UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA

FACULTATEA DE MEDICINĂ

TEZĂ DE DOCTORAT

SSttuuddiiuull MMooddiiffiiccăărriilloorr MMoorrffoollooggiiccee aallee

PPeerreetteelluuii TTuubbuulluuii SSeemmiinniiffeerr îînn ccaaddrruull FFeennoommeennuulluuii ddee ÎÎmmbbăăttrrâânniirree

- REZUMAT -

Conducător: Prof. Univ. Dr. Laurenţiu MOGOANTĂ

Doctorand: Oltin Tiberiu POP

2011

Investeşte în oameni! FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

Axa Prioritară: 1

Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii

Domeniul Major de Intervenţie: 1.5

Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării

Titlu proiect "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecvenţă prin acordarea de burse

doctorale" Cod Proiect

POSDRU/6/1.5/S/8 Beneficiar

Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova

2

CC UU PP RR II NN SS UU LL TT EE ZZ EE II

INTRODUCERE........................................................................ 1

STADIUL CUNOAŞTERII

CAPITOLUL I ANATOMIA TESTICULULUI .................................................... 4

SITUARE ................................................................................. 4 FORMĂ, ORIENTARE, DIMENSIUNI, CULOARE ŞI CONSISTENŢĂ ...... 4 CONFIGURAŢIA EXTERIOARĂ ŞI RAPORTURI ............................... 5

Faţa medială.........................................................................................5 Faţa laterală .........................................................................................5 Marginea cranială................................................................................5 Marginea caudală ................................................................................5 Extremitatea anterioară .......................................................................5 Extremitatea posterioară......................................................................6

ÎNVELIŞURILE TESTICULARE...................................................... 6 Scrotul ..................................................................................................6 Dartosul ................................................................................................6 Tunica adipoasă ...................................................................................7 Tunica fibroasă superficială sau aponevrotică...................................7 Cremasterul ..........................................................................................7 Tunica fibroasă profundă ....................................................................7 Tunica vaginală....................................................................................7

STRUCTURILE DE SUSŢINERE – CAPSULA TESTICULARĂ .............. 7 Mediastinul (Corpul lui Highmore) ....................................................7 Capsula propriu-zisă ............................................................................8 Septurile interlobulare .........................................................................9

VESTIGIILE EMBRIONARE JUXTATESTICULARE ............................ 9 Apendix testis........................................................................................9 Apendix epididymis ..............................................................................9 Canalele sau vasele Haller ..................................................................9 Vasul aberant al rete ..........................................................................10 Organul lui Giraldès ..........................................................................10

VASCULARIZAŢIA TESTICULULUI ............................................. 10 Vascularizaţia arterială......................................................................10 Drenajul venos ...................................................................................11 Drenajul limfatic ................................................................................12

3

INERVAŢIA............................................................................. 13 CAPITOLUL II HISTOLOGIA TESTICULULUI ............................................... 14

COMPARTIMENTUL INTERSTIŢIAL............................................. 14 Celulele Leydig...................................................................................15 Macrofagele, limfocitele, şi fibrele nervoase ....................................17 Arhitectura vasculară intratesticulară ..............................................17 Inervaţia .............................................................................................20

COMPRTIMENTUL TUBULAR .................................................... 20 Ţesutul peritubular ............................................................................20 Celulele Sertoli ...................................................................................22 Celulele germinale .............................................................................24 Cinetica spermatogenezei ..................................................................29 Apoptoza şi spermatogeneza ..............................................................31

CAPITOLUL III TESTICULUL SENESCENT ................................................... 32

FIZIOLOGIA ÎMBĂTRÂNIRII ....................................................... 32 TEORII ALE ÎMBĂTRÂNIRII ....................................................... 32 SEXUALITATEA ŞI SENESCENŢA .............................................. 34 MODIFICĂRI ENDOCRINE GENERALELA SENESCENŢĂ ................ 35 FUNŢIA DE REPRODUCERE LA BĂRBATUL VÂRSTNIC ................. 36

Hormonii sexuali la bărbatul vârstnic ..............................................36 Morfologia testiculară la vârste înaintate .........................................38 Parametrii spermei la vârstnici..........................................................41 Fertilitatea bărbatului vârstnic..........................................................42 Riscuri legate de reproducere asociate vârstei paterne avansate .....44

CONTRIBUŢII PERSONALE

CAPITOLUL IV MATERIAL ŞI METODE ......................................................... 47

MATERIALUL CERCETAT......................................................... 47 METODELE DE LUCRU ............................................................ 47

Studiul datelor clinice ........................................................................48 Studiul modificărilor histopatologice ................................................48 Prelucrarea şi interpretarea rezultatelor...........................................62

4

CAPITOLUL V STUDIUL TUBILOR SEMINIFERI ÎN TESTICULUL SENESCENT............................................... 63

MODIFICĂRILE DIAMETRULUI TUBULAR .................................... 63 STUDIUL MEMBRANEI BAZALE................................................. 76

Evaluarea MB cu ajutorul impregnării argentice ............................77 Evaluarea MB cu ajutorul imunomarcării cu anticorpi anti-colagen IV...................................................................89 Compararea valorilor obţinute la cele două coloraţii.....................101

STUDIUL LAMINEI PROPRIA TUBULARE .......................................................................... 105

Evaluarea grosimii laminei propria ................................................105 Evaluarea grosimii manşonului fibro-hialin intern (MFH) ..........123 Comparaţia dintre dimensiunile LP şi cele ale MFH intern..........140 Componenta vasculară intramurală................................................143

MODIFICĂRILE EPITELIULUI SEMINAL ..................................... 147 SCLEROZA TUBULARĂ ......................................................... 151

Etapa „manşonului fibro-hialin”....................................................151 Etapa sclerozei tubulare propriu-zise..............................................151

CONCLUZII........................................................................... 158

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE............................................. 160 REFERINŢE BIBLIOGRAFICE DIN LITERATURA DE SPECIALITATE .............................................. 160 REFERINŢE BIBLIOGRAFICE PERSONALE LEGATE DE TEMA TEZEI ........................................................ 168

Cuvinte cheie: testicul, îmbătrânire, tub seminifer, imunohistochimie,

morfometrie.

5

II NN TT RR OO DD UU CC EE RR EE Odată cu trecerea timpului, la nivelul organismului se acumulează

modificări. Îmbătrânirea poate fi definită ca totalitatea acestor modificări gradate şi ireversibile ale structurii şi funcţiei unui organism ce apar ca urmare a trecerii timpului şi care duc în final la probabilitatea crescută a morţii pe măsură ce organismul uman atinge o vârstă mai înaintată [*Online Medical Dictionary, 2011; Bowen şi Atwood, 2004].

Îmbătrânirea rămâne încă unul din cele mai mari mistere ale ştiinţei medicale. Peste tot în lume populaţia atinge vârste din ce în ce mai înaintate ceea ce incumbă găsirea cât mai rapidă a raspunsurilor la două întrebări fundamentale: cum şi de ce îmbătrânim. Se ştie mult prea bine ce ne aduce înaintarea în vârstă: ne face mai fragili, mai expuşi îmbolnăvirii şi în cele din urmă moartea. Ce detemină însă de fapt îmbătrânirea şi ce, dacă nu cumva nimic, putem face pentru a-i încetini apariţia? Şi ce trebuie să credem despre sumbra teorie sugerată pentru prima dată de Aristotel că îmbătrânirea şi moartea sunt preţul pe care-l plătim pentru sex?

