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UOC Microbiologia e Virologia (M&V) Direttore dr. Cristina Giraldi

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REVISIONE PERCORSO DIAGNOSTICO (PD) DELLE CONNETTIVITI ANA-CORRELATE

Redazione Elaborazione Verifica Approvazione

Dicembre 2016

Gruppo di lavoro Microbiologia e Virologia Dr. C. Giraldi Dr. R. Caruso Dr. D. Perugini Medicina Interna “Valentini” R.Pellegrino E.Fiaschi G.Vallone Reumatologia G.Nudo

Verifica clinica: dr. R. Bonofiglio Nefrologia dr. F. Fimognari Geriatria dr. P. Leo Gastroenterologia dr. C.Bova Medicina Interna dr. A. Petrone Neurologia Verifica Metodologica: Dott.ssa M. Loizzo S.D. Qualità ed Accreditamento

……………….. Consiglio di Direzione Direttore Sanitario Dott.ssa Loizzo

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Scopo del documento Il PD ha lo scopo di chiarire e sostenere la diagnostica di laboratorio; in particolare evidenziare quale sia il miglior iter ragionato e basato sulle evidenze scientifiche, a partire dalla fase preanalitica fino all’elaborazione di un referto completo che possa essere d’ausilio all’inquadramento delle Connettiviti ANA-correlate con lo scopo di fornire al clinico l’eventuale presenza di autoanticorpi responsabili di danno d’organo o predittivi di malattia o valutabili nel tempo.

CONNETTIVITI

Il termine connettiviti indica un gruppo di malattie reumatiche, caratterizzate dall’infiammazione cronica del tessuto connettivo. Considerata la diffusione del tessuto connettivo, tali malattie sono definite “sistemiche”. L‘origine del processo infiammatorio è di tipo autoimmune. I pazienti si dividono in due categorie: questa categoria appartengono: a. PAZIENTI CHE SODDISFANO PRECISI E SPECIFICI CRITERI DIAGNOSTICI

Lupus Eritematoso Sistemico (LES)

Sindrome di Sjögren (SS)

Sclerosi Sistemica (SSc)

Polimiosite/Dermatomiosite (PM/DM)

Connettivite Mista o Malattia Indifferenziata del Tessuto Connettivo (MCTD) b. PAZIENTI CHE NON SODDISFANO TUTTI I CRITERI RICHIESTI PER LA DIAGNOSI

Connettivite Indifferenziata o Malattia Indifferenziata del Tessuto Connettivo (UCTD)

Connettivite da sovrapposizione o Sindrome da Overlap (Overlap Syndrome) Appropriatezza della richiesta È fondamentale, nel percorso diagnostico delle connettiviti, che il clinico formuli una richiesta appropriata, al fine di evitare esami inutili, eseguire più rapidamente test mirati, ridurre i tempi di refertazione ed aumentare la capacità diagnostica del risultato. La richiesta di dosaggio di autoanticorpi deve riportare almeno:

1. sospetto diagnostico 2. fase d’indagine (iniziale, approfondimento, monitoraggio di terapia).

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Ricerca di autoanticorpi I test di laboratorio per la ricerca di autoanticorpi non hanno sempre un valore assoluto per la diagnosi, la prognosi o il monitoraggio delle connettiviti e i risultati devono essere sempre integrati con i dati anamnestici, clinici e strumentali. Inoltre nella formulazione del referto è importante considerare che gli autoanticorpi possono rappresentare:

