Università degli Studi di Siena

Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di Laurea Specialistica in Biologia Sanitaria

Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica

In collaborazione con il Dipartimento di Patologia Clinica U.O. Chimico Cliniche e Microbiologiche

Sezione semplice di Microbiologia Ospedale S. Donato - Arezzo

Sorveglianza di Laboratorio delle Tossinfezioni Alimentari con particolare attenzione a Escherichia coli

0157: H7

Docente Relatore: Prof. Giuseppe Lungarella

Docente Aziendale: Tesi di laurea di: Dott.ssa Irene A.Galanti Alessio Dini

Anno accademico 2008-2009

INDICE

1. RIASSUNTO …………………………………………………….………….. pag. 2

2. ABSTRACT ……………………………......................................................... pag. 3

3. INTRODUZIONE …………………………………………………..……….. pag. 4

3.1. Quadri clinici ………………………………………………………. pag. 6

3.2. Principali agenti eziologici di infezioni alimentari …………….….. pag. 6

3.3. Escherichia coli O157: H7 ………………………………….……… pag. 11

3.4. Terapia …………………………………………………..………….. pag. 14

3.5. Epidemiologia di EHEC ……………………………………………. pag. 15

4. SCOPO DELLA TESI ………………………………………………………... pag. 18

5. MATERIALI E METODI …………………………………………………….. pag. 19

5.1. Coprocoltura ………………………………………………………… pag. 19

5.2. Raccolta del campione di feci per coprocoltura …………………….. pag. 19

5.3. Tecnica di isolamento su terreno agarizzato ………………………… pag. 20

5.4. Ricerca di Salmonella e Shigella su Hektoen enteric agar …………. pag. 21

5.5. Ricerca di Yersinia enterocolitica su Cin agar ……………………… pag. 23

5.6. Ricerca di Campylobacter su Campylobacter selective agar ……….. pag. 24

5.7. Ricerca di E.Coli O157 ……………………………………………… pag. 25

5.8. Ricerca di E.coli O157 su Mac Conkey Sorbitol Agar “SMAC” …… pag. 25

5.9. E.coli O157 Latex kit ………………………………………………... pag. 26

5.10. Vitek 2 ……………………………………………………………… pag. 27

6. RISULTATI …………………………………………………………………… pag. 29

6.1. Risultati per E.coli O157 ……………………………………………. pag. 38

7. DISCUSSIONE ……………………………………………………………….. pag. 40

7.1. E.coli O157 …………………………………………………………. pag. 41

8. BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………… pag. 43

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SORVEGLIANZA DI LABORATORIO DELLE TOSSINFEZIONI

ALIMENTARI CON PARTICOLARE ATTENZIONE A ESCHERICHIA COLI

O157

Con il termine “malattie trasmesse da alimenti” (MTA) si intende qualsiasi malattia causata o

trasmessa da alimenti e dovuta a sostanze chimiche o ad agenti biologici.

Oggi sono note più di 250 cause di MTA al mondo, che si manifestano con differenti sintomi

e sono causate da diversi agenti patogeni, perlopiù batteri, virus e parassiti. Con il passare

degli anni, vengono identificati continuamente nuovi patogeni, i cosiddetti patogeni

emergenti, come Escherichia coli O157:H7.

Escherichia coli è un piccolo bacillo Gram negativo che appartiene alla famiglia delle

Enterobacteriaceae (enterobatteri). Cresce in habitat ampiamente diffusi, tra cui il suolo,

l’acqua, le piante e soprattutto l’intestino dell’uomo e degli animali.

Il ceppo O157 H:7 enteroemorragico (EHEC) dà una sintomatologia principalmente

intestinale che può variare da una semplice infezione asintomatica ad una diarrea acquosa,

fino ad una diarrea sanguinolenta con crampi addominali (colite emorragica). Nel 3-5% dei

casi può causare una complicazione definita Sindrome Emolitico Uremica (SEU).

Nel 2009 è stata richiesta dal Dipartimento di Prevenzione (U.F. di Igiene degli Alimenti e

Nutrizione) della A.S.L.8 di Arezzo la collaborazione del Laboratorio di Microbiologia

Clinica Ospedaliera della medesima A.S.L. per la trasmissione dei dati epidemiologici

riguardanti gli isolamenti di patogeni intestinali (batteri e virus). Al fine di poter verificare

l’effettiva incidenza di alcune patologie nella popolazione del territorio, ho effettuato

un’indagine epidemiologica retrospettiva della durata di un anno (2009), prendendo in analisi

tutti i campioni di feci per coprocoltura pervenuti al laboratorio di Microbiologia dell’A.S.L.8

di Arezzo. Inoltre, è stato richiesto di inserire, per un breve periodo nella routine diagnostica

delle coprocolture, la ricerca di E.coli O157, i cui dati epidemiologici sono scarsi. A tale

scopo ho effettuato uno studio sperimentale della durata di 6 mesi (2° semestre 2009),

includendo nelle batterie degli esami standard di circa 300 coprocolture la ricerca del

patogeno E.coli O157. I campioni arruolati in tale studio sono feci diarroiche/ematiche di

bambini ed adulti, ricoverati e non, presso l’Azienda U.S.L.8 di Arezzo. Dai risultati ottenuti,

emerge che l’assenza di isolamento di E.coli O157, contrariamente ad altri patogeni, conferma

la scarsa diffusione di questo microrganismo.

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MONITORING LABORATORY OF FOOD-BORNE DISEASE WITH

SPECIAL ATTENTION TO ESCHERICHIA COLI O157

The term "food-borne diseases" (MTA) is any disease caused or transmitted by food and due

to chemicals or biological agents.

Today there are over 250 known causes of MTA in the world, which manifests itself with

different symptoms and are caused by different pathogens, mostly bacteria, viruses and

parasites. Over the years, continually identifies new pathogens, the so-called emerging

pathogens such as Escherichia coli O157: H7.

Escherichia coli is a small gram negative bacillus that belongs to the family of

Enterobacteriaceae (enterobacteria). It grows widely in habitat, including soil, water, plants

and especially the intestines of humans and animals.

The strain O157 H: 7 enterohaemmoragic (EHEC) mainly by acute intestinal infection ranges

from asymptomatic to a simple watery diarrhea, up to a bloody diarrhea with abdominal

cramps (haemorrhagic colitis). In 3-5% of cases can cause a complication called Hemolytic

Uremic Syndrome (HUS).

In 2009 was requested by the Department of Prevention (UF of Food Hygiene and Nutrition)

of ASL8 Arezzo collaboration of the Laboratory of Microbiology, Hospital Clinic of the same

ASLfor the transmission of epidemiological data concerning the insulation of intestinal

pathogens (bacteria and viruses), In order to verify the incidence of some diseases in the

population of the area I have made an epidemiological retrospective of one year

(2009), taking tests all stool samples for coprocoltura arrived at the microbiology laboratory

dell'ASL8 of Arezzo.Furthermore, it was required to put, for a brief period in the routine

diagnostics coprocolture, the search for E. coli O157, which epidemiological data are

scarce. To that end, I made an experimental study lasting 6 months (2nd half 2009), including

the standard battery of examinations of 300 coprocolture the search for the pathogen E. coli

O157. The samples enrolled in this study were diarrhea / blood of children and adults, and not

hospitalized at the Company USL8 of Arezzo. The results obtained show that the absence of

isolation of E.coli O157, unlike other pathogens, confirming the lack of dissemination of this

microorganism.

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INTRODUZIONE

Con il termine “malattie trasmesse da alimenti” (MTA) si intende qualsiasi malattia causata o

trasmessa da alimenti e dovuta a sostanze chimiche o ad agenti biologici.

In questo ambito si riconoscono:

1. Intossicazioni alimentari: dovute a sostanze tossiche o tossine prodotte dagli organismi

nell’alimento ed ingerite con l’alimento stesso, senza che necessariamente venga ingerito

anche l’agente patogeno. Sono esempio di questo tipo le intossicazioni da tossina di

Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum e Bacillus cereus.

2. Tossinfezioni alimentari: dovute a tossine prodotte da microrganismi patogeni che si

moltiplicano all’interno del tratto gastrointestinale. Sono un esempio le malattie da

Clostridium perfringens, Bacillus cereus e Vibrio cholerae.

3. Infezioni alimentari: provocate dall’ingestione di agenti patogeni vivi, con successiva

invasione e moltiplicazione degli stessi all’interno della mucosa intestinale o altri tessuti,

senza la produzione di esotossine. Esempi sono le infezioni da Salmonella spp. Lysteria

monocytogenes, Campylobacter spp.

Oggi sono riconosciute più di 250 cause di MTA al mondo, che si manifestano con differenti

sintomi e sono causate da diversi agenti patogeni, perlopiù batteri, virus e parassiti. Con il

passare degli anni, vengono identificati continuamente nuovi patogeni (i cosiddetti patogeni

emergenti), come Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Listeria

monocytogenes, Yersinia enterocolitica, etc.

