UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA Dip. di Medicina...

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVADip. di Medicina Animale, Produzioni e Salute

Corso di laurea magistrale a ciclo unico inMEDICINA VETERINARIA

Tesi di laurea

HAV E NOROVIRUS NEGLI ALIMENTI: UN NUOVO PERICOLO EMERGENTE

PER LA SALUTE UMANA

Relatore: Ch.mo Prof. Valerio Giaccone

Laureando: Massimo Zanutto

ANNO ACCADEMICO 2012 - 2013

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INDICE

Capitolo 1 - Introduzione...............................................................................pag. 5

Capitolo 2 - I Virus............................ ..............................................................pag. 9

2.1 - Caratteristiche generali.......................................................................pag. 9

2.2 - Zoonosi...............................................................................................pag. 10

2.3 - Vie di trasmissione..............................................................................pag. 10

Capitolo 3 - Virus e trattamenti alimentari.............................................pag. 13

Capitolo 4 - Norovirus.....................................................................................pag. 15

4.1 - Caratteristiche microbiologiche......................................................... pag. 15

4.2 - Caratteristiche epidemiologiche.........................................................pag. 16

4.3 - Sintomatologia clinica........................................................................pag. 17

4.4 - Norovirus negli alimenti.....................................................................pag. 18

4.5 - Trattamenti sugli alimenti...................................................................pag. 19

4.5.1 - Refrigerazione.........................................................................pag. 19

4.5.2 - Congelamento..........................................................................pag. 21

4.5.3 - Acidificazione..........................................................................pag. 21

4.5.4 - Riduzione della frazione di acqua libera.................................pag. 22

4.5.5 - Trattamenti termici.................................................................pag. 23

4.6 - Epidemia in Germania........................................................................pag. 25

Capitolo 5 - Hepatitis A Virus (HAV).........................................................pag. 27

5.1 - Caratteristiche microbiologiche..........................................................pag. 27


5.3 - Diagnosi e prevenzione......................................................................pag. 29


3

5.4.1 - Sintomatologia nei bambini.....................................................pag. 30

5.4.2 - Sintomatologia negli adulti......................................................pag. 31

5.4.3 - Sintomatologia atipica.............................................................pag. 31

5.5 - HAV negli alimenti.............................................................................pag. 32

5.6 - Trattamenti sugli alimenti...................................................................pag. 34

5.6.1 - Refrigerazione............................................................................pag. 34

5.6.2 - Congelamento.............................................................................pag. 34

5.6.3 - Acidificazione.............................................................................pag. 35

5.6.4 - Riduzione della frazione di acqua libera....................................pag. 35

5.6.5 - Trattamenti termici.....................................................................pag. 36

5.7 - Epidemia nei Paesi nordici.................................................................pag. 37

5.7.1 - Epidemia in Danimarca..............................................................pag. 38

5.7.2 - Indagine epidemiologica del caso danese...................................pag. 39

5.7.3 - Epidemia in Finlandia, Norvegia e Svezia.................................pag. 40

5.7.4 - Risultati e ripercussioni..............................................................pag. 42

Capitolo 6 - Hepatitis E Virus (HEV)........................................................pag. 45

6.1 - Caratteristiche microbiologiche..........................................................pag. 45



6.4 - HEV negli alimenti.............................................................................pag. 47

6.5 - Trattamenti termici.............................................................................pag. 49

Capitolo 7 - Conclusioni.................................................................................pag. 51

Capitolo 8 - Bibliografia.................................................................................pag. 53

Capitolo 9 - Ringraziamenti..........................................................................pag. 71

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1 - INTRODUZIONE

Le infezioni e le tossinfezioni alimentari stanno diventando una frequente causa di

affezioni nei Paesi industrializzati. Le infezioni di origine alimentare sono causate dal

consumo di alimenti o bevande contaminati da diversi microrganismi. Gli agenti

eziologici principalmente coinvolti nelle epidemie che si verificano a seguito di

consumo di alimenti contaminati sono batteri, in particolare “Campylobacter spp.”,

“Salmonella spp”, ceppi patogeni di “E.coli” e virus enterici come Norwalk like virus, il

virus A dell’epatite (HAV), il virus dell’epatite E (HEV) e rotavirus (RV) (Newell et al.,

2010).

I patogeni emergenti rappresentano un serio problema di sanità pubblica assumendo una

sempre maggiore importanza epidemiologica. Questo potrebbe essere spiegato da

diversi fattori quali la globalizzazione del commercio, l’aumento della popolazione a

rischio (anziani e soggetti immunocompromessi), il cambiamento delle abitudini

alimentari, la tendenza a consumare pasti fuori casa.

L'incremento degli scambi internazionali di prodotti alimentari ha contribuito, inoltre,

alla rapida diffusione di malattie trasmesse per queste vie, incluse quelle ad eziologia

virale, comʼè stato segnalato sia dallʼOrganizzazione Mondiale della Sanità che dal

Codex Alimentarius (Koopmans et al., 2004).

Lo studio dei dati epidemiologici sulle infezioni alimentari degli ultimi anni ha

evidenziato un’ importanza crescente dei virus enterici, anche a seguito del

miglioramento delle tecniche di analisi che permettono di attribuire a questi agenti

patogeni molti episodi epidemici prima classificati ad eziologia sconosciuta. Fino

allʼinizio degli anni 70, infatti, le gastroenteriti virali nell'uomo erano diagnosticate solo

sulla base di criteri epidemiologici (Koopmans et al., 2004) a causa della scarsa

sensibilità e disponibilità di metodi per l'identificazione dei virus enterici che non

permettevano la loro determinazione diretta negli alimenti e, talvolta, neanche da

campioni fecali (Ahmad, 2002).

Diversamente dai batteri, i virus non si moltiplicano negli alimenti né producono tossine

in quanto parassiti intracellulari obbligati e quindi incapaci di replicare al di fuori della

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cellula ospite. La dose infettante per contro è molto bassa: generalmente tra 1 e 10 unità

virali (Phan T.G. et al., 2007) e quindi il rischio d'infezione da virus presenti negli

alimenti a parità di livello di esposizione risulta molto più alto di quello per i batteri.

I virus oggi sono tra le principali cause di infezioni alimentari. Gli USA stimano che i

virus provochino 2/3 dei focolai (CDC, 2012). Si conoscono oltre 120 virus enterici

classificati in diverse specie in base alle loro caratteristiche morfologiche, chimiche,

fisiche, antigeniche e genetiche (Koopmans et al., 2002; De Medici et al., 2009), ma

solo pochi sono comunemente riconosciuti come importanti patogeni di origine

alimentare. Questi possono essere classificati in tre gruppi principali, in base al tipo di

malattia che producono:

• Virus che provocano gastroenteriti: Rotavirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e due generi di

Calicivirus enterici umani: i Norovirus (NoV) e i Sapovirus (SV).

• Virus dellʼepatite a trasmissione oro-fecale: virus dellʼEpatite A (Hepatitis A Virus,

HAV) e virus dellʼEpatite E (Hepatitis E Virus, HEV).

• Virus che si replicano nellʼintestino umano ma provocano patologie in altri organi,

quali il sistema nervoso centrale o il fegato (Enterovirus) (Koopmans et al., 2004;

Widdowson MA et al., 2005; Han MG et al., 2004).

Chiaramente, i più rilevanti nelle infezioni di origine alimentare sono quei virus

infettanti le cellule che rivestono il tratto intestinale e sono dispersi con la perdita nelle

feci o attraverso il vomito (Koopmans et al., 2004).

I virus di Epatite A (HAV) e Caliciviridae sono agenti infettanti comuni per l'uomo,

mentre molti altri virus (Adenovirus, Poliovirus, Rotavirus, Coronavirus) sono infettanti

occasionali. HAV e Norovirus sono attualmente riconosciuti come i più importanti

patogeni di origine alimentare per quanto riguarda il numero di focolai e persone colpite

in Occidente. Sono altamente infettivi e possono portare alla diffusione di epidemie

(Cliver, 1997).

Le più documentate epidemie virali di origine alimentare possono essere ricondotte a

cibo che è stato manipolato da un lavoratore infetto, piuttosto che i cibi trasformati

industrialmente. La contaminazione virale del cibo può avvenire ovunque nel periodo

tra la fattoria e la tavola, ma molte infezioni virali di origine alimentare possono essere

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fatte risalire a persone infette che maneggiano il cibo che non è stato riscaldato o

successivamente trattato con altre tecnologie virucide. Se i virus sono presenti nel

pretrattamento, potrebbe essere presente una residua infettività virale dopo alcuni

trattamenti industriali. Peraltro molte delle attuali linee-guida dell'igiene alimentare

sono ottimizzate per la prevenzione delle infezioni batteriche e possono essere solo

parzialmente efficaci contro i virus. Un fattore di complicazione è che i più comuni

virus di origine alimentare crescono poco o per nulla nelle colture cellulari, così gli

studi di inattivazione di questi patogeni non sono possibili. Per questo alcuni autori

(Koopmans et al., 2004) hanno esaminato le informazioni attualmente disponibili sui

virus di origine alimentare e hanno provato a dare una stima dell'inattivazione virale

cercando un parallelo nei virus con strutture simili che possono crescere in sistemi ci

coltura cellulare in laboratorio.

Dal punto di vista della prevenzione risulta molto importante il monitoraggio

epidemiologico di queste infezioni, perché possono rappresentare un indice

dell’efficienza delle misure di sicurezza alimentare e può fornire importanti

informazioni per mantenerle sotto controllo e per prevenirne l’insorgenza.

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2 - I VIRUS

2.1 - Caratteristiche generali

I virus sono microorganismi molto piccoli, hanno dimensioni che variano dai 15 ai 400

nm (0,015 – 0,4 micron, mentre i batteri misurano da 0,8 a 10 micron e i lieviti dai 15 ai

30 micron), e causano una vasta gamma di malattie nelle piante, negli animali e negli

essere umani. Queste infezioni non avvengono casualmente: ogni gruppo di virus ha una

propria gamma di ospiti tipici e cellule preferite (chiamato tropismo) (Koopmans et al.,

2004). I virus non producono enzimi e non hanno un loro metabolismo interno (cosa che

invece fanno batteri, lieviti e muffe). Di conseguenza, la loro presenza in un alimento o

in altra matrice organica non è segnalata da eventuali effetti di deterioramento del

substrato. I virus sono parassiti intracellulari obbligati, mentre i batteri, i lieviti e le

muffe sono capaci di moltiplicare autonomamente. Infatti si dice che un batterio, un

lievito o una muffa “moltiplicano” mentre i virus “replicano”. Da ciò deriva che i virus

per replicare devono necessariamente “infettare” una cellula vivente (di uomo, animale

o pianta).

Anche i batteri possono essere “infettati” dai virus, proprio per le nette differenze di

dimensione tra i due e per la natura dei virus. A differenza dei batteri, poi, i virus non

sono sensibili agli antibiotici. I virus sono delle entità che non hanno struttura cellulare

evidente: appaiono al microscopio elettronico come dei solidi regolari a struttura più o

meno rigida in cui fondamentalmente abbiamo un filamento di materiale genomico

(DNA o RNA) avvolto da una struttura rigida di natura glicoproteica, chiamata capside.

Alcuni virus sono dotati anche di uno strato aggiuntivo di proteine e glucidi, chiamato

envelope. La presenza di questo envelope rende il virus che lo possiede meno resistente

alle condizioni avverse rispetto ad altri tipi di virus che non possiedono envelope.

Rispetto a batteri, lieviti e muffe, i virus hanno una struttura molto più essenziale,

ridotta al minimo, per cui in generale sono molto più resistenti di batteri, lieviti e muffe

alle condizioni stressanti che l’ambiente impone a tutti gli esseri viventi (pH del

substrato, parziale carenza di acqua disponibile, raggi UV, disinfettanti).

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2.2 - Zoonosi

Un consistente gruppo di generi virali può infettare gli animali vertebrati superiori,

causando malattie infettive più o meno gravi, e alcuni generi di virus sono in grado di

infettare le cellule umane, provocando nell’uomo infezioni che possono sfociare in vere

e proprie malattie. Un gruppo ancora più ristretto di queste infezioni può colpire senza

grosse distinzioni sia gli animali sia l’uomo: queste patologie infettive virali che

possono trasmigrare dagli animali all’uomo o vice versa, sono chiamate "zoonosi". Ciò

che va sottolineato, in ogni caso, è che di rado una specie di virus è capace di infettare

contemporaneamente un animale o l’uomo.

