ONCOGENI

I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi:

1.Fattori di trascrizione

2.Rimodellatori della cromatina

3.Fattori di crescita

4.Recettori dei fattori di crescita

5.Trasduttri del segnale

6.Regolatori dell’apoptosi

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FATTORI DI TRASCRIZIONEI fattori di trascrizione (TF) sono spesso membri

di una famiglia multigenica che mostra dei domini strutturali comuni e molti di questi fattori per funzionare richiedono l’interazione con altre

proteine. Il TF regolano positivamente o negativamente l’espressione di determinati geni,

legandosi a specifiche sequenze di DNA (promoter, enhancer, silencer). Esempi di TF,

codificati anche da retrovirus sono c-myc, fos e jun.

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• c-mycIl gene myc è conservato in tutte le specie animali e fu inizialmente scoperto in diversi retrovirus responsabili

nell’induzione di sarcomi, carcinomi e leucemie mieloidi. La proteina codificata da myc è un fattore trascrizionale

(p64myc) presente nelle cellule in attiva proliferazione anche se myc svolge un ruolo importante anche

nell’indurre l’apoptosi. Myc è classificato tra i gene della pronta risposta insieme a fos e jun, indotti da fattori di

crescita mitogenici, con il ruolo di indurre la progressione dalla fase G0-G1 alla fase S del ciclo cellulare.

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• Myc e ciclo cellulare:

• cicline D, E e A

• geni che codificano per le CDK2 e CDK4

• gene dell’enzima ornitina-decarbossilasi (ODC), essenziale nel

metabolismo degli acidi nucleici

• reprime i geni delle CDKI (inibitori delle CDK)

• attiva i geni che codificano per E2F

• reprime il gene dell’inibitore delle CDK (p27KIP1).

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I LIVELLI ECCESSIVI DI MYC POSSONO INDURRE LA CELLULA AD ATTIVARE IL PROCESSO DI APOPTOSI.

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fos e jun

Il fattore di trascrizione fos (p55) dimerizza con il fattore di

trascrizione jun (p39) per formare il fattore di

trascrizione AP-1, il quale aumenta l’espressione di

diversi geni che controllano la divisione cellulare.

L’attività di AP-1 è indotta da fattori di crescita,

citochine, ormoni polipetidici, neurotrasmettitori,

interazione cellula-matrice, infezioni virali e batteriche e

da diversi stress fisici e chimici.

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AP-1 è un dimero composto da proteine della famiglia Jun (c-jun, JunB, JunD),

Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2).

Riconosce sequenze del DNA TGAG/CTCA o CRE (TGACGTCA)

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Stimoli attivano la cascata delle MAPK

(mitogen activated protein kinase) che

inducono l’attività di AP-1 attraverso la

fosforilazione delle chinasi ERK

(extracellular-signal-regulated kinase), le

quali traslocano nel nucleo e fosforilano

fattori di trascrizione che attivano fos

che si lega al fattore

jun, formando AP-1.

AP-1 attivazione trascrizionale

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AP-1

FATTORI DI CRESCITA

I fattori di crescita (GF) sono proteine di piccole dimensioni che stimolano la

proliferazione, il differenziamento, la sopravvivenza e la motilità cellulare. La

maggior parte dei GF hanno effetto positivo su questi fenomeni, anche se alcuni

come il TGF-b (trasforming growth factor beta) agiscono come segnale

inibitorio. Nell’ambito delle patologie tumorali molti geni che codifica per GF, si

comportano da oncogeni, in quanto subiscono mutazioni tali da indurre la

cellula ad una sovra-produzione del GF con conseguente attivazione di uno

stimolo proliferativo autocrino o paracrino.

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Attivazione della trascrizione di geni bersaglio che inducono proliferazione

cellulare e disassociazione delle E-caderine con conseguente perdita dei legami

cellula/cellula e stimolo della mobilità cellulare.