Quindi lo scenario epidemiologico delle malattie trasmesse da alimenti è in mutazione

continua, e questo è dovuto soprattutto a:

Cambiamento delle abitudini alimentari, con aumento dei pasti consumati fuori casa,

incremento del consumo di cibi a lunga conservazione e la globalizzazione dei mercati, con

arrivo sulle nostre tavole di prodotti con origine e controlli spesso incerti.

Comparsa di “patogeni emergenti”, la cui responsabilità nell’insorgenza di focolai

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diventa sempre più importante.

Comparsa di nuovi veicoli alimentari prima sconosciuti e responsabili di focolai e casi

sporadici, come il sidro di mele (E.coli O157), i lamponi (Cyclospora, Norovirus), ed i

germogli alfa-alfa (Salmonella, E.coli 0157).

Nella seguente tabella sono elencati i più comuni agenti eziologici collegati al loro veicolo di

trasmissione più frequente.

AGENTE EZIOLOGICO VEICOLO

Salmonella enteritidis Uova

Salmonella spp Pollame, carne, germogli, pesce

Calmpylobacter jejuni Pollame

E. coli enteroemorragici Carne, germogli

Lysteria monocytogenes Formaggio, prodotti freschi, vegetali

Vibrio parahaemolitycus Frutti di mare

Cyclospora Acqua, alimenti

Criyptosporidium Acqua potabile

Shigella Vegetali

Staphylococcus aureus Manipolazione del cibo

Bacillus cereus Riso, pasta, patate

Clostridium perfringens Carne

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QUADRI CLINICI

Le MTA si manifestano principalmente con una sintomatologia definita gastroenterite.

La gastroenterite è un'infiammazione dell'apparato digerente (stomaco, intestino tenue e

crasso) che in forma acuta si manifesta tipicamente con comparsa improvvisa di diarrea per lo

più associata a febbre alta (38-39°C) e dolori addominali diffusi a tutto l'addome, che solo in

parte si attenuano con la defecazione. Spesso coesistono il vomito (specialmente in caso di

intossicazione alimentare) e segni generali di infezione, per esempio dolori muscolari, cefalea,

nausea e mancanza di appetito. Le feci possono essere completamente liquide, molli o semi-

formate, spesso mescolate a muco. La presenza di feci liquide mescolate a sangue

(dissenteria) indica che l'infezione ha colpito prevalentemente il tratto inferiore dell'intestino.

La maggior parte delle diarree infettive che si verificano nei paesi sviluppati e in individui per

altri versi sani ha un decorso abitualmente non grave e tende ad autolimitarsi. La durata di una

gastroenterite acuta non supera i 10 giorni, con una media di 4 giorni. Se una diarrea insorta

all'improvviso si protrae per oltre due settimane, si deve anche prendere in esame l'ipotesi di

una causa non infettiva.

La gastroenterite viene provocata principalmente da batteri e da virus, più raramente da

funghi o parassiti. Il contagio può avvenire da individuo a individuo, oppure attraverso il

contatto con oggetti, acqua o alimenti contaminati. Non è infrequente il manifestarsi di

piccole epidemie in ambienti sovraffollati (asili, ospedali, case di riposo).

Una delle modalità più frequenti di contagio è l'intossicazione alimentare causata dalla

ingestione di alimenti mal conservati o contaminati da batteri.

PRINCIPALI AGENTI EZIOLOGICI DI INFEZIONI ALIMENTARI

Le infezioni alimentari più note sono quelle causate dai batteri Salmonella, Shigella,

Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli e dai virus Rotavirus, Adenovirus e

virus Norwalk.

Salmonella è un batterio Gram negativo di forma bastoncellare, appartenente alla famiglia

delle Enterobacteriaceae, comprendente più di 2400 sierotipi il cui habitat è l‘intestino di

rettili, uccelli e mammiferi.

Dal punto di vista epidemiologico si distinguono:

- Salmonelle adattate all’ospite, che comprendono sierotipi che infettano solo l’uomo, come S.

typhi e S. paratyphi A, B e C;

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- Salmonelle non adattate all’ospite, che sono in grado di infettare sia l’uomo che animali di

specie diversa, come ad esempio S. enteritidis e S. typhimurium, e che sono di più frequente

isolamento.

L’infezione da salmonella si trasmette principalmente per via oro-fecale; gli alimenti

contaminati rappresentano quindi uno dei veicoli più importanti di diffusione per l’uomo.

L’infezione si manifesta con diarrea, vomito, dolori addominali, nausea, mal di testa e febbre;

i sintomi possono comparire da 12 a 72 ore dall’ingestione di alimenti contaminati e possono

protrarsi per 4-7 giorni. Nella maggior parte dei casi si ha guarigione senza ospedalizzazione.

Esiste la possibilità di diffusione e replicazione della Salmonella in sede extra-intestinale

(infezione sistemica) con conseguente processo infiammatorio generalizzato. Forme

sistematiche gravi possono colpire soggetti a rischio (neonati, anziani, immunodepressi) e

rendere necessaria l’ospedalizzazione.

Shigella è un bastoncino Gram negativo privo di motilità appartenente alla famiglia delle

Enterobacteriaceae; il genere Shigella comprende 4 specie: S. dysenteriae, S. flexeneri, S.

boydii e S. sonnei. Shigella è l’agente eziologico della dissenteria bacillare o shigellosi; la sua

azione patogena è dovuta alla spiccata invasività nei confronti della mucosa intestinale ed alla

produzione di tossine (endotossine ed esotossine); in particolare la tossina "shiga" (Shigella

dysenteriae) che inattiva la sintesi proteica interferendo con le sub-unità 60S

dei ribosomi (citotossica).

Il principale reservoir per Shigella è l’uomo; la trasmissione avviene per via oro-fecale, per

contatto diretto o attraverso la contaminazione di cibo e acqua.

Dà una sintomatologia caratterizzata da diarrea, febbre, nausea e crampi addominali. Le feci

contengono sangue e muco (dissenteria); la perdita di sangue è il risultato dei microascessi

causati dagli organismi che invadono e danneggiano l’epitelio intestinale. Tuttavia, in molti

casi, la diarrea è semplicemente acquosa. Sono comuni anche infezioni lievi o asintomatiche.

Campylobacter è un bastoncino Gram negativo, sottile, ricurvo e dotato di motilità

appartenente alla famiglia delle Vibrionaceae. Vive in condizioni di microaerofilia, cioè solo

quando i livelli di ossigeno sono ridotti. Per uno sviluppo ottimale è richiesto il 3-5%

ossigeno e il 2-10% CO2. Solo le specie termofile (temperatura di crescita 42°C ) sono causa

di gastroenterite (C. jejuni e C. coli).

I sintomi della campylobatteriosi sono solitamente leggeri o moderati e consistono in diarrea,

dolori addominali, febbre, mal di testa, nausea e vomito. La loro durata varia generalmente da

uno a sette giorni, ma nel 20% dei casi, può superare la settimana.

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Manifestazioni più gravi della malattia si verificano in meno dell’1% dei pazienti, solitamente

in soggetti molto anziani o molto giovani, e includono meningiti, endocarditi e aborti settici

(C. fetus). Pazienti con deficit di immunoglobuline possono presentare infezioni gravi,

prolungate e ricorrenti.

La campylobatteriosi è una delle malattie batteriche gastrointestinali più diffuse al mondo e il

suo tasso di incidenza ha superato in alcuni paesi europei quello relativo

alle salmonellosi non tifoidee.

Episodi epidemici di infezione da Campylobacter sono stati associati prevalentemente al

consumo di acqua o latte contaminati, alimenti a rischio consumati crudi e carne di pollo.

Yersinia enterocolitica è un bastoncello Gram negativo appartenente alla famiglia delle

Enterobacteriaceae, è causa frequente di diarrea ed è presente in ogni continente. La

trasmissione dell’infezione si verifica attraverso l’ingestione di acqua o di cibo contaminato e

meno frequentemente tramite contatti con animali o pazienti infetti. I serbatoi dell’infezione

sono roditori, conigli, maiali, pecore, bovini, cavalli, cani e gatti. La maggior parte delle

infezioni contratte dagli animali riconoscono come modalità di contagio, oltre al contatto

diretto, anche il consumo di carne poco cotta, specie di maiale, anche se refrigerata,

poiché Yersinia si sviluppa anche a basse temperature (4°C). Il microrganismo è stato isolato

anche da acque di superficie, ma raramente ha provocato epidemie attraverso questa via. Sono

state segnalate invece epidemie associate al consumo di latte pastorizzato contaminato, in

seguito al consumo di intestino di maiale crudo, salsicce crude o di germogli di fagioli. Le

epidemie sono più frequenti nei mesi freddi.

