«Utilità ed approccio pratico della tecnica FISH nella diagnosi dei Sarcomi»

Dott.ssa Aquino GabriellaBiologa S.C Anatomia

Patologica e Citopatologia

Micro Gap Technology Non-Biological Probe production

More genes simultaneously Automation, Digitalization

FISH-improvements

Classificazione dei tumori delle parti molli

2002 2013

• Gruppo di neoplasie eterogenee -> difficoltà di classificazione• WHO Classification (2013) 117 forme benigne e maligne•Diagnosi complessa

DIAGNOSTICO PROGNOSTICO PREDITTIVO RICERCA

Ruolo della FISH nei Sarcomi

Valutare la probabilità di risposta del tumorea determinati tipi di trattamento.

-Presenza o estensione di un tumore prima durante e dopo terapia

-Difficoltà nella distinzione tra lesioni benigne e maligne

Diagnosi differenziale tra istotipi con caratteristiche morfologiche/immunofenotipiche simili.

Valutare la aggressività biologica del tumore;

Ricerca di aneuploidie e nuovi riarrangiametiin campo oncologico

DIAGNOSTICO PROGNOSTICO PREDITTIVO RICERCA

Ruolo della FISH nei Sarcomi

Valutare la probabilità di risposta del tumorea determinati tipi di trattamento.

-Presenza o estensione di un tumore prima durante e dopo terapia

-Difficoltà nella distinzione tra lesioni benigne e maligne

Diagnosi differenziale tra istotipi con caratteristiche morfologiche/immunofenotipiche simili.

Valutare la aggressività biologica del tumore;

Ricerca di aneuploidie e nuovi riarrangiametiin campo oncologico

TERAPIE ORIENTATE

SULL’ISTOTIPO

LEIOMIOSARCOMA UTERINO

GEMCITABINA+TAXOTERE

LEIOMIOSARCOMA DACARBAZINA

LEIOMIOSARCOMA TRABECTIDINA

LIPOSARCOMA MIXOIDE

TRABECTIDINA

CELLULE ROTONDE VINCRISTINA + ETOPOSIDE

RABDOMIOSARCOMA IRINOTECAN

MPNST (tumore maligno delle guaine nervose periferice)

IFOSFAMIDE+ ETOPOSIDE

SARCOMA SINOVIALE PAZOPANIB

TERAPIE ORIENTATE SULL’ ISTOTIPO

Filtro diagnostico e

clinico

384 cases

Classificazione molecolare SarcomiTumor type Fusion Alveolar rhabdomyosarcoma PAX3-FOXO1, PAX7-FOXO1, PAX3-FOXO4, PAX3-

NCOA1, PAX3-NCOA2, PAX3-INO80D, VGLL2-CITED2

Alveolar soft-part sarcoma ASPSCR1-TFE3 Aneurysmal bone cyst CDH11-USP6, THRAP3-USP6, CNBP-USP6, OMD-

USP6, COL1A1-USP6, THRAP150-USP6, ZNF9-USP6

Angiomatoid fibrous histiocytoma EWSR1-AFT1, EWSR1-CREB1, EWSR1-CREM, FUS-ATF1

BCOR-rearranged Sarcoma BCOR-CCNB3, ZC3H7B-BCOR, BCOR-MAML3 CIC-rearranged sarcoma CIC-DUX4, CIC-FOXO4, CIC-NUTM1 Clear-cell sarcoma EWSR1-AFT1, EWSR1-CREB1, EWSR1-CREM, FUS-

CREM Desmoplastic small round-cell EWSR1-WT1 Epithelioid hemangioendothelioma WWTR1-CAMTA1, YAP1-TFE3 Epithelioid neoplasm with Gli1 rearrangement PTCH1-GLI1; MALAT1-GLI1 Ewing sarcoma EWSR1-FLI1, EWSR1-ERG, EWSR1-ETV1, EWSR1-

FEV, FUS-ERG, FUS-FEV, EWSR1-ETV4 Undifferentiaded small round cells Sarcoma EWSR1-NFAT2, EWSR1- SMARCA5, EWSR1-SP3,