WNT SIGNALING

Insulin Growth Factor (IGF)

Fra i vari fattori di crescita che giocano un ruolo determinante nei vari processi che

inducono proliferazione cellulare, sopravvivenza cellulare e resistenza ai

chemioterapici e radioterapia c’è il sistema IGF (insulin growth factor). Il sistema

IGF consiste di due ligandi, IGF-I e IGF-II, tre recettori di membrana (IGF-IR, IGF-

IIR) e recettore dell’insulina (IR) e sei proteine di legame ad alta affinità (IGFBP 1-

6). I recettori IGF-IR una volta tradotti vengono glicosilati, dimerizzano e processati

in due subunità a e b che attraverso ponti disolfuro vanno a formare il tetramero

funzionante ( - - -b a a b) che viene trasportato in membrana. Attraverso la subunità

a che è extracellulare si ha il legame del IGF, con conseguente trasduzione del

segnale a livello intracellulare che consiste nella fosforilazione di residui di tirosina

in domini di tirosin chinasi.

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La cascata di attivazione comporta, principalmente, tre tipi si segnali:

1.attivazione del pathways del fosfatidilinositolo 3- chinasi (PI-3K), Akt, mTOR che

attiva la sintesi proteica e i meccanismi antiapoptotici mediante inattivazione

(fosforilazione) di Bad

2.attivazione del pathway di Ras/Raf1/MEK/ERK che induce proliferazione

cellulare

3.attivazione di altri meccanismi cellulari che inducono l’espressione di fattori di

crescita, citochine e integrine

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Inoltre il IGF-IR svolge un ruolo nel facilitare :

1.il passaggio dalle fase G0 a G1 mediante attivazione della p70 S6K,

che fosforila la proteina ribosomiale S6 che stimola l’insieme di proteine

ribosomiali necessarie a entrare nel ciclo cellulare.

2.Inoltre promuove anche il passaggio dalla fase G1 a S mediante

l’induzione dell’espressione della ciclina D1 e della CDK4, comportando

fosforilazione del fattore Rb.

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RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA

L’eccessiva stimolazione della proliferazione cellulare, nei tumori, dipende anche

dall’amplificazione o dalle mutazioni dei geni codificanti per i recettori dei fattori di

crescita, con conseguente aumento dell’espressione dei recettori o la sintesi di recettori

strutturalmente e funzionalmente modificati, con conseguente alterazione del segnale e

guadagno di funzione.

Tali recettori possono essere suddivisi in base ai residui presenti nella regione

citoplasmatica in: tirosinchinasici e serin/treoninchinasici

Nell’ambito dei tumori, i recettori tirosinchinasici (RTK) sono quelli maggiormente mutati

nei tumori e sono tra i geni codificati dagli oncogeni virali.

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I RTK si possono suddividere in:tirosinchinasi citoplasmaticherecettori con attività tirosinchinasica

I RTK sono suddivisi in diverse famiglie che si caratterizzano principalmente per la porzione aminoacidica extracellulare in:porzione ricca di cisteine come EGFR, IR, IGFRdomini simili a quelli delle Ig (Ig like motif), come PDGFR e FGFRdomini con sequenze di fibronectina combinate a sequenze Ig-like, come efrinaAR, efrinaBR, angiotensina .1Rdomini che reagiscono con le caderine in presenza di Ca2+nabissi 14

Attivazione dei recettori

RTK: Il sito catalitico, in posizione C-terminale ha attività proteinchinasica, ed è

costituito da tre regioni: 1) legante ATP, 2) attività fosfotransferasica,

3) contenente una proteinchinasi attivata da fosforilazione dopo legame del

ligando al recettore. Gli RTK sono presenti in stato inattivo come monomeri e

dimerizzano dopo interazione con il ligando. La dimerizzazione induce un

cambiamento conformazionale che attiva il sito catalitico con attività

tirosinchinasica, che induce fosforilazione nei siti catalitici che in altri residui.

