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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA

FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN MEDICINA VETERINARIA

DIPARTIMENTO DI PRODUZIONI ANIMALI, BIOTECNOLOGIE

VETERINARIE, QUALITÀ E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI

SEZIONE DI BIOCHIMICA VETERINARIA

NEOSPORA CANINUM:

STUDIO DELLA TRASMISSIONE VERTICALE NELLA

VACCA DA LATTE

NEOSPORA CANINUM:

STUDY OF A VERTICAL TRANSMISSION IN DAM

Relatore:

Chiar.ma Prof.ssa LAURA HELEN KRAMER

Correlatore:

Prof.ssa SILVIA CLOTILDE CABASSI

Laureanda:

ELISA VALERUZ

ANNO ACCADEMICO 2006-2007

- 2 -

A Dana

Kalikos e Micia.

Per il loro amore.

- 3 -

Ringraziamenti

I miei primissimi ringraziamenti vanno sicuramente alla Prof.ssa Laura Helen Kramer per

l’infinità disponibilità e l’inimitabile professionalità. È solo grazie hai suoi preziosi consigli

che questa tesi è diventata realtà. Un grazie anche alla prof.ssa Silvia Clotilde Cabassi, a

Francesca Ghedini e Chiara Piancastelli (Istituto di Malattie Infettive) per la disponibilità e

per il meticoloso lavoro svolto.

Un grazie di cuore ad Antonio Olivieri e alla sua stupenda famiglia, per avermi permesso di

approfondire il grande mondo della Neosporosi. Un grazie anche a tutti i loro animali, che

hanno dovuto sopportarmi in ogni mio “prelievo”!

Un ringraziamento affettuoso va sicuramente a tutta la mia famiglia. A mamma Margherita,

a papà Eugenio e ai miei piccoli grandi fratelli, Giacomo e Gianmatteo. Il loro

incoraggiamento ed ammirazione sono stati la forza che mi ha permesso di giungere fino a

qui. A mio marito Sandro ed alla nostra splendida bimba Mariavittoria per la pazienza, la

fiducia, la grinta e l’amore che ogni giorno mi avete donato (ossigeno per il mio cuore e la

mia mente!). Sono orgogliosa di voi!

A Bruno ed Idelma per la stima e l’affetto.

Ai miei nonni che da lassù mi vegliano.

Un grazie a tutti i medici veterinari (ormai colleghi!) che mi hanno seguita, aiutata e spinta

al raggiungimento del mio obiettivo; in particolare il prof. Enrico Parmigiani, il dott.

Valentini, il dott. Pretto, il dott. Buniotto, il dott. Brisighella, il dott. Alborali, il dott.

Fiocco, il dott. Fanini e il sign. Gabriele Vallani. Grazie infinite per i vostri preziosi

insegnamenti.

Ed infine, ma non per ultimi, un grazie di cuore a tutti i miei amici di Parma e Verona. Ad

Alessia, Alice, Chiara e Sara, per avermi sempre rallegrata nei giorni più tristi, dove tutto

sembrava perduto; a Nadia, per le sue preziose traduzioni.

Grazie infinite a tutti!!

- 4 -

Abstract

Neospora caninum is a protozoan parasite that has been identified as a major

cause of abortion in dairy and beef cattle. Vertical transmission from mother

to fetus is an important mode of maintaining the parasite within a herd.

This thesis is aimed at evaluating the frequency of vertical transmission of N.

caninum in an Italian dairy herd. Pre-colostral serology in calves showed

100% efficiency in transplacental infection from N. caninum-positive cows.

These results confirm those of others and indicate that control and

management of N. caninum infection must take into account the high

frequency of vertical transmission.