Come si è appurato in questi ultimi anni, però, alcuni virus hanno, rispetto ad altri

consimili, un genoma che può facilmente ricombinarsi, ossia mutare rispetto alla sua

struttura originaria. Queste modificazioni di struttura chimica del genoma virale sono

dette "mutazioni", e, in qualche occasione, la mutazione che interviene può rendere il

virus meno infettante o, vice versa, aumentarne la virulenza.

In più quando uomini e animali vivono a lungo in stretto contatto, il mix di virus che

possono trovarsi contemporaneamente nello stesso ospite può indurre mutazioni del

genoma di un virus che lo rendono capace di fare un “un salto di specie” ossia diventare

patogeno non solo per la specie originaria, ma anche per un’altra specie (in questi casi,

l’uomo). Al momento non vi è riscontro di infezioni virali trasmessa da avicoli, bovini e

suini a uomo.

I virus possono passare in vario modo da un essere vivente a un suo simile sensibile:

dipende da quali cellule il virus predilige per la sua replicazione. Esistono vari gruppi di

virus che hanno uno specifico tropismo per le cellule della mucosa intestinale e quindi il

loro “serbatoio naturale” o reservoir nel contenuto intestinale dell’uomo e/o degli

animali (Koopmans et al., 2004)

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2.3 - Vie di trasmissione

Sappiamo che le principali vie di trasmissione dei virus enterici sono: per diretto

contatto con feci umane (acqua contaminata da feci umane infette), per materiali

imbrattati da feci di persone malate (utensili, mani di operatori), per superfici o acque in

cui vi sono tracce di vomito umano, oppure per aver respirato l'aerosol di persone

infette, generato nell'emesi.

Le feci e i liquami portano nell’ambiente esterno una carica di solito molto elevata del

virus. In un grammo di feci di un uomo o di un animale infetto possano essere presenti

1010-1011 particelle virali (Leclerc H et al., 2002). Una volta arrivati nell’ambiente

esterno, i virus si trovano a dovere resistere ai fattori ambientali come luce solare e

raggi UV, pH variabili, possibile carenza d’acqua. Questi fattori ambientali fanno sì che

la carica virale che arriva nell’ambiente esterno con l’aria espirata o le feci si disperda,

tanto che agli alimenti arrivano cariche virali molto contenute (anche meno di 100 o 10

virioni/gr di prodotto). La dispersione ambientale è però compensata da una capacità

infettiva del virus molto elevata anche in poche decine di particelle virali. Infatti le feci

disperse nelle acque fognarie possono provocare la contaminazione delle acque

superficiali, incluse quelle marine, visto che i virus enterici possono sopravvivere a

lungo in acqua (Koopmans et al., 2002), in quanto protetti dai trattamenti di

disinfezione, dall'azione inattivante della temperatura, del pH e dei raggi UV ed infine

dall'antagonismo microbico grazie a due sistemi: l'aggregazione e l'adsorbimento.

L'aggregazione corrisponde alla formazione di aggregati formati da 2-10 unità virali

chiamate "Clumps" che garantiscono una maggiore resistenza delle singole particelle

alle condizioni ambientali, mentre l'adsorbimento è la grande capacità di legarsi a tutti i

materiali, organici ed inorganici, e, nascosti dentro questi materiali, sono protetti dagli

insulti ambientali. I virus così protetti riescono a sopravvivere per lunghi periodi

nell'ambiente e possono essere trasportati dalle correnti anche a grande distanza dai

punti di scarico.

I virus non replicano negli alimenti che contaminano e non producono alcun tipo di

tossina. La carica dei virus rimane quella che si realizza con la contaminazione, visto

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che dopo la carica virale non aumenta dopo l'arrivo nell'alimento.

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3 - VIRUS E TRATTAMENTI ALIMENTARI

Come precedentemente ricordato, i virus enterici arrivano a contaminare gli alimenti e

ovviamente anche tutti gli oggetti che l'uomo usa ogni giorno per molteplici vie.

Possono arrivare dal contenuto intestinale degli animali da reddito ( polli, bovini, suini,)

o da compagnia, o dall’aria stessa che sfiora gli alimenti e gli altri oggetti, come le

superfici di lavoro all’interno delle industrie alimentari, viaggiando con il pulviscolo

atmosferico e il vapore acqueo. Grazie alle loro dimensioni così piccole e la loro massa

ridottissima, vengono facilmente trasferiti a lunga distanza dal punto di emissione.

Per riprodursi, devono per forza infettare una cellula vivente e parassitarla obbligandola

a produrre nuovi virioni dal suo interno stesso. Quando contaminano un alimento o un

altro substrato, i virus non aumentano la loro carica iniziale; la carica virale che arriva a

contaminare un alimento o un oggetto resta invariata, a meno che non intervenga un

trattamento che la riduce inattivando una parte o tutta la carica virale iniziale.

Un trattamento sarà tanto più efficace quanto maggiore è la riduzione di carica virale

che riesce a garantire. Questa riduzione di carica viene espressa con un parametro che

viene chiamato "valore D".

Il valore D è un parametro usato in microbiologia che esprime in numero di secondi o

di minuti che sono necessari a un certo trattamento per ridurre del 90% una carica

iniziale nota di un batterio o di un virus, come nel nostro caso.

La maggior parte dei virus che sono agenti di infezione umana con gli alimenti non

possono essere coltivati in laboratorio, su colture cellulari, come invece sovente è

possibile per i virus agenti di malattia infettiva dei polli. Per cui i dati sulla loro

sopravvivenza negli alimenti e sulla velocità di inattivazione con una tecnologia

alimentare sono per lo più ottenuti da virus “surrogati”. I “surrogati” dei virus patogeni

per l’uomo sono dei virus che non sono pericolosi per la salute umana e che quindi

possono essere manipolati in laboratorio senza adottare particolari precauzioni. Questi

virus, però, sono scelti appositamente perché hanno una sensibilità al calore o ad altri

agenti stressanti molto simile a quella posseduta dai virus patogeni che ci interessano.

Quindi, i “surrogati” possono essere immessi intenzionalmente negli alimenti da trattare

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per essere poi conteggiati al termine del trattamento e valutare, quindi, l’efficacia

distruttiva di quel trattamento non solo nei confronti del virus surrogato, ma anche dei

virus o dei virus patogeni che gli assomigliano.

A differenza di quanto sappiamo per i batteri agenti di malattia alimentare, non abbiamo

molti dati bibliografici che documentino con precisione la sensibilità o la resistenza dei

virus patogeni per l’uomo rispetto ai possibili trattamenti che l’uomo può mettere in

atto con gli alimenti. La bibliografia scientifica ci aiuta con alcune importanti

considerazioni per i principali trattamenti sugli alimenti.

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4 - NOROVIRUS

4.1 - Caratteristiche microbiologiche

NoV è un virione di forma sferica, privo di envelope, di piccole dimensioni, 25-35 nm

di diametro (Wobus et al., 2004), e possiede un genoma a RNA a singola catena,

poliadenilato, di senso positivo lungo 7.400 – 7.700 nucleotidi (Wobus et al., 2006; Lin

CY et al., 2010). Il capside contiene 90 dimeri che formano un involucro dal quale

protrudono 90 capsomeri simili ad archi a livello locale dei doppi assi. Gli archi sono

disposti in modo tale da formare, nelle posizioni tre e cinque delle pieghe icosaedriche,

larghe depressioni simili a calici, da cui il nome Caliciviridae (Mans et al., 2010).

I Norovirus, detti anche “Small Round Structured Viruses”, SRSV, o “Norwalk-like

Viruses”, dalla prima identificazione in un'epidemia in una scuola elementare nel 1968 a

Norwalk, Ohio, USA, sono il prototipo dei Calicivirus (calice dal latino calix = calice,

coppa) (Rabenau et al., 2003; Costantini et al., 2006). Inizialmente descritti sulla base

del loro aspetto al microscopio immuno-elettronico come dei Picornavirus o Parvovirus

vennero più tardi inseriti in una nuova famiglia creata appositamente: le Caliciviridae.

La famiglia Caliciviridae, virus a RNA a singola catena, poliadenilato, con senso

positivo, è divisa in quattro generi: Norovirus, Saporovirus, Lagovirus e Vesivirus

(Ozawa et al., 2007; Bull et al., 2006).

Il genere Norovirus appartiene, quindi, alla famiglia Caliciviridae e comprende virus

enterici in grado di infettare l'uomo, il bovino, il suino e il topo. Geneticamente i NoV

possono essere divisi in cinque genogruppi (GI, GII, GIII, GIV e GV) in base alla

regione N-terminale (regione C) della regione del capside VP1 e alla sequenza della

regione RdRp (Castilho et al., 2006; Green et al., 2001; Cox et al., 2009).

In particolare I, II e IV comprendono i NoV umani mentre III e V comprendono i NoV

bovini e murini, rispettivamente. La stretta correlazione genetica tra ceppi umani ed

animali di NoV ha sollevato la possibilità di trasmissione zoonotica.

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4.2 - Caratteristiche epidemiologiche

Nonostante la diffusione mondiale e lʼalto livello dʼincidenza non si conosce molto

della biologia del Norovirus, del suo ciclo vitale e dei suoi punti critici per un eventuale

trattamento (Preeti et al., 2008). Non esistendo ad oggi dei sistemi di coltura cellulari

efficaci per la replicazione dei NoV che colpiscono lʼuomo, viene considerato, come

modello per comprendere la replicazione, il ciclo vitale, la patogenesi e la risposta

immunitaria dellʼospite, il Murine Norovirus-1 (MNV-1) (Wu et al., 2008; Ozkula et al.,

2011).

Wobus e collaboratori hanno dimostrato infatti che MNV-1 ed il NoV umano hanno

molte caratteristiche simili, tra cui il genoma e la sua organizzazione e funzione, la

grandezza del virione (da 28 a 35 nm), la modalità di trasmissione oro-fecale e la

sintomatologia provocata ( Henriëtte et al., 2010). Inoltre, allʼinterno dei 5 genogruppi,

il NoV murino è considerato lʼunico ceppo in grado di replicare in colture cellulari di

mammifero, così da divenire un eccellente candidato come modello sperimentale del

NoV umano (Shuvra Kanti Dey et al., 2010; Gustavsson et al., 2011). Wobus e

collaboratori nel 2004 hanno dimostrato che MNV-1 replica nelle linee cellulari

ematopoietiche, incluse le cellule RAW 264.7, nelle cellule del midollo spinale che

derivano da macrofagi e nelle cellule dendritiche. Altre linee cellulari di macrofagi e

cellule dendritiche, che permettono la replicazione di questo virus, sono le IC21,

P388D1, WBC264-9C e JAWSII. Le cellule RAW 264.7 rappresentano il modello più

ampiamente utilizzato di linee cellulari per gli studi di MNV.

Il virus attacca i recettori della cellula ospite, penetra per endocitosi recettore mediata,

perde il suo rivestimento e rilascia il genoma virale nel citoplasma. La proteina VPg

viene rimossa dallʼRNA virale, permettendo la traduzione di ORF1 in una poliproteina

di cui fanno parte alcune proteine non strutturali coinvolte nella trascrizione stessa

dellʼRNA.

Attualmente il rischio di infezione nell’uomo con ceppi di NoV bovini è considerato

basso, tuttavia la co-infezione di animali infettati da entrambi i tipi virali potrebbe

portare alla produzione di un agente ricombinante con alterata virulenza. I BoNoV

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hanno infatti dimostrato di andare incontro ad una estensiva ricombinazione genetica in

una maniera simile ai NoVs umani (Mattison et al., 2007).

Recentemente NoV è stato trovato in una grande percentuale di mandrie di vitelli e in

alcuni maiali (Van der Poel et al., 2000). I ceppi negli animali sono geneticamente

distinti da ognuno dei virus trovati nelle persone (Sugieda et al., 1998). Nessuna

trasmissione vitello-uomo o suino-uomo è stata documentata finora. I virus animali,

comunque, sono abbastanza simili al NoV umano e continua a cambiare come tutti i

virus a RNA. Allo stesso modo, varianti di HEV sono state trovate in suini e, in questo

caso, identici virus sono stati trovanti anche in alcuni esseri umani (Meng et al., 1997).