EWSR1-PATZ1, CRTC1-SS18, TPM3-NTRK1, LMNA-NTRK1

Extraskeletal myxoid chondrosarcoma EWSR1-NR4A3, RBP56/TAF15-NR4A3, TCF12-NR4A3, TFG-NR4A3

Low-grade fibromyxoid sarcoma FUS-CREB3L1, FUS-CREB3L2 Mesenchymal chondrosarcoma HEY1-NCOA2, IRF2BP2-CDX1, NUPIO7-LRG5 Myoepithelial tumor of soft tissue and bone EWSR1-POU5F1, FUS-POU5F1, EWSR1-ZNF444,

EWSR1-PBX1, EWSR1-PBX3, FUS-KLF17 Myxoid/round-cell liposarcoma FUS-DDIT3, EWSR1-DDIT3 Synovial sarcoma SS18-SSX1, SS18-SSX2, SS18-SSX4, SS18L1-SSX1,

SS18-REPS2-SSX1 Sclerosing epithelioid fibrosarcoma FUS-CREB3L1, FUS-CREB3L2 Angiofibroma AHRR-NCOA2 Biphenotypic sinosal Sarcoma PAX3-MAML3 Congenital/infantile fibrosarcoma ETV6-NTRK3, EML4-NTRK3 Chondroid lipoma C11orf95-MKL2 Dermatofibrosarcoma protuberans COL1A1-PDGFB Low grade Endometrial stromal sarcoma JAZF1-SUZ12, JAZF1-PHF1, EPC1-PHF1, MEAF6-

PHF1 High grade Endometrial stroma Sarcoma YWHAE-NUTM2, FN1-ALK, ZC3H7B-BCOR Inflammatory myofibroblastic tumor TPM3/4-ALK, CLTC-ALK, RANBP2-ALK, CARS-ALK,

ATIC-ALK, SEC31A-ALK, PPFIBP1-ALK, NAB2-PDGFRB, TFG-ROS1, YWHAE-ROS1, EML4-ALK, PRKAR1A-ALK, LMNA-ALK, TFG-ALK, FN1-ALK

Leiomyomas (gastrointestinal) FN1-ALK Lipoblastoma COL1A2-PLAG1, HAS2-PLAG1 Lipoma HMGA2-LPP Meningeal hemangiopericytoma/ Solitary fibrous tumor

NAB2-STAT6

Myxoinflammatory fibroblastic sarcoma/ Pleomorphic Hyalinizing Angiectatic Tumor/ Hemosiderotic Fibrolipomatous Tumors

FBXW4-TGFBR3, TOM1L2-BRAF

Nodular fasciitis MYH9-USP6, HMGA2-LPP Pecoma SFPQ-TFE3 Perycitoma ACTB-GLI1 Spindle cell rhabdomyosarcoma SRF-NCOA2, TEAD1-NCOA2 Tenosynovial giant-cell Tumor COL6A3-CSF1

2002

2013

2020

Commercial FISH PROBE

SARCOMA DI EWINGLa t(11;22)(q24;q12) è la prima traslocazione associata ad un sarcoma ad esser stata caratterizzata a livello molecolare (Delattre et al. 1992).

EWS-FLI190%

EWS-ERG5%

RGG box (RNA-binding domain) 656Aa

EWSR (22q12) FLI1 (11q24) ERG (21q22)Trascription factors

ETS box domain

Famiglia di Fattori TrascrizionaliDominio di legame al DNA C-terminale

RNA binding protein 1Dominio TAD N-terminale

SARCOMA DI EWING

Ulteriori indagini molecolari

EWSR1-NFATC2

EWSR1-UNUSUAL PATTERN

EWSR1-NFATC2

EWSR1-NFATC2

RT-PCREWSR1-FLI1 and EWSR1-ERG

NEGATIVE

Gene Promiscuity

Geneticamente differenti, ma clinicamentente identici

Gene Promiscuity

Geneticamente differenti, ma clinicamentente identici

Geneticamente Identici, ma clinicamente differenti

Ewing Sarcomat(11:22) (q24;q12) FLI1-EWSR1

ES vs Condrosarcoma mesenchimaleNR4A3 (TEC) vs FLI1

ES vs Sarcoma Desmoplastico a cellule rotondeWT1 vs FLI1

ES vs Sarcoma sinoviale scarsamente differenziato

FISH SS18

EWSR1 (R)