Dopo un periodo d’incubazione di 4-7 giorni compaiono i sintomi iniziali rappresentati da

febbre, diarrea e dolore addominale; l’infezione può causare ulcerazioni della mucosa

dell’ileo terminale con interessamento delle placche del Peyer, e aumento di volume dei

linfonodi mesenterici. Il paziente accusa dolori alla fossa iliaca destra e febbre; talora può

subentrare stipsi. Spesso questa sintomatologia porta ad un intervento di appendicectomia con

appendice normale.

Rotavirus sono un genere di virus a RNA a doppio filamento rivestiti da un doppio capside

icosaedrico, appartenenti alla famiglia Reoviridae. Al microscopio elettronico hanno l’aspetto

simile a quello di una ruota. Sulla base di diversità antigeniche presenti sul capside, sono

classificati in gruppi, sottogruppi e sierotipi; i 7 gruppi maggiori sono contraddistinti dalle

lettere dalla A alla G.

Rotavirus è uno dei principali agenti causa di gastroenterite acuta, specialmente nei bambini

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di età inferiore a 2 anni. La malattia ha un periodo di incubazione di circa 2 giorni, dopo i

quali insorgono febbre, disturbi gastrici, vomito e diarrea acquosa che perdurano per 3 - 8

giorni. È trasmesso per contagio oro-fecale, per ingestione di acqua o cibo contaminati, ma a

volte anche per via respiratoria.

Adenovirus genere appartenente alla famiglia Adenoviridae, è caratterizzato da un capside di

forma icosaedrica, formato da proteine disposte in modo regolare, contenente un filamento di

DNA che ne costituisce il patrimonio genetico. Gli Adenovirus sono responsabili di affezioni

che interessano soprattutto le vie respiratorie, ma possono localizzarsi anche a livello

dell’apparato digerente e degli occhi; possono causare anche altre infezioni importanti come

epatiti, nefriti, miocarditi, meningoencefaliti. La gastroenterite da Adenovirus ha un periodo

di incubazione di 7 - 8 giorni, la sintomatologia, vomito, diarrea, febbre e malessere generale

perdura per 8 - 14 giorni.

Escherichia coli (Il suo nome deriva dal suo scopritore, Theodor Escherich) è un piccolo

bacillo Gram negativo che appartiene alla famiglia delle Enterobacteriaceae (enterobatteri). È

un batterio aerobio/anaerobio facoltativo, solitamente mobile per mezzo di flagelli peritrichi,

asporigeno, catalasi positivo ed ossidasi negativo; è in grado di fermentare il glucosio ed il

lattosio con produzione di gas e metaboliti acidi. Cresce rapidamente ad una temperatura

ottimale di 37°C. Le caratteristiche sopra riportate, permettono a E.coli di crescere in habitat

ampiamente diffusi, tra cui il suolo, l’acqua, le piante e soprattutto l’intestino dell’uomo e

degli animali.

E. coli è la specie più nota del genere Escherichia. Sebbene siano stati tipizzati oltre 50.000

sierotipi la maggior parte di essi è costituita da microrganismi commensali e solo un ristretto

numero di ceppi è in grado di indurre malattia. I vari sierotipi sono caratterizzati da diverse

combinazioni degli antigeni O,H,K,F (O: Somatico/parietale; K: capsulare; H: Flagellare; F:

Fimbrie). È una delle specie principali di batteri che vivono nella parte inferiore

dell'intestino di animali a sangue caldo (inclusi gli uccelli e i mammiferi), contribuendo alla

digestione corretta del cibo. La sua presenza nelle falde acquifere è un indicatore comune di

contaminazione da feci.

Dal punto di vista clinico sono 5 i gruppi importanti di E.coli:

-Enteropatogeni (EPEC “Entero-Pathogenic Escherichia Coli“), i primi ad essere associati

con la malattia diarroica. Negli EPEC la malattia è causata dal fatto che questi ceppi sono in

grado di aderire all'epitelio dell'intestino tenue e di interferire con l'assorbimento delle

sostanze; questo provoca la formazione di un ambiente iperosmolare nel lume dell'intestino

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con conseguente richiamo d'acqua ed infine diarrea. Il quadro di adesione all'epitelio e

la distruzione dei microvilli giustifica la definizione di istopatologia

A/E (attachment/effacement).

-Enterotossigeni (ETEC “Entero-Toxigenic Escherichia Coli“), in grado di

provocare gastroenteriti molto gravi, soprattutto nei viaggiatori e nelle persone che hanno

ingerito cibi o liquidi contaminati da feci. Questi ceppi producono sia tossine labili al calore

(LT-1 e LT-2), sia tossine stabili al calore (StA e Stb). LT-1 è formata da una subunità A e da

cinque subunità B. Queste ultime si legano all’enterocita, il legame promuove

l'internalizzazione della subunità A, una proteina con attività ADP - ribosiltransferasica nei

confronti di una proteina G stimolatoria, in grado di attivare l'adenilato ciclasi. Gli elevati

livelli di amp-ciclico, portano ad un rapido rilascio dei soluti nel lume intestinale, questi

richiamano acqua e il quadro clinico connesso è la diarrea.

-Enteroinvasivi (EIEC “Entero-Invasive Escherichia Coli“), strettamente simili a Shigella,

sono in grado di provocare diarrea sanguinolenta crampi addominali e febbre. Una serie di

geni espressi in un plasmide, denominati pInv, codificano per una serie di proteine di

membrana in grado di promuovere la fagocitosi e la lisi intracellulare del vacuolo fagocitico,

con proliferazione del batterio all'interno del citoplasma degli enterociti dell'intestino crasso.

Questo comporta depolimerizzazione dell'actina, lisi cellulare ed emorragia.

-Enteroaderenti (EAEC “Entero-Adherent Escherichia Coli“), sono coinvolti in una diarrea

acquosa persistente nei viaggiatori e nei bambini dei paesi in via di sviluppo. Questi ceppi

esprimono sia pili formanti fasci che fimbrie di aderenza, fattori di adesione in grado di

promuovere la colonizzazione dell'intestino tenue, con stimolazione della produzione

di muco. Questo forma un biofilm in grado di isolare ed aggregare i batteri. In seguito

all'aggregazione si ha riduzione della lunghezza dei microvilli, infiltrazione mononucleata ed

emorragia.

-Enteroemorragici (EHEC “Entero-Hemorrhagic Escherichia Coli“), Questi ceppi causano

coliti emorragiche accompagnate da diarrea sanguinolenta e da forti dolori addominali.

Negli animali gli EHEC colonizzano il tratto terminale dell’ileo, il cieco ed il colon e

posseggono la capacità di aderire alla mucosa intestinale causando una peculiare lesione

istopatologica ultrastrutturale definita attacco ed eliminazione “attaching and effacing”,

simile a quella indotta dagli EPEC, caratterizzata dalla distruzione dei microvilli e da uno

stretto contatto del batterio con la membrana cellulare. Questa capacità adesiva è governata da

numerosi geni associati in un locus definito LEE (locus of enterocyte effacement).

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All’interno del locus LEE è presente anche il gene eae che codifica per l’intimina che è una

adesina batterica. Il gene eae coincide all’86% col gene eaeA dei ceppi EPEC.

La patogenicità dei ceppi EHEC è legata soprattutto alla produzione di due tossine Shiga-

simili (SLT-1 ed SLT-2), chiamate così perchè molto simili strutturalmente alla tossina

prodotta da Shigella dysenteriae tipo 1, dette anche verocitossine VT1 e VT2, da cui la sigla

VTEC usata in Italia per questo ceppo.

Tuttavia non si può affermare con sicurezza che tutti i ceppi EHEC dispongano della capacità

di elaborare Verocitossine per cui nell’ambito degli EHEC è distinto un sottogruppo,

denominato VTEC, che comprende i ceppi E. coli produttori di Verocitossina. I VTEC sono considerati tra i più temibili agenti patogeni alimentari ed il loro capostipite è

sicuramente l’E.coli O157 H:7; altri sierotipi clinicamente importanti sono lo O26, lo O113,

lo O111 e lo O145.

ESCHERICHIA COLI O157: H7

E. coli O157 è stato incluso nella lista dei patogeni emergenti dall’Organizzazione Mondiale

della Sanità (WHO) e rappresenta un grave problema di sanità pubblica. Fu identificato per la prima volta come patogeno in U.S.A. e Canada nell’anno 1982 a seguito

di un’ epidemia di diarrea emorragica associata al consumo di hamburger nei fast food. Altre

epidemie sono state poi registrate in Canada (1991, 22casi di SEU e 2 morti), Australia (1995,

22 casi di SEU e 0 morti), Svezia (1995, 29 casi di SEU e 0 morti), Giappone (estate 1996,

106 casi di SEU e 4 morti) e Scozia (dicembre 1996, 6 morti).

I caratteri distintivi di E. coli O157:H7 sono la mancata capacità di fermentare il sorbitolo, la

negatività alla prova d’idrolisi del MUG (4- metilumbelliferil-beta-D-glucuronide) e la

sensibilità al blu di bromotimolo ad alte temperature (44-45°C). Queste caratteristiche sono

sfruttate ai fini diagnostici nella routine di laboratorio per l’identificazione microbiologica del

microrganismo. Peculiarità di E. coli O157:H7 è la resistenza alle basse temperature, infatti

può resistere per nove mesi alla temperatura di -80°C, con successivo stoccaggio a -20°C.