Questa è stata presa come la prima evidenza di zoonosi da HEV. Quindi, data la

flessibilità genetica dei virus a RNA, questi dovrebbero essere monitorati attentamente

per i cambiamenti nel comportamento.

4.3 - Sintomatologia clinica

Recenti acquisizioni mostrano l’elevata capacità di NoV sia umani che animali di

ricombinare a livello della sequenza di giunzione tra ORF1 e ORF2, attraverso un

meccanismo simile al crossing-over, con frequenze dell’ordine del 10%, nel corso di

infezioni multiple con diversi ceppi virali. Questi shift genetici sono stati al momento

descritti solo tra virus di una stessa specie, ma i dati restano ancora parziali

(Widdowson et al., 2005). Il rischio di adattamento e salto di specie, soprattutto nel caso

di virus ad RNA ad elevata diffusione e resistenza ambientale, deve essere considerato

realistico anche alla luce di quanto riportato recentemente per altri sistemi virali, quali

Coronavirus e Influenzavirus. Alcuni autori (Tirado et al., 2010) hanno ritrovato

sequenze GII.4 like umane in campioni di feci bovine suggerendo un possibile ruolo

degli animali infetti come serbatoio per l’introduzione di nuovi ceppi virali con diverso

tropismo o differente virulenza derivanti da ricombinazione tra NoVs bovini e umani.

Inoltre questo studio evidenzia un potenziale meccanismo di trasmissione zoonotica dei

NoV all’uomo attraverso carni, prodotti lattiero-caseari o contatto in stalla con animali

infetti.

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Recenti studi hanno dimostrato che NoV è la più comune causa unica di gastroenteriti in

persone di tutte le età ed è comune allo stesso modo dei rotavirus in pazienti che si

rivolgono ai loro medici di base per una gastroenterite (Wheeler et al., 1999; Koopmans

et al., 2000).

I NoV sono i patogeni più comunemente isolati sia in casi sporadici che in episodi

epidemici di gastroenterite, responsabili di più del 90% delle gastroenteriti non

batteriche e di circa il 50% delle epidemie di gastroenterite nel mondo (Lopman et al.,

2008; Patel et al., 2008). Si stima che il 12% dei casi di gastroenterite severa nei

bambini al di sotto dei 5 anni di età ed il 12% dei casi moderati e medi di diarrea nelle

persone di tutte le età siano imputabili ai NoV (Patel et al., 2008). In studi condotti nei

bambini sotto i 5 anni, la prevalenza di infezioni severe da NoV nei Paesi in via di

sviluppo è risultata comparabile a quella nei paesi industrializzati (12%) (Patel et al.,

2008). Si stima, infatti, che ogni anno i NoV causino 64.000 episodi di diarrea che

richiede ospedalizzazione e 900.000 visite cliniche di bambini nei paesi industrializzati

e fino a 200.000 decessi di bambini sotto i 5 anni di età nei paesi in via di sviluppo

(Patel et al., 2008).

L'incidenza è la più elevata nei bambini, ma la malattia si manifesta regolarmente anche

negli adulti. Infezioni asintomatiche sono comuni. In aggiunta, la maggioranza delle

epidemie di gastroenterite in ospedali e case di cura sono causate da NoV (Codex

Alimentarius, 1999).

4.4 - Norovirus negli alimenti

Anche se non è noto quale percentuale di infezioni può essere attribuito al consumo di

cibi contaminati, diversi rapporti hanno dimostrato che le infezioni di NoV di origine

alimentare sono comuni. Grandi epidemie, anche internazionali, di origine alimentare

causate da NoV sono state descritte (Berg et al., 2000). I dati dagli studi di

sieroprevalenza suggeriscono che le infezioni da NoV si trovano in tutto il mondo.

Per NoV, epidemie di origine acquatica sono inusuali ma sono state riportate.

I NoVs sono stati rinvenuti in campioni ambientali (per esempio nei liquami trattati e

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non trattati) così come in alimenti contaminati quali ostriche, frutti di mare, sandwich,

insalata, frutti di bosco e perfino in cubetti di ghiaccio (Da Silva et al., 2007; Ozawa et

al., 2007). Bassi livelli di trasmissione si possono verificare mediante

approvvigionamento idrico per contaminazione delle falde o delle acque superficiali. Le

acque dolci e marine infatti sono soggette a contaminazione a causa dellʼintensa attività

umana che determina apporti continui in aree specifiche. Lʼingestione accidentale di

acque ricreative contaminate può portare ad episodi di gastroenterite sporadici (La Rosa

et al., 2007), ma sono soprattutto i molluschi filtratori che vivono o vengono allevati in

acque contaminate che possono diventare una fonte di contagio; si pensa infatti che i

NoV possano essere concentrati nei bivalvi (La Rosa et al.,2007; Nishida et al., 2007).

Lʼ infezione primaria risulta dallʼingestione di alimenti o acqua contaminati da feci

infette, mentre lʼinfezione secondaria si ha per contatto diretto da persona a persona,

aerosol prodotto durante il vomito, fomiti e persone addette alla preparazione dei cibi

infetti (La Rosa et al., 2007).

4.5 - Trattamenti sugli alimenti

4.5.1 - Refrigerazione (H)

Mattison e collaboratori (2007) hanno valutato la sopravvivenza dei Calicivirus del

gatto (FCV) inoculati in dosi di 105 ufp (unità formanti placche) su insalata e fragole

mantenute a 4°C. La sospensione era stata preparata stemperando in soluzione

fisiologica sterile il 10% di feci umane, con lo scopo di imitare il grado di

contaminazione del prodotto dalla manipolazione umana. Il ceppo di virus FCV è stato

preso in esame dagli Autori della ricerca per valutare la persistenza alla temperatura di

refrigerazione dei Norovirus, pericolosi agenti di gastroenterite umana. Il gruppo di

ricerca ha riscontrato un calo di circa 2 gradi log nell’insalata a distanza di 7 giorni a

4°C, mentre sulle fragole il calo registrato è stato di oltre 2,5 gradi log nel giro di 6

giorni (Mattison et al., 2007).

Nonostante la riduzione anche piuttosto notevole, nei prodotti freschi condizionati solo

con la temperatura di refrigerazione si è avuta la sopravvivenza di un numero ancora

19

elevato di virus, a breve termine. Quindi verosimilmente anche i Norovirus patogeni per

l’uomo possono persistere a lungo sulla superficie degli alimenti, una volta che li hanno

contaminati.

Dawson e collaboratori (2005) hanno usato un ceppo di Levivirus (MS2) come

surrogato per i Norovirus per valutare la sopravvivenza di questi ultimi su differenti tipi

di prodotti freschi. Per ciascun tipo di prodotto gli autori hanno inoculato 10 g con una

sospensione di almeno 108 ufp di MS2 purificato. A 4°C nel giro dei successivi 7 giorni

si è registrato un calo della carica virale non oltre 1 log, su prodotti quali pomodori,

cavolo, carote, pepe, fragole e lattuga e un calo di meno di 2 log prima che i prodotti

andassero a male. Anche questa seconda ricerca conferma che i Norovirus e altri tipi di

virus analoghi non sono particolarmente sensibili alle basse temperature di

refrigerazione.

Kurdziel e collaboratori (2001) riportano una riduzione di 1 LOG di poliovirus dopo

11,6 giorni di conservazione di lattuga e dopo 14,2 giorni sul cavolo bianco, a 4°C. Gli

stessi autori non hanno registrato alcun calo della carica virale sulle cipolle nel giro di

15 giorni. La carica virale iniziale stimata da questi autori era di 104-105 ufp/g, una dose

più realistica e vicina alle condizioni naturali di quanto non avessero fatto Dawson e

collaboratori citati sopra, ma sostanzialmente i dati riscontrati sono stati gli stessi.

Oltre che la persistenza di FCV su vegetali freschi, Mattison e collaboratori (2007)

hanno valutato la sopravvivenza di FCV anche su fette di prosciutto e hanno riscontrato

all’incirca una riduzione di 1 log dopo 7 giorni di conservazione a 4°C. I ricercatori

hanno notato che sul prosciutto il virus persisteva più a lungo e meglio che sulle

verdure, ma non hanno saputo fornire una motivazione per questo comportamento,

ipotizzando che il prosciutto in qualche modo “proteggesse” meglio il virus dalla

disidratazione. Al contrario dei vegetali freschi, infatti, il prosciutto è ricco di proteine e

grassi e la presenza di questi composti potrebbe offrire una protezione migliore ai virus.

Il virus FCV inoculato in molluschi bivalvi (cozze e vongole) marinati reperiti in

vendita al dettaglio ha mostrato un calo di ben 7 log per FCV nel giro di 1 sola

settimana (Hewitt e Greening, 2004). La marinata aveva un pH di 3,75 che potrebbe

giustificare la rapida inattivazione del virus FCV.

20

Un altro studio ha valutato la sopravvivenza di poliovirus in yogurt del commercio (con

il 3,5% di grasso e circa pH 4) trovando dei virus ancora infettanti a distanza di 24 ore

sempre a 4°C (Strazynski et al., 2002).

4.5.2 - Congelamento

FCV felini e quelli del cane (CaCV), sempre usati come “surrogati” per valutare la

resistenza dei Norovirus patogeni per l’uomo, hanno manifestato un calo di infettività

rispettivamente di 0,34±0,18 log e di 0,44±0,12 log dopo 5 cicli di congelamento e

scongelamento (Duizer et al., 2004). I Poliovirus, dal canto loro, hanno presentato un

calo di 1 log in fragole congelate dopo oltre 8 giorni (Kurdziel et al., 2001). Vice versa,

non si è riscontrata alcune significativa riduzione di infettività di Norovirus murino 1

(MNV-1) in cipolle surgelate e in spinaci surgelati nell’arco di 6 mesi (Baert et al.,

2008b). A differenza di HAV e rotavirus, il virus FCV ha fatto segnare 1-2 log di

riduzione dopo 2 giorni di conservazione in fragole e altri frutti di bosco congelati,

probabilmente per l’ambiente acido in cui si trovava il virus.

4.5.3 - Acidificazione

L’incubazione di FCV e di CaCV (surrogati dei Norovirus umani) a pH di 2 o più basso

per 30 min a 37°C ha prodotto un calo della carica iniziale di oltre 5 LOG (Duizer et al.,

2004).

Una riduzione di meno di 1 LOG è stata registrata, invece, per il ceppo MNV-1 esposto

a valori di pH di 2,0 a 37°C per 30 minuti mentre per il virus FCV il calo è stato di 4,4

log dopo esposizione alle medesime condizioni (Cannon et al., 2006).

Particelle virali ancora infettanti sono state riscontrate se un filtrato di feci con

Norovirus era sottoposto a valori di pH di 2,7 per 3 ore (Dolin et al., 1972).

Simili bassi livelli di pH (pH 1 a 3,5) non sono tipici né degli alimenti né dei processi

produttivi degli alimenti.

21

4.5.4 - Riduzione della frazione di acqua libera (AW)

La sottrazione di acqua da un alimento provoca una concentrazione dei sali e un calo di

quel fattore che si chiama “frazione di acqua libera” o “attività dell’acqua libera” (Aw).

Un calo della Aw in un substrato rallenta la moltiplicazione di batteri, lieviti e muffe, se

pure con differente intensità a seconda dei microrganismi.

Già nel 1973 Konowalchuk e Speirs avevano condotto prove sperimentali per valutare

la persistenza di enterovirus (quali Coxsackievirus B5, Poliovirus, Echovirus 7) su

vegetali conservati a 4°C per 8 giorni coperti, mentre i vegetali mantenuti scoperti

avevano presentato un calo del 30% già dopo il primo giorno (Konowalchuk e Speirs,

1975). Gli studiosi ipotizzarono che la maggiore persistenza di virus sui campioni di

vegetali fosse da ricondurre alla minore perdita di umidità superficiale nei campioni

mantenuti coperti rispetto a quelli esposti direttamente all’aria.