EWSR1-FLI1 (R)

Traslocazioni EWSR1

EWSR (22q12)

WT1 (11p13)

üSarcoma Desmoplastico a cellule rotonde

NR4A3 (TEC) (9q22)

üCondrosarcomamixoide

extrascheletrico

üSarcoma a cellule chiare

üIstocitoma (AFH)üCarcinoma

ialinizzante delle ghiandole salivari

ATF (12q13)/CREB1 (2q32) DDIT3 (CHOP)

üLiposarcomamixoide

CREB3L2 (7q33)

CREB3L1 (11p11)

üSarcoma fibromixoide di

basso grado

CUSTOMCUSTOM

Zyto Light

SPEC NR4A3Dual Color Break Apart

Probe

ZZyto Light

SPEC WT1 Dual Color Break Apart

Probe

Zyto Light

SPEC DDIT3 Dual Color Break Apart

Probe

SMALL ROUND CELL SARCOMA

ES98% t EWSR1-ETS

ESLEWSR-

IHCMorphology

MOLECULAR STUDIESFISH

CIC-DUX4

BCOR-CCNB

3

Clinically Different

SMALL BY

Undifferentiated

CIC-rearranged sarcoma

G. W. Charville et al Modern Pathology 2017

Synovial sarcoma

Diagnosi differenziale:

SCHWANNOMA,

FIBROMATOSI

SUPERFICIALE,

FIBROSO SOLITARIO,

SPINDLE CELL

CARCINOMA,

SPINDLE CELL

MELANOMA,

LEIOMIOSARCOMA,

SCHWANNOMA

MALIGNO

EWING SARCOMA

Rimodellamento della cromatina

SSX (Xp11.2)SYT(18q11.2)

CoattivatoreTrascrizionale

RepressoreTrascrizionale

Ruolo sconosciuto

• Circa il 5-10% dei sarcomi dei tX molli

• Più del 95% t(X;18)(p11.2;q11.2), SS18-SSX1, SS18-SSX2 e raramente SS18-SSX4

• <5% dei Sarcoma Synoviale può presentare una fusion alternativa SS18L1/SSX1 o riarrangiamento criptico.

SS18-UNUSUAL PATTERN

>1F+>2O

1F+1O

2F+1/2 O

>2F+>2O

SS18-SSX1 (80%)SS18-SSX2 (20%)

ZytoLight ® SPEC SS18/SSX1 TriCheckTM Probe

SS18-SSX2

SS18 translocationwithout involvement

of SSX1,2,4

SS18-SSX1or

SS18-SSX4NORMAL

M. El Beaino, Ann Surg Oncol (2017)

SS18-SSX1 associate a d un comportamento biologico più aggressivo

rispetto a SS18-SSX2

.SS18-SSX1 associate a tumori bifasici

con un alto Ki67, SS18-SSX2 associate a tumorimonofasico con un basso Ki67.

SS18/SSX1

NGS

1 23

FISH

4

+26 seq

Quando?Discrepanza tra morfologia/IHC vs FISHSarcomi indifferenziatiDiagnosi differenziale tra differenti entità che necessitano di più di 3-4 FISH Materiale scarso

ADIPOCYTIC NEOPLASM

Includono sia lesioni benigne (Lipoma) che maligne (Liposarcoma)

Liposarcoma ben differenziato (WDLPS):-localizzazione retroperitoneale-presenza di adipociti maturi proliferanti frammisti a lipoblasti e cellule stromali atipiche.

Liposarcoma dediferrenziato(DDLPS): -localizzazione retroperitoneale-assenza di adipociti maturi.-Tendenza alla metastatizzazione.

Amplificazione della regione 12q13-12q15 in cui mappano i geni HGMA2 (riscontrata nel 76% dei casi), MDM2 (95%) e CDK4 (80%).