1. marcatori patogenetici 2. marcatori non patogenetici 3. epifenomeni

Ricerca Anticorpi Anti Nucleo (ANA) La determinazione degli ANA rappresenta il primo livello diagnostico delle indagini sierologiche ai fini della diagnosi, prognosi e/o monitoraggio delle Malattie Autoimmuni Sistemiche (MAIS). La presenza degli ANA non sempre è indice di malattia: essi sono presenti a titolo 1:40 (basso) e 1:160 (cut-off) nel 31,7% e 5% rispettivamente nella popolazione sana, in particolare nelle donne sopra i 40 anni, negli anziani e come epifenomeno. I test di maggior significato per la diagnosi delle malattie reumatiche autoimmuni includono: TEST DI I° LIVELLO Ricerca degli anticorpi anti-nucleo (ANA) Metodo di riferimento – Immunofluorescenza indiretta (IFI), permette di individuare il grado di positività e il tipo di pattern fluoroscopico. Entrambi i dati devono essere riportati nel referto. Substrato consigliato - Cellule HEp-2 (ATCC-CCL 23) o HEp-2000 preferibili ad altri tipi di substrato (fegato di topo e/o ratto) Titolo di screening: 1:160. Non risulta utile differenziare la diluizione di screening tra adulti e pediatrici fino a 16 anni. Titolo clinicamente significativo: > 1:160 Valori di riferimento: ANA assenti (<1:160, ANA presenti ≥ 1:160) Refertazione test ANA - Raccomandazioni Indicare: 1. substrato 2. metodo utilizzati (es. HEp-2, IFI), 3. diluizione di screening e titolo clinicamente significativo 4. riportare l’esito del test: assenti o presenti

a. Se Assenti riportare il commento: “In mancanza di forte sospetto clinico per malattia autoimmune sistemica, non si raccomanda approfondimento diagnostico con ENA e anti ds-DNA”.

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b. Se Presenti riportare il commento: “Si raccomanda approfondimento diagnostico sulla base del sospetto clinico e delle evidenze microscopiche” e descrivere:

c. Quadro Fluoroscopico: NUCLEARE, CITOPLASMATICO, MITOTICO d. Pattern: SPECKLED/GRANULARE, OMOGENEO, NUCLEOLARE, CENTROMERICO, ecc.. (Allegato 1 - Pattern ANA).

e. Titolo: 1:160, 1:320, >1:640. Ricerca anticorpi anti antigeni nucleari estraibili (ENA) - ENA mediante test di immunofluorescenza

(IFI) su cellule Hep-2. INTERPRETAZIONE: ANA POSITIVO= ≥ 1/160, ANA NEGATIVO:< 1/160

TEST DI II° LIVELLO RICERCA ANTICORPI ANTI ANTIGENI NUCLEARI ESTRAIBILI (ENA) Nell’ambito degli ENA si possono individuare: 1. Proteine associate a DNA: istoni, antigeni Scl-70, PCNA (ciclina I), Ku, proteine centromeriche. 2. Proteine associate a RNA: U1RNP, Sm, fibrillarina, RNA-polimerasi I, NOR-90, nucleolina, SSA/Ro52, SSA/Ro60, SS-B/La, Jo1, PL-7, PL-12, RNP

ribosomiali. La ricerca degli autoanticorpi anti-ENA rappresenta il II° livello diagnostico, la loro determinazione è raccomandata in presenza di positività ANA con un titolo ≥1:160. Con titoli ANA ≤ 1:160 non è necessario la loro determinazione. In alcuni casi, in assenza di positività ANA, ma con sintomi clinici di una malattia autoimmune specifica, può essere necessaria la determinazione degli stessi. Metodi consigliati 1. ENA-screening ELISA/CLIA pannello minimo: Sm, RNP, SSA, SSB, Scl-70, Jo-1 2. Dot-Blot Approfondimento diagnostico (Allegato 2 - flow chart ANA-test)

Dopo l’esecuzione dell’ENA screening ELISA (pannello minimo) si effettua la tipizzazione con dot blot.

In caso di quadro fluoroscopico suggestivo per presenza di autoanticorpi diversi da quelli del secondo livello diagnostico, si effettua la tipizzazione profilo specifico: 1. ENA profilo allargato – Istoni, Nucleosomi, PCNA, CENP-B, P-ribosomiale 2. ENA profilo Epatico – AMA-M2, Sp100, PML, gp210, SLA/LP, LC1, LKM1 3. ENA profilo Miositi – Mi-2, Ku, PL-7, PL-12, EJ, OJ, SRP, PM-Scl75/100.