Una importante caratteristica, che può incidere sulla capacità di colonizzare l’intestino umano

è la resistenza all’acidità dello stomaco. È noto che l’esposizione di batteri enterici ad un pH

basso induce una risposta acido-tollerante e ciò incrementa la sopravvivenza di E. coli

O157:H7 in alimenti moderatamente acidi.

Tale patogeno, oltre che dalla produzione di VT, è caratterizzato anche dalla presenza di un

plasmide di 60 MDa, che codifica per fattori di virulenza quali fimbrie ed enteroemolisine.

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Pertanto tale plasmide influenza notevolmente la patogenicità del batterio, controllando

l’espressione dell’adesività e della sintesi di enterotossine.

L’antigene flagellare H7, codificato da una porzione del gene flic, aumenta la virulenza del

sierotipo O157 attraverso vari meccanismi; Esso facilita, infatti, il superamento dello strato di

muco che riveste le mucose e, di conseguenza, aiuta l’adesione e la colonizzazione.

E. coli O157:H7 presenta pili di adesione tramite i quali realizza l’attacco alle cellule

intestinali. Tale patogeno è caratterizzato da una manifestazione clinica molto grave, da una dose

infettante molto bassa, da epidemie nella comunità molto estese e da una origine zoonosica.

E.coli O157

È un batterio che colonizza frequentemente gli allevamenti animali, e trova nei ruminanti,

soprattutto nei bovini, il suo reservoir naturale; normalmente infetta gli esseri umani

attraverso la contaminazione di cibo e acqua con residui fecali degli animali. La sua

sintomatologia è principalmente intestinale e può variare da una semplice infezione

asintomatica, ad una diarrea acquosa, fino ad una diarrea sanguinolenta con crampi

addominali (colite emorragica).

La colite emorragica ha carattere autolimitante anche se negli anziani determina un alto tasso

di mortalità. Questa sindrome si manifesta con la comparsa di improvvisi e dolorosi crampi

addominali, seguiti da diarrea, che compare entro 24 ore, inizialmente acquosa poi

emorragica, definita da alcuni autori anglosassoni “all blood and no stool” cioè tutto sangue e

niente feci.

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I sintomi possono essere accompagnati da nausea e vomito, mentre la febbre è assente o lieve

e ciò permette di differenziare tale patologia da quelle causate da altri ceppi di E. coli, come

EIEC e da Shigella dysenteriae.

Il periodo di incubazione e la durata della malattia variano da tre a nove giorni.

Circa il 5% dei casi è complicato dalla Sindrome Emolitica-Uremica (SEU).

La sindrome emolitico uremica può presentarsi in forma primaria o come evoluzione della

colite emorragica. Viene trasmessa per via alimentare o profetale e sono colpiti

prevalentemente soggetti immunodepressi, bambini ed anziani, nei quali può avere un decorso

grave fino ad essere, talvolta, mortale. Generalmente i casi di SEU si presentano in forma

sporadica, mentre focolai epidemici possono manifestarsi sia in ambito familiare che in

comunità (asili nido, scuole, ecc.) e sono riconducibili all'esposizione a fonti comuni di

infezione da VTEC

Tale sindrome è caratterizzata da:

Anemia emolitica (microangiopatica)

Trombocitopenia

Insufficienza renale acuta (prima causa in pediatria)

Talvolta possono subentrare anche complicazioni a carico dell’apparato cardiovascolare o al

SNC con encefalopatie. L’esito della malattia è spesso letale e le lesioni renali sono

permanenti, infatti i soggetti colpiti da tale sindrome vengono sottoposti a dialisi e trasfusioni

di sangue.

Questa sindrome è talvolta diagnosticata come porpora trombotica trombocitopenica (PTT)

quando si verifica negli adulti.

I principali fattori di virulenza di E.coli O157 H:7 sono STX1 e STX2 (Shiga toxin 1 e 2),

definite così per la stretta somiglianza con la tossina prodotta da Shigella dysenteriae.

Entrambe le tossine sono composte da una subunità A e cinque subunità B che sono in grado

di legarsi al globotriaosilceramide (Gb3 o cd77); il legame con questo recettore promuove

l'internalizzazione della subunità A nell'enterocita dove si lega al frammento di RNA

ribosomiale 28s bloccando la sintesi proteica. La distruzione degli enterociti, accompagnata

da una diminuzione della capacità di assorbimento, comporta la presenza di una diarrea molto

liquida e sanguinolenta.

Successivamente, le Stx prodotte localmente dai batteri, dopo aver danneggiato le cellule

14

epiteliali dei villi vengono adsorbite in circolo. Nel sangue le tossine aderiscono alla

superficie dei neutrofili, ma non vengono internalizzate, perciò queste cellule circolanti sono

in grado di veicolare le tossine all'endotelio di alcuni organi ed in particolare del rene. Nelle

cellule endoteliali renali sono presenti recettori glicolipidici (globotriaosilceramide, Gb3 o

CD77) che hanno un'affinità per le Stx 100 volte superiore a quella dei recettori presenti sui

neutrofili. Perciò le Stx si legano alle cellule endoteliali e, dopo internalizzazione, sono in

grado di colpire i bersagli macromolecolari endocellulari, provocando lesioni alle cellule

endoteliali renali.

Meccanismo di azione delle tossine STX

La presenza di STX è strettamente correlata con l’evoluzione verso la SEU. I principali organi

bersaglio di STX sono i reni. Spesso le tossine sono prodotte in combinazione ma possono

essere prodotte anche singolarmente. STX2 è maggiormente associata con la severità della

malattia e l’evoluzione a SEU.

TERAPIA

La terapia nell’adulto come nel bambino è fondata sulla reidratazione e sulla la correzione di

alterazioni elettrolitiche, dell’equilibrio acido-base e delle eventuali perdite ematiche. La

terapia antibiotica (Fluorochinoloni nell’adulto, Cotrimoxazolo nel bambino) non è

raccomandata in quanto può aumentare il rilascio di tossina e aggravare le condizioni generali

dei pazienti ai quali è stata somministrata. I pazienti più critici richiedono un trattamento

intensivo basato su dialisi, trasfusioni di sangue fino ad arrivare al trapianto di reni.

15

EPIDEMIOLOGIA DI EHEC

I dati di seguito riportati, forniti dall’ENTERNET Italia (rete internazionale di sorveglianza

per le infezioni enteriche da Salmonella e da VTEC O157 coordinata dall‘Istituto Superiore di

Sanità ISS), mostrano le positività per VTEC riconosciute nel periodo che va dal 1988 al

2004.

In questo periodo sono stati notificati 344 casi di infezione da VTEC, si tratta per lo più di

infezioni sporadiche anche se sono presenti anche alcuni episodi epidemici, identificati

attraverso la registrazione di cluster di casi di SEU.

Le informazioni relative alla sintomatologia clinica delle infezioni da VTEC riflettono il fatto

che la maggior parte delle notifiche proviene dal sistema di sorveglianza della SEU pediatrica

che contribuisce con il 73% dei casi (252).

La sintomatologia osservata negli altri casi è stata la seguente:

• Diarrea: 38 casi (11,0%)

• Diarrea con sangue: 30 casi (8,7%)

• Nessun sintomo: 19 casi (5,5%)

• Sconosciuto: 3 casi (0,87%)

• Altro: 2 casi (0,58%)

La determinazione del sierogruppo del ceppo VTEC infettante è stata possibile solo nell’87%

dei casi identificati.

16

Nella tabella sono elencati i sierogruppi VTEC, con la rispettiva frequenza di isolamento.

SIEROGRUPPO FREQUENZA DI

IDENTIFICAZIONE

PERCENTUALE

O157 121 39,3%

O26 65 21,1%

O145 37 12,0%

O111 27 8,8%

O103 16 5,2%

O118 5 1,6%

O128 5 1,6%

O13 4 1,3%

O121 3 1,0%

O186 3 1,0%

Secondo i dati forniti dal sistema di sorveglianza nazionale della SEU in età pediatrica, in

Italia l’incidenza della SEU è di circa 0,3 casi per 100.000 abitanti nella fascia tra 0-14 anni,

più bassa rispetto ad altri Paesi europei. Nell’arco di tempo che va dal 1988 al 2005 sono stati

registrati 481 casi di SEU pediatrica. Dal 2005 si è costituito il Registro Italiano della SEU

pediatrica (la sorveglianza della SEU coinvolge i principali centri ospedalieri di nefrologia

pediatrica e l’Istituto Superiore di Sanità) e tra il 2005 ed il 2008, 17 centri hanno segnalato

158 casi di SEU, con evidenze di infezione da VTEC in 96 di essi. I pazienti provenivano da

18 regioni, prevalentemente Veneto, Lombardia, Campania e Piemonte; in alcuni casi la SEU

conseguiva a un soggiorno all’estero. La maggior parte dei casi aveva presentato diarrea

prodromica, acquosa o emorragica. Sono risultati implicati otto diversi sierogruppi VTEC, i

più frequenti dei quali erano nell’ordine O26, O157, O111, O103, O145 nel periodo

complessivo 2005-2008, mentre nel 2007 e 2008 il sierogruppo più frequente è risultato

17

O157.

