geni

precoci del genoma virale che rimane nella cellula

(integrato o episomiale)

Virus a DNA

Herpes virus (EBV, HHV-8) Papovavirus (HPV, BKV, JCV, SV40) Hepadnavirus (HBV) Adenovirus Poxvirus (virus mollusco contagioso –neoformazioni benigne)

Virus a RNA

Flavivirus (HCV) Retrovirus (HTLV-I e – II)

•NO envelope

•Icosaedrico

•52-55 nm di diametro

•dsDNA circolare 8Kb•Capside a 72 capsomeri composti dalle proteine L1 (55 KDa) e L2 (70 KDa)

Caratteristiche della particella virale di HPV (Human Papilloma Virus)

2000

3000

HPV-16

LCRE6

E7

E1

E2

E4

E5L2

L1

AL

P97

AE

1000

4000

5000

6000

7000

7904/1

Papillomavirus HPV

HPV ha tropismo specifico per le cellule degli epiteli squamosi cheratinizzati e nonLa replicazione è associata allo stadio differenziativo della cellula

Replicazione HPV

L1 E5

Controllo negativo HPV

Replicazione di HPV Fibropapilloma -Ibridazione in situ

Barksdale et al, J. Virol. 1993

Principali funzioni delle proteine di HPV

HPV è associato con lo sviluppo di lesioni displastichepre-neoplastiche e carcinomi a livello ano-genitale,

ma anche nella cavità orale e vie respiratorie (DNA integrato)

HPV causa lesioni epiteliali benigne caratterizzate daintensa proliferazione delle cellule basali e,

conseguentemente, da un ispessimento locale dell’epitelio(DNA episomiale)

Lesioni associate all’infezione da HPV

Tipo di lesioni Genotipi di HPV

Lesioni cutanee •Verruche volgari, piane e palmari 1,2,3,4,7,10,27,28,29,40 •Verruche in soggetti con EV 5,8,9,12,14,15,17,19,20,47,49•Carcinomi cutanei in soggetti con EV 5,8,14,17,20,47 (in rari soggetti geneticamente predisposti)

Lesioni mucose•Condilomi acuminati 6,11, 42,43, 44, 54,55•Papulosi Bowenoide 16•Condiloma gigante 6,11•Papillomi delle vie respiratorie 6,11•Papillomi congiuntivali 6,11 •Lesioni della mucosa orale iperplasia focale epiteliale 13,32 infezione con HPV del tratto genitale 6,11,16 lesioni sulle labbra 2•Carcinoma della cervice uterina alta associazione 16,18,45, 56 moderata associazione 31,33,35,51,52 scarsa associazione 6,11,42,43,44•Cancro vulvare 16

Verruca piana

Condilomi acuminati

Una risposta immune efficiente è importante per la risoluzione dell’infezione da HPV (tessuto linfoide associato alla cute e

mucose)

Le malattie associate ad HPV sono frequenti e severe in pazienti con immunodeficienze primarie e secondarie, con

disordini linfoproliferativi e AIDS

Infiltrati linfo-monocitici sono presenti nelle lesioni in guarigione e i linfociti T infiltranti proliferano in risposta a

E7 e L1

La regressione di una lesione è generalmente seguita dalla regressione delle altre

HPV e tumori

Nel 85-90% di tutti i tumori della cervice uterina è presente DNA di uno dei genotipi di HPV a medio-alto rischio

e in circa il 70% è presente il genotipo 16 o 18

HPV a medio-alto rischio è presente nelle lesioni pre-cancerose e nelle lesioni neoplastiche intraepiteliali (CIN).

mRNA di HPV è espresso nelle lesioni tumorali

Evidenze sierologiche indicano una prevalenza di anticorpi anti-HPV-16 e –18 nei pazienti con tumore cervicale rispetto ai

controlli

Evidenze simili esistono per l’associazione di HPV e alcuni tumori a cellule squamose vaginali, vulvari, penili e anali

Carcinomi della cervice uterina

Lesione intra-epiteliale squamosa della cervice (Low-grade)

IPHPV capsid

H&EIP

HPV capsid

H&E

Prevalenza delle infezione genitali da HPV e di malattie associate ad HPV in donne (USA)

Il carcinoma cervicale correla con il numero di partners sessuali

LSIL, low-grade squamous intraepithelial lesion HSIL, high-grade squamous intraepithelial lesion

Associazione di HPV con la progressione del carcinoma cervicale

HPV-6,11,42,43,44

HPV-31,33,35,51,52

HPV-16,18,45,56

• HPV ALTO RISCHIO: 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/66/68

• HPV BASSO RISCHIO: 6/11/40/42/43/44/54/61/72

Le proteine E5, E6, E7 di HPVinducono la proliferazione cellulare

(immortalizzazione)e favoriscono la probabilità di trasformazione

neoplasticadelle cellule infettate

Oncoproteine di HPV

Nelle lesioni maligne il DNA di HPV è integrato a livello del gene E2

L’interruzione di E2 potrebbe svolgere un ruolo nella patogenesi neoplastica in quanto normalmente

“down-regola” espressione di E6 e E7

Funzioni di E6 (HPV alto rischio)Funzioni di E6 (HPV alto rischio)

Immortalizzazione cellulare

Degradazione p53

Inibizione apoptosi

Destabilizzazione cromosomica

Attivazione telomerasi

Blocco funzioni interferone (?)