În mod surprinzător, îmbătrânirea este legată de sex dar nu aşa cum şi-a închipuit Aristotel. Se pare că, în ultimă instanţă, omul îmbătrâneşte pentru că, în cursul evoluţiei biologice, natura a mizat mai mult pe reproducere decât pe menţinerea îndelungată a corpului uman care ne-ar fi permis să trăim veşnic. Înţelegerea acestui adevăr deschide noi căi de investigare a modului în care genele determină lungimea vieţii noastre. Progresele ştiinţifice şi tehnologice ale secolului XX au remodelat viaţa în secolul XXI în ţările industrializate ale lumii. Condiţiile de viaţă s-au îmbunătăţit atât de mult încât mortalitatea infantilă a fost profund diminuată, iar progresele înregistrate în medicină cu privire la profilaxia şi tratamentul principalelor cauze de deces cum ar fi afecţiunile cardiace şi cancerul au determinat prelungirea şi mai mult a vieţii indivizilor vârstnici. Ca urmare, pe parcursul unui singur secol, speranţa medie de viaţă în ţările dezvoltate aproape că s-a dublat. Pentru prima dată în istoria umanităţii, vârsta înaintată a devenit o etapă normativă în viaţă. Nu numai că durata medie de viaţă a indivizilor a crescut, ci populaţiile au inceput să îmbătrânească, ca urmare a creşterii speranţei de viaţă, alături de o diminuare abruptă a ratei de fertilitate. În ţările dezvoltate se atinge relativ rapid un punct în care numărul persoanelor peste 60 de ani este mai mare decât al celor sub 15 ani. Astfel, statusul populaţiei vârstnice are implicaţii multiple în ceea ce priveşte funcţionearea unor întregi societăţi. Cu toate că dublarea speranţei de viaţă reprezintă o realizare spectaculoasă, nu a existat şi un progres concomitent în ceea ce priveşte capacitatea noastră de a ameliora afecţiunile dizabilitante ale vârstei înaintate. Pentru a înţelege potenţialul enorm al unei vieţi mai îndelungate, cercetătorii trebuie să işi formeze o imagine de ansamblu mult mai

6

complexă a procesului de îmbătrânire şi a factorilor sociali, psihologici şi biologici ce contribuie la o finalitate optimă [Rando şi Carstensen 2011].

Modificările produse de îmbătrânire la nivelul organelor corpului uman au fost studiate amănunţit în anii 50-60 [Bourne şi Wilson 1961; Andrew 1971]. Testiculul a făcut excepţie, din motive necunoscute, fiind neglijat. Până la studiul profesorului Louis H. Honoré de la departamentul de anatomie patologică al Grace General Hospital din Vancouver [Honoré 1978], literatura de specialitate consemnează numai prezenţa câtorva articole cu privire la histologia testiculului la bărbaţii vârstnici, studii care au folosit material recoltat post mortem ce poate fi cu greu considerat reprezentativ pentru o populaţie în curs de îmbătrânire „sănătoasă” [Sniffen 1950; Harbitz 1973] şi o amplă şi solid documentată monografie în trei volume despre testicul, editată în 1970 de trei prestigioşi profesori americani: A. D. Johnson (Department of Animal Science, University of Georgia), W. R. Gomes şi N. L. VanDemark (Animal Reproduction Teaching and Research Center, The Ohio State University) [Johnson şi colab. 1970]. Nici unul însă din studiile menţionate nu a abordat descrierea sistematică a histologiei testiculului în cursul procesului de îmbătrânire. Profesorul Honoré a pornit la realizarea demersului său de la două motive demne de luat în seamă: pe de-o parte, lipsa datelor cu privire la testiculul bărbaţilor în vârstă iar, pe de altă parte, studiile endocrine de la acea dată care relevau o scădere progresivă a funcţiilor celulelor Leydig, legată de vîrstă [Steinberger şi Tijoe 1969; Suoranta 1971; Stearns şi colab. 1974]. De asemenea, a încercat realizarea unei comparaţii între testiculul bărbaţilor vârstnici cu şi fără carcinom de prostată. După 1975, numărul studiilor legate de modificările morfologice ale testiculului la senescenţă devin din ce în ce mai numeroase, ieşind în evidenţă patru mari grupuri de cercetători pentru care acest subiect a devenit o preocupare continuă. Abordarea relativ restrânsă a modificărilor morfologice induse de înaintarea în vârstă la nivelul parenchimului testicular în literatura de specialitate pe de-o parte, iar pe de altă parte preocuparea şcolii craiovene de morfologie pentru studiul structurilor stromale şi al răsunetului modificărilor acestora asupra structuriilor funcţionale atât în condiţii normale dar şi patologice, au fost cele două motive principale care au condus la conturarea subiectului acestei lucrări.

Pornind de la aceste considerente, lucrarea de faţă îşi propune un studiu al modificărilor morfologice care apar o dată cu vârsta ale uneia din componentele de susţinere ale epiteliului nobil seminal, şi anume peretele tubului seminifer, însă restrâns numai la cazuri de pacienţi cu proliferare malignă epitelială la nivelul prostatei care a condus la orhiectomie ca metodă terapeutică.

Fără a avea pretenţia că a surprins toate aspectele legate de aceste modificări morfologice ale înaintării în vârstă, lucrarea se doreşte a fi mai degrabă un pas în studierea detaliată a participării peretelui tubului seminifer la îmbătrânirea parenchimului testicular.

7

SS TT AA DD II UU LL CC UU NN OO AA ŞŞ TT EE RR II II

CC AA PP II TT OO LL UU LL II AA NN AA TT OO MM II AA TT EE SS TT II CC UU LL UU LL UU II

Capitolul I – „Anatomia testiculului” descrie elemente clasice ale anatomiei testiculului la adult. Sunt detaliate aspecte privind situarea, forma, orientarea, dimensiunile, culoarea şi consistenţa, configuraţia exterioară şi raporturile anatomice ale testiculului. De asemenea, sunt descrise învelişurile testiculare, structurile de susţinere ale acestuia, precum şi aspecte legate de vascularizaţia arterială, drenajul venos şi limfatic şi inervaţia organului studiat.

CC AA PP II TT OO LL UU LL II II HH II SS TT OO LL OO GG II AA TT EE SS TT II CC UU LL UU LL UU II

În capitolul II – „Histologia testiculului”, se face descrierea de la nivel de ţesut pana nivelul componentelor celulare şi stromale individuale testiculare.

În prima parte accentul este pus pe componentele interstiţiului testicular (celulele Leydig, macrofagele, limfocitele şi fibrele nervoase, arhitectura vasculară intratesticulară, inervaţia), pentru ca apoi să se discute în amănunt comartimentul tubular testicular, acesta constituind şi subiectul principal abordat în tema de cercetare. Sunt descrise în detaliu ţesutul peritubular, celulele Sertoli şi celulele germinale împreuna cu cinetica procesului de spermatogeneză.

CC AA PP II TT OO LL UU LL II II II TT EE SS TT II CC UU LL UU LL SS EE NN EE SS CC EE NN TT

Subiectul acestui studiu este reprezentat de modificările morfologiei peretelui tubului seiminifer odată cu înaintarea în vârstă. În consecinţă, Capitolul III al tezei tratează procesul de senescenţă din punct de vedere morfologic, fiziologic, psihologic şi social. Este abordată senescenţa la nivel de organism şi în special implicaţiile şi particularităţile sale la nivelul gonadei masculine si funcţiei de reproducere a bărbatului (fiziologia îmbătrânirii, teorii ale senescenţei, sexualitatea şi senescenţa, aspecte endocrine la senescenţă, morfologia testiculară la vârstnic, fertilitatea vârstnicului, riscuri legate de reproducere asociate vârstei paterne avansate).

8

CC OO NN TT RR II BB UU ŢŢ II II PP EE RR SS OO NN AA LL EE Studiul de faţă a abordat următoarele aspecte: - Modificările Diametrului Tubular în cadrul procesului de îmbătrânire. - Modificările Membranei Bazale în cadrul procesului de îmbătrânire. - Modificările Laminei Propria la senescenţă. - Modificările epiteliului seminal odată cu înaintarea în vârstă. - Studiul sclerozei tubulare în cadrul senescenţei testiculului.

CC AA PP II TT OO LL UU LL II VV MM AA TT EE RR II AA LL ŞŞ II MM EE TT OO DD EE

Capitolul intitulat „Material şi Metode” are ca obiectiv descrierea loturilor de studiu, a tehnicilor utilizate în studiu şi a instrumentelor folosite.

Baza de studiu a prezentei teze de doctorat a fost constituită din două loturi distincte de pacienţi internaţi în Clinicile de Urologie şi Chirurgie Pediatrică ale Spitalului Clinic Nr. 1 din Craiova şi la care diagnosticul histopatologic a fost stabilit în Serviciul de Anatomie Patologică şi Citologie al aceluiaşi spital.

Loturile au fost alcătuite pornind de la trei criterii de selecţie: Diagnosticul histopatologic Intervalul de timp luat în consideraţie Tehnica/tehnicile de colorare histopatologică utilizată/utilizate

Distribuţia cazurilor studiate pe cele două loturi, în funcţie de criteriile de selecţie este prezentată în tabelul 1:

TTaabbeelluull 11:: DDiissttrriibbuuţţiiaa ccaazzuurriilloorr ppee lloottuurrii

Nr. Lot Perioada Diagnostic Tehnica colorare Nr. Cazuri 1 1997 - 2001 ADKP Clasice: HE, van G, G-S, Gö 192

2 2002 ADKP

Clasice: HE, van G, G-S, Gö IHC: - atc anti Actina muşchi neted - atc anti Colagen IV - atc anti CD34

28

Materialul de studiu a fost reprezentat de două categorii de surse de date. Din prima categorie au făcut parte documentele de evidenţă medicală ale

pacienţilor incluşi în studiu şi anume foile de observaţie clinică, protocoalele de intervenţie chirurgicală şi registrele de diagnostic histopatologic.