La maggior parte delle infezioni da E. coli O157 è legata al consumo di alimenti contaminati;

in particolare sono stati implicati in casi umani alimenti di origine bovina, a seguito di

contaminazione fecale all’origine (macellazione, mungitura) e non sottoposti ad adeguato

trattamento termico, quali hamburger poco cotti, latte crudo non pastorizzato e prodotti

caseari derivati. Più recentemente e con crescente frequenza sono stati coinvolti anche

vegetali (lattuga, spinaci, germogli, ecc.). E’ possibile anche la cross-contaminazione tra

alimenti.

E. coli O157 è in grado di persistere e moltiplicarsi nelle deiezioni dei ruminanti per cui, se

esse vengono impiegate a fini agronomici senza adeguati processi di maturazione, possono

contribuire alla contaminazione di suolo, acque, vegetali. A livello internazionale sono stati

segnalati focolai di origine idrica, considerando sia l’acqua potabile che quella usata a fini

ricreazionali. Il contatto diretto con gli animali infetti rappresenta una modalità non

infrequente di trasmissione, con casi sporadici ma anche eventi epidemici (descritti in fattorie

didattiche, petting-zoo). L’infezione può essere assunta anche per contatto persona-persona,

soprattutto in ambito familiare e di comunità (asili, case di riposo, ecc).

In Toscana, come in poche altre regioni italiane, esiste un sistema di sorveglianza speciale

sulle tossinfezioni alimentari, definito Ce.R.R.T.A (Centro di Riferimento Regionale sulle

Tossinfezioni Alimentari). Il Ce.R.R.T.A, istituito a fine 1999, si propone principalmente

l’obiettivo di diffondere le conoscenze scientifiche e culturali in merito alle tossinfezioni

alimentari e alle metodologie epidemiologiche di approccio, e di promuovere le attività di

notifica e di indagine degli episodi isolati ed epidemici. Il Centro raccoglie, vaglia e studia le

denunce di caso isolato e focolaio epidemico di tossinfezione alimentare provenienti dai

dipartimenti della prevenzione delle singole Aziende USL. Il Centro si compone di due

articolazioni di riferimento sub-regionali che hanno lo scopo di raccordare le attività delle

singole Aziende USL con il Centro Regionale.

Le articolazioni sub-regionali sono collocate nelle Aziende USL 3 di Pistoia e 8 di Arezzo,

presso le rispettive U.F. di Igiene degli Alimenti e Nutrizione.

18

SCOPO DELLA TESI

Nel 2009 è stata richiesta dal Dipartimento di Prevenzione (U.F. di Igiene degli Alimenti e

Nutrizione) della A.S.L.8 di Arezzo, la collaborazione del Laboratorio di Microbiologia

Clinica Ospedaliera della A.S.L.8, per la trasmissione dei dati epidemiologici riguardanti gli

isolamenti di patogeni intestinali (batteri e virus).

Al fine di poter verificare l’effettiva incidenza di alcune patologie nella popolazione del

territorio ho effettuato un’indagine epidemiologica retrospettiva della durata di un anno

(gennaio/dicembre 2009), prendendo in analisi tutti i campioni di feci per coprocoltura

pervenuti al laboratorio di Microbiologia dell’A.S.L.8 di Arezzo.

Inoltre, è stato richiesto dal Dipartimento di Prevenzione di inserire per un breve periodo nella

routine diagnostica delle coprocolture, la ricerca di E.coli O157, i cui dati epidemiologici

sono scarsi.

A tale scopo ho effettuato uno studio sperimentale della durata di 6 mesi (2° semestre 2009),

includendo nelle batterie degli esami standard di circa 300 coprocolture la ricerca del

patogeno E.coli O157. I campioni arruolati in tale studio sono feci non formate,

diarroiche/ematiche di bambini ed adulti, ricoverati e non, presso l’Azienda U.S.L.8 di

Arezzo.

19

MATERIALI E METODI

COPROCOLTURA

La coprocoltura “standard” eseguita nel laboratorio prevede la ricerca colturale, su terreni

solidi selettivi, dei patogeni Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica, Campylobacter e,

ove richiesto, con metodi non colturali, la ricerca di virus enterici Rotavirus e Adenovirus.

RACCOLTA DEL CAMPIONE DI FECI PER COPROCOLTURA

Nei giorni che precedono la coprocoltura non utilizzare lassativi, purghe o supposte per

evacuare. E' inoltre necessario sospendere, secondo quanto prescritto dal proprio medico,

eventuali terapie antibiotiche.

1. Munirsi di un recipiente pulito per la raccolta delle feci munito di un cucchiaino interno

2. Deporre le feci in un recipiente idoneo pulito e lavato accuratamente ed in seguito,

sciacquato con acqua distillata.

3. In alternativa è possibile foderare il water di carta igienica e raccogliere immediatamente

un campione di feci appena emesse

4. Evitare di mescolare le feci con le urine.

5. Raccogliere con il cucchiaino del vasetto più campioni sulla superficie delle feci emesse ed

in punti diversi (3 o 4) sino a riempire metà circa del recipiente

6. Portare in Laboratorio immediatamente oppure entro 24 h dalla raccolta avendolo

conservato in frigo

7. I campioni devono essere sottoposti a coltura il prima possibile, poiché alcune specie

batteriche, in particolar modo Shigella, non sopravvivono al cambiamento di pH

(acidificazione) che si realizza con la caduta della temperatura delle feci dopo l‘emissione. In

caso contrario è necessario l’utilizzo di un terreno di trasporto.

Soltanto in casi selezionati, come la difficoltà ad ottenere feci nell'infanzia, il campione fecale

può essere raccolto attraverso un tampone rettale.

Il materiale andrebbe preferibilmente raccolto nel momento acuto del processo infettivo.

Per aumentare le possibilità di isolamento dei patogeni può essere richiesto di inviare al

laboratorio tre campioni raccolti in giorni diversi.

20

Esempio di contenitore per coprocoltura

TECNICA DI ISOLAMENTO SU TERRENO AGARIZZATO

La semina del materiale deve avvenire in condizioni di sterilità. Importante quindi l’utilizzo di

cappe di aspirazione e dei dispositivi di protezione individuale (D.P.I.).

Il terreno dovrebbe essere sempre controllato prima dell’uso (data di scadenza o eventuale

contaminazione).

Con l’ansa procediamo a prelevare una piccola quantità di feci dal contenitore del campione,

l’area iniziale di semina deve ricoprire una superficie di circa un terzo dell’area complessiva

dell’agar utilizzato.

Le anse metalliche devono essere flambate dopo la semina, le monouso devono essere

sostituite.

Lo scopo della semina su piastra è quello di ottenere delle colonie batteriche ben isolate su cui

sia possibile effettuare una identificazione, per fare questo dobbiamo cercare di sfruttare al

meglio tutta la superficie della piastra. La tecnica più utilizzata è quella della semina a 4

quadranti.

Dopo la semina i terreni devono essere posti in incubazione il prima possibile.

21

Metodo di semina a 4 quadranti

RICERCA DI SALMONELLA E SHIGELLA SU HEKTOEN ENTERIC AGAR

(BioMerieux)

Hektoen Enteric Agar è un terreno selettivo per l’isolamento e la differenziazione della flora

intestinale Gram-negativa. Il terreno contiene, oltre ad una miscela di peptoni:

- carboidrati: lattosio, saccarosio e salicina;

- indicatori di pH: blu di bromotimolo e fucsina acida;

- agenti selettivi: sali biliari n° 3

- indicatori di H2S: sodio tiosolfato e ferro (ico) ammonio citrato.

I sali biliari rendono il terreno selettivo, inibendo gli organismi Gram-positivi e riducendo la

crescita di alcuni organismi Gram-negativi, a parte Salmonella e Shigella. Lattosio, saccarosio

e salicina vengono aggiunti per favorire la differenziazione in quanto colorano le colonie e il

terreno adiacente. Salmonella e Shigella non fermentano questi composti di carbonio e quindi

non modificano il colore degli indicatori di pH, mentre gli organismi che fermentano questi

composti in acidi, ad es. E. coli, modificano il colore in giallo o arancione. Il citrato di

ammonio ferrico e il tiosolfato di sodio nel terreno consentono di rilevare il solfuro di

idrogeno prodotto dalla Salmonella. Il sistema di indicatori del pH è costituito dalla fucsina

acida e dal blu di bromotimolo.

Con l’impiego dell’Hektoen enteric agar è possibile anche una presuntiva differenziazione, a

livello colturale, tra Salmonella e Shigella.