In bibliografia troviamo anche studi che miravano a valutare l’influenza della Aw sulla

persistenza di virus negli alimenti, ma sono studi limitati sebbene la sopravvivenza dei

virus sia documentata in varie condizioni sulle superfici inanimate.

Doultree e collaboratori (1999) hanno osservato un calo di oltre 8 log per il virus FCV

dopo 20 giorni a temperatura ambiente in condizioni di essiccamento. Nonostante il calo

di FCV, un focolaio specifico di norovirosi registrato su una nave da crociera ha

confermato che questi virus possono persistere bene nell’ambiente. Sequenze identiche

si registrarono anche in crociere successive in cui i focolai erano da attribuire alle

contaminazioni delle superfici della nave, nonostante l’accurata pulizia e disinfezione

(Isakbaeva et al., 2005). Il riscontro di sequenze identiche di Norovirus sulle superfici

(tavoli, pulsanti di ascensori) e nei pazienti in un altro focolaio di norovirosi conferma

che le superfici possono agire da veicolo di trasmissione di questi virus (Wu et al.,

2005).

La sopravvivenza dei virus dopo essiccazione a temperatura ambiente potrebbe anche

dipendere dal terreno in cui i virus sono sospesi, come è stato già indicato per i rotavirus

(Ward et al., 1991).

Il trasferimento di NoV e FCV all’insalata diminuisce in caso si partisse da un inoculum

prima disidratato (D'Souza et al., 2006). Anche i virus HAV, essiccati, erano trasferiti in

22

misura minore alle superfici in acciaio (Mbithi et al., 1992). Se l’essiccazione può agire

favorendo minori contaminazioni delle superfici, la medaglia ha anche un suo rovescio:

in condizioni di essiccazione i virus diventano molto più resistenti ai disinfettanti clorati

come è stato segnalato per i ceppi MNV-1 e MS2 rispetto ai virus presenti in

sospensione acquosa.

4.5.5 - Trattamenti termici

Gli effetti inattivanti che le alte temperature possono avere su virus e batteri non

dipendono solo dall’intensità del calore, ma anche dal tempo di contatto del calore con i

microrganismi. Ciò va sempre tenuto presente per valutare l’efficacia inattivante del

calore nei confronti dei microrganismi.

Duizer e collaboratori (2004) hanno riscontrato tassi di inattivazione simili per i

Calicivirus del gatto (FCV) e del cane (CaCV) a temperature che andavano da 37°C a

100°C. Ricordo qui che i due virus sopra indicati sono dei “surrogati” dei Norovirus,

importanti agenti di malattia alimentare umana.

Tassi di inattivazione termica analoghi ai precedenti sono stati rilevata a 63 °C e 72 °C

sono stati notati per i virus FCV e MNV-1 anche da Cannon e collaboratori (2006).

Dati discordanti dai precedenti erano stati invece quelli sull’abbattimento della carica

virale già rilevati anni prima per il virus FCV per le medesime combinazioni

tempo/temperatura da Doultree e collaboratori (1999) e questi riscontri sono stati poi

confermati da Buckow e collaboratori (2008). Le differenze rilevate dai due gruppi di

ricerca erano verosimilmente da attribuire alle modalità di impostazione delle due serie

di prove sperimentali.

Il ceppo virale MNV-1 ha manifestato un calo di 2,81 log dopo esposizione a 75°C per

0,25 min in 10 g purea di ribes (Baert et al., 2008a).

Slomka e Appleton (1998) hanno studiato sperimentalmente l’inattivazione termica di

virus FCV per immersione di molluschi bivalvi in acqua bollente per 0,5 min e hanno

trovato una riduzione di 1,7 log di FCV. Con quel tipo di trattamento termico si può

stimare che a cuore dei molluschi la temperatura fosse arrivata all’incirca a 60°C. Dopo

1 minuto, la temperatura interna raggiunse i 78°C e ciò portò alla completa scomparsa

23

di oltre 4,5 log di virus FCV.

Programmando e mettendo in atto prove sperimentali molto valide sotto il profilo

tecnico, alcuni autori avevano già anni fa appurato che dei Norovirus presenti in filtrati

di feci umane mantenevano la loro capacità infettante anche dopo esposizione a 60°C

per 30 minuti. Questo studio ha fatto emergere i risultati contraddittori se confrontati

con le indagini sui surrogati degli stessi Norovirus, per cui sarebbe opportuno

approfondire gli studi da questo punto di vista.

Il meccanismo di inattivazione termica sopra i 65°C potrebbe essere causato da profondi

e irreversibili cambiamenti nella struttura del virione, verosimilmente dovuti allo

srotolamento notevole delle proteine (Volkin et al., 1997).

Nuanualsuwan e Cliver (2003b) hanno ipotizzato che il trattamento termico non causi

perdita della infettività dell’RNA dei poliovirus, ma che il bersaglio presumibile

dovrebbe essere il capside virale. Inoltre, la struttura quaternaria dei Norovirus resta

invariata se si sale di temperatura fino a 60°C. Occorre superare i 65°C perché le

particelle virali comincino a diventare irregolari di forma con una significativa rottura

della loro tipica struttura icosaedrica (Ausar et al., 2006).

Siccome il calore colpisce primariamente il capside virale, emerge una discrepanza tra

infettività del virus e il suo rilevamento con tecniche PCR. Il ceppo MNV-1 esposto a

80°C per 2,5 min ha fatto segnare un calo di 6,5 Log mentre il segnale di PCR, che

rappresenta il numero di copie genomiche, non era ridotto anche dopo 1 ora di

trattamenti a questa temperatura (Baert et al., 2008c). Le copie genomiche del ceppo

MNV-1 sono state individuate su spinaci cotti a vapore mediante real-time RT-PCR

(Baert et al., 2008b). I segnali ottenuti con RT-PCR da campioni trattati col calore

dovrebbero essere quindi interpretati con cautela perché si rischia di fare una sovrastima

dell’infettività del virus e di conseguenza di aumentare il rischio virale per la salute

umana.

24

4.6 - Epidemia in Germania

Nel Settembre/Ottobre 2012, un'epidemia di gastroenteriti da Norovirus è stata

registrata nella parte orientale della Germania. Sono state colpite un totale di 390

strutture, molte scuole, dislocate in cinque degli Stati Federali della Germania. Sono

stati registrati 10.950 casi di gastroenterite, con 38 ricoveri (Made et al., 2010).

I risultati delle indagini epidemiologiche e di rintracciabilità suggeriscono che una

consegna di fragole congelate importate dalla Cina fosse l'origine della epidemia. Gli

studi caso-controllo hanno rivelato una forte correlazione tra le gastroenteriti e il

consumo di composti di fragole servite fredde nelle mense (Anonymous, 2012b).

Questa è stata la più grande epidemia di origine alimentare che sia mai stata riportata in

Germania.

La tipizzazione dei norovirus ha rivelato tre differenti genotipi che includevano una

combinazione di genotipo II.16 (polimerasi virale) e II.13 (capside virale). Il genotipo

ricombinato II.16/II.13 che è stato trovato, non era mai stato riportato in Germania. Un

genotipo ricombinato II.16/II.13 da Kolkata, in India, è stato depositato recentemente

nel database GenBank (Made et al., 2010).

Anche se la fonte della contaminazione è in molti casi sconosciuta, è stata più volte

considerata come causa di contaminazione da virus nei frutti di bosco l'acqua di

irrigazione contaminata da liquami umani. Da questo ci si può aspettare la

contaminazione con un mix di virus diversi. La varietà riscontrata di genotipi di

norovirus nelle fragole analizzate durante le indagini, è in linea con questa ipotesi

(Made et al., 2010).

25

5 - Hepatitis A Virus


Nel 1947, McCollum ha introdotto i termini "Epatite A" per le epatiti infettive e "Epatite

B" per le epatiti da siero (Purcell et al., 2005). L'infezione da Epatite A è endemica in

molti Paesi in via di sviluppo, e c'è un graduale spostamento nell'età in cui si contrae

l'infezione dalla prima infanzia all'età adulta in diverse parti del mondo. Questo ha dei

riflessi nella sintomatologia clinica, che da infezione asintomatica o blanda nei bambini

sta aumentando l'incidenza di malattia grave e sintomatica. Negli ultimi anni, sta

aumentando il numero di casi con una sintomatologia atipica di Epatite A nei bambini

(Hussain et al., 2006; Barzagna, 2000).

HAV è un piccolo virus a singolo filamento di RNA, con un genoma pari a 7500

nucleotidi, lineare, senza envelop, con tropismo epatico, classificato nel genere

Hepatovirus nella famiglia dei Picornaviridae. I genotipi sono definiti basandosi su

un'analisi di 900 nucleotidi del completo capside della proteina VP1. Basandosi su

questa sequenza, sono stati definiti 6 genotipi di HAV: genotipo I, II, III, IV, V, VI.

I genotipi I, II e III, divisi in sottotipi A e B, colpiscono gli esserei umani. Informazioni

sulla distribuzione del genotipo I mostrano che è il più prevalente in tutto il mondo, con

IA più frequentemente riportato di IB, e il sottogenotipo IIIA è prevalente in Asia

Centrale. In aree con bassa endemicità, come gli USA e l'Europa Occidentale, il

sottogenotipo IA domina, ma tutti i genotipi e i sottotipi sono stati riportati (Desbois et

al., 2010).

HAV, a differenza degli altri membri della famiglia Picornaviridae, è stabile a pH 1 e

resiste al calore (56° per 30 min), al congelamento, ai detergenti e agli acidi, ma è

inattivato da formalina e cloro. Il virus è resistente, sopravvive sulle mani delle persone

e negli oggetti inanimati. L'escrezione di particelle virali nelle feci può durare dai 3 agli

11 mesi (Cuthbert et al., 2001; WHO, 2000).

27


L'infezione da HAV è una malattia autolimitante che non causa epatite cronica. Ha

quattro fasi:

• un periodo di incubazione che dura tra i 10 e i 50 giorni (media di 28 giorni),

che è asintomatico ma durante il quale avviene l'escrezione virale.

• una fase prodromale, caratterizzata da malessere, febbre, mal di testa, disturbi

gastrointestinali, urine scure e feci chiare.

• una fase itterica quando si sviluppa ittero, che avviene entro 10 giorni della fase

prodromale.

• una fase di convalescenza con lenta ripresa dall'infezione acuta (WHO, 2000).

HAV può essere trasmesso attraverso acqua contaminata, cibo, e per via oro-

fecale nei contatti ravvicinati (contatti domestici, contatti sessuali, asili nido o

scuole). Non esiste una cura (Blystad et al., 2004; Hanna et al., 2005; Pebody et

al., 1998).

L'epatite A ha una distribuzione mondiale, con circa 1.4 milioni di casi all'anno. In molte

aree del mondo è un'infezione endemica, tra cui parti del subcontinente indiano,

America Centrale e del Sud, Africa e Medio Oriente. La diffusione di epatite A è

inversamente correlata con i livelli di igiene e dei servizi sanitari (WHO, 2000).

La frequenza di notifica di casi di HAV nell'Unione Europea sta diminuendo

consistentemente negli ultimi 15 anni, da 14.0 nel 1997 a 2.6 per 100 000 persone nel

2010. Questo più probabilmente riflette il miglioramento delle condizioni di vita poichè

i tassi di sieroprevalenza di HAV sono altamente correlati con lo status socio economico

e all'accesso ad acqua pulita e alla sanificazione. I più alti tassi di notifica nella UE sono

riportati tra i giovani (sotto i 15 anni) (ECDC, 2011; Jacobsen et al., 2000).

HAV generalmente segue uno di questi tre pattern epidemiologici: nei Paesi dove le

condizioni igieniche sono scarse, molti bambini sono contagiati in tenera età. Uno studio

condotto sui bambini di una scuola a Delhi ha trovato che tutti i bambini di 16 anni

avevano anticorpi contro l'epatite A. Un diverso pattern è stato visto nei Paesi

industrializzati , dove la diffusione di infezioni da HAV è bassa fra i bambini e i giovani

28

adulti. Negli USA, la diffusione di anti-HAV è approssimativamente del 10% nei

bambini ma del 37% negli adulti. Un terzo pattern si è osservato in comunità chiuse o

semi-chiuse, come le comunità isolate nel Sud Pacifico, in cui una epidemia di HAV è

capace di contagiare l'intera popolazione, che poi diventa immune. Da quel momento in

poi, i nuovi nati rimangono suscettibili fino a che il virus non è reintrodotto nella

comunità (Acharya et al., 2003; Sjorgen et al., 2006).