9

A doua categorie a fost constituită din piesele de exereză chirurgicală sau de puncţie-biopsie şi preparatele histopatologice efectuate pentru cazurile internate în intervalul 1997-2002.

Coloraţiile clasice (hematoxilină-eozină, van Gieson şi Gömöri) au fost efectuate, pentru toate cazurile studiate, în laboratorul de histopatologie al Serviciului de Anatomie Patologică a Spitalului Clinic Nr. 1 din Craiova.

Coloraţiile speciale pentru componentele ţesutului conjunctiv (Goldner - Szeckeli - green light) au fost efectuate în laboratorul de histologie al disciplinei de Histologie din cadrul Centrului pentru Studii de Morfologie Microscopică şi Imunologie al Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova.

Coloraţiile folosind tehnica imunohistochimică pentru evidenţierea componentelor ţesutului conjunctiv cu anticorpi anti Actina muşchiului neted, anticorpi anti Colagen IV şi anticorpi pentru markerul celulelor endoteliale CD34 au fost efectuate în laboratorul de histopatologie al disciplinei de Morfopatologie al Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova.

Studiul de faţă a presupus o analiză retrospectivă care a inclus cazurile de

adenocarcinom de prostată internate între 1997 şi 2002 la care s-a practicat orhiectomie bilaterală. Pentru culegerea datelor au fost create fişiere tip „bază de date” în calculator în care au fost introduşi toţi parametrii ce urmau a fi studiaţi. Aceştia au fost împărţiţi în două mari categorii:

• parametri clinici • parametri histopatologici.

Parametrii clinici luaţi în considerare au fost: • Perioada • Vârsta. Grupele de vârstă au fost stabilite după cum urmează:

• Pentru cazurile de criptorhidie, în funcţie de etapele copilăriei: 0-2 ani; 3-4 ani; 5-6 ani; 7-14 ani; 15-18 ani; peste 18 ani

• Pentru cazurile de orhiectomie pentru ADKP: 50-54 ani; 55-59 ani; 60-64 ani; 65- 69 ani; 70-74 ani; 75-79 ani; peste 80 ani.

• Localizarea Parametrii histopatologici urmăriţi au fost: • Modificările tubilor seminiferi

Diametrul tubular mediu Atrofia epitelială Modificările morfologice ale laminei propria (ţesutul

conjunctiv peritubular), incluzând modificările membranei bazale, modificările straturilor externe ale laminei propria şi modificările structurilor vasculare intramurale.

Astfel, în funcţie de parametrii stabiliţi pentru a fi evaluaţi, studiul nostru a avut trei componente:

• Studierea datelor clinice

10

• Studierea modificărilor histopatologice în tubii seminiferi din testiculul senescent

Parametrii clinici stabiliţi – perioada, distribuţia pe grupe de vârstă şi

distribuţia în funcţie de localizare – au fost evaluaţi la toate loturile. Materialul biologic uman reprezentat de piesele de exereză chirurgicală

sau de fragmentele de puncţie biopsie au fost supuse tehnicilor histologice clasice de prelucrare (fixare şi includere la parafină) şi au fost apoi colorate cu metode de colorare clasice uzuale (hematoxilină eozină) dar şi specifice pentru diferitele componente ale stromei (tricromic van Gieson, tricromic Goldner Szekeli, Gömöri) precum şi, în 28 dintre cazuri, cu metode de identificare imunohistochimică (anticorpi anti Actina muşchiului neted, anticorpi anti Colagen IV şi anticorpi anti CD34).

S-a utilizat metoda IHC indirectă tristadială Avidină-Biotină-Peroxidază

(ABC) după un protocol utilizat în Laboratorul de Patologie al Forschungszentrum Borstel din Germania cu folosirea sistemului de aplicare a anticorpilor prin capilaritate după metoda introdusă de firma Shandon.

Această metodă IHC este relativ simplă, iar amplificarea semnalului obţinut este optimă.

Tehnica s-a aplicat pe materialul inclus în parafină şi secţionat la 2μm grosime.

Secţiunile au fost etalate pe lame Superfrost +. Etapele parcurse în cadrul acestei metode au fost următoarele:

Prima zi • Deparafinarea în Xilen 10 min • Hidratarea

• alcool etilic absolut 2 min • alcool etilic 96 grade 2 min • alcool etilic 90 grade 2 min • alcool etilic 70 grade 2 min

• Trecere în apă distilată • Demascarea anticorpilor prin încălzire

• Introducere în tampon citrat • Încălzire la cuptorul cu microunde la 1000W 4 min • Fierbere în tampon citrat 20 min

• Răcire în vas cu apă curentă 20 min • Clătire în TBS 3 scufundări • Clătire cu apă distilată • Inhibarea peroxidazei endogene prin trecerea într-o soluţie de apă oxigenată 0,3% 10 min

11

• Spălarea în soluţie Triss • Montare pentru aplicarea anticorpilor pe suporturi CoverPlate

• Aplicare soluţie Tris pe lamă 2 picături • Montare pe suport CoverPlate • Fixare în stativul de colorare

• Legarea situsurilor nespecifice de tip Fc cu ser normal de porc 2 picături • Aplicarea anticorpului primar în diluţia specifică de lucru 3 picături • Incubare la 40-50 C (frigider) 10-12 ore (peste

noapte) A doua zi

• Spălare în soluţie Tris 5 min • Se adaugă anticorpul secundar biotinilat(cu rol de punte) (soluţia A kit LSAB +) 2 picături • Incubarea secţiunilor la temperatura camerei 30 min • Spălare cu soluţie Tris 5 min • Se adaugă streptavidina (soluţia b kit LSAB +) 2 picături • Incubarea secţiunilor la temperatura camerei 30 min • Demontare de pe suportul CoverPlate • Trecere în soluţie Tris • Developarea cu cromogen ACE

• Ştergere lamă • Aplicare cromogen 1-3 picături (sub control microscopic)

• Contracolorarea nucleilor cu hemalaun Mayer 30 sec • Clătire în apă distilată 3 băi succesive • Spălare Apă Amoniacală 0,03% 15 sec • Trecere în apă distilată • Montare lamelă cu Kayser Glycerol Gelatine Anticorpii utilizaţi sunt prezentaţi în tabelul 2.

TTaabbeelluull 22:: AAnnttiiccoorrppii ffoolloossiiţţii îînn ssttuuddiiuull ccoommppoonneenntteelloorr ssttrroommaallee

Anticorp Specificitate Sursa Diluţie Anti alfa Actina muşchiului neted, Clona 1A4

Fibre musculare netede din interstiţiu şi peretele vascular arteriolar

DAKO – reprezentaţa pentru România REDOX Cod M085101

1:50

Anti Colagen IV Fibrele de colagen DAKO – reprezentaţa pentru 1:50

12

Clona CIV 22 din membranele bazale

România REDOX Cod Mo785

Anti CD34 Clona QBEnd 10

Celule endoteliale DAKO – reprezentaţa pentru România REDOX Cod M7165

1:50

Aspectele histopatologice au fost selectate cu ajutorul microscopului

Nikon Lab Fot II, folosindu-se ocularul cu grosisment de 4 şi obiective corectate optic planacromate cu grosismente de 2,5 (lupă), X10, X20 şi X40.

Cele mai semnificative imagini din perioada 1992-1997 au fost fotografiate cu ajutorul sistemului Nikon - Microflex AFX DX, cu casetă de fotografiere Nikon FX 35DX.. Au fost utilizate filme Kodak Gold 100 de 35 mm.

Fotografiile au fost scanate cu un scanner AGFA SNAPSCAN 1236. Imaginile după preparatele histologice ale cazurilor începând cu anul

1997 au fost realizate cu ajutorul camerei digitale Olympus C4040 şi preluate direct în calculator cu ajutorul softului CAMEDIA Master 4.02.

Prelucrarea imaginilor microscopice a fost efectuată cu ajutorul modulului „Contrast Enhancement” din programul de analiză a imaginii Olympus Micro Image 3.0 - 32 bit.