Dopo incubazione a 37°C per 24-48 ore i microrganismi si presentano su Hektoen Enteric

Agar con le seguenti caratteristiche:

Salmonella spp. colonie verde blu con o senza centro nero

Salmonella typhi colonie verde blu senza centro nero

22

Shigella spp. colonie verde chiaro, il terreno non vira al blu

E.coli crescita scarsa, colonie rosso salmone

Enterobacter spp. colonie rosso salmone

Klebsiella spp. colonie rosso salmone

Pseudomonas spp colonie incolori tendenti al verde

Proteus spp. saccarosio/salicina fermentanti colonie rosso salmone

Proteus spp. saccarosio/salicina non fermentanti colonie verde blu con o senza centro nero

Batteri Gram positivi crescita inibita

Sulle colonie sospette di Salmonella si esegue Mucap test (Biolife), reattivo sensibile e

specifico per l’identificazione di Salmonella spp. che contiene un estere a otto atomi di

carbonio coniugato con il metilumbelliferone, (4-metil umbelliferil caprilato) in solvente

organico (eptano). Tale composto è idrolizzato dall’enzima C8 esterasi con liberazione di

metilumbelliferone, fortemente fluorescente se osservato sotto lampada di Wood con

emissione a 366nm.

Per conferma si utilizza l'identificazione biochimica con card GN Vitek2 (BioMerieux), e

immunologica con antisieri anti-salmonella (DID).

Per Shigella l’identificazione è biochimica con card GN Vitek2 (BioMerieux), e

immunologica con antisieri anti-Shigella.

Piastra di Hektoen enteric agar positiva per Salmonella

23

RICERCA DI YERSINIA ENTEROCOLITICA SU CIN AGAR (BioMerieux)

Il terreno Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (C.I.N.) Agar è preparato addizionando al CIN agar

base il supplemento selettivo con cefsulodina e novobiocina; è un terreno altamente selettivo

per l’isolamento di Yersinia enterocolitica da campioni clinici e da alimenti. I batteri Gram

positivi e parte di quelli Gram negativi sono inibiti dagli agenti selettivi presenti nel terreno di

base: sodio desossicolato, cristall violetto, Irgasan; gli antibiotici inibiscono la crescita degli

enterobatteri. Il mannitolo è presente quale carboidrato fermentabile: i batteri in grado di

fermentarlo inducono un’acidificazione del terreno con precipitazione del sodio desossicolato

e assorbimento del rosso neutro. Dopo incubazione a 37°C per 24-48 ore Yersinia

enterocolitica cresce su CIN Agar con colonie rosso-porpora, circondate da un bordo

trasparente (caratteristico aspetto delle colonie ad “occhio di bue”). Il diametro delle colonie

varia da ceppo a ceppo ma rimane costante per ceppi del medesimo sierotipo.

L’identificazione finale è biochimica tramite card GN Vitek2 (BioMerieux).

Piastra di Cin agar positiva per Yersinia

24

RICERCA DI CAMPYLOBACTER SU CAMPYOBACTER SELECTIVE AGAR

(BioMerieux)

Campylobacter selective agar è un terreno selettivo usato per l’isolamento di Campylobacter

spp. da campioni clinici. La presenza di supplemento antimicrobico con vancomicina,

polimixina B, trimetoprim e cefalotina, inibisce la normale flora intestinale; l’amfotericina B

inibisce la crescita dei funghi. Il terreno consente la crescita delle specie di Campylobacter

grazie al contenuto in peptoni, destrosio, estratto di lievito e sangue. I peptoni forniscono

composti azotati, carbonio, zolfo e tracce di altri elementi. L'estratto di lievito è una fonte di

vitamine B. Il sangue di montone fornisce ulteriori sostanze nutrienti.

Dopo 42 – 48 h di incubazione in atmosfera modificata (anaerobiosi) a 42°C, il

Campylobacter jejuni si presenta con colonie mucoidi di piccole o medie dimensioni, in

genere verdastre, piatte con bordi irregolari e non emolitiche. C. lari e C. coli producono

colonie simili. Un piccolo numero di ceppi può apparire di colore marrone chiaro o

lievemente rosato. Le colonie di C. jejuni tendono a diffondersi o sciamare, in particolare se

inizialmente sono state isolate da campioni recenti. tutti i ceppi sono ossidasi positivi.

L’identificazione definitiva dei Campylobacter viene effettuata con carte NH Vitek2

(BioMerieux).

Piastra di Campylobacter selective agar positiva per Campylobacter

25

RICERCA DI E.COLI O157

I campioni selezionati per la ricerca di E.coli O157 sono stati processati, addizionando alla

metodica standard della coprocoltura, un terreno selettivo per la ricerca di questo patogeno

(Mac Conkey Sorbitol Agar “SMAC”,BioMeriux). Le colonie identificate in tale terreno

come non fermentanti il sorbitolo (NSF) e quindi come sospette, sono state sottoposte a

identificazione con due diverse metodiche:

• Identificazione biochimica, tramite strumento “Vitek2” (BioMerieux)

• Identificazione immunologica, tramite “E.coli O157 Latex Kit” (Oxoid)

Sugli stessi campioni sono stati contemporaneamente eseguiti anche esami coprocolturali

tradizionali per la ricerca dei principali batteri patogeni (Salmonella, Shighella, Yersinia

enterocolitica e Campylobacter). Ove richiesta è stata effettuata anche la ricerca di antigeni

virali (Rotavirus ed Adenovirus).

RICERCA DI E. COLI O157 SU MAC CONKEY SORBITOL AGAR “SMAC”

(BioMerieux)

Mac Conkey Sorbitol Agar è impiegato per l’isolamento e l'identificazione presuntiva di

Escherichia coli O157. Il terreno Mac Conkey Sorbitol Agar differisce dal Mac Conkey Agar

perché ha come carboidrato fermentabile il sorbitolo al posto del lattosio . La selettività del

terreno è incrementata dall’aggiunta di cefixime e potassio tellurito. L’aggiunta di cefixime e

potassio tellurito al terreno SMAC sopprime efficacemente la crescita di alcuni generi

batterici Non Fermentanti il Sorbitolo (NSF), quali Proteus, Providencia, Aeromonas, E.coli

NSF non appartenenti al sierogruppo O157 e dei ceppi di E.coli fermentanti il sorbitolo. Zadik

e coll. riportano una inibizione del 67% dei ceppi di E.coli “non O157” saggiati e della

maggior parte degli stipiti NSF diversi da E.coli O157 .

Le colonie di E. coli O157:H7 si presentano incolori, ma per il resto possiedono le

caratteristiche tipiche di E. coli.

L’identificazione finale si ottiene tramite card GN Vitek2 (BioMerieux) per identificazione

biochimica o tramite E.coli O157 latex kit (Oxoid) per identificazione sierologica.

26

Piastra di Mac Conkey sorbitol agar positiva per E.coli O157

E.COLI O157 LATEX KIT

Kit per il test in agglutinazione rapido al lattice su vetrino, per la determinazione di E.coli

O157 da coltura. Tramite specifici anticorpi si dimostra la presenza in superficie dell’antigene

O 157.

Caratteristiche del kit:

RAPIDO: Consente la rapida identificazione delle colonie con anticorpo specifico anti E.coli

O157.

FACILE: L’agglutinazione è facilmente eseguibile su colonie coltivate su SMAC, senza

procedere ad ulteriori trapianti su terreni d’uso generale.

SENSIBILE: Il test può essere eseguito anche su 1 colonia.

SPECIFICO: Rimuove ogni cross-reattività di E.hermannii e di altri sierotipi simili O ed H.

Specificità 100%.

COMPLETO: Il kit comprende il reattivo con latice sensibilizzato, le card, gli stick, il

controllo positivo ed il controllo negativo.

METODICA D’USO DEL KIT

1. Prelevare 1 o più colonie tipiche dal terreno d’isolamento e risospenderle in circa 0,2 ml di

soluzione fisologica sterile.

2. Risospendere la sospensione di particelle di latice agitando delicatamente ed assicurarsi che

il reattivo abbia raggiunto la temperatura ambiente prima dell’uso.

3. Trasferire una goccia di sospensione batterica nella zona centrale della card delimitata da

un cerchio.

27

4. Trasferire una goccia della sospensione di particelle di latice sensibilizzate nella zona

centrale della card delimitata da un cerchio.

5. Mescolare le due gocce insieme usando uno stick fornito con il kit.

6. Ruotare delicatamente la card osservando per la presenza di agglutinazione in condizioni di

luce normali.

7. Qualsiasi grado di agglutinazione entro 2 minuti è da considerarsi risultato positivo per

E.coli O 157, se in concomitanza si ha un risultato negativo con il Controllo Negativo ed

agglutinazione con il Controllo Positivo.