ANTICORPI ANTI DNA dsDNA Anticorpi diretti verso il DNA a doppia elica o DNA nativo (nDNA) che si legano con epitopi situati sulla struttura esterna di deossiribofosfato del DNA. Sono altamente specifici di LES, ed il loro rilevamento dipende sia dalla sensibilità del metodo impiegato, sia dalla fase più o meno attiva della malattia. Ad elevata concentrazione sono prognostici di una riacutizzazione di malattia, anche se il LES o la nefropatia sono quiescenti. A causa dell’alto grado di specificità (95,9%), la loro presenza rappresenta uno dei criteri di diagnosi di LES, infatti i criteri ACR sono stati validati nel 2012 da SLICC (Systemic Lupus Collaborating Clinics). Dal momento che la concentrazione degli anticorpi anti dsDNA correla con l’andamento clinico del LES e della nefrite lupica, la loro determinazione quantitativa è

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utile per il monitoraggio della terapia e si deve eseguire obbligatoriamente in tutti i casi in cui il test ANA in fluorescenza risulti positivo al titolo maggiore o uguale a 1:160 con pattern omogeneo o speckled e quadri non chiari e con positività simil-mitosi. Ricerca degli anticorpi anti-dsDNA (nDNA) 1. - IFI (IFA): rileva anticorpi ad alta e media avidità. Substrato cellulare - Crithidia luciliae, metodo gold standard il cui esito ha elevato valore diagnostico e/o monitoraggio. Titolo di screening - 1:10. Rappresenta anche il titolo minimo significativo, se positivo si procede alla diluizione per raddoppio fino a “end point”. Valutazione microscopica - deve essere valutata la fluorescenza del Kinetoplasto, organulo ricco di DNA nativo posto in posizione sub-terminale della Crithidia.

2 - ELISA: permette il dosaggio quantitativo in rapporto a standard di riferimento internazionali (WHO 80). È il sistema più sensibile ma meno specifico (rileva anche anticorpi a bassa avidità, presenti anche in patologie diverse dal LES). Il test ELISA può essere utilizzato per lo screening quantitativo, i risultati positivi devono essere confermati in IFI.

Refertazione anticorpi anti-dsDNA (nDNA) – Raccomandazioni Indicare: 1. Metodo e substrato utilizzato, (es IFI su Crithidia luciliaei) 2. Riportare l’esito del test: assenti o presenti a. Se presenti indicare il titolo di positività (end point) 3. Nel caso in cui si effettua lo screening con metodo ELISA e conferma con IFI, è necessario specificare nella descrizione del test la sensibilità e specificità; predisporre un referto di univoca interpretazione. Secondo i criteri SLICC gli anti-dsDNA saggiati con metodo ELISA sono considerati presenti se il valore è almeno doppio rispetto al range di riferimento.

ANTICORPI ANTI ISTONI Gli istoni sono proteine basiche associate al DNA. Si ritrovano prevalentemente nel LES farmaco-indotto (procainamide, idralazina, sulfonamidi, isoniazide, tranquillanti, anticonvulsivanti), ma si possono riscontrare anche nell’artrite reumatoide (AR), vasculiti, cirrosi biliare primitiva (PBC), sclerosi sistemica (SSc), epatopatie autoimmuni (AIH), neoplasie, AIDS. Ricerca degli anticorpi anti-istoni: si effettua mediante test di Immunoblotting: sensibile, permette l'identificazione del pattern di reattività anticorpale verso le varie componenti istoniche.

ANTICORPI ANTI NUCLEOSOMI (ANuA) Gli anticorpi anti-nucleosomi sono presenti nel 100% dei pazienti affetti da LES e nella nefrite lupica, in particolare durante la fase attiva della malattia. Ne rappresentano un utile marcatore diagnostico soprattutto nei pazienti anti dsDNA negativi. Ricerca degli anticorpi anti nucleosoma: si effettua mediante test di Immunoblotting

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CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE Il percorso diagnostico delle connettiviti rappresenta uno strumento di supporto alla valutazione clinica nel soggetto con segni e sintomi suggestivi di perdita del self immunologico. L’algoritmo rappresenta un “cammino” verso la diagnosi reumatologica o differenziale. L’iter diagnostico dovrebbe essere articolato su tre livelli come sopra esposto:

I° livello – ANA

II° livello – ENA-screening e tipizzazione minima.

Livello specialistico – tipizzazione quadro fluoroscopico dipendente o secondo puntuali indicazioni cliniche. Allegati: Allegato 1 Pattern ANA (IFI su HEp-2) Allegato 2 Flow chart ANA-test Allegato 3 Significato diagnostico ENA e anti ds DNA

INDICATORI PER MONITORARE ADERENZA AL PD DELLE CONNETTIVITI

I report di verifica dell’aderenza allo standard saranno valutati a 6-12 mesi.