Parametrii morfometrici ai componentelor structurii de susţinere stromale

intralobulare a tubuilor seminiferi evaluaţi au fost următorii: • Diametrul tubular mediu • Grosimea membranei bazale evaluată pe coloraţia Gömöri • Grosimea membranei bazale evaluată pe marcarea imunohistochimică

a Colagenului IV • Grosimea laminei propria • Grosimea manşonului fibro-hialin dezvoltat la exteriorul membranei

bazale tubulare Determinările au fost realizate cu ajutorul modulului „Measurement” din

programul de analiză a imaginii Olympus Micro Image 3.0 - 32 bit. În prealabil, programul a fost calibrat pentru toate obiectivele (X4, X10,

X20 şi X40) cu ajutorul unei grile micrometrice de etalonare produsă de I.O.R. Diametrul tubular mediu Pentru efectuarea măsurătorilor au fost utilizate, la fiecare caz,

preparatele, indiferent de coloraţia practicată, pe care au putut fi individualizaţi 30 de tubi pentru fiecare caz, cu formă cât mai apropiată de cea rotundă, observaţi cu obiectivul X40.

• Pentru determinarea diametrului mediu pe tub au fost făcute câte două determinări:

13

• D = distanţa dintre punctele cele mai îndepărtate de pe circumferinţa tubului

• d = distanţa dintre punctele cele mai apropiate de pe circumferinţa tubului

Pentru fiecare tub s-a calculat diametrul tubular, valorile obţinute fiind notate cu D1, D2, …, D30.

Pentru fiecare caz s-a calculat valoarea medie a diamerului tubular, valorile obţinute fiind notate cu DM 1, DM 2, ..., DM n unde „n” a fost numărul de cazuri din fiecare grupă de vârstă.

Pentru fiecare grupă de vârstă s-a calculat valoarea medie a diametrului tubular unde „n” a fost numărul de cazuri din fiecare grupă de vârstă, valorile obţinute fiind notate cu DM g01, DM g02, ..., DM g07.

Evaluarea membranei bazale tubulare Dimensiunile membranei bazale au fost evaluate pe două seturi de

secţiuni seriate: • un set la care s-a efectuat imunomarcare cu anticorpi anti colagen IV • un set la care s-a efectuat impregnare argentică după metoda Gömöri

La fiecare caz au fost aleşi aleator şi fotografiaţi câte 30 de tubi pentru fiecare tip de coloraţie, folosind obiectivul X40 al microscopului iar imaginile au fost achiziţionate direct în calculator.

Pentru fiecare tub au fost efectuate cinci detereminări aleatorii, valorile obţinute fiind notate cu g1 CIV, g2 CIV, …, g5 CIV şi g1 Go, g2 Go, …, g5 Go.

S-a calculat Grosimea Medie / Tub valorile obţinute fiind notate cu G1 CIV, ..., G30 CIV, respectiv G1 Go, ..., G30 Go.

S-a calculat grosimea medie pe caz valorile obţinute pentru fiecare caz fiind notate cu GM1 CIV, ..., GMn CIV, respectiv GM1 Go, ..., GMn Go, unde „n” a fost numărul ultimului caz de la fiecare grupă de vârstă.

S-a calculat grosimea medie pentru fiecare grupă de vârstă valorile obţinute fiind notate cu GM 01 CIV, ..., GM07 CIV, respectiv GM 01 Go, ..., GM 07 Go

Determinarea grosimii laminei propria Determinarea grosimii laminei propria a fost făcută pe trei seturi de

secţiuni seriate: • un set imunomarcat cu cu anticorpi anti colagen IV • un set colorate cu tricromicul green light după metoda Goldner-Szeckeli • un set imunomarcat cu anticorpi anti Actina muşchiului neted.

Au fost aleşi aleator şi fotografiaţi câte 30 de tubi pentru fiecare caz, folosind obiectivul X40 al microscopului. Imaginile au fost achiziţionate direct în calculator după prealabila calibrare a modulului de măsurare din programul de analiză a imaginii folosit pentru obiectivul X40.

Pentru fiecare tub au fost efectuate cinci detereminări aleatorii, valorile obţinute fiind notate cu g1, g2, …, g5.

14

S-a calculat Grosimea Medie / Tub valorile obţinute fiind notate cu G1, G2, G3, ..., G30.

S-a calculat grosimea medie pe caz valorile obţinute pentru fiecare caz fiind notate cu GM1, GM2, ..., GMn, unde „n” a fost numărul ultimului caz de la fiecare grupă de vârstă

S-a calculat grosimea medie pentru fiecare grupă de vârstă valorile obţinute fiind notate cu GM 01, GM 02, ..., GM07.

Determinarea grosimii manşonului fibro-hialin intern (M F-H) Măsurătorile pentru manşonul fibro-hialin s-au efectuat la aceiaşi tubi la

care s-a măsurat grosimea LP. Pentru fiecare tub au fost efectuate cinci detereminări aleatorii, valorile

obţinute fiind notate cu g1, g2, …, g5. S-a calculat Grosimea Medie / Tub valorile obţinute fiind notate cu G1,

G2, G3, ..., G30. S-a calculat grosimea medie pe caz valorile obţinute pentru fiecare caz

fiind notate cu GM1, GM2, ..., GMn, unde „n” a fost numărul ultimului caz de la fiecare grupă de vârstă.

S-a calculat grosimea medie pentru fiecare grupă de vârstă valorile obţinute fiind notate cu GM 01, GM 02, ..., GM07.

Datele referitoare la parametrii clinici şi la cei morfologici măsuraţi au fost introduse în calculator în tabele de baze de date din modulul Microsoft Access din pachetul de programe Microsoft Office 2003 professional. Prelucrarea datelor rezultate în urma măsurătorilor a fost efectuată cu ajutorul modulului Microsoft Excel din pachetul de programe Microsoft Office 2003 professional.

Pentru a stabili existenţa tendinţei de evoluţie o dată cu vârsta a parametrilor morfologici evaluaţi a fost construită Dreapta de Regresie pentru fiecare în parte. Drept variabilă independentă a fost folosită, pentru toate determinările „Grupa de vârstă” iar fiecare dintre parametri a constituit variabila dependentă.

Pentru evaluarea tendinţei evolutive a fiecăreia din variabilele dependente a fost calculată, la fiecare dintre dreptele de regresie, Panta, notată cu “m”.

A fost stabilit de asemenea Testul de semnificaţie a pantei pentru a aprecia gradul de semnificaţie a evoluţiei fiecăruia dintre parametri. Tendinţa de evoluţie corelată cu vârsta a fost considerată semnificativă dacă valoarea testului, notată cu “p” a fost < 0,05.

Graficele au fost realizate cu ajutorul modulelor Microsoft Graph 2003 Chart şi Microsoft Excel din pachetul de programe Microsoft Office 2003 professional.

15

CC AA PP II TT OO LL UU LL VV SS TT UU DD II UU LL TT UU BB II LL OO RR SS EE MM II NN II FF EE RR II ÎÎ NN TT EE SS TT II CC UU LL UU LL SS EE NN EE SS CC EE NN TT

Modificările diametrului tubular În Tabelul 3 au fost centralizate cele trei valori determinate pentru fiecare

grupă de vârstă, iar apoi a fost construită histograma în baza acestor date. Se poate observa o tendinţă oarecum divergentă a evoluţiei curbelor celor trei valori luate în consideraţie. În timp ce cu excepţia valorii pentru prima grupă (unde, de altfel, au fost numai două cazuri) valoarea diametrului mediu determinat pe tub tinde să creasă uşor odată cu înaintarea în vârstă, valorile celei mai mici determinări pe tub şi media pe grupă de vârstă au o uşoară tendinţă, oscilatorie însă, la scădere. Cea mai mare variaţie individuală a valorilor determinate pe tub a fost întâlnită la grupa 6 de vârstă, adică după 75 de ani iar limitele cele mai strânse de variaţie au fost observate la grupa 3 de vârstă, adică între 60 şi 64 de ani.

TTaabbeelluull 33:: VVaalloorriillee mmiinniimmee,, mmaaxxiimmee şşii mmeeddiiii aallee

DDiiaammeettrruulluuii TTuubbuullaarr

Valoare Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7 Minimă 99,3 69,7 99,3 73,1 85 68,8 89

Medie 120,4 99,5 118,3 96,4 102,2 113 112,2Maximă 145,2 118,6 136,9 117,5 133,8 139 139,3

99,3

69,7

99,3

73,185

68,8

89

120,4

9 9,5

118,3

96 ,4 102,2113 112,2

145,2

118,6

136,9

117,5133,8 139 139,3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7

Diam

etru

Tub

ular

Med

iu (µ

m)

Val Min Val Med Val Max

Figura 1

16

Au fost centralizate valorile medii ale diametrului tubular mediu de la toate cazurile lotului 1, pe grupe de vârstă. Pe baza valorilor medii ale diametrului tubular calculate pentru fiecare caz în parte, consemnate în acest tabel, a fost construită dreapta de regresie pentru a stabili dacă există într-adevăr o tendinţă de evoluţie o dată cu vârsta a valorii diametrului tubular mediu (DTM).

„Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea DTM pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă.

Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii DTM a fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m DTM”. Valoarea pantei a fost m DTM = + 0,82 (Figura 2), aceasta însemnând că DTM a avut tendinţa reală, în ansamblu, să crească o dată cu înaintarea în vârstă.

75

85

95

105

115

125

135

145

0 1 2 3 4 5 6 7

Grupa de Vârstă

Dia

met

rul T

ubul

ar M

ediu

(µ

m)

8

Figura 2

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor DTM în corelaţie cu vârsta a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p DTM”. Valoarea determinată a fost de p = 0,24, arătând astfel că între variaţia DTM şi înaintarea în vârstă nu există o corelaţie semnificativă.

În concluzie, valoarea medie a DMT, deteminată pentru întreg lotul de studiu, a fost de 108,8 µm cu limite ale valorilor medii pe grupă de vârstă cuprinse 96,4 µm şi 120,4 µm şi variaţii individuale cuprinse între 78,9 µm (- 29,9) şi 137,2 µm (+ 28,4), valoare reprezentând 54% din media consemnată în literatura de specialitate. Ţinând cont însă că datele din literatură se referă la adulţi tineri, înseamnă că DMT scade la senescenţă, el reprezentând astfel un semn indirect al involuţiei epiteliului seminal. Tendinţa staţionară pe de-o parte şi marea variabilitate a determinărilor pe de altă parte, sunt probabil consecinţa involuţiei inegale a epiteliului seminal, atât individuale cât şi la nivelul fiecărei grupe de vârstă.

17

Înainte de a continua evaluarea diferitelor componente ale peretelui tubului seminifer trebuie menţionat că, pentru evidenţierea aspectelor stabilite a fi analizate, au fost folosite, pe lângă tehnicile clasice de colorare pentru componentele ţesutului conjunctiv, şi tehnicile de imunomarcare cu anticorpi selectivi.

Deoarece, pe de o parte, efectuarea acestor tehnici în laboratorul departamentului de Morfopatologie al Universităţii de Medicină şi Farmacie din Craiova a fost posibilă numai începând cu anul 2002, iar, pe de altă parte, reactivii pentru imunohistochimie au costuri ridicate, investigaţia parametrilor morfometrici ai peretelui tubular a fost restrânsă la un lot mai mic, de numai 28 de cazuri, alcătuit din cazurile cu orhiectomie pentru carcinom de prostată apărute în cursul anului 2002.

Distribuţia pe grupe de vârstă a cazurilor din acest al doilea lot, centralizată în Tabelul 4 şi reprezentată grafic în Figura 3, este similară cu cea a lotului 1, cazurile fiind concentrate tot la grupele 4, 5 şi 6, adică între 65 şi 80 de ani (75%), o treime din cazuri având vârsta între 75 şi 80 de ani.

TTaabbeelluull 44:: DDiissttrriibbuuţţiiaa ccaazzuurriilloorr ppee ggrruuppee ddee vvâârrssttăă

Grupa 1

Grupa 2

Grupa 3

Grupa 4

Grupa 5

Grupa 6

Grupa 7 Grupa de vârstă 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 > 80

Total

Lotul 2 1 3 2 5 7 9 1 28

1

3

2

5

7

9

1

0

12

34

56

78

910

Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7

Nr. C

azur

i

Figura 3

18

Studiul membranei bazale Evaluarea MB cu ajutorul impregnării argentice Pe baza valorilor medii ale grosimii MB calculate pentru fiecare caz în

parte a fost construită dreapta de regresie pentru a stabili dacă există într-adevăr o tendinţă de evoluţie o dată cu vârsta a valorii grosimii medii a MB (GMMB).

„Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea GMMB pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă.

Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii GMMB pe coloraţiile după metoda Gömöria fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m GMMB-Gö”.

Valoarea pantei a fost m GMMB-Gö = + 0,04 (Figura 4), aceasta însemnând că GM MB-Gö a avut tendinţa reală, în ansamblu, să crească o dată cu înaintarea în vârstă.

00,20,40,60,8

11,21,41,6

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Grupa de vârstă

Gro

simea

MB

(µm

)

Figura 4

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor GMMB-Gö în corelaţie cu vârsta a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p GM MB-Gö”.

Valoarea determinată a fost de p = 0,097 , arătând astfel că, din punct de vedere statistic, îngroşarea MB, observată pe secţiunile colorate după tehnica Gömöri, nu ar fi legată în mod semnificativ de îmbătrânire, deşi panta dreptei de regresie este una evident ascendentă. Acest rezultat poate fi justificat însă de numărul redus de cazuri din care a fost alcătuit lotul şi de modul de distribuţie al acestora în funcţie de variabila independentă.

19

Evaluarea MB cu ajutorul imunomarcării cu anticorpi anti-colagen IV Au fost centralizate, pe grupe de vârstă, valorile medii ale grosimii MB

determinate pe secţiunile imunomarcate cu anticorpi anti Colagen IV de la toate cazurile lotului 2.

Pe baza valorilor medii ale grosimii MB calculate pentru fiecare caz în parte, a fost construită dreapta de regresie pentru a stabili dacă există într-adevăr o tendinţă de evoluţie o dată cu vârsta a valorii grosimi medii a MB (GMMB-CIV). „Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea GMMB-CIV pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă. Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii GM MB a fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m GM MB-CIV”. Valoarea pantei a fost m GMMB-CIV = - 0,012 (Figura 5), aceasta însemnând că GMMB-CIV a avut o tendinţă reală, în ansamblu, să se reducă odată cu înaintarea în vârstă.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 1 2 3 4 5 6 7

Grupa de Vârstă

Gro

simea

MB

(µm

)

8

Figura 5

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor GMMB-CIV în corelaţie cu vârsta a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p GM MB-CIV”. Valoarea determinată a fost de p = 0,309 , arătând astfel că, din punct de vedere statistic, reducerea dimensiunilor MB determinate cu ajutorul anticorpilor anti CIV nu se corelează semnificativ cu înaintarea în vârstă. Şi acest rezultat, însă, poate fi justificat de numărul redus de cazuri din care a fost alcătuit lotul şi de modul de distribuţie al acestora în funcţie de variabila independentă.

Compararea valorilor obţinute la cele două coloraţii S-a calculat pentru fiecare grupă de vârstă, procentul reprezentat de

grosimea MB determinată prin imunomarcare din grosimea determinată cu săruri de argint.

20

0,58

0,820,91

0,83 0,89

1,14 1,08

0,610,590,68 0,69

0,590,67

0,49

1,23

0,87

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7 Media

(µm

)

C IV Gomori

Figura 6

O primă constatare, este că stratul de fibre de colagen de tip IV a fost totdeauna mai subţire decât cel colorat cu săruri de argint. Această observaţie întăreşte supoziţia că sărurile de argint nu se fixează numai pe fibrele de colagen de tip IV ci şi pe alte tipuri de structuri fibrilare colagene, în felul acesta, singura modalitate de a evidenţia fidel numai MB fiind imunomarcarea cu anticorpi specifici pentru componentele sale şi, în primul rând, pentru CIV.

O a doua constatare este aceea că cele două straturi evidenţiate, MB şi stratul fibrilar fixator de săruri de argint au tendinţe evolutive diferite odată cu înaintarea în vârstă. În timp ce grosimea stratului de CIV are o tendinţă de reducere în dimensiuni mai ales către vârstele înaintate, stratul marcat cu săruri de argint care-l înglobează pe primul, îşi măreşte dimensiunile către aceleaşi vârste. Altfel spus, adevărata membrană bazală pare să fie sediul unui proces discret regresiv, pe când structurile fibrilare de tip reticular de la exteriorul ei par să devină din ce în ce mai numeroase şi mai dense (Figura 6).

„Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea raportului GMMB-CIV/GMMB-Gö pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă.

Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii GMMB-CIV/GMMB-Gö a fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m GMMB-CIV/GMMB-Gö”.