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Il primo segnale dell’attivazione del recettore,

mediata dal ligando, e’ la fosforilazione nel dominio

citoplasmatico del recettore stesso, mediata dalla

dimerizzazione del recettore.

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receptor-directed protein-tyrosine phosphatases (PTPs)

L’autofosforilazione dei recettori genera siti

di fosforilazione i quali diventano siti

recettivi per proteine SH2 che includono

fosfolipasi C o GRB (growth factor receptor

bound). I domini SH3 agiscono poi come

domini di legame per domini ricchi in prolina

presenti in molecole effettrici che agiscono

come percorsi molecolari a valle.

Il legame ligando-recettore recluta proteine adattatrici contenenti SH2 domain

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Trasduzione del segnale

La posizione specifica delle tirosine presenti nei RTK è quella che rende che

condiziona le interazioni con specifiche proteine citoplasmatiche da fosforilare.

In particolare i domini SH2 presenti su specifiche proteine (proteine con attività

enzimatica) vengono fosforilate dai TRK o mediante proteine adattatrici che

facilitano il contatto con le proteine che sono substrato delle proteinchinasi. I

residui carichi positivamente, presenti nelle regioni SH2 reagiscono con i gruppi

fosfato (carichi negativamente) presenti sulle TK e permettono la formazione di

un complesso che attiva la proteina contenente il dominio SH2. Altri domini

proteici che interagiscono con le tirosine fosforilate sono i SH3 e PTB

(phosphotyrosin binding).

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• RAS è un oncogene coinvolto nella proliferazione cellulare ed

è composto da tre membri (H, K, N)-RAS. Sono proteine legate

nel lato citoplasmatico della cellula ed il loro ruolo è quello di

legate, nello stato inattivo GDP.

• Mutazioni puntiformi del gene Ras sono l’anomalia singola

piu’comune di oncogeni trasmesse come carattere autosomico

dominante.

RAS

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Queste proteine sono attivate dai RTK e passano continuamente da una

forma inattiva legante il GDP ad una forma attiva legante il GTP.

Le proteine ras sono state scoperte nei virus oncogeni :

K-ras-A, K-ras.B : sarcoma murino, il proto oncogene umano nel

cromosoma 12

H-ras: sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 11

N-ras: neuroblastoma e carcinomi umani, presente nel cromosoma 1

Il prodotto di questi geni distinti è molto simile e viene denominato p21ras

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Mutazioni nei geni ras hanno come conseguenza quella di ridurre

l’attività GTPasica, con conseguente mantenimento del GTP e

quindi prodotto attivo o mutazioni che facilitano il distacco del

GDP e conseguentemente ras attivo. Il risultato finale è che ras

rimane piu’ a lungo o costitutivamente attivo, stimolando la

proliferazione cellulare delle cellule tumorali.

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MUTAZIONE DI KRAS

Inactive KRAS

active KRAS

Inactive KRAS

GDP

GTPGDP

GAP

Downstream signal transduction cascade

+

Mutant KRAS active

+

GTP

GAP

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mutazioni attivanti RAS

mutationi RAS si riscontrano nel 30% dei tumori

HRAS1KRAS2NRAS

Ras-mut = GAP- refractory GTPase

Un’alta incidenza di mutazioni di K-RAS si riscontrano nei tumori al pancreas (70 –100%)

R-RAS

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Meccanismo di trasduzione di ras

Nel citoplasma delle cellule è presente una proteina denominato GRB-2 con

domini SH2/3 che gli permettono di formare un complesso con una proteina

denominata SOS (che è un fattore di scambio di nucleotidi guanidilici). Quando

la cellula riceve un segnale da un fattore di crescita che lega RTK, il complesso

GRB-2 SOS interagisce mediante i domini SH2/3 o PTB (phosphotyrosin

binding) ai residui fosforilati del RTK. Questo contatto permette il reclutamento

da parte di SOS della proteina ras (che lega il GDP), questo permette lo

scambio con il GTP e ras si attiva.