Vi è un chiaro andamento stagionale con un picco in autunno, che può riflettere aumenti

a seguito di viaggi in Paesi endemici durante le vacanze. La bassa incidenza nella

popolazione europea può risultare in una alta percentuale di individui suscettibili se la

copertura vaccinale è insufficiente (ECDC, 2011).

5.3 - Diagnosi e Prevenzione

L'epatite A è diagnosticata da un insieme di sintomi e dalla presenza di

immunoglobuline M anti-HAV nel siero. Questo è riscontrabile nel siero da 2 settimane

a 6 mesi dopo l'infezione. IgG anti-HAV è riscontrabile 5-6 settimane dopo l'esposizione

e permane per anni. Conferisce immunità per il virus (Alazawi et al., 2011).

Rigorose misure di controllo come far rispettare l'igiene personale, rintracciare i rapporti

e somministrare i vaccini alle persone esposte sono risultati efficaci. Attualmente, sono

disponibili due tipi di vaccini contro l'epatite A: pool di globulina sierica umana (ISG) e

il vaccino inattivato contro l'epatite A (Stapleton JT, 1995). Le popolazioni target per la

vaccinazione contro l'epatite A comprendono personale e bambini che frequentano asili

nido; i membri della famiglia di una persona contagiata; viaggiatori in una area

endemica; e personale delle forze armate. Se il gruppo di studio include individui che

sono stati vaccinati contro l'HAV, questo porterebbe ad un errore di classificazione

dell'esposizione al virus. Persone che hanno ricevuto dosi standard di ISG mostreranno

negatività all'IgG di HAV indipendentemente dall'esposizione al virus perché sono

protetti dall'essere contagiati. La risposta immunologica ai vaccini inattivati è molto

simile all'infezione acquisita naturalmente (Stapleton JT, 1995; Sandman et al., 1995).

Gli attuali test sierologici non possono differenziare anticorpi sviluppatisi in risposta a

29

questo vaccino da anticorpi sviluppati in risposta all'infezione da HAV (Stapleton JT,

1995). Così, qualche individuo che era sieropositivo per HAV a causa della

vaccinazione può non essere stato esposto alla via di trasmissione dell'HAV.

L'immunizzazione attiva e passiva è efficace se somministrata entro due settimane dopo

l'esposizione.

L'immunoglobulina HAV è efficace come profilassi post-esposizione in quelli che non

sono immuni e in quelli esposti da meno di 2 settimane. I vaccini con HAV inattivato

sono raccomandati per tutti quelli che possono essere a rischio di infezione da HAV

(viaggiatori in zone endemiche, droghe illecite, sesso tra uomini) e coloro che hanno un

maggiore rischio di grave patologia epatica da HAV, come quelli con virus da epatite C

(HCV) cronico. In alcuni Paesi, come gli USA, viene ora incoraggiata la vaccinazione

generale dei bambini. Il richiamo del vaccino è raccomandato ogni 10 anni (Martin et

al., 2006).


La malattia, spesso asintomatica o blanda, particolarmente in bambini con meno di 5

anni, è una malattia altamente trasmissibile con una media come periodo di incubazione

dai 28 ai 30 giorni (range tra i 15 e i 50 giorni), con un periodo prodromico tra i 7 e i 12

giorni che inizia con con anoressia, nausea, vomito e malessere per arrivare all'ittero

(Heymann, 2008). Quando la fase itterica inizia, i sintomi spesso si risolvono e ritorna

l'appetito nei bambini piccoli, ma i bambini più grandi possono provare un

peggioramento transitorio nei sintomi della fase prodromale di anoressia, malessere e

debolezza (Bell et al., 2004).

5.4.1 - Sintomatologia nei bambini

Nei bambini può essere inapparente (asintomatica, con nessun aumento del livello di

aminotransferasi sierica), sub clinica (asintomatica, con aumento del livello enzimatico)

o clinicamente evidente. Sintomi specifici di disfunzione epatica sono l'ittero e le urine

scure da iperbilirubinemia. Sono stati segnalati casi di epatite A senza ittero (Bell et al.,

30

2004). Per i bambini è meno probabile avere un'infezione sintomatica degli adulti e si

verifica raramente l'ittero nei bambini con meno di 6 anni. Meno del 10% dei bambini

con meno di 6 anni diventeranno itterici con infezione da HAV rispetto al 40% dei

bambini tra i 6 e i 14 anni e il 70% dei bambini che hanno superato i 14 anni, mentre

negli adulti il 75-95% delle infezioni sono sintomatiche. Nelle aree endemiche tra il 73 e

il 100% dei bambini hanno dimostrato di essere stati infettati in tenera età (Denson et

al., 2004).

5.4.2 - Sintomatologia negli adulti

Negli adulti, l'insorgenza della sintomatologia è solitamente brusca con febbre,

malessere e dolori addominali. L'ittero è il sintomo predominante. I sintomi possono

durare una o due settimane, fino ad un mese. L'epatite recidivante per fino ad un anno

avviene nel 15 % dei casi. Nessuna infezione cronica è conosciuta e l'infezione

conferisce una immunità permanente (Heymann, 2008).

La mortalità è bassa (0,1 - 0,3%) ma può diventare elevata (1,8%) negli adulti con più di

50 anni o in persone con una malattia epatica cronica sottostante (Heymann, 2008; Koff,

1998). Il picco di infettività è nella seconda metà del periodo di incubazione (mentre è

asintomatico) e molti casi sono considerati non infettivi dopo la prima settimana di

ittero.

5.4.3 - Sintomatologia atipica

Samanta T e collaboratori hanno riportato un'incidenza del 14% di manifestazione

atipica in 229 bambini con epatite A nei loro studi dal 2004 al 2008. I sintomi più

comuni sono colestasi prolungata, insufficienza epatica acuta, ascite recidivante e

complicazioni ematologiche. I sintomi e le complicazioni cliniche atipiche del virus

dell'epatite A possono variare considerevolmente:

• Epatite A recidiva: decorso clinico bifasico o polifasico può essere osservato

dopo 1-4 mesi dal primo episodio di epatite A. Frequenza simile in bambini e

adulti.

• Epatite fulminante: complicazione rara ma può essere più comune nei Paesi in

31

via di sviluppo. Nella parte orientale dell'India è la causa più comune di

insufficienza epatica acuta. L'epatite A fulminante non ha caratteristiche

cliniche distintive che la distinguono da insufficienza epatica fulminante

dovuta ad altre cause.

• Epatite A colestasica: si manifesta in una piccola percentuale di bambini. Sono

molto itterici e possono avere prurito, stanchezza,febbre, perdita di feci,

anoressia, urine scure e perdita di peso (Samanta T et al., 2010).

5.5 - HAV negli alimenti

La trasmissione di HAV di origine alimentare è stato implicato in alcune epidemie negli

ultimi anni. EFSA e ECDC hanno riportato 11 epidemie tra il 2007 e il 2011, con una

forte evidenza di HAV come agente eziologico. I mezzi alimentari coinvolti erano: pesce

e prodotti a base di pesce, crostacei, vongole, molluschi e prodotti che li contenevano,

vegetali, succhi e pomodori secchi (EFSA e ECDC, 2011).

L'incidenza di infezioni da HAV variano considerevolmente tra e all'interno dei Paesi

(Mast and Alter, 1993). In gran parte dei Paesi in via di sviluppo, dove l'infezione da

HAV è endemica, la maggioranza delle persone sono infettate in tenera età e

virtualmente tutti gli adulti sono immuni. In queste aree, la trasmissione di HAV è

primariamente da persona a persona. Le epidemie sono rare perché molte infezioni

avvengono tra bambini che generalmente rimangono asintomatici.

Nei Paesi sviluppati, tuttavia, le infezioni da HAV diventano meno comuni come

risultato degli aumentati livelli di benessere. Veramente poche persone sono infettate

nell'infanzia, e la maggioranza degli adulti rimane suscettibile all'infezione di HAV.

Siccome la diffusione del virus inizia 10-14 giorni prima dell'insorgenza dei sintomi, vi

è un periodo per la diffusione del virus. Come risultato, il rischio di (grandi) epidemie di

HAV aumenta in queste regioni.

Inoltre, gli adulti hanno più probabilità di sviluppare sintomi al momento dell'infezione,

causando un maggior riconoscimento delle epidemie. Anzi, epidemie di origine

alimentare sono state riportate in molte parti del mondo e possono essere di grande

32

dimensione.

A livello europeo, la Francia ha segnalato un' epidemia infettiva da HAV coinvolgente

59 casi (Gallot et al., 2011); pomodori secchi congelati sono stati identificati come

mezzo dell'infezione in tutti i casi primari. Pomodori secchi sono stati anche implicati in

un'epidemia coinvolgente 144 casi da HAV in Australia nel 2009 (Donnan et al., 2012) e

furono sospettati in un gruppo di casi in UK nel 2011 (Carvalho et al., 2012).

In Agosto e Novembre, l'Olanda ha segnalato due gruppi di infezioni da HAV IA con

una grande percentuale di casi che sono stati precedentemente esposti alle fragole

(indagine urgente in EPIS-FWD). I frutti di bosco sono anche implicati in epidemie

infettive da HAV: nel 1987, 24 casi da HAV, associati al consumo di lamponi congelati,

sono stati riportati in Scozia, UK (Reid et al., 1987) ; nel 1997, un'epidemia che

interessava 153 persone, associate con il consumo di fragole congelate, è stato segnalato

in Michigan, USA (CDC, 1997). Il succo di arancia era implicato nel 2004 in una grande

epidemia con più di 300 casi di infezioni da HAV in viaggiatori da nove Paesi europei,

ritornanti dall'Egitto (Frank et al., 2007).

Secondo il database del Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF), 18 campioni

di alimenti sono stati trovati essere contaminati con HAV tra il 1999 e il 2013. HAV è

stato trovato in sei Paesi europei (Belgio, Repubblica Ceca, Germania, Italia, Olanda e

Spagna) nei seguenti cibi: crostacei ( ostriche, cozze, vongole, capesante), pomodori

secchi, datteri, fragole congelate, e la torta di yogurt alla fragola.

Per quanto riguarda i Paesi extraeuropei, sappiamo che a Shanghai, Cina, nel 1988,

250,000 persone ebbero un'infezione da HAV dopo aver consumato vongole

contaminate (Halliday et al., 1991). L'indagine di casi sporadici o piccoli gruppi di

epatite A di origine alimentare è problematica perché il periodo di incubazione può

essere lungo. In seguito, una possibile associazione con cibo consumato settimane prima

può essere raramente investigato nel momento della comparsa della malattia. Come per

il NoV, anche per HAV le epidemie di origine acquatica sono inusuali ma sono state

riportate.

33

5.6 - Trattamenti sugli alimenti

5.6.1 - Refrigerazione

Croci e collaboratori (2002) hanno inoculato verdure pre-tagliate (carote, finocchio,

insalata) per immersione in una sospensione contenente virus dell’epatite infettiva di

tipo A (HAV) invece che effettuare l’inoculazione con metodo per aspersione, come

fatto dagli autori prima citati e in altri studi (Mattison et al., 2007; Dawson et al., 2005;

Kurdziel et al., 2001). Inoltre hanno appurato che dopo 9 giorni di conservazione a 4°C

delle verdure, si otteneva una riduzione di circa 2 gradi LOG di HAV. Il virus

sopravviveva più a lungo sull’insalata rispetto al finocchio o alle carote, probabilmente

per la struttura e la superficie dei differenti tipi di vegetali.

In sostanza, considerati i dati raccolti, sembrerebbe che i virus MS2 abbiano una

maggiore persistenza sui vegetali rispetto ai Calicivirus, ai poliovirus e al virus HAV, ma

questo comportamento potrebbe essere attribuito anche alla notevole carica inquinante

che gli autori delle ricerche hanno inoculato nei campioni studiati, rispetto alle

condizioni di contaminazione che si registrano nella realtà quotidiana dei fatti.

