UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMAFacoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia

Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute

ISOLAMENTO DI CELLULE ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DA STAMINALI MESENCHIMALI DA

SANGUE DEL CORDONE SANGUE DEL CORDONE OMBELICALEOMBELICALE

Laureando: Arianna Beduschi Relatore: Prof. Roberto Sala

Tutore: Dott. Stefano Negri

CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI

Cellule staminali adulte multipotenti

Capacità di aderire a superfici di plastica

Espressione di markers specifici

POSITIVI: CD90; CD73; CD105; CD44; CD29; HLA-ABC NEGATIVI: CD34; CD45; CD14; HLA-DR

Capacità di differenziare:

Adipociti; osteociti; cellule muscolari;

Altro:neuroni, epatociti…

Fonti delle MSCs

FONTI DI MSCs

Agoaspirato midollareTessuto adiposo

Placenta Sangue e tessuti cordonali

IL SANGUE CORDONALE COME FONTE DI MSCs

tessuto di scarto

presenza di staminali mesenchimali ed emopoietiche

MSCs da UCB hanno le stesse caratteristiche di quelle isolate da midollo

uso autologo ed allogenico

dibattito tra ricercatori sull’accessibilità alle MSCs: difficoltà d’isolamento

meno MSCs rispetto midollo e Wharton’s jelly

Obiettivo:

tutelare sempre il diritto della madre a conservare il proprio sangue del cordone ombelicale per uso autologo e al tempo stesso garantire la possibilità di donare tale sangue per uso allogenico

Arrivo sacca sangue cordonale

Calcolo del volume netto di sangue cordonale raccolto:

• Peso lordo sacca – peso sacca ( tara = 28 g) = peso netto sacca

• Peso netto sacca / peso specifico sangue (1.05 g/ml) = volume sacca con anticoagulante

• Volume sacca con anticoagulante – volume anticoagulante (20 ml) =

volume netto sangue cordonale

Aliquota per la ricerca: attenzione a NON pregiudicare mai la conservazione del sangue raccolto sia per uso autologo che allogenico!

Prelievo 0,5 ml per emocromo e analisi multiparametrica al citofluorimetro

Analisi multiparametrica al citofluorimetro:

• CD 34 – APC

• CD 45 – PERPC

• CD 90 – FITC

• CD 73 - PE

Cellule MSCs-likeCENTRIFUGAZIONE IN

GRADIENTE DI DENSITÀ CON HISTOPAQUE-1007

Sangue intero

Histopaque

Analisi multiparametrica al citofluorimetro:

• CD 34 – APC

• CD 45 – PERPC

• CD 90 – FITC

• CD 73 - PE

Cellule MSCs-like

Plasma

Eritrociti Histopaque

Cellule mononucleate

Cellule mononucleate

SELEZIONE NEGATIVA DELLE CELLULE

Utilizzo di biglie paramagnetiche rivestite di Ab CD34.

Selezione negativa delle MSCs in quanto tali cellule non esprimono CD34.

COLTURE CELLULARI

IMDM + 10%FBS + bFGF 10ng/ml+ ITS+ 50 mg/ml

I dati forniti dall’emocromo e dall’analisi multiparametrica al citofluorimetro sono stati utilizzati per calcolare la % di MSCs sulla frazione di cellule mononucleate nel sangue e dopo estrazione con Histopaque.

La procedura di gating applicata è stata:

RISULTATI sample % MSCs /cell mono

nel sangue% MSCs/cell mono

dopo estrazione Histopaque

Cordoni di peso superiore a 90 g:

Cord 10 0,058 0,074

Cord 11 0,078 0,040

Cord 12 0,119 0,014

Cord 13 0,152 0,132

Cord 15 0,010 0,140

media 0,083 ± 0,055 0,080 ± 0,055

Cordoni di peso inferiore a 90 g:

Cord 18 0,078 0,382

Cord 19 0,029 0,306

Cord 20 0,092 0,177

media 0,066 ± 0,033 0,288 ± 0,104

RISULTATI

Efficienza di estrazione : (42,19 ± 16,37) %

Relazione tra volume di sangue raccolto e numero MSCS

0

10000

20000

30000

40000

50000

ml sangue raccolto

Numero MSCs nel sangue intero 11355 10050 22585 39310 3061

Numero MSCs dopo Histopaque 8606 6825 6385 1511 11220

20-40 ml 41-60 ml 61-80 ml 81-100 ml 101-120 ml 121-140 ml

All’aumentare del volume di sangue cordonale raccolto aumenta la quantità di MSCs-like presenti.

In proporzione la resa d’estrazione con Histopaque rimane la stessa.

RISULTATI

Relazione tra le ore trascorse dalla raccolta e il numero di MSCs

0

20000

40000

60000

80000

ore dalla raccolta

nu

mer

o M

SC

s

sangue intero 70833 12893 24951

estratto conHistopaque

5874 10448 5489

0-4 H 5-12 H 13-24 H

La percentuale di MSCs-like diminuisce nel sangue intero con l’aumentare del tempo trascorso tra raccolta e lavorazione.

I tempi migliori per l’estrazione con Histopaque sono tra 5 e 15 h.

RISULTATI

RISULTATI

Si ottengono colture dal 13% dei cordoni analizzati, percentuale che sale al 33,3 % se si considerano solo i cordoni di peso > 90g.

CONCLUSIONI

L’analisi multiparametrica al citofluorimetro dimostra la presenza di cellule MSCs-like sia nel sangue cordonale che nella frazione di cellule mononucleate da esso ottenute.

Con l’estrazione mediante centrifugazione in gradiente di densità non si perdono MSCs-like, anzi in alcuni casi aumenta la %.

All’aumentare del volume di sangue raccolto aumenta la % di MSCs-like.

Si ottengono colonie di MSCs-like solo da cordoni molto abbondanti, generalizzando con volume > 40 ml.

I tempi migliori per la lavorazione del sangue cordonale sono tra 5 e 12 ore MA sono state ottenute colonie di MSCs-like da un cordone lavorato + di 24 h dopo la raccolta.?

La coltura di MSCs-like è difficoltosa.

Cautela nel generalizzare i nostri risultati perché ottenuti su un ristretto numero di cordoni e su volumi ridotti in alcuni casi:

Infatti sempre, in ogni caso, sono stati tutelati i diritti della madre e del neonato e la possibilità di donare il sangue cordonale per uso allogenico.

Probabilmente se ci fosse la possibilità di lavorare tutto il sangue di una sacca idonea al congelamento la % di cordoni ombelicali da cui si ottengono colonie di cellule MSCs-like aumenterebbe.