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Questa attivazione comporta la fosforilazione della serina/treonina chinasi raf-1 che a sua

volta fosforila una MAPKK (MEK) (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase) che a sua volta

fosforila una MAPK (ERK1/2) che trasloca nel nucleo, fosforila fattori di trascrizione, come c-

fos, myc e attiva la proteina ribosomiale S6, che attivano la trascrizione di geni coinvolti

nell’indurre la proliferazione cellulare o contribuiscono alla crescita cellulare. Quando ras

lega il GTP assume un cambiamento conformazionale che comporta anche il reclutamento

delle GTP-asi activating protein (GAPs) come la p120GAP e la neurofibromina1 (NF1) che

riportano ras nella forma legante il GDP.

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NF-1

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PI3-K pathways

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I pathways RAS, PI(3)K e mTOR formano una rete biochimica

intersecata che, quando mutata, guida la crescita cellulare in

maniera indipendente dall’ambiente circostante. Questi pathways

guidano la tumorigenesi attraverso la fosforilazione coordinata di

proteine che attivano la progressione del ciclo cellulare, la

regolazione della sintesi di proteine e di fattori trascrizionali che

regolano l’espressione di geni coinvolti in questi processi.

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Il pathway PI(3)-chinasi.

PI(3)K è attivato sia da RAS che da RTK e di seguito attiva diversi

pathways a valle attraverso la generazione del secondo messaggero

lipidico fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P3. In particolare la

famiglia di chinasi serina-treonina AKT è considerata come il principale

bersaglio di PI(3)K nei tumori.

Esistono tre classi di PI(3)Ks, ma sembra che solo il sottogruppo IA-PI(3)K

sia coinvolto nei tumori. IA-PI(3)K sono eterodimeri composti da una

famiglia di subunità regolatorie (p85) e di subunità catalitiche (p110).

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Sono capaci di fosforilate l’anello inositolico del lipide di membrana fosfatidil-

inositolo 4,5 bifosfato per generare il secondo messaggero PtdIns(3, 4, 5)P3.

Inoltre le subunità p85 contengono dei domini che legano specifici residui nella

regione citoplasmatica dei RTKs, questo legame permette di generare un pool

locale di PtdIns(3, 4, 5)P3. Le subunità p110 possono legarsi direttamente ed

attivare RAS.

Una delle famiglie maggiormente attivate da PtdIns(3, 4, 5)P3 sono le

serine/treonine chinasi AKT. AKT controlla il ciclo cellulare, la sopravvivenza e la

crescita cellulare attraverso la fosforilazione di diversi substrati.

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Regolazione del pathway PI3K

Per i tumori con lesioni genetiche definite,

l’abilità di superare un dato bersaglio terapeutico

è data dalla capacità di acquisire altre mutazioni

che superano l’effetto del farmaco o effettori

biochimici del pathway mutato o di up-regolare il

pathway disregolato.

a) l’attivazione del fattore IF4E e HIF,

inizialmente determinato dal pathway Ras/Akt e

bloccata con Rapamicina risulta inefficiente

causa attivazione di pathways alternativi.

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b) In tumori con lesioni iniziali in PI(3)K o altri regolatori di mTOR non hanno vie

alternative per attivare IF4E and HIF. Questi tumori rispondono a Rapamicina

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c) In tumori che esprimono EGFR e ERBB3 inibitori dell’eterodimero bloccano la via delle IP3K.

d) Nei tumori dove ERBB3 non è espresso la via IP3K è regolata da altre vie e gli inibitori non funzionano

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PTEN è una fosfatasi che lega e distrugge PIP3 convertendolo in PI(4,5)P2 o PI(3,4)P2

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mutazioniPTEN

Prostatic carcinomas – PTEN mutato negli stadi avanzati.Le cellule PTEN-negative cells diventano andrigeni resistenti