Bersagli cellulari di HPV E6

G2M

S

G1

Radiazioni UV

Agenti citotossici

Mutageni

virus

Danno del DNA

p53

p21

p21

Cyclin E cdk 2

mdm2 HPV E6 (alto-

rischio)

Apoptosi

bax

bcl-2 p21

PCNA DNA polymerase

-

+

+

+-

-

p21

Cyclin A cdk 2

cdk 2, 4,5,6 Cyclins D1,

D2, D3

PCNA

p15 p16p18 p21

HPV E6

Inattiva p53

PROTEASOMA

Ub

p53

p53

p53p53

E6 AP

E6 AP

E6 AP

E1

E3

E3

E6

E1Ub

E2Ub

E2

AMP ATP

HPV E6 induce la degradazione di p53

Funzioni di E7 (HPV alto rischio)Funzioni di E7 (HPV alto rischio)

Immortalizzazione cellulare

Inattivazione Rb

Attivazione cycline E e A

Induzione apoptosi

Inhibizione degli inibitori delle kinasi ciclino-dipendenti

Degradazione di tirosin-chinasi Blk (?)

Bersagli cellulari di HPV E7

+

G1

G2

SM

ppRBppRB

ppRBppRBppRBppRB

pRBpRB

pRBpRB

E7E7E7E7

E2F-1E2F-1

E2F-1E2F-1

E2F-1E2F-1

inattiva

inattivainattiva

Repressionetrascrizionale

Attivazionetrascrizionale

Complesso inattivo

HPV E7

inattiva Rb

cdkPPasi

M

G1

G2

S

Rb

pRb

Cyclin A-cdk 1

Cyclin B-cdk 1

Cyclin A-cdk 1

Cyclins D, D2, D3 cdks

2,4,5,6

Cyclin E-cdk 2 Cyclin H-cdk 7

Cyclin A-cdk 2

Cyclin E-cdk 2

HPV E7 ?

PCNA

HPV E7 ?

HPV E7 high-risk p53

p21

Rb

Rb

E2F

E2F

Cyclin-cdk

Trascrizione

Pp15, p16 p18, p27

+

HPV E7 e ciclo cellulare

HPV E5 si inserisce nella membrana

cellularee attiva il recettore PDGF in

assenza del ligando specificoinnescando segnali di

proliferazione cellulare

The major differences between high-risk HPV E6 and E7 proteins and their low-risk counterparts are their abilities to bind to the tumor suppressor proteins p53 and Rb. A number of

additional interactions have been reported for the high-risk E6 and E7 proteins. The functions of E6 and E7, independent of their abilities to inactivate p53 and Rb that are required for

stable episomal maintenance, remain to be determined. The observation that HPV31 genomes containing E6 mutations

unable to degrade p53 and an E7 mutation with reduced Rb binding provides a model to explore the activities of E6 and E7

necessary for genome replication that are shared among all HPVs. Because the complete viral replication program requires

a differentiated environment, it will be interesting to conduct future experiments using organotypic models to further analyze the balance between E6 and E7 functions permissive for viral

DNA replication in differentiating keratinocytes.

ConclusionsConclusions

The molecular pathogenesis of cancer caused by high-risk

HPV infections is presently not fully understood

However, high-risk HPVs are self-sufficient to induce malignant

conversion

Induction of chromosomal instability, mutations, and aneuploidy

in noncommitted proliferating cells plays a major role in

tumorigenesis

Interruption of two independent signaling cascades, i.e., TP53

and RB, is responsible for cellular immortalization and invasive

phemotype

Vaccino

• Profilassi delle infezioni

• VLP ottenute a partire da VP1

• Merck (tetravalente HPV 6, 11, 16, 18): GARDASIL

• GSK (bivalente HPV16, 18): CERVARIX

subclinicasubclinicasubclinicasubclinica Lesione Lesione intraepiteliale intraepiteliale

squamosasquamosa

(low-grade)(low-grade)

Lesione Lesione intraepiteliale intraepiteliale

squamosasquamosa

(low-grade)(low-grade)

Lesione Lesione intraepiteliale intraepiteliale

squamosa squamosa (high grade)(high grade)