E.coli O157 Latex Kit (Oxoid)

VITEK 2

Il VITEK 2 consente l’identificazione sulla base di test biochimici tradizionali di cocchi Gram

positivi, di bacilli Gram negativi e dei lieviti. I risultati di questi test sono disponibili

rispettivamente entro 2, 3, e 15 ore. La rapidità è assicurata da substrati fluorescenti inseriti

nella card. Il VITEK 2 è anche in grado di saggiare, con metodica della microdiluizione in

brodo, 32 antibiotici per i cocchi Gram positivi, inclusi Stafilococchi e Streptococchi, e 46

antibiotici per i bacilli Gram negativi. Per ogni antibiotico sono saggiate più concentrazioni

(break point) ed i risultati sono espressi in MIC (minima concentrazione inibente) e categoria

S, I, R (sensibile, intermedio, resistente). Può inoltre testare la B-lattamasi per Stafilococchi

ed Enterococchi, la meticilino resistenza e le ESBL (beta lattamasi a spettro esteso).

28

Stumentazione completa di analisi Vitek 2 (BioMerieux)

29

RISULTATI

Nel corso dell’anno 2009 al laboratorio di Microbiologia dell’USL8 Ospedale San Donato di

Arezzo sono pervenuti 3936 campioni di feci per esami microbiologici; su tutti i campioni

analizzati è stata eseguita la coprocoltura standard per Salmonella, Shigella, Yersinia,

Campylobacter (S,S,Y,C) secondo il protocollo in uso presso il laboratorio. Dietro richiesta

specifica su 111 campioni (2,8%) è stata eseguita, oltre alla coprocoltura standard, la ricerca

di Rotavirus e su 1318 campioni (33.5 %) la ricerca di Adenovirus oltre a tutti i precedenti.

N° di campioni % su 3936 campioni Microrganismi

ricercati

1318 33,5% S,S,Y,C Rotavirus Adenovirus

111 2,8% S,S,Y,C Rotavirus 2507 63,7% S,S,Y,C

Tabella 1

Possiamo dire quindi che su circa due terzi (63,7%) dei campioni è stata eseguita la ricerca dei

batteri S,S,Y,C, e su circa un terzo (36,3) tale ricerca è stata accompagnata da quella dei virus

enterici.

63,7%

36,3%

campioni di feci per esamimicrobiologici su cui è stataeseguita la ricerca dei batteri(2507)campioni di feci per esamimicrobiologici su cui è stataeseguita anche la ricerca deivirus enterici (1429)

Grafico 1 (riferito a tabella 1)

30

Dei campioni analizzati (3936), 294 (7.46%) sono risultati positivi per almeno un

microrganismo.

Percentuale di positività delle coprocolture

92,5%

7,5% campioni di feci per esamimicrobiologici risultati negativiper la ricerca di batteri e virus(3642)campioni di feci per esamimicrobiologici risultati positiviper la ricerca di batteri e virus(294)

Grafico 2

La positività dei vari microrganismi enterici risulta così distribuita nei 294 campioni:

Microrganismo Tot. numero %

Salmonella 57 19,4%

Shigella 0 0%

Yersinia 10 3,4%

Campylobacter 82 27,9%

Adenovirus 32 10,9%

Rotavirus 113 38,4%

Totale 294 100%

Tabella 2

31

Distribuzione di frequenza per microrganismo

19,4% 0,0%

3,4%

27,9%10,9%

38,4%Salmonella (57)Shigella (0)Yersinia (10)Campylobacter (82)Adenovirus (32)Rotavirus (113)

Grafico 3 (riferito a tabella 2)

Mettendo in relazione il totale dei campioni di feci per coprocoltura pervenuti al laboratorio di

Microbiologia dell’USL8 di Arezzo (3936), con quelli positivi per la ricerca dei singoli batteri

(149) otteniamo una percentuale di positività del 3,78%.

Frequenza di positività per batteri

96,2%

3,8% campioni di feci per esamimicrobiologici negativi perogni tipo di microrganismobatterico (3787)campioni di feci per esamimicrobiologici positivi peralmeno un microrganismobatterico (149)

Grafico 4

32

La positività dei batteri enterici risulta così distribuita nei 149 campioni:

Distribuzione di frequenza per batteri

38,3%

0,0%

6,7%

55,0%

Salmonella (57)Shigella (0)Yersinia (10)Campylobacter (82)

Grafico 5

Mettendo in relazione adesso il totale dei campioni di feci per coprocoltura, pervenuti al

laboratorio di Microbiologia dell’USL8 di Arezzo, su cui è stato eseguito l’esame dei virus

enterici (1429), con quelli positivi per tali microrganismi (145), vediamo che la percentuale di

positività sale al 10,15%.

Frequenza di positività per virus

89,85%

10,15%campioni analizzati per virusenterici e risultati negativi(1284)campioni analizzati per virusenterici e risultati positivi(145)

Grafico 6

33

La positività dei virus enterici (145) risulta così distribuita nei campioni:

Distribuzione di frequenza per virus

22,07%

77,93%

adenovirus (32)rotavirus (113)

Grafico 7

La frequenza di positività per singolo microrganismo è riportata nella seguente tabella.

Microrganismo Tot. esami Positivi Negativi %

Salmonella 3936 57 3879 1,45%

Shigella 3936 0 3936 0%

Yersinia 3936 10 3926 0,25%

Campylobacter 3936 82 3854 2,08%

Adenovirus 1318 32 1286 2,43%

Rotavirus 1429 113 1316 7,90%

Totale 18491 294 18197 1.59%

Tabella 3

34

1,45%

0% 0,25%

2,08% 2,43%

7,90%

0,00%

1,00%

2,00%

3,00%

4,00%

5,00%

6,00%

7,00%

8,00%

1

SalmonellaShigellaYersiniaCampylobacterAdenovirusRotavirus

Grafico 8 (riferito a tabella 3)

Tutti i dati riportati fino ad ora sono riferiti al numero di campioni risultati positivi per la

ricerca di microrganismi (batteri e virus) nel laboratorio di Microbiologia dell’Ospedale S.

Donato di Arezzo;

la tabella successiva (tab. 4) mostra la differenza tra numero di campioni positivi per

microrganismi ed il numero effettivo di casi (escluso duplicati).

Microrganismo Tot. esami Campioni positivi N° di casi % relativa al n°

di casi Salmonella 3936 57 38 0,97%

Shigella 3936 0 0 0%

Yersinia 3936 10 9 0,23%

Campylobacter 3936 82 72 1,8%

Adenovirus 1318 32 30 2,3%

Rotavirus 1429 113 95 6,6%

Totale 18491 294 244 1,32%

Tabella 4

35

0,97%

0% 0,23%

1,80%2,30%

6,60%

0,00%

1,00%

2,00%

3,00%

4,00%

5,00%

6,00%

7,00%

1

SalmonellaShigellaYersiniaCampylobacterAdenovirusRotavirus

Grafico 9 (riferito a tabella 4)

La tabella 5 mostra la distribuzione effettiva dei microrganismi ricercati nei rispettivi sierotipi

o specie.

SALMONELLE GRUPPO A 0totale GRUPPO B 3

Salmonelle GRUPPO C 238 GRUPPO D 3

GRUPPO E 1SALMONELLA SPP 3SALMONELLA ENTERIDIS 3SALMONELLA TYPHI-MURIUM 23ALTRI SIEROTIPI 0

SHIGELLE DYSENTERIAE 0FLEXNERI 0BOYDII 0SONNEI 0SPP 0

YERSINIA ENTEROCOLITICA 9CAMPYLOBACTER COLI 6

totale JEJUNI 38Campylobacter SPP. 28

72ROTAVIRUS 30ADENOVIRUS 95

Tabella 5

36

È importante anche notare la differente distribuzione di questi microrganismi in base all’età.

Possiamo vedere che le infezioni di tipo batterico (119; vedi tabella 4) sono così distribuite:

• Bambini: 87 (73,1%)

• Adulti: 32 (26,9%)

73,1%

26,9%

bambini con infezioni di tipobatterico (87)adulti con infezioni di tipobatterico (32)

Grafico 10

Nella seguente tabella (tab. 6) possiamo vedere le positività di ogni singolo agente batterico

per fascia di età.

Età Salmonella Shigella Yersinia Campylobacter

< 1 anno 0 0 0 3 (4,2%)

1 - 3 anni 11 (28,9%) 0 6 (66,7%) 31 (43,1%)

4 - 7 anni 8 (21%) 0 1 (11,1%) 17 (23,6%)

8 - 10 anni 4 (10,5%) 0 1 (11,1%) 5 (6,9%)

Adulti 15 (39,5%) 0 1 (11,1%) 16 (22,2%)

Totale 38 (100%) 0 9 (100%) 72 (100%)

Tabella 6

37

Per quanto riguarda le infezioni di tipo virale (125; vedi tabella 4) abbiamo una distribuzione

di questo tipo:

• Bambini: 114 (91,2%)

• Adulti: 11 (8,8%)

91,2%

8,8%

bambini con infezioni di tipovirale (114)adulti con infezioni di tipo virale(11)

Grafico 11

Nella seguente tabella (tab. 7) possiamo invece notare le positività di ogni singolo agente

virale per fascia di età.