E tendono a metastiizzare

carcinoma mammario: inattivato 15-30%

GLIOMA: mutazioni di PTEN sono indice di aggressività

Carcinoma follicolare della tiroide (25%),

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EGF RECEPTOR

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EGF-R

EGF-R ha un ruolo importante nell’ambito di diverse patologie tumorali in quanto

la sua attivazione costitutiva lo rende responsabile dell’attivazione di meccanismi

di proliferazione cellulare. L’omologo del protoncogene EGF-R è stato scoperto

nel virus dell’eritroblastosi aviaria e denominato v-erb. L’analisi della sequenza

aminoacidica di v-erb ha dimostrato che questo oncogene virale codifica per una

proteina (gp65) che è simile ad una parte del EGFR, quindi è un recettore

troncato della porzione extracellulare responsabile del legame a EGF, ma

contenente la porzione citoplasmatica con attività tirosinchinasica che è

costitutivamente attiva. I pathways principalmente attivati dall’attivazione di

EGF-R sono quello di Ras/MAPchinasi e PI3 chinasi/AKT, che agiscono entrambi

nella mitogenesi e sopravvivenza cellulare.nabissi 14

ATTIVAZIONE DEI SEGNALI INTRACELLULARI EGFR-DIPENDENTI

1)Legame del ligando specifico nella porzione extracellulare del EGFR

2)Formazione dell’omodimero o eterodimero che causa la fosforilazione

ATP-dipendente di specifici residui di tirosina nel dominio intracellulare di

EGFR

3)Attivazione dei pathways intracellulari:

1) Ras-Raf-MEK-MAPK che controllano la progressione della fase

G1/S

2) PI3K-Akt che attiva una cascata antiapoptotica e di sopravvivenza

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EGFR è un recettore appartenente ad una famiglia di quattro recettori.

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Tre diverse strategie terapeutiche per interagire con tale sistema e inibire la trasduzione dei segnali proliferativi :•Uso di anticorpi monoclonali antirecettore che si legano alla porzione extracellulare della molecola recettoriale e impediscono il legame con il ligando•Uso di farmaci inibitori selettivi della tirosinchinasi associata al recettore•Uso di farmaci che agiscono sulle fasi piu’ avanzata della cascata della trasduzione del segnale come i farmaci che interagiscono con le proteine della famiglia RAS (inibitori della farnesiltrasferasi)

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Meccanismo d’azione dei farmaci Anti-EGFR

Le conseguenze sono:

- Arresto delle cellule in fase G1 con incremento di p27 (inibizione delle CDK)

-Inibizione dell’angiogenesi tramite il blocco della sintesi di TGFa, VEGF, IL-8,

FGF.

-inibizione dell’invasività e delle metastasi

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Meccanismo dei Anti-EGFR Monoclonal Antibodies.

L’anti-EGFR cetuximab, che è una immunoglobulina IgG1 induce immunorisposta

anticorpo dipendente, citotossicità cellulo-mediata (Panello A). Inoltre gli anticorpi

anti-EGFR inducono internalizzazione del recettore e down-regolazione

incrementando la sua degradazione (Panello B).

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Nella FISH il centromero del cromosoma 17 e' marcato con un segnale fluorescente verde e il gene HER-2 con un segnale fluorescente arancio. In breve si contano circa 60 nuclei cellulari e in ognuno di essi si fa il rapporto tra segnale verde e segnale arancio.Il tumore e'definito "positivo" per l'amplificazione genica quando il rapporto gene/cromosoma e'>2

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Tipo di Neoplasia % espressione EGFRVescica 31-48%

Mammella 14-91%

Utero 90%

Colon 25-77%

Esofago 43-88%

Stomaco 4-33%

Glioma 40-63%

Testa-collo 80-100%

Ovaio 35-70%

Pancreas 30-89%

Prostata 40-85%

Rene 50-90%

Polmone 40-80%

Percentuali di tumori EGFR+

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