Variazioni epigenetiche

•Imprinting;

•Inattivazione cromosoma X (lyonizzazione);

•Effetto posizione.

•Inattivazione centromerica (eterocromatina);

Modifiche ereditabili, che può riguardare un cromosoma o l’attività di un gene, che non varia la sequenza nucleotidica.

• L’imprinting genomico consiste nella espressione allelica differenziale e parentale-specifica.

Cromosoma materno

gene ”X” trascrizionalmente attivo

Cromosoma paterno

gene”X” trascrizionalmente inattivo

Caratteristiche principali della seq. di DNA dei geni “imprinted”:

• % elevata di CpG islands (bersaglio della metilazione);

• Sequenze ripetute vicino alle CpG islands;

• Legame parentale-specifico di particolari complessi proteici responsabili delle modifiche epigenetiche;

• ImprintingControlRegions in alcuni clusters di geni “imprinted”.

Altre caratteristiche epigenetiche delle regioni “imprinted”:

• Differenze nella frequenza della ricombinazione meiotica vicino o internamente ai clusters “imprinted”;

• Asincronia nella fase S del ciclo cellulare;

Non si conosce ancora la relazione tra queste caratteristiche ed il grado di metilazione o la

struttura della cromatina.

Metilazione differenziale degli alleli parentali (DMRs)

• La metilazione influisce sul grado di espressione genica in modo variabile: la metilazione può riguardare la copia inattiva o attiva del gene (es. gene Igf2).

CpG

CpG

Metilazione

Allele 1 (espresso)

Allele 2

(a) Promoter methylation

MDBs?

CpG Igf2r

CpG Igf2r

CpG Air

CpG Air

Allele materno (espresso)

Allele paterno

(b) Antisense transcripts

(c): Silencing factors

CpG of Igf2

CpG of Igf2

Allele paterno (espresso)

Allele materno

Repressore

Metilazione

Fattori coinvolti

•DNA cytosine methyltransferases (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b);

•Methyl-CpG-binding proteins (MECP2);

•Histone-modification enzymes (H3-K4 methyltransferases, H3-K9 methyltransferases),

•Histone acetyltransferase enzymes (GCN5/PCAF);

•ATP-dependent remodelling complexes (ISWI);

Alcuni geni sottoposti ad imprinting•Chr1 (p73);

•Chr5 (U2AFBPL);

•Chr6 (MAS1; M6P/IGF2R..);

•Chr7 (GAMMA2-COP..);

•Chr11 (H19;IGF2;INS..);

•Chr13 (HTR2A);

•Chr14 (MEG3/GTL2);

•Chr15 (GABRA5;GABRB3;NDN;PAR1;PAR5;SNRPN;UBE3A)

•Chr18 (IMPACT);

•Chr19 (PEG3);

•Chr20 (GNAS1;NEURONATIN)

•ChrX (XIST).

Imprinting genomico

•Cos’è l’imprinting?

•Meccanismi molecolari responsabili dell’imprinting;

•Regione 15q11-13 e sindromi di PraderWilli-Angelman;

•Modifiche epigenetiche nella regione critica 15q11-q13.

•Geni espressi paternamente: SNRPN locus

(snoRNA cluster), necdina, PAR1, PAR5, PAR7;

•Geni espressi maternamente: UBE3A;

Imprinting nella regione 15q11-q13

(K.O. e studio di mutazioni)

SNRPN UBE3A

•Maturazione mRNA;•10 esoni;•SNRPN locus > 460kb;•Espressione monoallelica nel cuore (feto) e nel cervello (feto e adulto).

•Ubiquitina transferasi;•10 esoni;•Locus > 60kb;•Espressione monoallelica (cervello).

Prader-Willi (PWS)/Angelman syndrome (AS)

Cromosoma 15q11-q13 (mouse 7C-D1);

PWS (MIM 176270) AS (MIM 105830)

• Ritardo mentale;• Obesità;• Ipotonia muscolare;• Ridotta attività fetale;• Bassa statura;• Ipogonadismo

• Ritardo mentale;• Ritardo motorio;• Atassia;• Epilessia;• “Absence of speech”;• Facies tipica

UBE3A SNRPN

Modifiche epigenetiche

tel cen

UBE3A SNRPNtel cen

Angelman syndrome

Prader-Willi syndrome

ICR (Impriniting Control Region) nella PWS/AS

•AS-SRO (0,88Kb), 35Kb upstream SNRPN promoter

Fig.1a pubblicazione di Perk

•PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1

AS-SRO e PWS-SRO costituiscono un “imprinting box” che regola l’intero dominio 15q11-q13 su entrambi i

cromosomi

Modifiche epigenetiche allele-specifiche

AS-SRO sul chr paterno

PWS-SRO sul chr materno

UBE3A non espresso SNRPN non espresso

Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO.Livelli di metilazione allelica

A differenza di quanto atteso, i livelli di metilazione della AS-SRO è simile in entrambi gli alleli

ER+ Southern blot

ASAS

Met

Osservazioni:

•Forse il livello di metilazione della AS-SRO non costituisce un meccanismo chiave nell’imprinting;

Accessibilità maggiore nel locus materno.