Il virus HAV inoculato in molluschi bivalvi (cozze e vongole) marinati reperiti in

vendita al dettaglio ha mostrato un calo di circa 1,7 log di HAV dopo 4 settimane di

conservazione a 4°C (Hewitt e Greening, 2004). La marinata aveva un pH di 3,75 che

potrebbe giustificare la rapida inattivazione del virus FCV.

Possiamo concludere che le indagini sperimentali condotte sui prodotti refrigerati (sia di

origine animale sia di origine vegetale) hanno permesso di accertare che i virus possono

persistere in numero considerevole sui prodotti nell’arco della loro vita commerciale se i

prodotti sono conservati solo con l’impiego delle temperature di refrigerazione.

5.6.2 - Congelamento

Butot e collaboratori (2008) riferiscono che il numero dei rotavirus (altri pericolosi

agenti di gastroenterite umana, sovente veicolati da alimenti e acque poco potabili) e di

HAV resta stabile durante i 90 giorni di conservabilità di lamponi e altri frutti di bosco

congelati, ma anche su prezzemolo e basilico, ad eccezione dei rotavirus che hanno fatto

34

segnare un calo di 1 log sui ribes e basilico dopo 2 giorni di congelamento.

5.6.3 - Acidificazione

Unità infettanti di HAV erano ancora presenti a distanza di 5 ore di esposizione a pH di

1 a temperatura ambiente mentre ceppi di Coxsackievirus A9 e B1, enterovirus 9 e

poliovirus scomparivano del tutto nel giro di 2 ore alle condizioni sopra specificate

(Scholz et al., 1989). A 38°C, il virus dell’epatite infettiva A è rimasto infettante fino a

90 minuti a pH 1 (Scholz et al., 1989).

5.6.4 - Riduzione della frazione di acqua libera (AW)

Mbithi e collaboratori (1991) riferiscono che i tassi di decadimento del virus dell’epatite

infettiva A sono maggiori a elevata umidità relativa dell’aria (80%), rivelando una

sopravvivenza del 34% rispetto a tassi di umidità relativa più bassa (25%), dove

registriamo un 52% di sopravvivenza su superfici non inerti non porose. Però Abad e

collaboratori (1994) segnalarono una migliore sopravvivenza del virus HAV se l’umidità

relativa era alta (90%) rispetto a una bassa umidità relativa del 50% su superfici non

porose nel corso di 60 giorni a 20°C. Il calo massimo registrato è stato di 2 log nell’arco

di 60 giorni.

In un’altra nutrita serie di indagini, è stata studiata l’inattivazione di virus alle

condizioni di essiccamento o la loro sopravvivenza in quelle condizioni. Dopo

essiccamento per circa 4 ore a temperatura ambiente, il 7% dei rotavirus e tra il 16% e il

30% dei virus HAV poteva ancora persistere ed essere ritrovato (Ansari et al., 1988;

Mbithi et al., 1992).

I Poliovirus hanno fatto segnare riduzioni tra 3,1 e 3,5 log dopo un’essiccazione di 3-5

ore su superfici non porose con un calo da 0,1–0,5 log e 0,3–1,1 rispettivamente per

virus HAV e rotavirus su quelle stesse superfici (Abad et al., 1994). L’essiccazione può

giocare un ruolo di primo piano nella capacità dei virus di sopravvivere nell’ambiente

esterno.

Il virus dell’epatite infettiva A e i rotavirus hanno manifestato maggiore stabilità rispetto

ai poliovirus confermando la maggiore trasmissibilità dei predetti due gruppi di virus

35

tramite superfici di lavoro contaminate da materiale fecale. Inoltre, HAV infettanti sono

stati ancora rilevati dopo essiccamento in una sospensione di feci per 30 giorni a 25°C e

con un’umidità relativa del 43% (McCaustland et al.,1982).

5.6.5 - Trattamenti termici

Bidawid e collaboratori (2000b) hanno studiato l’inattivazione termica del virus

dell’epatite infettiva A (HAV) in latte magro sterile, in latte omogeneizzato e in panna

da cucina. A 71°C l’esposizione dei virus per tempi di 0,16 – 0,18 – 0,52 minuti è stata

la minima necessaria per ridurre di almeno 1 log la carica iniziale di HAV mentre per

arrivare a un calo di 4 log si doveva salire a 6,55 minuti (latte magro), 8,31 minuti per

latte intero e 12,67 minuti per la panna da cucina.

Questa variabilità di efficacia del trattamento termico nei confronti dei virus citati è da

attribuire alla differente composizione dell’alimento e in particolare il suo tenore di

lipidi, che influenza certamente la resistenza termica o l’inattivazione termica dei virus.

Per esempio nella panna da cucina si è dovuti arrivare a un trattamento ancora più lungo

per ottenere un’efficace riduzione del virus HAV analoga a quella ottenuta nel latte.

Verosimilmente gli elevati tassi di lipidi della panna proteggevano il virus HAV dal

calore.

Analogamente, i poliovirus perdono la loro infettività se esposti nel latte ad almeno

72°C nel giro di 0,25 minuti, tempi maggiori rispetto alla sola acqua, sempre a motivo

dei componenti del latte (Strazynski et al., 2002).

Un effetto protettivo analogo nei confronti dei virus è stato descritto per i molluschi

eduli (cozze e vongole) da Croci e collaboratori (1999). Inoculando del virus HAV in un

omogenato di molluschi eduli, infatti, gli studiosi hanno ottenuto una riduzione di 2 del

virus HAV dopo esposizione di 10 minuti a 60°C o di 3 minuti a 80°C (Croci et al.,

1999).

Bidawid e collaboratori (2000b) hanno osservato un calo non lineare del virus HAV in

latte se trattato tra 65°C e 75°C. La rapida inattivazione osservata nella fase iniziale del

trattamento e il “rallentamento” dell’inattivazione nella parte finale potrebbe essere

spiegata dalla presenza di molti virioni in sospensione e al di fuori degli aggregati che in

36

genere i virus formano.

Anche Floyd e Sharp (1979) hanno stabilito che una sottopopolazione di microrganismi

può diventare più resistente ai disinfettanti per la formazione di “aggregati” (clumps).

L’aggregazione virale è influenzata dalla composizione ionica del mezzo in cui si

trovano, dal pH della matrice e dal punto isoelettrico del virus. Le condizioni che

inducono la formazione di aggregate virali, quindi, può essere influenzata dalla matrice

alimentare come pure dal tipo di virus.

Deboosere e collaboratori (2004) hanno studiato la termo-resistenza del virus

dell’epatite infettiva (HAV) inoculato in terreni sintetici che simulavano le

caratteristiche chimiche di fragole e simili (Deboosere et al., 2004). I loro esperimenti

hanno dimostrato che la concentrazione di saccarosio (espressa in gradi Brix) e il pH

influenzavano l’inattivazione termica del virus HAV. In 1 g di fragole il virus HAV

calava di 1 log dopo un trattamento termico di 2 minuti per raggiungere gli 85°C e poi

seguito da 0,96 minuti a 85°C (Deboosere et al., 2004).

Sebbene sembri che il virus HAV sia più termoresistente del virus MNV-1, la

composizione del ribes (vale a dire alte concentrazioni di saccarosio associata ad altri

possibili componenti), il periodo di pre-riscaldamento di 2 minuti e l’alta carica

dell’inoculum virale (107 ufp/ml HAV contro 105 ufp/ml MNV-1), potrebbero essere

parzialmente responsabili dei differenti tassi di inattivazione.

5.7 - Epidemia nei Paesi nordici

Nel Febbraio 2013, la Danimarca ha registrato un numero di pazienti segnalati con

un'infezione da virus dell'epatite A più alto del normale, che non avevano fatto viaggi

nelle 2-6 settimane precedenti alla comparsa dei sintomi e non avevano altri fattori di

rischio conosciuti per le infezioni da HAV. Allo stesso tempo, i virus da sei pazienti con

epatite A, che sono stati comunicati fin dall'Ottobre 2012, hanno mostrato di essere di

genotipo 1B (numero di accesso in GenBank KC876797).

Un'indagine epidemica è stata iniziata ed è stata inviata una richiesta urgente attraverso

l'Europe Epidemic Intlligence Information System for food- and waterborne diseases

(EPIS-FWD) il 1 Marzo 2013, chiedendo se altri Paesi avessero notato un aumento di

37

loro connazionali con infezione da HAV (MacDonald et al., 2013).

Anche Finlandia, Norvegia e Svezia riportarono un aumento nel numero di pazienti con

HAV senza aver viaggiato all'estero. Ogni Paese ha identificato uno o più casi con

genotipo IB di HAV che ha sequenza identiche agli HAV dei casi danesi. L'epidemia è

ancora in corso (Gillesberg Lassen et al., 2013).

In Danimarca furono stabilite le seguenti definizioni dei casi di epidemia e sono stati

applicati in tutti e quattro i Paesi, ad eccezione della Svezia che include solo casi dal 1

Dicembre 2012 in avanti e la Finlandia che non esclude casi con altri fattori di rischio:

• Un caso probabile viene definito come una persona che vive in Danimarca,

Finlandia, Norvegia o Svezia con malattia clinica compatibile con infezione da

HAV e positività per gli anticorpi IgM di HAV; nessuna storia di viaggi fuori dai

Paesi nordici due o sei settimane prima dalla comparsa dei sintomi; o avendo

altri fattori di rischio conosciuti per HAV e la comparsa dei sintomi il 1 Ottobre

2012 o più tardi.

• Un caso confermato viene definito come un probabile caso con un genotipo IB

di HAV con una sequenza che non differisce più del 2% dalla sequenza

KC876797.

• Sono stati esclusi tutti i pazienti con altro genotipo di HAV che non sia IB, o

pazienti con una sequenza di genotipo IB che differisce più del 2% dalla

sequenza KC876797, o pazienti con un HAV atipico da familiari di un paziente

escluso con infezione da HAV.

• Un caso secondario viene definito come un caso probabile o confermato con

contatto ravvicinato a un caso probabile o confermato e avendo la comparsa dei

sintomi due o più settimane dopo il caso primario (Gillesberg Lassen et al.,

2013).

5.7.1 Epidemia in Danimarca

La malattia da HAV viene denunciato in Danimarca: i medici di base riportano i pazienti

direttamente al Statens Serum Institute (SSI). I test diagnostici vengono svolti nei

38

laboratori locali e nel SSI, usando la sierologia. La tipizzazione del virus è avvenuta

solo al SSI Microbiological Diagnostics and Virology Department, che ha ricevuto i

campioni diagnostici IgM positivi per la conferma dell'identificazione dell'RNA virale

grazie alla PCR, e ulteriori caratteristiche da genotipizzazione e sequenziamento.

L'RNA virale viene estratto, tipizzato e sequenziato alla regione VP1, usando un

protocollo fornito da H. Norder (comunicazione personale, 21 Dicembre 2006),

compreso alcune sequenze di primer precedentemente pubblicato (Tallo et al., 2003).

Al 17 Aprile 2013, sono stati identificati in Danimarca un totale di 35 casi, di cui 13

confermati e due casi secondari: 21 erano donne e l'età media era 22 anni ( range tra i 4

e i 66 anni). La data della comparsa dei sintomi spazia tra il 1 Ottobre 2012 e il 27

Marzo 2013. Sono state identificate due famiglie con, rispettivamente, due e tre casi,

oltre a un gruppo di quattro amici che sono stati esposti nel medesimo periodo.

In 10 casi è stato identificato il ceppo HAV con numero KC876797 (sequenza 1). Il

ceppo HAV con numeri KC876798 e KC876799 (sequenza 2), che differiscono del 1,7%

su 847 coppie di basi dalla sequenza 1, è stato identificato in tre dei quattro amici.

Il 4 marzo 2013, Olanda e Francia hanno comunicato, via l'EPIS-FWD e la rete di

laboratori di HAV, che la sequenza 1 assomiglia alle sequenze di HAV trovate nei casi di

epatite A di ritorno dall'Egitto. La sequenza 1 ha mostrato anche di essere per il 98,7%

identica a sequenze di HAV da una epidemia canadese associata a semi di melograno

importati dall'Egitto nel 2012 (Dr. Anton Andonov, comunicazione personale, 19 Marzo

2013). Inoltre, i ceppi dell'epidemia sono strettamente correlati al ceppo trovato in turisti

europei di ritorno dall'Egitto. La sequenza 1 ha mostrano anche un 99% di omologia con

il numero HQ401265 dalla Spagna nel 2010 e il 98% di omologia con il numero

EF190998 dall'Ungaria nel 2006 (Gillesberg Lassen et al., 2013).