- 5 -

INDICE

Abbreviazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Introduzione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

PARTE GENERALE

1111 Caratteristiche generali di Neospora Caninum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15

� Tassonomia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

� Caratteristiche morfologiche e differenziali di N. Caninum. . . . . . . . 20

� Stadi morfologici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

• Stadio di tachizoita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

• Stadio di bradizoita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

• Stadio di oocista. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2222 Ciclo vitale di Neospora Caninum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

� Ospite intermedio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

� Ospite definitivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

� Ciclo domestico e ciclo selvatico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3333 Epidemiologia: trasmissione di N. caninum nella vacca da latte. . . . . . 46

� Trasmissione orizzontale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

� Trasmissione verticale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

� Altre fonti di trasmissione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

- 6 -

4444 Patogenesi e sintomatologia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

� Aborto nella bovina: modelli epidemiologici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

• Aborto endemico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

• Aborto epidemico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

� Sintomatologia nel vitello. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

5555 Tecniche diagnostiche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

� DIAGNOSI DIRETTA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

• Esame istologico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

• Immunoistochimica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

• Cultura cellulare e inoculo in animali di laboratorio. . . . . . . . . 64

• Biologia molecolare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

� DIAGNOSI INDIRETTA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

• Risposta anticorpale nel bovino. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

• Test sierologici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

1. IFAT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

2. ELISA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

3. Avidity test. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

4. Immunocromatografia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

6666 Terapia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

7777 Profilassi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

� Igienico-sanitaria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

� Immunizzante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

- 7 -

PARTE SPERIMENTALE

Scopo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

MATERIALI E METODI:

� Allevamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

� Animali. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

� Esami sierologici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

• IFAT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

• ELISA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

� Risultati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

Discussione dei risultati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .104

Conclusioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Bibliografia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

Siti internet. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

- 8 -

ABBREVIAZIONI

H. hammondi Hammondia hammondi

H. heydorni Hammondia heydorni

N. caninum Neospora caninum

N. hughesi Neospora hughesi

S. neurona Sarcocystis neurona

T. gondii Toxoplasma gondii

Ac Anticorpo

Ac-PC Antibody-Peroxidase Coniugate

Ag Antigene

BVDV Bovine Viral Diarrhoea Virus

CI-ELISA Competitive Inhibition Enzyme-linked Immunosorbent Assay

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

EPM equine protozoal myeloencephalitis

ICT Immunochromatographic test

IFAT indirect fluorescent antibody test (immunofluorescenza indiretta)

Ig immunoglobulina

Iscom immunostimulating complex

LEB Leukosis Enzootic Bovine

LT Linfocita T

LTC Linfocita T-citotossico

MAb monoclonal antibody

Nc Neospora caninum

Nh Neospora hughesi

pc plasmide combination

PCR polymerase chain reaction

PBS Phosphate Buffered Solution

SAG surface antigen

SRS surface-antigen related sequenze

- 9 -

INTRODUZIONE

Neospora caninum, è un parassita protozooario strettamente correlato con

Toxoplasma gondii, responsabile di aborto nella bovina e di patologie nervose

nei vitelli.

È stato isolato per la prima volta nel 1984 in Norvegia in cani colpiti da

encefalite e miosite (Bjerkås, Mohn, Presthus, 1984); successivamente, nel

1988, questa ed altre segnalazioni vennero identificate come causate da un

unico agente eziologico, denominato appunto come Neospora caninum

(Thilsted et al., 1989; Dubey et al., 1988).

Da alcuni studi epidemiologici si ritiene che N. caninum, in alcune zone come

ad esempio la California, l’Australia, la Nuova Zelanda, l’Olanda, il Regno

Unito, rappresenta dal 20% al 43% di tutte le cause di aborto (Pfeiffer et al.,

1997; Dubey et al., 1999); l’infezione potrebbe coinvolgere oltre il 20% degli

allevamenti. È stata descritta come importante causa di aborto perfino nelle

regioni della Scandinavia (Petersen et al.,1999) (Fig. 1).

I danni economici sono legati sostanzialmente all’aborto che avviene

generalmente tra il IV ed il VII mese di gestazione con la conseguente perdita

del vitello e mancata produzione lattea, nonché i conseguenti costi veterinari;

- 10 -

è stata osservata anche una diminuzione del 5% della produzione di latte

durante la prima lattazione nelle bovine infette che non hanno abortito (French

et al., 1999).

Inoltre si hanno sicuramente costi legati alla diagnosi, al ripristino della

riproduttività degli animali, che comprende inseminazione artificiale,

l’acquisto di animali per la rimonta, se necessario, e, infine, il costo per

l’eventuale eliminazione di bovini sieropositivi e per l’acquisto di animali

sieronegativi (Dubey et al., 2003).