Caratteristiche della cromatina AS-SRO:accessibilità alla Dnasi I.

Dnasi I

Metilazione H3(K4) e

acetilazione H3 e H4 maggiori a livello materno

Caratteristiche epigenetiche differenziali.

ChIP assay

•Struttura cromatinica più accessibile sul cromosoma materno;

Caratteristiche epigenetiche della AS-SRO

•Metilazione materna H3 (K4)

•Acetilazione materna H3 e H4

Espressione genica allele-specifica

SNURF-SNRPN gene locus

PWS-SRO (4,3Kb), SNRPN promoter/exon1

•ChIP assay

(Ab anti-acetylated H3 e H4 histone)

•PCR

Acetilazione istonica (espressione genica)

Prodotto di PCR

Cromosoma paterno

Deacetilazione istonica

Prodotto di PCR

Cromosoma materno

ChIP assay

L’acetilazione istonica H3/H4 è limitata alla regione 5’ del locus SNURF-SNRPN

CpG island

SNRPN

Copia attiva del gene

Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNRPN

•Acetilazione istonica

•Metilazione

•Acetilazione istonica

•Metilazione

Copia inattiva del gene (“imprinted”)

•ChIP assay Ab anti-acetylated H3 e H4 histone

•M-PCR: amplificazione del DNA non metilato

Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP

Prodotto di M-PCR

Cromosoma paterno

Deacetilazione istonica

No prodotto di M-PCR

Cromosoma materno

Acetilazione istonica

Relazione tra acetilazione istonica e metilazione della CpG island del locus SNURF-SNURP

La copia attiva del gene (paterna) è caratterizzata da

acetilazione istonica e metilazione

ChIP assay e M-PCR

Conclusioni

AS-SRO (copia materna,

trascrizionalmente attiva)

•Suscettibilità alla DNAsi I;•Acetilazione istonica H3-H4;•Metilazione istonica H3(K4);

PWS-SRO (copia paterna,

trascrizionalmente attiva)

•Suscettibilità alla DNAsi I;•Acetilazione istonica H3-H4;•Metilazione istonica H3(K4);•Metilazione CpG island.

Modifiche epigenetiche che garantiscono l’espressione allelica

differenziale

Esiste un’influenza della AS-SRO PWS-SRO?

La delezione della AS-SRO, esclusivamente a livello materno, è in grado di influenzare lo stato di

metilazione della PWS-SRO;

ER+Southern blotMet

PWSAS

Caratteristiche strutturali della cromatina nella PWS-SRO:

La delezione materna della AS-SRO rende la

PWS-SRO materna accessibile alla Dnasi I

Dnase I assay + Southern blot

AS

Modifiche epigenetiche differenziali della PWS-SRO:

La delezione materna della AS-SRO influisce considerevolmente sullla metilazione istonica del locus PWS-SRO, mentre è ininfluente sull’acetilazione istonica.

ChIP assay

La presenza della AS-SRO sul cromosoma materno interviene nei meccanismi di imprinting che agiscono sulla PWS-SRO.

Influenza della AS-SRO sulla PWS-SRO

Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO

L’assenza della PWS-SRO, sia materna che paterna, non influisce:

•Sul tasso di metilazione della AS-SRO;•Sulla suscettibilità della AS-SRO alla DNasiI;•Sul tasso di acetilazione istonica a livello della AS-SRO.

Dnasi I assay

Influenza della PWS-SRO sulla AS-SRO

ER+Southern blot

ChIP assay

Conclusioni

•La AS-SRO materna ha un ruolo importante nel determinare una struttura cromatinica “chiusa” della PWS-SRO materna (DNasiI/ChIP).•L’attività della AS-SRO sulla PWS-SRO non è l’unico meccanismo in grado di sostenere l’imprinting della PWS-SRO (acetilazione istonica).

La AS-SRO probabilmente acquisisce un’espressione differenziale prima della PWS-SRO

Conclusioni

Gli oociti subiscono metilazione differenziale

durante la loro maturazione

Entrambi i tipi di gameti non presentano

metilazione della PWS-SRO