Lesione Lesione intraepiteliale intraepiteliale

squamosa squamosa (high grade)(high grade)

Carcinoma Carcinoma invasivoinvasivo

Carcinoma Carcinoma invasivoinvasivo

metastasimetastasimetastasimetastasi

Fattori mutageni

Derivati estrogeni

Instabilità genomica

per aumentata espressione dei geni

virali

Aumentata Aumentata espressione e espressione e

replicazione DNA replicazione DNA viralevirale

Aumentata Aumentata espressione e espressione e

replicazione DNA replicazione DNA viralevirale

InfezionePersistenza

DNA virale

Modificazioni di geni cellulari

Integrazione

genoma virale

Mutazioni geni cellulari

HPV (alto rischio) e Patogenesi carcinoma cervicale

Gardasil (MERK)• Gardasil è un vaccino quadrivalente ricombinante non infettante preparato da

particelle simili al virus ( VLPs ) dalla proteina capsidica maggiore L1 del papillomavirus umano ( HPV ) tipi 6, 11, 16 e 18 altamente purificate. Le VLPs non contengono DNA virale, non possono infettare le cellule, riprodursi o causare malattia.L’HPV infetta soltanto l’uomo, ma gli studi sugli animali con papillomavirus analoghi suggeriscono che l’efficacia dei vaccini L1 VLP sia mediata dallo sviluppo di una risposta immune di tipo umorale.

• Indicazioni terapeutiche - Gardasil è un vaccino per la prevenzione della displasia di alto grado del collo dell’utero ( CIN 2/3 ), del carcinoma del collo dell’utero, delle lesioni displastiche di alto grado della vulva ( VIN 2/3 ) e delle lesioni genitali esterne ( condilomi acuminati ) causate dal Papillomavirus Umano ( HPV ) tipi 6, 11, 16 e 18.

L’indicazione è basata sulla dimostrazione di efficacia di Gardasil in donne adulte di età compresa tra 16 e 26 anni e sulla dimostrazione dell’immunogenicità di Gardasil in bambini ed adolescenti di età compresa tra 9 e 15 anni. L’efficacia protettiva non è stata valutata nei maschi.

• Approvato da EMEA/FDA

Cervarix (Glaxo Smith Kline)

• Cervarix è un vaccino bivalente contenente proteine L1 purificate per due tipi del papillomavirus umano ( HPV, tipo 16 e 18 ).

• Cervarix trova indicazione nella protezione contro la neoplasia intraepiteliale cervicale di alto grado ( detta CIN, una abnorme crescita cellulare precancerosa all’interno della cervice uterina ) ed il cancro cervicale ( detto anche, tumore del collo dell’utero ), causati dall’HPV, sierotipo 16 e 18.

• Approvato da EMEA, non ancora da FDA

Diagnosi di Laboratorio di “Human Papilloma Virus” (HPV)

Campioni clinici HPV

•Frammento bioptico incluso in paraffina

•Tampone regione ano/genitale

•Tampone cervicale

•Tampone altro tipo

Diagnosi di infezione da HPV

•Esame Clinico e colposcopia

•Esame citologico ed istologico

•Immunocitochimica

•Microscopia elettronica

•Sierologia

•Ricerca acidi nucleiciRicerca acidi nucleici

Ibridazione diretta del DNA virale con sonde specifiche

•Southern Blot

•Ibridazione in situ (ISH)

•Ibridazione in soluzione

Amplificazione di sequenze target del genoma virale

•PCR

•Sequenziamento

Southern blot•Tecnica laboriosa: Estrazione DNA, purificazione, taglio con enzimi restrizione, elettroforesi, trasferimento su filtro, denaturazione, ibridazione, rilevazione con SONDE marcate.

•Standardizzazione difficile: necessita personale qualificato e strutture idonee.

•Alta sensibiltà con sonde radioattive.

Ibridazione in situ (ISH)

•Rivelazione di sequenze specifiche di acidi nucleici (DNA e/o RNA) in cellule e tessuti (morfologicamente conservati) mediante l’impiego di sonde geniche marcate con traccianti di diversa natura.

•Tecnica efficace e di rapida esecuzione ma limitata nell’utilizzo a causa della bassa sensibilità rispetto alle tecniche che utilizzano metodi di amplificazione del segnale o del DNA target.

•Kit commerciali per diagnostica routinaria di HPV.

INFORM® HPV testMetodica di ISH che permette di discriminare HPV ad alto/basso rischio con sonde specifiche mediante reazione colorimetrica o lettura in fluorescenza direttamente su vetrino di preparazione istologica o citologica.

INFORM® HPV testVantaggi: sistema automatizzato, permette di associare direttamente la rilevazione del virus con i cambiamenti nella morfologia di cellule e tessuti, contribuendo a fornire un’immagine chiara della patologia in atto.