Valoarea pantei a fost m GMMB-CIV/GMMB-Gö = - 0,038 . Aceasta înseamnă că procentul ocupat de componenta marcată cu C IV,

care reprezintă adevărata membrană bazală şi componenta marcată cu săruri de argint a avut o tendinţă reală, în ansamblu, să se reducă odată cu înaintarea în vârstă. Se poate spune, cu alte cuvinte, că trama de fibre colagene de tip

21

reticular care fixează sărurile de argint se îngroaşă odată cu înaintarea în vârstă, însă această îngroşare nu priveşte şi adevărata membrană bazală care are o tendinţă discret regresivă.

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor raportului dintre cele două determinări la fiecare caz în parte în funcţie de vârstă a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p GM MB-CIV/GMMB-Gö”.

Valoarea determinată a fost de p = 0,174 , arătând astfel că, din nou, din punct de vedere statistic, această corelaţie inversă dintre grosimea MB şi grosimea stratului fibrilar colagen evidenţiat cu ajutorul impregnării argentice şi tendinţa lor evolutivă divergentă nu ar fi legate în mod semnificativ de procesul de îmbătrânire. Şi acest rezultat, însă, poate fi justificat de numărul redus de cazuri din care a fost alcătuit lotul şi de modul de distribuţie al acestora în funcţie de variabila independentă.

În concluzie, MB a tubilor seminiferi are, în jurul vârstei de 55 de ani, o grosime medie de 0,6 µm, cu variaţii medii de +/- 0,1µm. După 70 de ani, limitele de variaţie se lărgesc, trădând apariţia unor procese zonale de îngroşare a ei, însă, valoarea medie a grosimii MB are tendinţa să se micşoreze după această vârstă. Dacă se ia încă în considerare afirmaţia că fibrele colagene reticulare reprezintă structuri fibrilare colagene nou formate, atunci se poate avansa ipoteza că, spre vârstele înaintate, stratul intern al tunicii propria, aflat în apoziţie cu MB, este sediul unui proces de fibrilogeneză care determină lărgirea sa.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Grupa de vârstă

Rap

ort M

B C

IV/M

B G

ö

Figura 7

22

Studiul Laminei propria

TTaabbeelluull 55:: VVaalloorriillee mmiinniimmee şşii mmaaxxiimmee ppee ttuubb şşii mmeeddiiiillee ggrroossiimmiiii LLPP ppee ggrruuppee ddee vvâârrssttăă

Valoare Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7 Minimă 3,3 5,3 4,2 6,6 4 3,8 4

Medie 3,99 6,75 5,94 7,81 6,3 6,25 5,21 Maximă 4,6 9,1 9,2 8,73 7,9 9,4 7,6

3,3

5,3

4,2

6,6

4 3 ,8 4

3,99

6,755,94

7 ,81

6,3 6,25

5,214,6

9,1 9,2 8,737,9

9 ,4

7,6

01

23

4

56

7

89

1011

Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7

Gro

sim

ea L

P (µ

m)

Val Min Val Med Val Max

Figura 8

Se poate observa că valoarea medie a grosimii LP la lotul de persoane vârstnice studiat a oscilat (cu excepţia valorilor de la singurul caz din grupa 1) în jurul valorii de 6 µm, cu limite între 5,21 şi 7,81 µm şi cu o tendinţă uşoară de scădere către vârstele înaintate. Valorile nu diferă foarte mult de cele citate literatură care însă au fost determinate la persoane adulte şi nu la vârstnici.

Pe baza valorilor medii ale grosimii LP calculate pentru fiecare caz în parte, a fost construită dreapta de regresie pentru a stabili dacă există într-adevăr o tendinţă de evoluţie o dată cu vârsta a valorii grosimi medii a LP (GMLP). „Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea GMLP pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă. Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii GMLP a fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m GMLP”.

Valoarea pantei a fost m GMLP = - 0,03 (Figura 9), aceasta însemnând că GMLP a prezentat o tendinţă discretă, însă reală, în ansamblu, să se micşoreze odată cu înaintarea în vârstă, date care contrazic afirmaţiile din literatură potrivit cărora LP s-ar îngroşa, chiar şi relativ, la senescenţă.

23

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Grupa de vârstă

Gro

simea

LP

(µm

)

Figura 9

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor GMLP în corelaţie cu vârsta a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p GMLP”.

Valoarea determinată a fost de p GMLP = 0,875 , arătând astfel că, din punct de vedere statistic, reducerea dimensiunilor LP nu poate fi legată semnificativ de înaintarea în vârstă. Rezultatul, însă, poate fi consecinţa aceloraşi cauze invocate şi la determinările MB şi anume numărul redus de cazuri din care a fost alcătuit lotul şi modul de distribuţie al acestora în funcţie de variabila independentă.

Evaluarea grosimii manşonului fibro-hialin Valorile cele mai mici şi cele mai mari ale grosimii MFH determinate la

nivel de tub pentru fiecare grupă de vârstă precum şi valorile medii calculate pe grupa de vârstă au fost introduse, pentru comparare, în Tabelul 6 şi, în baza lor, au fost trasate curbele de variaţie din histograma corespunzătoare tabelului.

TTaabbeelluull 55..1155:: VVaalloorriillee mmiinniimmee şşii mmaaxxiimmee ppee ttuubb şşii mmeeddiiiillee

ggrroossiimmiiii MMFFHH ppee ggrruuppee ddee vvâârrssttăă

Valoare Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7 Minimă 0 1,3 0 2,6 0 0 1,4

Medie 0,14 2,97 1,43 3,35 1,99 1,97 2,1 Maximă 0,8 5 3,2 4,4 3,6 3,95 2,7

24

0

1,3

0

2,6

0 0

1,4

0,14

2,97

1,43

3,35

1,99 1,97 2,1

0,8

5

3,2

4,4

3,63 ,95

2,7

0

1

2

3

4

5

6

Grupa 1 Grupa 2 Grupa 3 Grupa 4 Grupa 5 Grupa 6 Grupa 7Gro

sim

ea M

anşo

nulu

i F-H

(µm

)

Val Min Val Med Val Max

Figura 10

Se poate observa că valoarea medie a grosimii MFH a oscilat în jurul valorii de 2µm. La nivel tubular, condensarea fibro-hialină fie a lipsit, fie a atins grosimi medii de până la 5 µm. Cele mai mari variaţii ale valorilor medii individuale tubulare au fost înregistrate între 55 şi 65 de ani şi între 70 şi 80 de ani.

Evoluţia curbelor nu pare să sugereze vreo corelaţie între înaintarea în vârstă şi dezvoltarea acestei bariere amorfe între MB şi straturile celulare şi vasculare ale LP.

Pe baza valorilor medii ale grosimii MFH calculate pentru fiecare caz în parte, a fost construită dreapta de regresie, pentru a stabili dacă există într-adevăr o tendinţă de evoluţie odată cu vârsta a valorii grosimi medii a MFH (GMMFH).

„Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea GMMFH pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă.

Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii GMMFH a fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m GMMFH”.

Valoarea pantei a fost m GMMFH = - 0,05 (Figura 11), aceasta însemnând că GMMFH a prezentat, de fapt, o tendinţă discretă însă reală, în ansamblu, să se micşoreze odată cu înaintarea în vârstă.

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor GMLP în corelaţie cu vârsta a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p GMMFH”.

Valoarea determinată a fost de p GMMFH = 0,73 , arătând astfel că, din punct de vedere statistic, reducerea dimensiunilor MFH nu poate fi legată semnificativ de înaintarea în vârstă. Rezultatul, însă, poate fi consecinţa

25

numărului redus de cazuri din care a fost alcătuit lotul şi a modului de distribuţie al acestora în funcţie de variabila independentă.

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Grupa de vârstă

Gro

simea

M F

-H (µ

m)

Figura 11

Comparaţia dintre dimensiunile LP şi cele ale MFH intern „Grupa de vârstă” a fost considerată variabilă independentă, iar valoarea

raportului GMMFH/GMLP pentru fiecare caz a reprezentat variabila dependentă.

Pentru evaluarea tendinţei evolutive a valorii GMMFH/GMLP a fost calculată, la dreapta de regresie obţinută, panta, notată cu “m GMMFH/GMLP”.

Valoarea pantei a fost m GMMFH/GMLP = - 0,0022 reliefând o uşoară tendinţă descendentă a procentului reprezentat de MFH din grosimea LP. Luând în consideraţie faptul că valorile grosimii medii pe grupe de vârstă atât ale LP cât şi ale MFH au avut o tendinţă regresivă, înseamnă că reducerea procentului reprezenat de MFH din LP se datorează reducerii grosimii sale medii.

Gradul de semnificaţie a evoluţiei valorilor raportului dintre cele două determinări la fiecare caz în parte în funcţie de vârstă a fost apreciat în urma aplicării testului de semnificaţie a pantei, notat cu “p GMMFH/GMLP”.