MDM2/CEN 12 Dual ColorProbe

LIPOSARCOMA BEN DIFFERENZIATO (WDL)LIPOSARCOMA DEDIFFERENZIATO(DDLPS)

FISH Gold standard

IHC Aspecifico

Alti livelli di amplificazione di MDM2 sono associati ad una peggior DFSIn DDLPS Amplificazioni di MDM2 e CDK4 si associa ad elevato rischio di recidiva locale (47% VS 12,5% in caso di sola amplificazione di MDM2)

Chop +Fus +

Chop +Fus -

Chop -Fus +

EWSR1+Liposarcoma Mixoide Sarcoma fibromixoide

di basso gradoà RT-pcr

CREB3L2 (7q33)

CREB3L1 (11p11)

Differential Diagnosis•Lipomatous tumors•Other myxoid neoplasms

• Aggressive angiomyxoma

• Intramuscular myxoma• Juxta-articular

myxoma• Low grade

myxofibrosarcoma• Extraskeletal myxoid

chondrosarcoma• Small round blue cell

tumors

LIPOSARCOMA MIXOIDE

ZytoLight ® SPEC DDIT3 DC/BAZytoLight ® SPEC FUS DC/BA

t(12;16)(q13;p11) >95%DDIT3-FUS With 11 isoforms

t(12;22)(q13;q12) <5%DDIT3-EWSR1

With 4 different isoforms

Liposarcoma mixoide

t(12;22)(q13;q12)DDIT3- EWSR1 t(11;16)(p11;p11)

FUS/CREB3

t(12;16)(q13;p11) DDIT3-FUS

-Localizzazione a livello degli arti

-Presenza di lipoblasti a diverso stadio di differenziazione di forma rotonda/ovale.

-Tumore aggressivo con propensione alla metastatizzazione.

La proteina chimerica FUS-DDIT3 blocca il processo di differenziazione adipocitaria nelle cellule progenitrici mesenchimali

Dermatofibrosarcoma protuberans

• (COLA1-PDGFB) 90%• Sarcoma di basso grado• Forte espressione CD34• Dermatofibroma VS

Dermatofibrosarcoma protuberans

FISH analysis has been helpful for confirming the diagnosis of dermatofibrosarcoma protuberans in 25% (104/411) of cases and necessary for the diagnosis of dermatofibrosarcoma protuberans in 5% (21/411) of cases.

Cut off >20%

SPEC COL1A1/PDGFB Dual Color Dual Fusion Probe

Differential Diagnosis•Sarcoma (general)•Low grade fibromyxoid sarcoma•Inflammatory myofibroblastic tumor•Fibroma of tendon sheath•Desmoplastic fibroblastoma•Intramuscular myxoma•Juxta-articular myxoma•Myofibroma

Nodular fasciitis

Sensibilità: 86%Specificità 100%VPP: 100%VPN:90%

4 Diagnosi possible Fascite Nodulare1FISH+7 Diagnosi Fascite nodulare6FISH+

ZytoLight ® SPEC USP6 Dual Color Break Apart Probe

MYH9/USP6t(17;22)(p13;q12)

USP6 B\A DDIT3 B\A FUS B\A

CONCLUSIONI

o UN’ACCURATA DIAGNOSI DI SARCOMA RICHIEDE UN’INTEGRAZIONE CLINICA, ISTOPATOLOGICA E MOLECOLARE

o LA CLASSIFICAZIONE PATOLOGICA CORRELA CON I DISTINTI OUTCOME DELLE DIVERSE ENTITà

o La FISH è UN UTILE STRUMENTO DIAGNOSTICO

o DESCRIVERE SEMPRE QUALSIASI ALTERAZIONE

o INTEGRAZIONE TRA LE TECNICHE CHE CONSENTONO DI FARE DIAGNOSI

o OGNI ALTERAZIONE MOLECOLARE DEVE ESSERE CONTESTUALIZZATA CON IL QUADRO MORFOLOGICO E IMMUNOFENOTIPICO

Dott.ssa M.Curcio Dott. M. Di BonitoDott.ssa G. Liguori Dott.ssa A. De Chiara