5.7.2 Indagine epidemiologica del caso danese

Un totale di 11 casi sono stati intervistati usando un'intervista informativa per

identificare possibili comuni esposizioni, quali eventi comuni o il consumo di cibi

implicati in altre epidemie di epatite A di origine alimentare ( per esempio molluschi,

pomodori semi-secchi, frutta secca, frutti di bosco e fagioli).

39

Per corroborare l'ipotesi che un alimento su un elenco di prodotti a lunga conservazione

potesse essere l'origine dell'infezione, è stato istituito uno studio caso-controllo. Lo

studio includeva 25 casi probabili e confermati e 50 controlli, ed è stata effettuata con

questionari in interviste telefoniche dal 6 al 13 Marzo 2013. I casi secondari non sono

stati inclusi nell'indagine. I casi sono stati interrogati sulle esposizioni nelle sei

settimane prima della comparsa dei sintomi e i controlli nelle sei settimane precedenti

all'intervista. Un caso è stato escluso successivamente dalle analisi, visto che la persona

aveva un genotipo IA di HAV.

Dei 24 casi, 18 avevano mangiato frutti di bosco congelati, usati per frullati preparati al

momento e 20 avevano mangiato fragole. Solo in sei casi è stato segnalato il consumo di

pomodori secchi, datteri o fichi. Per gli ultimi due alimenti, un'associazione distorta

potrebbe derivare dal fatto che il periodo di esposizione dei casi, non dei controlli, in

alcuni casi includeva Natale, periodo in cui datteri e fichi sono tradizionalmente

mangiati in Danimarca. Nessuna catena specifica di supermercati è stata associata ai

casi di malattia.

I risultati sono stati inviati direttamente al Danish Food and Veterinary Administration

(DFVA) e al pubblico attraverso notizie sul sito della SSI. La comunità internazionale è

stata informata il 14 Marzo 2013 attraverso l'European Early Warning and Response

System (EWRS). Il DFVA ha raccomandato alla popolazione di bollire tutti i frutti di

bosco congelati per almeno un minuto prima di consumarli (Gillesberg Lassen et al.,

2013).

5.7.3 Epidemia in Finlandia, Norvegia e Svezia

Al 17 Aprile 2013, 36 casi sono stati identificati in Finlandia, Norvegia e Svezia,

di cui 15 erano confermati. In totale sono stati trovati 71 casi in quattro Stati.

Finlandia e la Norvegia hanno riportato casi confermati con sequenza 1 e 2. In

Svezia, due degli otto casi confermati avevano sequenza IB di HAV (chiamata

sequenza 3), con un 2% di differenza dalla sequenza 1 e un 1% dalla sequenza 2.

L'età media complessiva dei casi confermati era 25 anni (tra i 3 e i 78 anni); 43

40

casi sono donne. In Norvegia e Svezia (ma non in Finlandia), erano contagiate

più donne che uomini. Al 17 Aprile, la Svezia era il solo Paese con casi la cui

insorgenza dei sintomi è avvenuta in Aprile. Un aumento del numero di pazienti

con epatite A collegata ai viaggi può essere spiegata in parte da persone

contagiate in Egitto (MacDonald et al., 2013).

Le indagine sull'epidemia sono in corso in Svezia, Finlandia e Norvegia. In

Svezia, il questionario danese è stato inviato a tutti i casi. Di 12 casi, che hanno

risposto al questionario entro il 15 Aprile, nove risposero di aver mangiato frutti

di bosco congelati al tempo dell'infezione. Tra i sette casi confermati che hanno

risposto al questionario, cinque avevano mangiato frutti di bosco congelati.

In Finlandia, sette casi avevano mangiato frutti di bosco congelati al tempo

dell'infezione. Tutti e tre i casi confermati in Finlandia avevano mangiato fragole

congelate; due avevano anche mangiato altri tipi di frutti di bosco ( lamponi,

mirtilli e mix di vari frutti di bosco).

In Norvegia, tutti i sei casi riportati avevano mangiato frutti di bosco congelati al

tempo dell'infezione e i quattro casi confermati avevano mangiato fragole

congelate. La Norvegia, tra il 18 e il 21 Marzo 2013, ha condotto uno studio

caso-controllo, includendo 10 pazienti e 25 controlli. I casi erano pazienti con

infezione da HAV o persone epidemiologicamente collegate a casi di HAV

confermati, e che avevano sintomi simili senza viaggi nei due mesi precedenti

all'insorgenza dei sintomi, che hanno contratto un'infezione primaria e hanno

avuto un'insorgenza dei sintomi tra il 1 Novembre 2012 e il 21 Febbraio 2013.

Nessun prodotto alimentare è stato statisticamente e in modo significativo

collegato con la malattia; però, questo studio ha sofferto di un limitato potere a

causa del basso numero di casi. Comunque sei dei casi riportati avevano

mangiato frutti di bosco congelati. La tipizzazione successivamente ha mostrato

che solo quattro degli 11 "casi" nello studio corrispondevano alla definizione di

caso da epidemia (Gillesberg Lassen et al., 2013).

I test di laboratorio sui frutti di bosco presi dalle case di sette casi confermati da

Danimarca, Svezia e Norvegia sono risultati negativi a HAV. Si stanno ancora

41

aspettando i risultati di campioni di frutti di bosco presi da due casi confermati in

Finlandia.

5.7.4 Risultati e ripercussioni

Questa è la prima epidemia da HAV di origine alimentare dei Paesi nordici. I

risultati dello studio caso-controllo indicano chiaramente i frutti di bosco

congelati (in particolare le fragole) come il probabile veicolo dell'epidemia. I

frutti di bosco surgelati sono già stati in precedenza identificati come veicolo in

epidemie da HAV. Le indagini epidemiologiche negli altri tra Paesi nordici

confermano questa informazione (Hutin et al., 1999; Reid et al., 1987; Niu et al.,

1992).

Come le prove disponibili hanno stabilito che il consumo di frutti di bosco

congelati è il probabile dell'infezione, l'indagine in corso è ora volta a identificare

il tipo e la marca di frutti di bosco responsabili per l'epidemia.

Nell'epidemia sono implicate tre sequenze di genotipo IB di HAV con una

massima differenza del 2%, corrispondente a una differenza di pochi nucleotidi.

Una possibile spiegazione di questo è che i frutti di bosco sono stati contaminati

con diversi ceppi strettamente correlati. Mentre le epidemie da infezioni di HAV

sono spesso causate da un singolo genotipo e sequenza virale (Schwarz et al.,

2008), le epidemie di origine alimentare causate da molteplici ceppi HAV

(Fournet et al., 2011; Carvalho et al., 2011), a causa di alimenti importati da

regioni endemiche (Nygard et al., 2001; Pebody et al., 1998).

Peraltro, data la lunga durata di conservazione dei prodotti surgelati, il lungo

periodo di incubazione del virus dell'epatite A da 28 ai 30 giorni (range: 15-50

giorni) (Heymann, 2008) e il potenziale ritardo nelle comunicazioni,

probabilmente più casi saranno comunicati nei quattro Paesi.

Per questo l'11 Aprile, le autorità alimentari in Danimarca, Finlandia e Svezia

hanno emesso la raccomandazione di, prima di consumarli, trattare termicamente

tutti i frutti di bosco congelati o di origine non domestica. Il 12 Aprile, il

Norwegian Food Authorities e il Norwegian Institute of Public Health hanno

42

informato la popolazione che, per ridurre il rischio di contrarre HAV attraverso i

frutti di bosco congelati importati, è sufficiente bollire i frutti di bosco prima di

mangiarli. Il 16 Aprile 2013, l'European Centre for Disease Prevention and

Control (ECDC) ha pubblicato una rapida valutazione dell'epidemia, informando

gli altri Paesi europei, oltre alla Commissione Europea (EFSA-ECDC, 2013).

43

6 - HEPATITIS E VIRUS

Il virus dell'epatite E è un'importante causa di morbilità nei Paesi in via di sviluppo

(Teshale et al., 2010) e recentemente è stato riscontrato in molti Paesi industrializzati.

Questo virus dovrebbe essere preso in considerazione nei casi di epatite acuta,

soprattutto nei viaggiatori che ritornano a casa (Meng et al., 2011). Non essendo

argomento specifico della tesi, verrà data solo un breve inquadramento, con particolare

attenzione alla trasmissione alimentare.


HEV è un virus di RNA a singolo filamento della famiglia Herpesveridae, senza

envelope, con delle dimensioni tra i 27 e i 34 nm (Panda et al., 2013; Kamar et al.,

2012). Sono stati descritti quattro genotipi: i genotipi 1 e 2 sono stati trovati unicamente

negli umani e sono associati con i focolai epidemici in Africa, Asia e Messico

(Aggarwal, 2013; Kmush et al., 2013), mentre i genotipi 3 e 4 sono coinvolti con casi

sporadici e sono stati trovati sia negli umani che negli animali, oltre che in Asia (Banks

et al., 2004).


Il virus HEV viene trasmesso primariamente per via oro-fecale ed è globalmente la più

comune causa di epatite virale acuta (AVH). Il contagio è seguito da un periodo di

incubazione variabile, tra le 2 e le 8 settimane. Causa epidemie di AVH su larga scala

nei Paesi a basso e medio reddito in Asia e Africa, e provoca anche casi sporadici nelle

stesse regioni (Purcell et al., 2008).

Una percentuale significativa di individui sani nei Paesi industrializzati è sieropositiva

per HEV, e un'alta diffusione di anticorpi anti-HEV di più del 20% è stata segnalata in

alcune aree degli USA (Kuniholm et al., 2009). Sono stati individuati anticorpi anti-

HEV su molte specie animali, e HEV RNA è stato isolato da suini domestici e animali

selvatici (cinghiali, cervi e manguste). HEV è il solo virus che da un'epatite che infetta

45

gli animali oltre che i primati (Pavio et al., 2010), però non è una causa di malattia nei

suini. Un'indagine sui macelli suini sarà intrapresa nei primi mesi del 2013 per meglio

comprendere il possibile ruolo dell'infezione nei suini sull'incidenza della malattia negli

esseri umani. (Zoonoses Report UK, 2012)

In Gran Bretagna, il 9% dei casi diagnosticati tra il 1996 e il 2003 era in pazienti che

non avevano viaggiato nella fase precedente alla malattia, con la possibilità che fossero

collegati a reservoir di HEV in suini e, forse, altri animali (Meng, 2011). Nel 2003 i casi

di zoonosi umana confermati in laboratorio erano 129 (di cui 124 solo in Inghilterra e

Galles) (Zoonoses Report UK, 2012). Negli ultimi anni i casi da HEV sono

significativamente aumentati ed è sempre di più riconosciuto come una delle principali

zoonosi. C'erano 657 casi (di cui 579 sono in Inghilterra e Galles) riportati in Gran

Bretagna nel 2012, un aumento del 39% dal 2011. I casi autoctoni oggi rappresentano la

maggior parte dei casi in Inghilterra e Galles e questa sembra essere la principale

ragione dell'aumento recente. Più del 50% dei casi sono uomini con più di 50 anni, con

nessun raggruppamento geografico. Gli studi hanno dimostrato che i casi non legati a

viaggi sono contagiati dal genotipo 3 di HEV, simile a quello trasmesso dai suini

britannici (Zoonoses Report UK, 2012).

Il periodo di infettività è sconosciuto e delle buone misure generali di igiene sono

fondamentali per limitare la diffusione. L'isolamento non è stato indicato visto che la

diffusione da persona a persona non è stata riportata. Le epidemie sono più frequenti in

Paesi in via di sviluppo con scarsa igiene e tendono a seguire i Monsoni o i disastri

naturali dove l'igiene è ulteriormente compromessa. Il consiglio ai viaggiatori è di usare

le precauzioni standard per l'igiene degli alimenti. Non ci sono vaccini autorizzati.