Valoarea determinată a fost de p = 0,905 , arătând, şi în acest caz, că, între cele două elemente variabile luate în consideraţie, „grupa de vârstă” şi „GMMFH/GMLP”, nu există o corelaţie statistică semnificativă.

În concluzie, grosimea LP a prezentat variaţii semnificative la nivel tubular, la nivel individual, la nivel de grupă de vârstă şi la nivelul întregului lot. Valoarea medie a grosimii LP a avut o tendinţă evolutivă regresivă,

26

observaţie care este în discordanţă cu afirmaţiile din literatura de specialitate. La niveul stratului celui mai intern al LP, aflat în raport direct cu MB, are loc un proces degenerativ al structurilor fibrilare reticulare, constând în creşterea numărului de fibre colagene, cu rearanjări după un model fascicular, condensări focale şi chiar transformare în material amorf hialin. Toate aceste alterări nu prezintă însă o răspândire difuză nici la nivel tubular nici la nivel lobular şi nu au o tendinţă generalizată de accentuare odată cu înaintarea în vârstă, fapt demonstrat de marea variabilitate a determinărilor morfometrice, care pornesc de la absenţa totală a alterărilor din unii tubi, până la prezenţa lor pe întreaga circumferinţă a tubului. Observaţiile şi măsurătorile efectuate au demonstrat incontestabil că LP este, la senescenţă, sediul unor modificări de tip degenerativ care au, însă, caracter extrem de variabil ca intensitate şi extindere, fapt susţinut de valorile testelor de semnificaţie a dreptelor de regresie ale valorilor medii ale grosimii LP, MFH şi ale procentului MFH din LP.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Grupa de vârstă

Rapo

rtul M

F-H

/LP

Figura 12

Scleroza tubulară Dacă termenul de „scleroză tubulară”, este considerat ca definiţie a unui

aspect morfologic, atunci el are semnificaţia de masă amorfă de fibre colagene care înlocuieşte tubul seminifer după atrofia epiteliului seminal, reprezentând etapa finală a proceselor degenerative ale structurilor tubului seminifer, odată cu înaintarea în vârstă.

Dacă însă termenul este considerat ca definiţia unui proces în evoluţie, atunci el înseamnă transformarea tubului seminifer într-o aglomerare acelulară, amorfă de fibre colagene care înlocuieşte treptat tubul, pe măsură ce epiteliul acestuia ajunge la atrofie completă, proces care debutează încă de timpuriu,

27

când şi modificările epiteliale sunt la început şi care se desfăşoară concomitent cu acestea până la stadiul de înlocuire completă a structurii tubulare cu una colagenă. Astfel definit, procesului i se pot descrie două mari etape, care sunt indisolubil legate de modificările degenerative epiteliale: etapa manşonului fibro-hialin şi etapa de scleroză propriu-zisă.

Etapa „Manşonului Fibro-Hialin” Prima etapă este concomitentă cu fazele de involuţie graduală a epiteliului

seminal. Modificările morfologice apar numai la nivelul stratului intern al LP, aflat în raport direct cu MB a epiteliului seminal. Ele constau în densificări focale ale stratului de fibre reticulare de lângă MB, cu rearanjarea acestora şi dispunerea lor în fascicule şi benzi care se pot îngroşa şi pot suferi chiar fenomene de degenerescenţă hialină. Aceste benzi se pot extinde la întreaga circumferinţă a tubului, formând astfel un fel de manşon acelular, fibrilar dens, interpus între MB şi restul straturilor LP. De aceea, această etapă ar putea fi denumită etapa „manşonului fibro-hialin”.

Caracteristic pentru această etapă este, pe de-o parte, prezenţa epiteliului seminal, chiar dacă se află în faze avansate ale involuţiei (cum ar fi etapa opririi procesului de spermatogeneză la stadiul de spermatogonie) iar pe de altă parte, limitarea procesului de scleroză la stratul intern al LP.

La cazuistica studiată, la toate grupele de vârstă, majoritatea alterărilor tubulare observate, atât cele epiteliale cât şi cele ale peretelui tubular, se găseau în această etapă. Gradul de extensie al procesului de scleroză a fost extrem de variabil atât în ceea ce priveşte grosimea cât şi în ceea ce priveşte perimetrul tubular. Astfel au putut fi observaţi tubi fără modificări scleroase ale LP, tubi cu densificări focale de grosimi variabile care nu ocupau întreaga circumferinţă şi tubi cu veritabile manşoane fibro-hialine cu grosimi variabile. De menţionat că modificările degeneative nu au afectat decât stratul intern şi, de regulă, procesele de tip circumferenţial s-au asociat cu grade mai severe de involuţie ale epiteliului seminal şi au prezentat o mare variabilitate atât individuală cât şi la nivel de grup de vârstă.

Etapa Sclerozei Tubulare Propriu-Zise Cealaltă etapă se derulează după atrofia completă a epiteliului seminal,

într-un ritm mult mai rapid decît prima, trăsătura definitorie fiind colagenizarea tuturor straturilor LP, cu extinderea procesului proliferativ fibrilar până la ocuparea integrală a lumenului tubular. În debutul acestei faze mai pot fi observaţi tubi cu vestigii epiteliale formate din CS degenerate.

Tubii complet sclerozaţi, au fost observaţi la toate cazurile din toate grupele de vârstă însă prezenţa lor a fost una izolată, de obicei în vecintatea septurilor interlobulare şi la cei doi poli ai lobulilor: cel subcapsular şi cel pararetial.

28

CC OO NN CC LL UU ZZ II II Modificările morfologice şi funcţionale ale ţesutului testicular odată cu

înaintarea în vîrstă au constituit o preocupare continuă pentru multe centre de cercetare renumite, pentru echipe consacrate de cercetători şi pentru generaţii întregi de anatomopatologi şi endocrinologi. Studiile au fost axate în marea lor majoritate pe evaluarea componentei epiteliale funcţionale şi a secreţiei endocrine. Componenta stromală apare în foarte puţine studii din străinătate ca subiect de cercetare, la noi în ţară studiul de faţă fiind al doilea care abordează modificările morfologice induse de instalarea senescenţei în parenchimul testicular.

Din studiul materialului tisular reprezentat de ţesut testicular provenind de la pacienţi orhiectomizaţi pentru carcinom de prostată, studiu realizat prin combinarea tehnicilor clasice de investigare morfologică cu marcarea cu cromogen ataşat de un anticorp specific a anumitor componente ale stromei testiculare şi cu determinări morfologice cantitative realizate cu ajutorul tehnicii de calcul pe imagini microscopice digitizate, s-au desprins câteva concluzii interesante care oferă şi provocarea şi perspectiva continuării ulterioare şi completării investigaţiilor proceselor de degenerescenţă a parenchimului testicular pe măsura înaintării în vârstă.

1. În ciuda marii variabilităţi, atât individuale cât şi la nivel de grupe de

vârstă, ţesutul conjunctiv de susţinere are o tendinţă regresivă odată cu înaintarea în vârstă, participând astfel, împreună cu epiteliul seminal, la reducerea volumului total al parenchimului testicular senescent.

2. Nu a fost constatată, însă, reducerea reţelei vasculare capilare

intramurale, descrisă de unele studii din literatura de specialitate, ci, dimpotrivă aceasta a putut fi observată la toate grupele de vârstă.

3. Tubii seminiferi au arătat dimensiuni mai reduse în comparaţie cu cei

ai adultului, probabil datorită reducerii volumului ocupat de epiteliul seminal, însă fenomenul de regresie se reduce foarte mult, ne mai fiind corelat cu înaintarea în vârstă.

4. La nivelul peretelui tubului seminifer, se produc o serie de modificări

care pot avea influenţă asupra modificărilor degenerative ale epiteliului seminal. Astfel, membranele bazale par să sufere un proces de regresie dar numai către vârstele foarte înaintate.

29

5. Lamina propria are o tendinţă staţionară în general, cu îngroşări focale,

care nu pot să explice izolarea epiteliului seminal şi fenomenele sale involutive.

6. Una din modificările care pot atrage atenţia şi pot explica degenerarea epiteliului seminal este apariţia zonei amorfe, hialine, interpuse între mebrana bazală şi structurile vasculare trofice din interiorul laminei propria, reprezentate de capilarele intramurale. Această lamă de colagen, discontinuă, cu îngroşări şi hialinizări focale, cu un aspect de „sac zdrenţuit”, semnalată de coloraţia Gömöri imediat lângă membrana bazală, se poate constitui într-o veritabilă barieră care împiedică hrănirea celulelor tubulare şi completează deficitul nutritiv determinat de modificările scleroase din pereţii arterelor inter şi intralobulare.

