Vantaggi e limiti della NIPT

Convegno. “Sindrome di Down dalla Diagnosi alla Terapia”

Napoli, 19-20 Ottobre 2018

Simona CavaniS.C. Laboratorio di Genetica Umana – E.O. Ospedali Galliera

Rosaliartbook

Materiale genetico fetale nel sangue materno

Anomalie cromosomiche

Incompatibilita’ Rh - MEN

Malattie geniche

Determinazione Sesso fetale

Cellule fetali circolanti nel sangue materno

•Cellule del trofoblasto

•Cellule nucleate della serie rossa del sangue

•Leucociti

•Cellule staminali mesenchimali

1970 - 1996

•Scarsa quantita’ 1/107 cellule nucleate materne – n°1-3/ml di sangue

•Difficolta’ di isolamento -per via meccanica (es: gradients, single cell manipulation, high specificity sorting)

-per via biochimica (es: antigens, mRNA, fetal specific protein)

•Lunga permanenza nella madre anche anni

•Difficolta’ di analisi Fish, Cariotipo, QF-pcr, CGH-SNP, NGS

Bassa Sensibilita’ e Specificita’NIFTY = National Institute of Child Health and Human Development Fetal Cell Isolation Study

multicenter clinical project to develop non-invasive methods of PD

DNA fetale libero circolante nel sangue materno (cffDNA)

1997

•origina dalla placenta (apoptosi cellule del citotrofoblasto)

•rilevabile dalla 5°-7° settimana

•aumenta nel corso della gravidanza

•~10% del DNA libero circolante totale

•970 volte di piu’ rispetto a DNA fetale cellulare

•frammenti 145-200 paia di basi

•assente a 24h dal parto (emivita 20’)

2008

Taglauer et a., Placenta,2014, 36, S64-68

2011 Commercializzazione primi test NIPT per aneuploidieGennaio - Cina

Dicembre - USA

NIPT per le piu’comuni aneuploidie fetali(Non Invasive Prenatal Testing per trisomie 13, 18, 21)

NO LEA

NIPT – Test Commerciale

NIPT – Test Prenatale Non Invasivo

Isolamento

plasma

Prelievo di sangue

(5-10ml)Estrazione DNA

libero circolante(madre + feto)

Amplificazione cfDNA(madre + feto)

NGS•Sequenziamento

•Allineamento

•Conta sequenze

Analisi bioinformaticaReferto

2 – 14 giorni

NGS

Illumina Ltd

NGS

•576 marcatori SNP NON polimorfici (13, 18, 21)

•192 marcatori SNP polimorfici (cr. 1-12)

NGS – DANSR (Digital Analysis of Selected Regions)

Analisi NGS

5% del DNA genomico

Analisi NGS

Conta

1ml plasma = cfDNA equivalente a 100 cellule (~90% materno – ~10% fetale)

Gravidanza normale

Cr.21 materni

2x90=180

Cr.21 fetali

2x10=20

Totale cr.21= 200

Gravidanza tri 21

Cr.21 materni

2x90=180

Cr.21 fetali

3x10=30

Totale cr.21= 2100,05%

(Paerinatal)

No gravidanza

Gravidanzanormale

GravidanzaTri 21

cfDNA feto

cfDNA madre

Analisi NGS

Analisi bioinformatica

N° di “READS”

cfDNA – Quantita’

cfDNA = ~90% materno – ~10% fetale

10ml di sangue

5.5ml di siero

6ng – 50ng cfDNA

10ml di sangue in toto 300ng – 1.500ng DNA

cffDNA – Settimane di gestazione

(Wang et al, Prenat Diag. 2013)

NIPT >10° sett. di gestazione

www.depositphoto.com

cffDNA - BMI

(data from Labor Enders, Stuttgart, Harmony Test)

> diluizione con aumento della massa corporea> rilascio cfDNA materno dalle celule adipose (Bianchi et.al.,2012)

colourbox.com

Altri Fattori che influenzano la Frazione Fetale

Materni:

-anomalie cromosomiche

-trapianto allogenico d’organi

-terapia con cellule staminali allogeniche

-emotrasfusione

-tumori

Della gravidanza:

-Fecondazione assistita mediante ovodonazione

-Gravidanze gemellari

-Vanishing twin

Fetali:

-Trisomia 21: aumento FF

-Trisomie 13/18: < cffDNA per riduzione volume placentare (Rava et al.,2014 – Wegrzyn et al.,2005)

2% NIPT nel I trimestre NO RISULTATO per bassa Frazione Fetale

Quantificazione cffDNA

SNPsValutazione

polimorfismi di singoli nucleotidi

FrammentiValutazione

quantita’ frammneti 145-200bp

Nessuna

Report

Mosaicismo

Casistica Casi Mosaici (%)

II trimestre

USA (1984)

Europa(1984)

Canada (1984)

62.279

44.170

12.386

0,25

0,10

0,30

I trimestre

Vejerslev (1989)

C.E.S.C.A. (1988)

11.855

3.354

1,18

1,20

1% mosaicismo

Cromosoma Sensibilita’ Falsi negativi Specificita’ Falsi positivi

21 99,7% 0,3% 99,96% 0,04%

18 97,9% 2,1% 99,96% 0,04%

13 99,0% 1,0% 99,96% 0,04%

NIPT per trisomie 21, 18, 13

Gil et al., 2017

Trisomia 21

In pratica……

NIPT per trisomie 21, 18, 13

Cromosoma Sensibilita’ Falsi negativi Specificita’ Falsi positivi

21 99,7% 0,3% 99,96% 0,04%

18 97,9% 2,1% 99,96% 0,04%

13 99,0% 1,0% 99,96% 0,04%

VANTAGGI

•SICURO = prelievo di sangue (non invasivo)

•ACCURATO = sensibilita’ e specificita’ elevate

•PRECOCE = dalla 10° sett. di gestazione

•RAPIDO = risultato in 2-14gg

LIMITI•LIMITATO ai crom. analizzati (% anomalie CC)

•FALSI NEGATIVI/POSITIVI

•NO RISULTATO ~2%

•GEMELLARITA’ = no analisi singolo gemello

•RISULTATI ALTERATI da det. condiz. materno/fetali

Gil et al., 2017Popolazione a basso rischio < VPP

NIPT per trisomie 21, 18, 13

NIPT per trisomie 21, 18, 13

NIPT per altra anomalie cromosomiche

DR FPR

Monosomia X 90.3% 0.23%

Altra Anom. Cr.Sex (XXX, XXY, XYY) 93.0% 0.14%

Gil et al., 2015

DR VPP

Microdelezioni 62-95% 7%

Wapner et al., 2014Sequenom, 2014

Studio cffDNA – Altre applicazioni

• Determinazione del sesso fetale (ricerca SRY)

-malattie legate all’X (es:DMD)

-iperplasia congenita dei surreni (sindrome adreno-genitale)

-gestione feti con ambiguita’ genitali

• Determinazione Rh-D fetale (in madri Rh- con partner Rh+)

• Malattie Autosomiche Dominanti ad insorgenza de novo o ereditate dal

padre (es: acondroplasia, displasia tanatofora, S. di Apert)

• Malattie Autosomiche Recessive con ricerca della mutazione paterna (es:

fibrosi cistica, talassemia)

NIPT – Altre applicazioni?????

NIPT – Altre applicazioni?????

NIPT – Altre applicazioni?????

Unita di Fisiopatologia Fetale – E.O. Ospedali Galliera

Ubaldo Passamonti

Bianca Rocca

Gloria Fondacaro

Michela Malacarne

Roberto Ferrari

Chiara Cavallini

Ilaria Russo

Guido Zerega

Lorella Stagni

Giuseppe Piombo

Antonella Pandullo

Domenico Coviello

Grazie per l’attenzione

Laboratorio di Genetica Umana – E.O. Ospedali Galliera