Limiti: sensibilità inferiore rispetto alle metodiche di amplificazione del target o del segnale.Non permette una genotipizzazione virale, ma discerne solamente tra HPV ad alto/basso rischio.Richiede personale qualificato nella preparazione del campione.

Ibridazione in soluzione

•Test in vitro che rileva la presenza di acidi nucleici virali grazie al legame diretto di una sonda a singolo filamento.

•Riconoscimento dell’ibrido genoma virale-sonda da parte di numerosi anticorpi specifici marcati, in grado di dare un segnale amplificato rilevabile da parte di appositi strumenti senza che sia necessaria un’amplificazione di sequenze.

Estrazione DNA virale Legame DNA con sonda a RNA specifica

Legame DNA-RNA sonda a fase solida mediante Ac

Digene HC2 Hybrid Capture® System

Legame di DNA-RNA con Ac coniugati a fosfatasi alcalina

Emissione di luce misurata con luminometro in Unità di Luce Relativa (RLU)

1

54

32

Digene HC2 Hybrid Capture® System

Vantaggi: Test di elevata sensibilità (1 pg target/ml), veloce esecuzione, minimi rischi di contaminazione dovuti ad assenza di amplificazione del segnale, altamente standardizzabile, unico test per rilevazione di HPV approvato dalla Food and Drug Administration.

Limiti: Identificazione solo di HPV ad alto/basso rischio, NO genotipizzazione, possibili falsi positivi per cross-reazione, costi più elevati rispetto ad equivalenti metodiche PCR.

Amplificazione del Target

PCR

PCR con ibridazione di sonda

PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

PCR Quantitativa

Sequenziamento

PCRPCR

PCR standard: utilizzo di primer universali in grado di amplificare sequenze conservate all’interno del genoma di HPV (L1) oppure di oligonucleotidi specifici per la rivelazione di un particolare tipo virale (E6/E7).

PCR nested: prima amplificazione con primer consensus, seconda con primer complementari alla sequenza target amplificata.

Vantaggi: rapida, economica, molto sensibileSvantaggi: non approvata FDA, personale esperto, possibilità di contaminazioni.

Vantaggi: altamente sensibileSvantaggi: laboriosa, rischio contaminazioni più elevato

PCRPCR

PCR con ibridazione di sonda

Ibridazione su filtro con sonda marcata di frammenti amplificati mediante PCR standard con primer consensus.

Vantaggi: Altissima sensibiltà anche in presenza di bassa carica virale

Svantaggi: Laboriosa, necessità di strutture idonee, non discrimina tra i diversi genotipi.

PCR-RFLPPCR-RFLP

•PCR standard seguita da digestione del prodotto amplificato tramite enzimi di restrizione.•Primers consensus costruiti su regioni conservate che amplifichino un frammento contenente porzioni variabili del genoma virale.

Vantaggi: economica, molto sensibile, permette una tipizzazione di diversi tipi virali a rischio.

Svantaggi: più laboriosa di una PCR standard, necessita di personale esperto nell’interpretazione dei profili elettroforetici, possibili contaminazioni.

PCR-RFLP

PCR QUANTITATIVA (Taq Man)

Quantificazione della carica virale mediante analisi di fluorescenza emessa da sonde marcate.

Vantaggi: Altissima sensibilità (limite teorico di 1 copia di genoma virale), alta specificità, non necessita di corsa elettroforetica, basso rischio contaminazione, rapida esecuzione; diversi lavori sperimentali riconoscono ruolo della carica virale nella patogenesi.

Svantaggi: Metodica non ancora standardizzata nella routine diagnostica di HPV, costi elevati, necessita di personale esperto nella messa a punto e nella validazione dei risultati.

SEQUENZIAMENTO

Metodica di riferimento per il riconoscimento e la genotipizzazione di acidi nucleici virali.

L’identificazione avviene mediante la comparazione della sequenza ottenuta con quelle presenti in database pubblici e/o privati.

Vantaggi: Massima specificità e sensibilità nella diagnosi, possibilità di genotipizzazione e riconoscimento di tipi virali a rischio particolarmente elevato e identificazione di nuovi tipi.

Svantaggi: Costi elevati, metodica laboriosa, personale esperto nell’interpretazione dei cromatogrammi

SEQUENZIAMENTO

HPV DNA testing

Approaches Advantage Disadvantage Suthern blot high sensitivity time-consuming Dot blot high sensitivity old fashioned

(radioactive probes)

Hybrid capture high sensitivity low specificity

DNA assay (HC I) (non radioactive probes) use of tubes Hybrid capture detects 18 HPV types low specificity

DNA assay (HC II) (microtiter plates) (better than HC I)

In situ hybridization practical to use low sensitivity

(non radioactive probes)

PCR high specificity and high risk of

sensitivity sample contamination