Responsabile della verifica dott.ssa D. Perugini.

indicatore standard

n° totale Ena test eseguiti su pazienti interni / n° totale ANA test eseguiti su pazienti interni. non superiore al 20%

n° totale DNA Ab test eseguiti su pazienti interni / n° totale ANA test eseguiti su pazienti interni non superiore al 20%

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Allegato 1 PATTERN NUCLEARI

DEFINIZIONE ANTIGENI PATOLOGIE ASSOCIATE Omogeneo (Homogeneous)

dsDNA, istoni, nucleosomi, HMG LES, LES indotto da farmaci, artrite idiopatica giovanile, AIH.

Membrana nucleare (Smooth nuclear envelope)

Lamina A, B, C LES, SjS, AR, artriti sieronegative.

Nuclear Pore Complex gp 210, nucleoporina p62 PBC, AIH. Granulare (Speckled)

A) Fine Speckled SS-A/Ro, SS-B/La, Mi-2, Ku LES, SjS, SSc, MCTD, DM/PM

B) Coarse Speckled hnRNP, U1-snRNP, U2-snRNP Sm, RNA polymerase III MCTD, LES, SS, SjS, UCTD, Fenomeno di Raynaud C) Nuclear Matrix hnRNP LES, MCTD, AR, SSc D) Dense fine speckled DFS70/LEDGF SjS (rara), SSc, LES, controlli sani Diffuse grainy Topoisomerasi I (Scl-70) dcSSc, SLE, Raynaud Nucleolare (Nucleolar)

A) Omogeneo PM/Scl-75, PM/Scl-100, Th/To,B23/nucleophosmin,nucleolin, No55/SC65 SSc, SSc/PM overlap

B)Clumpy U3-snoRNP/fibrillarin SSc C)Speckled RNA polymerase I, hUBF/NOR-90 SSc, SjS Centromerico (Centromere)

CENP A/B (C) lc SSc, PBC, CREST Nuclear dots

Multiple nuclear dots Few nuclear dots

Sp-100, Sp-140, PML proteins, MJ/NXP-2p-80 coilina

PBC, AIH, DM, SARD

Ciclo cellulare

PCNA Ciclina (fattore di processività della DNA polimerasi δ -PFDPδ)

LES, Epatite cronica B o C, SSc.

CENP-F - Mitosina Prevalentemente associato a patologie neoplastiche. Incorso di definizione l’associazione di questi autoanticorpi con la patologia.

PATTERN MITOTICI

Centriolo/Centrosoma (Centriole/Centrosome)

Pericentrina, Nineina, Cep250, Cep110 SSc, Raynaud, patologie infettive (virus e mycoplasma)

Fuso mitotico (NuMa-2) (Mitotic Spindle)

HsEg5 SjS (rara), LES, CTD

NuMA-Like (MSA-1)

NuMA-1 (210 kDa) SjS (rara) LES. Marcatore aspecifico legato anche ad altre condizioni come infezioni da M.pneumoniae

Midbody (MSA-2) ATPasi SSc, Fenomeno di Raynaud Mitotic chromosomal envelope Proteina istonica H3, MCA-1 LES discoide (rara), Leucemia linfocitica cronica, SjS, polimialgia reumatica.

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PATTERN CITOPLASMATICI

Filamentoso /Actina (Filamentous/Actin)

Actina AIH, PBC, MCTD, myasthenia gravis, Morbo di Crohn

Filamentoso /Vimentina (Filamentous/Vimentin)

Vimentina, Citocheratina Patologie infettive/infiammatorie, epatopatie alcooliche, SARD, psoriasi, controlli sani

Fibrillare a segmenti (Fibrillar segmental)

Alpha-actinina, tropo miosina, vinculina Miastenia gravis, morbo di Crohn, Colite ulcerosa

Dense fine speckled PL-7, PL-12, proteina P

ribosomiale Sindrome anti-sintetasi,PM/DM, LES, LES giovanile, LES con interessamento neuropsichiatrico

Fine speckled Jo-1/histidyl-tRNA synthetase Sindrome anti-sintetasi,PM/DM, SSc, PM con fibrosi polmonare

Reticolare/mitocondrio (Cytoplasmic reticular/mitochondria)