7. Deşi ţesutul testicular investigat s-a aflat sub semnul influenţei date de

prezenţa ţesutului neoplazic malign în parenchimul prostatic, histologia testiculară a prezentat o mare variabilitate atât individuală cât şi la nivel de grupe de vârstă. Pe acest fond, s-a putut observa însă o discretă tendinţă generală de agravare a modificărilor legate de îmbătrânire. Argumentele care pledează pe de-o parte pentru plaja extinsă de variaţie a diferitelor alterări, iar, pe de altă parte, pentru caracterul focal, izolat şi lent evolutiv, în ansamblu, al acestor modificări sunt tocmai instrumentele statistice care au arătat, o tendinţă discret regresivă a majorităţii dreptelor de regresie calculate pentru parametrii măsuraţi însă nu au relevat semnificaţia statistică a corelării acestei regresii cu înaintarea în vârstă.

8. Rezultatele acestui studiu al modificărilor componentelor peretelui

tubului seminifer la senescenţă nu pot decât să îndemne la continuarea cercetărilor şi pe loturi de testicule provenind de la persoane în vârstă fără carcinom de prostată şi, apoi, la compararea rezultatelor pentru a elucida cît mai multe din necunoscutele procesului de îmbătrânire tisulară, atât în general cât şi la nivelul acestui parenchim nobil.

30

BB II BB II OO GG RR AA FF II EE SS EE LL EE CC TT II VV ĂĂ

1. * http://www.online-medical-dictionary.org/omd.asp?q=Aging (2011). Aging. In: On-line Medical Dictionary.

2. Andrew W. (1971). The anatomy of aging in man and animals, Grunne and Stratton, New York, pp. 185-86.

3. Bourne GH, Wilson GMH. (1961). Structural aspects of ageing, Hafner, New York, 1961.

4. Bowen RL, Atwood CS. (2004). Living and dying for sex. A theory of aging based on the modulation of cell cycle signaling by reproductive hormones. Gerontology, 50(5):265–90.

5. Harbitz TB. (1973). Morphometric studies of the seminiferous tubules in elderly males with special reference to the histology of the prostate. An analysis in an autopsy series. Acta Path Microbiol Scand, 81:843-56.

6. Honoré HL. (1978). Ageing changes in the Human Testis: a Light-Microscopic Study. Gerontology, 24:58-65.

7. Johnson AD, Gomes WR, VanDemark NL. (1970). The Testis, Academic Press Inc.

8. Rando TA, Carstensen LL. (2011). In: Masoro EJ, Austad SN, (eds.), Handbook of the Biology of Aging, 7th Edition, Academic Press, Elsevier, USA, p. xi.

9. Sniffen RC. (1950). The Testis I. The normal testis. Archs Path, 50:259-84.

10. Stearns EL, McDonnell JA, Kaufman BJ, et al. (1974). Declining testicular function with age: hormonal and clinical correlations. Am Med, 57:761-6.

11. Steinberger E, Tijoe DY. (1969). Spermatogenesis in rat testis after experimental ischemia. Fert Steril, 20:639-49.

12. Suoranta H. (1971). Changes in the small blood vessels of the adult human testis in relation to age and some pathological conditions. Virchows Arch Abt A Anat, 352:165-81.

31

CC UU RR RR II CC UU LL UU MM VV II TT AA EE NUME Oltin Tiberiu POP DATA ŞI LOCUL NAŞTERII 2 noiembrie 1979, Craiova, Dolj AFILIAŢIE CURENTĂ Centrul pentru studii de Morfologie

Microscopică şi Imunologie, UMF Craiova

CELE MAI SEMNIFICATIVE REZULTATE ALE ACTIVITĂŢII - activitate de cercetare concretizată prin participarea ca cercetător la 9

contracte de cercetare; - 15 februarie 2010 – 14 octombrie 2010 – stagiu de cercetare în cadrul

Laboratorului de Neurobiologie Moleculară, Clinica de Neurologie, Universitatea Ernst-Moritz-Arndt, Greifswald, Germania;

- activitate publicistică: 1 carte; 11 lucrări in extenso publicate în reviste de specialitate indexate

ISI; 18 lucrări publicate în rezumat în reviste de specialitate indexate

ISI; 7 lucrari publicate in extenso in reviste de specialitate indexate in

alte baze de date internationale; 1 lucrare publicata in rezumat in reviste de specialitate indexate in

alte baze de date internationale; 6 lucrari publicate in extenso in reviste de specialitate din tara; 25 de lucrări prezentate la congrese şi alte reuniuni ştiinţifice de

prestigiu din ţară şi străinătate. - Premiul al II-lea pentru lucrarea „Morphological changes in lamina

propria of the seminiferous tubule in aging testis” prezentată în cadrul 18th European Students' Conference, 2007, Berlin, October, 7th-11th;

- Organizarea de manifestări ştiinţifice: Secretar al celui de-al X-lea Simpozion Naţional cu Participare

Internaţională al Societăţii Române de Morfologie, Craiova, 25-28 mai 2011

Secretar al celui de-al VIII-lea Simpozion Naţional al Societăţii Române de Morfologie, Craiova, 26-30 mai 2009

Local organiser al „European School of Pathology Course - Update in Female Genital Tract Pathology”, Craiova, 17th-20th September, 2009

- Membru al Societăţii Române de Biologie Celulară (SRBC) (2011); - Editorial Secretary al Romanian Journal of Morphology and

Embriyology.

32

LUCRARI PUBLICATE DIN TEMA STUDIATĂ ÎN TEZA DE DOCTORAT

1. Cotoi CG, Pop OT, Mandache E, Gherghiceanu M, Georgescu CV, Enache SD, Plesea IE. (2010). Studiu morfologic cantitativ al peretelui tubului seminifer la senescenta la om si sobolan. The IXth National Symposium with International participation on Microscopic Morphology, Craiova, 26-29 May, pp. 29-30.

2. Pleşea IE, Enache SD, Badea P, Georgescu CV, Ghiluşi M, Popescu CF, Pop OT, Ciurea R. (2008). Morphological changes of seminiferous tubular basement membrane in ageing testis. Histopathology, 53(Suppl. 1):285 (XXVIIth Congress of International Academy of Pathology, 12-17 October 2008, Athens).

3. Plesea IE, Enache SD, Georgescu CV, Pop OT. (2009a). Morphological changes of peritubular tissue in ageing testis. Virchows Archiv, 455(Suppl. 1):S224-S225 (22nd European Congress of Pathology, 4-9 September 2009, Florence).

4. Plesea IE, Pop OT, Enache SD, Mandache E, Gherghiceanu M, Stanoiu B, Butaru A. (2009b). Comparative study of peritubular tissue in human and rat ageing testis. 20th Ljudevit Jurak International Symposium on Comparative Pathology", Zagreb, Croatia, June, 5th-6th.

5. Plesea IE, Gherghiceanu M, Enache SD, Mandache E, Hortopan G, Pop OT. (2010a). Histological and ultrastructural analisys of seminiferous tubule wall in ageing testis. Virchows Arch, 457(2):246 (Intercongress Meeting of the European Society of Pathology, 31 august – 3 september 2010, Krakow, Poland).

6. Plesea IE, Enache SD, Popescu FC, Pop OT, Cotoi CG, Enche MA, Plesea RM. (2010b). Correlation between intralobular interstitial morphological changes and epithelial changes in ageing testis. Pathologica, 102(4):288, (50 Congresso Triennale della Societa’ Italiana di Anatomia Patologica e Citopatologia, Bologna, Italy, September, 21th-25th, 2010).

7. Pop OT, Stanoiu B, Enache SD, Panus A, Riza L, Enache M, Plesea RM, Plesea IE. (2009). Intralobular supporting structures of seminal epithelium in ageing testis - quantitative study. "Adriatic Society of Pathology 24th Meeting", Duino, June 27th – 28th.

8. Pop OT, Cotoi CG, Plesea IE, Gherghiceanu M, Enache SD, Mandache E, Hortopan G, Plesea RM. (2011a). Histological and ultrastructural analysis of the seminiferous tubule wall in ageing testis, Rom J Morphol Emryol, 52(1 Suppl):241-8.

33

34

9. Pop OT, Cotoi CG, Plesea IE, Enache SD, Popescu CF, Enache MA, Plesea RM. (2011b). Correlations between intralobular interstitial morphological changes and epithelial changes in ageing testis. Rom J Morphol Emryol, 52(1 Suppl):339-47.