Età Adenovirus Rotavirus

< 1 anno 3 (10%) 5 (5,3%)

1 - 3 anni 16 (53,3%) 62 (65,3%)

4 - 7 anni 6 (20%) 16 (16,8%)

8 - 10 anni 3 (10%) 3 (3,2%)

Adulti 2 (6,7%) 9 (9,4%)

Totale 30 (100%) 95 (100%)

Tabella 7

È ben evidente come nelle infezioni di tipo batterico (Campylobacter, Yersinia) ed anche in

quelle di tipo virale la fascia di età più colpita è quella 1 - 3 anni, mentre per Salmonella la

distribuzione è più lineare.

38

Nel corso dell’anno 2009 sono state registrate 6 coinfezioni.

Agenti implicati Numero

Rotavirus + Adenovirus 4

C. termofili + Rotavirus 1

C. coli + Rotavirus 1

Tabella 8

RISULTATI PER E.COLI

Nel secondo semestre 2009 da 1800 coprocolture totali pervenute al laboratorio di

Microbiologia dell’USL8 Ospedale S. Donato di Arezzo, circa un sesto (286) sono state

selezionate (non formate, diarroiche o ematiche), per la ricerca del batterio E. coli O157,

anche se non esplicitamente richiesto, e analizzate aggiungendo un terreno selettivo (SMAC)

alla batteria standard utilizzata per la coprocoltura (Hektoen enteric agar, Cin agar,

Campylobacter selective agar) per valutare la frequenza di isolamento di questo

microrganismo.

Nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo per E.coli O157.

Sugli stessi campioni (286) sono stati ricercati anche altri patogeni (batteri e ove richiesto

anche virus enterici), e 20 sono risultati positivi per almeno un microrganismo.

93,2%

6,8%

campioni risultati negativi per laricerca di batteri e virus (272)campioni risultati positivi per laricerca di batteri e virus (14)

Grafico 12

39

La tabella 9 ci mostra l’effettiva distribuzione di tali positività sopra menzionate.

Microrganismo Positivi

Salmonella 6 (30%)

Shigella 0

Yersinia 3 (15%)

Campylobacter 4 (20%)

Adenovirus 6 (30%)

Rotavirus 1 (5%)

E.coli O157 0

Totale 20 (100%)

Tabella 9

40

DISCUSSIONE

Nonostante l’incidenza globale delle tossinfezioni alimentari sia molto difficile da stimare,

secondo l’OMS la maggior parte delle morti per diarrea (oltre due milioni in tutto il mondo

nell’anno 2000) sono dovute a questa causa. Nei soli paesi industrializzati, il 30 per cento

della popolazione ogni anno è soggetto ad una tossinfezione alimentare. Molto più complesso

è stimare l’incidenza di queste infezioni nei paesi del sud del mondo, dove le condizioni

igieniche e l’assenza di misure e di strutture adeguate a un trattamento corretto dei cibi,

rendono molto più difficile la preservazione di cibi non contaminati. L’obiettivo della OMS

sarebbe quello di raggiungere un consenso internazionale per valutare i rischi alimentari e per

mettere a punto un sistema di sorveglianza sulle tossinfezioni.

In Italia le informazioni sui focolai di tossinfezioni alimentari (TA) derivano dal sistema di

notifica obbligatorio delle malattie infettive, in particolare riferibili alla classe II (salmonellosi

non tifoide, diarree infettive non dovute a Salmonella) e IV (focolai epidemici). Spesso, questi

dati sono inficiati dalla sottonotifica, ma anche dalla mancata diagnosi eziologica attribuibile

a uno scarso ricorso ad accertamenti di laboratorio in caso di sintomatologia compatibile con

TA.

Poter stimare correttamente il peso delle malattie veicolate da alimenti è fondamentale in

salute pubblica, in quanto permette di orientare in modo qualitativamente e quantitativamente

corretto ed efficace qualsiasi azione volta a prevenire l’insorgenza di tali patologie.

Per calcolare il peso reale delle MTA (malattie trasmesse da alimenti) negli Stati Uniti ed in

altri paesi vengono utilizzati dei fattori moltiplicativi che vengono applicati ai dati provenienti

dalla sorveglianza passiva e dai referti di laboratorio.

Per l’anno 2009 la Regione Toscana con il C.e.R.R.T.A (Centro di Riferimento Regionale

sulle Tossinfezioni Alimentari) ha inteso migliorare la completezza dei dati relativi alle

tossinfezioni alimentari coinvolgendo i laboratori di Microbiologia per la segnalazione dei

microrganismi isolati dai campioni fecali attraverso la compilazione di schede di sorveglianza

da inviare mensilmente al centro di riferimento. Il laboratorio di Microbiologia della ASL 8 di

Arezzo ha aderito spontaneamente all’iniziativa e i risultati ottenuti sono quelli riportati nel

presente elaborato.

41

I microrganismi più frequentemente riscontrati sono stati i virus enterici. (vedi tabella 4)

Rotavirus con una percentuale di positività riferita ai casi del 6,6%

Adenovirus con una percentuale del 2,3%

I batteri sono stati riscontrati con delle frequenze di identificazione inferiori, e sono quì

riportate: (vedi tabella 4)

• Campylobacter con una percentuale dell’1,8%

• Salmonella con una percentuale dello 0,97%

• Yersinia con una percentuale dello 0.23%

• Shigella di cui non è stata riscontrata nessuna positività.

Come possiamo notare l’incidenza dei Campylobacter riscontrati alla ASL8 di Arezzo

nell’anno 2009 è stata quasi doppia rispetto a quella di Salmonella;

Le positività di Yersinia (9) sono un indice di diffusione di questo microrganismo che

abitualmente non viene ricercato nella indagine di coprocoltura di routine in molte ASL

d’Italia (per coprocoltura come da voce ufficiale del Tariffario Nomenclatore Nazionale si

deve intendere la ricerca di Salmonella, Shigella e Campylobacter);

I grafici 10 e 11 mostrano l’effettiva distribuzione dei microrganismi in base all’età dei

pazienti, come possiamo vedere i virus enterici (125) sono stati riscontrati per il 91,2% in

bambini, con un picco di incidenza nella fascia di età 1 - 3 anni, e nell’8,8% in adulti.

I bambini con infezioni di tipo batterico sono stati 87 (73,1%), gli adulti 32 (26,9%).

Il C.e.R.R.T.A ha in corso l’elaborazione dei dati epidemiologici pervenuti dai laboratori

aderenti all’iniziativa che saranno confrontati con quelli provenienti delle schede di notifica di

MTA. Con ogni probabilità dal confronto incrociato fra le due fonti emergerà un migliore

riconoscimento eziologico delle MTA.

E.COLI O157

Nel presente studio si è voluto anche porre l’attenzione all’isolamento dei ceppi

enteroemorragici in particolare E.coli O157 per valutarne la circolazione.

Al termine del lavoro svolto su campioni di feci selezionati per la ricerca di E.coli O157, è

emerso che, su circa il 10% di essi (25) si sono sviluppate delle colonie non fermentanti il

sorbitolo (NFS); dalle analisi successive effettuate con Vitek2 per l’identificazione biochimica

e con test sierologico E.coli O157 Latex kit è risultato che:

42

Per 4 isolati lo strumento per l’identificazione (Vitek2) ha fornito un risultato di “probabile

E.coli O157: confermare con test sierologico”

In un solo caso il test sierologico di agglutinazione (Latex kit) è risultato dubbio.

In nessun isolato sono risultati positivi entrambi i test.

I risultati forniti dal Vitek2 non sono stati risultati di certezza, la percentuale di identificazione

non ha mai superato il 51% e tali risultati non sono stati poi confermati con Latex kit.

L’agglutinazione fornita dall’isolato batterico al Latex kit è stata causata da una cross reazione

con un altro microrganismo enterico, “Klebsiella”, batterio gram negativo appartenente alla

famiglia degli enterobatteri.

In conclusione possiamo dire che, l’assenza di isolamento di E.coli O157, contrariamente ad

altri patogeni, conferma la scarsa diffusione di questo microrganismo nella popolazione;

sarebbe quindi importante ricercare tale microrganismo solo in casi fortemente sospetti

(diarrea ematica o pazienti con sindrome emolitico uremica), e quindi sulla base di una

richiesta specifica del clinico.

Sarebbe opportuno in questi casi specifici aggiungere, oltre all’esame colturale, anche la

ricerca delle tossine specifiche (Stx1, Stx2).

Siamo in attesa che il C.e.R.R.T.A. renda noto il risultato dell’indagine effettuata nel 2009 fra

i laboratori della Regione Toscana relativamente all’isolamento dei patogeni legati ad

infezioni alimentari, per poter confrontare i dati ottenuti in questo studio con quelli delle altre

province.

43

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