Nelle Paesi industrializzati, anche se l'incidenza clinica di epatite E nelle persone è

bassa, la sieroprevalenza di anticorpi anti-HEV è relativamente alta, il che sta a

segnalare un'alta percentuale di malattia subclinica e/o sottodiagnosticata. Una piccola

percentuale di esposizione all'HEV è probabilmente il risultato di viaggi in regioni

endemiche o migrazioni da queste aree (Zhu FC et al., 2010).

46


L'epatite virale acuta causata da HEV è solitamente una malattia acuta, autolimitante,

simile nella sintomatologia clinica manifestata all'epatite virale acuta causata da HAV.

Tuttavia, in due situazioni può causare grave malattia che può portare ad un'alta

mortalità: quando l'epatite virale acuta si presenta in donne incinte può portare a un

rapido peggioramento come l'insufficienza epatica acuta (Shalimar et al., 2013), e

quando avviene in pazienti con malattia epatica cronica che può peggiorare in una

insufficienza epatica acuta su epatopatia cronica (ACLF) (Jalan et al., 2012).

I sintomi e i segni non sono specifici e sono tipici di altre epatiti virali con ittero,

sofferenza e dolorabilità addominale, febbre, nausea e vomito. C'è una grande gamma di

gravità che include insufficienza epatica acuta, con una mortalità fino al 4% nella

popolazione generale e arriva al 20% nelle donne in gravidanza al terzo trimestre.

Le particelle virali possono essere trovate nella bile e nelle feci per circa 2 settimane

dopo la comparsa dei sintomi, ed è stato segnalato anche a 52 giorni. L'RNA virale

viene individuato usando la PCR per circa 4 settimane dopo la comparsa della

sintomatologia e, anche se uno stato realmente cronico non esiste, può essere riscontrato

dopo 16 settimane dai primi sintomi (Alazawi et al., 2011).

Non c'è una terapia ottimale per le infezioni acute da HEV, ma la Ribavirina può avere

qualche efficacia (Kamar et al., 2013). L'interferone peghilato è stato usato con

successo nel trattamento di epatite E cronica (Kamar et al., 2010).

6.4 - HEV negli alimenti

Nelle regioni dove l'infezione è endemica, la principale via di trasmissione del virus di

epatite E è attraverso il consumo di acqua o cibo contaminato. Invece, nelle aree non

endemiche, casi sporadici di epatite E acuta negli esseri umani sono ricondotti all'aver

consumato carne contaminata di cinghiale e cervo cruda o poco cotta (Masuda et al.,

2005; Tei et al., 2003). Per di più, in diversi Paesi, tra il 2 e l'11% dei fegati suini nel

negozio o nei macelli sono contaminati da HEV, e alcuni contengono particelle infettive

(Bouwknegt et al., 2007; Feagins et al., 2007; Rose N et al., 2013; Wenzel et al., 2011).

47

In Giappone, è stata dimostrata la trasmissione con gli alimenti attraverso il consumo di

carni di cervi Sika ( Cervus nippon), cinghiali selvatici, e suini (Tei S et al., 2003). La

scoperta di HEV in fegati suini nella vendita al dettaglio è stata provata in Giappone

(1,9%), Usa (14%) e Olanda (6,5%) (Bouwknegt et al., 2007; Feagins et al., 2007). La

PCR ha indicato che 1 su 76 (1,3%) dei fegati suini presi nei negozi al dettaglio nella

parte sudoccidentale dell'Inghilterra erano positivi all'HEV (Banks et al., 2010).

Uno studio ha dimostrato che in Gran Bretagna il 10% dei campioni di salsicce con

carne di maiale nei punti di vendita al dettaglio erano positive al virus, e simili riscontri

sono stati affermati da altri laboratori europei (Berto et al., 2009; Di Bartolo et al.,

2012).

La malattia di origine alimentare è stata associata al consumo di fegato suino e tessuto

muscolare suino. Tra Settembre 2009 e Ottobre 2010, Berto e collaboratori hanno

raccolto campioni da suini macellati, mani delle persone, e i punti critici per la

contaminazione del virus nel macello di suini, impianto di trasformazione, e tre punti di

vendita al dettaglio. Al macello sono risultati positivi a HEV 5 (13%) dei 40 campioni di

feci, 1 (3%) di 40 fegati, e 1 (25%) di 4 tamponi su mani dei lavoratori. All'impianto di

trasformazione, ognuno dei 40 campioni di muscolo suino era negativo per HEV, e un

tampone superficiale da una punta metallica usata per agganciare le carcasse era

positiva. Al punto vendita, 6 (10%) di 63 salsicce e 2 (25%) di 8 campioni superficiali

(coltello e affettatrice) erano positive. Il loro studio ha dimostrato che in Gran Bretagna,

i prodotti di carne suina con grande quantità di consumo a livello nazionale potrebbe

essere positivo all'HEV. Non c'erano prove di contaminazione fecale umana nei punti

della catena di lavorazione, che sta a significare come gli standard di igiene del

personale fossero alti e che fosse improbabile che il virus trovato derivasse dalla

contaminazione umana dei campioni (Berto et al., 2012).

Più recentemente, in Francia, diversi casi di epatite E sono stati collegati al consumo di

salsicce fatte da fegato di maiale (Berto et al., 2013).

Il potenziale zoonosico è stato confermato usando i modelli animali. Il genotipo 3 di

HEV, isolato dal suino, può superare la barriera di specie e infettare i primati dopo

inoculo sperimentale (Meng et al., 2011).

48

Durante l'infezione da HEV nel suino, il virus replica all'interno degli epatociti, che si

traduce in un alto titolo di HEV nella bile; il virus poi viene perso nelle feci. Quindi, i

prodotti alimentari contenenti fegato infetto sono internamente contaminati e non sono

contaminati solo sulla superficie (Bernaud et al., 2012).

6.5 - Trattamento termico

Da quando HEV è stato associato con il consumo di prodotti fatti con suino crudo, è

importante determinare se riscaldare il prodotto sarebbe un metodo efficace per

inattivare il virus e ridurre il rischio di esposizione a HEV. Come osservato per altri

virus trasmessi attraverso gli alimenti come HAV (Croci et al., 1999), il grasso ha un

ruolo protettivo e probabilmente contribuisce alla stabilità di HEV al calore. Quindi, la

composizione dell'alimento e in particolare la percentuale di grasso sono importanti nel

determinare la temperatura e il tempo di trattamento per inattivare HEV (Bernaud et al.,

2012).

Pochi dati sono disponibili sulla resistenza del virus al trattamento termico. I due studi

disponibili sull'inattivazione termica di HEV hanno usato differenti modelli in vitro o in

vivo. Il primo studio era basato sul riscaldamento a una temperatura tra i 45 e i 70°C di

una sospensione fecale contenente i genotipi 1 e 2 di HEV e l'inoculo in una coltura

cellulare tollerante all'HEV (Emerson et al., 2005). Il secondo studio ha usato suini in

cui è stato inoculato un omogeneizzato di fegato suino contenente il genotipo 3 di HEV

riscaldato a 56°C friggendolo o bollendolo (Feagins et al., 2008). Entrambi gli studi

mostrano che è più probabile che HEV resista a un riscaldamento fino a 56°C ed è

inattivato a temperature più grandi di 71°C.

L'inoculo di suini con differenti preparazioni ha dimostrato che solo un trattamento

termico di 70°C per 20 min. porta alla mancanza di infezione da HEV negli animali

inoculati (Bernaud et al., 2012).

Possiamo concludere dicendo che i prodotti dovrebbero consumati dopo che sono stati

cotti per almeno 20 minuti a un temperatura al cuore del prodotto di 71°C.

49

7 - CONCLUSIONILe conclusioni che possiamo trarre da questa rassegna critica si possono così

sintetizzare:

• i virus agenti di malattia alimentare umana (o i loro “surrogati” non patogeni)

hanno una resistenza termica variabile da un ceppo all’altro,

• i dati riscontrati con prove sperimentali più o meno precise e appropriate portano

a concludere che oltre i 65°C si ottiene un’efficace inattivazione dei virus nel

giro di 30 minuti,

• la composizione della matrice alimentare o del substrato nel quale i virus sono

immersi incide in modo decisivo sulla resistenza termica dei virus,

• il tenore di lipidi della matrice è decisivo per aumentare la resistenza termica dei

virus perché i grassi proteggono i virus dall’azione inattivante del calore.

Anche le indagini sperimentali condotte sui prodotti refrigerati (sia di origine animale

sia di origine vegetale) hanno permesso di accertare che i virus possono persistere in

numero considerevole sui prodotti nell’arco della loro vita commerciale se i prodotti

sono conservati solo con l’impiego delle temperature di refrigerazione.

Inoltre i virus enterici quali Norovirus e virus dell’epatite infettiva A potranno

verosimilmente sopravvivere all’acidificazione o ai processi di fermentazione

microbica come trattamento. La resistenza all’acido di questi virus potrebbe spiegare la

loro associazione con frutta e altri vegetali implicati nei focolai di malattia alimentare

per es. da fragole (Cotterelle et al., 2005; Hjertqvist et al., 2006).

Tutti questi studi hanno evidenziato che anche il congelamento non assicura

un’adeguata riduzione decimale della carica virale iniziale di un alimento, il che

coincide con quanto sappiamo per i batteri, i lieviti e le muffe. Possiamo, quindi,

affermare che il trattamento di congelamento così come è fatto oggi (a bassissime

temperatura di -40°C e anche inferiori) blocca l’attività metabolica dei microrganismi,

ma non ne inattiva più di tanto la sopravvivenza e, nel caso dei virus, l’infettività.

L'unico metodo attualmente efficace nel settore alimentare resta il trattamento termico

superiore ai 70°C.

Le recenti epidemie di HAV e Norovirus nei Paesi europei ha dimostrato come questi

51

patogeni saranno sempre più presenti nel commercio internazionale e che nessun Paese

potrà essere considerato indenne. Molte volte i casi di gastroenteriti infettive restano

però non diagnosticati o non riportati, quindi il numero potrebbe crescere

esponenzialmente nei prossimi anni con la maggiore consapevolezza della popolazione.

Le norme di igiene nella manipolazione, nel trasporto e nel consumo degli alimenti

saranno sempre di più il cardine della prevenzione di queste epidemie. Nel 2012 il

Codex Alimentarius Comittee ha pubblicato delle linee guida sull'applicazione di

principi generale di igiene alimentare sul controllo dei virus negli alimenti includendo i

frutti di bosco. Gli operatori di commercio alimentare devono essere consapevoli del

rischio di contaminazione degli alimenti. La contaminazione virale può, in genere,

essere prevenuta dalla applicazione adeguata di principi di igiene a tutte le fasi della

produzione.

L'aumento delle dimensioni di un lotto di prodotti freschi, ristoratori operativi a livello

nazionale e la globalizzazione della produzione primaria richiedono nuovi strumenti per

affrontare la sicurezza alimentare. Ci deve essere una maggior focalizzazione sulle

condizioni locali della produzione primaria nei Paesi di origine, specialmente nelle

regione dove è limitata la disponibilità di acqua pulita.

I Norovirus, i virus dell'epatite A e, ora, i virus dell'epatite E causano spesso patologie

asintomatiche ma non devono essere in alcun modo sottovalutati, visto che potrebbero

essere causa di zoonosi pandemiche e causare problemi di ordine mondiale,

specialmente in caso di comparsa di varianti genomiche ad alta virulenza, date dalla

commistione genomica di ceppi virali di origine umana e animale.

52

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http://www.cdc.gov/foodborneburden/estimates-overview.html

9 - RINGRAZIAMENTI

Ringrazio il mio relatore, Prof. Valerio Giaccone, che mi ha sempre seguito e sostenuto

nel mio lavoro, rendendosi disponibile a qualsiasi ora, compresi i week-end. La sua

grande pazienza e i suoi preziosi consigli hanno reso il mio lavoro ancora più

interessante e stimolante.

Un infinito grazie lo voglio dare ai miei genitori, Marinella e Bruno. Solo con il loro

sostegno e aiuto sono riuscito in questo compito. Non smetterò mai di ringraziarli.

Un ringraziamento anche ai miei amici, ai miei parenti e a tutti quelli che mi hanno

sostenuto e aiutato. Questo lavoro è merito anche vostro.

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