PDC-E2/M2, BCOADC-E2,OGDC-E2, sub unità E1α della PDC, E3BP/proteina X

PBC

Lisosomiale-like (Lysosome-like)

GW-Like

Endosomi (early endosome antigen 1), GW/Processing bodies (GW182, Su/Ago2), corpi

multivescicolari/lisosomi LES, SjS, RA, PBC, UCTD,patologie neurologiche

SRP SRP PM/DM

Apparato di Golgi (Polar/Golgi-like)

giantin/macrogolgin, golgin-95/GM130, golgin- 160, golgin-97, golgin-245

SjS (rara), LES, RA, MCTD,atassia cerebellare idiopatica, degenerazione cerebellare paraneoplastica, infezioni virali

Rods and Rings IMPDH2, altri antigeni sono in corso di

caratterizzazione Pazienti con infezione da HCV in corso di terapia con IFN/ribavirina, LES (rara), tiroidite di Hashimoto, controlli sani.

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Allegato 2

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Allegato 3 SIGNIFICATO DIAGNOSTICO ENA E ANTI ds DNA

Pattern ANA (IFI)

e titolo

Tipo di dosaggio UTILITÀ Cadenza analitica

anti-SSA/Ro: ribonucleoproteina, Ag nucleare

1 : 160 Fine speckled

Qualitativo

(QL) - Diagnosi di S.Sjögren, LES - Blocco atrio-ventricolare congenito

Una sola volta

anti-SSB/La: fosfoproteina, Ag nucleare

1 : 160 Fine speckled

QL - Diagnosi di S.Sjögren, LES - Nefrite lupica

Una sola volta

anti-Scl70: enzima DNA-topoisomerasi, Ag nucleare

1 : 160 nucleolare e granulare

atipico o omogeneo

QL - Diagnosi di Sclerodermia (SSc) Presenti nel 30-40% , marker specifico La contemporanea negatività anti Scl70 e anti-centromero, esclude SSc

Una sola volta

anti-proteine centromeriche

1 : 160 centromerico

QL

- Diagnosi di Sclerodermia circoscritta (CREST) Marker specifico, presenti nel 50-80%. Nella Cirrosi biliare primitiva (CBP) vi è una presenza contemporanea di anti-centromero e anti M2

Una sola volta

anti nRNP e anti Sm: due complessi costituiti da ribonucleoproteine

1 : 160 Corse speckled

anti nRNP anti Sm anti nRNP anti Sm anti nRNP anti Sm

Quantitativo

QT QL

- Diagnosi MCTD - Follow up terapia Nel 90-100% di MCTD sono presenti alti titoli che correlano con l’andamento clinico. Sono un marker specifico

- Diagnosi LES Anti Sm e anti dsDNA sono

patognomonici del LES Mensile Una sola volta

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Acronimi AIH Epatite autoimmune (Auto Immune Hepatitis) AR Artrite Reumatoide CTD Connective Tissue Diseases CREST Calcinosi, Fenomeno di Raynaud, esofagopatia, sclerodattilia,teleangectasie dcSS diffuse cutaneous Systemic Sclerosis DM Dermatomiosite IFN Interferon lcSSc limited cutaneous Systemic Sclerosis

LES Lupus eritematoso sistemico MCTD Mixed Connective Tissue Diseases PBC Cirrosi biliare primitiva (Primary Biliary Cirrhosis) PM Polimiosite SARD Systemic autoimmune Rheumatic Diseases SjS Sindrome di Sjogren SRP Signal Recognition Particle SSc Sclerosi Sistemica UCTD Undifferentiated Connective Tissue Diseases

anti RNP ribosomiale

1 : 160 Ribosomiale

citoplasmatico milky-way

Qualitativo (QL) - Diagnosi di Lupus psicotico Una sola volta

anti Jo1

1 : 160 punteggiatura citoplasmatica

QL - Diagnosi di Dermato/Polimiosite Una sola volta

anti nucleosomi

1 : 160 omogeneo

QT - Diagnosi di LES in fase attiva - Diagnosi di nefrite lupica - Marker precoce di LES

Mensile

anticorpi anti-dsDNA

1 : 160 omogeneo o

periferico

QT - Diagnosi di LES - Screening monitoraggio terapia - Andamento clinico

Mensile

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