Fig. 1. Distribuzione geografica dei diversi casi di Neosporosi riscontrati sino ad oggi. (Marquer et al., 1999)

- 11 -

Per quanto concerne una classifica dei costi, la Neosporosi, si pone

immediatamente dopo l’infezione da virus della diarrea virale bovina

(BVDV), ma prima della paratubercolosi e della leucosi bovina enzootica (Chi

et al., 2002).

Sporadicamente, nei vitelli possono manifestarsi, alla nascita, turbe di tipo

neurologico con incoordinazione dei movimenti e paralisi degli arti.

Oltre che nel bovino, l’esistenza di infezioni da N. caninum è stata individuata

in numerose altre specie animali, quali cane, pecora, capra, cavallo, cervo,

nonché in camelidi e mammiferi marini (Dubey et al., 2007).

Per quanto riguarda la situazione nel Nord Italia, N. caninum appare

ampiamente diffusa nell’allevamento della vacca da latte con danni ingenti

soprattutto negli allevamenti dove l’evento aborto assume un andamento

epidemico (gli autori anglosassoni utilizzano il termine “abortion storm” per

indicare appunto l’improvvisa insorgenza e l’intensità del fenomeno) (Dubey

et al., 1999; Yaeger et al., 2004;).

La via principale di trasmissione dell’infezione è quella verticale, tra madre e

feto, ma può verificarsi anche per via orizzontale attraverso l’ingestione da

parte del bovino di oocisti emesse con le feci da cani infetti.

- 12 -

È ancora in corso di accertamento l’eventuale trasmissione per via sessuale o

attraverso il latte (Anderson, Reynolds et al., 1997).

Il lavoro che ho effettuato ha avuto l’obiettivo di valutare la sieroprevalenza di

N. caninum nel sangue precolostrale di vitelli nati nell’arco di 15 mesi (03/04-

06/05) in un allevamento nel veronese, nel quale è stata più volte riscontrata la

presenza di N. caninum come causa dominante di aborto.

L’obiettivo è stato quindi di confermare ulteriormente come N. caninum venga

trasmessa direttamente dalla madre infetta al prodotto del concepimento

durante la vita intrauterina (trasmissione verticale), e come questo importante

evento possa venir evidenziato attraverso la rilevazione di anticorpi contro N.

caninum effettuata sul sangue del vitello, ancora prima che questo abbia

assunto colostro dalla madre (prelievo precolostrale).

L’eventuale riscontro di sieropositivà nel vitello in esame, deriva quindi da

un’attivazione dell’immunità attiva umorale dello stesso vitello, dovuta al

passaggio transplacentare dei tachizoiti, e non dall’immunità passiva

colostrale eventualmente appresa dalla madre sieropositiva.

- 13 -

La tesi è stata suddivisa in due parti:

• Nella prima, di carattere generale, dopo una descrizione delle

caratteristiche di N. caninum e del suo ciclo vitale, prendo in

considerazione l’epidemiologia, la patogenesi e la sintomatologia della

Neosporosi nella vacca da latte, nonché le tecniche diagnostiche più

utilizzate e quelle ancora in via di sperimentazione ed infine i sistemi di

terapia e profilassi che possono venir adottati all’interno di un

allevamento;

• nella seconda parte, di carattere sperimentale, descrivo i risultati

sierologici ottenuti con la ricerca di anticorpi contro N. caninum

attraverso metodica IFAT ed ELISA su un campione di 106 vacche da

latte e sui propri vitelli nati nell’arco dei 15 mesi, mettendo in evidenza

la trasmissione verticale (trasmissione transplacentare) di N. caninum

tra le madri ed i rispettivi vitelli.

- 14 -

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- 15 -

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La Neosporosi bovina è una patologia a carattere abortigeno sostenuta da

Neospora caninum; è emersa in tutto il mondo come un’importante causa di

patologia riproduttiva che colpisce sia bovine da latte che da carne (Dubey et

al., 1996; Anderson et al., 2000).

Neospora caninum è un parassita intracellulare obbligato a prevalente

localizzazione intracitoplasmatica, correlato morfologicamente e

antigenicamente con Toxoplasma gondii.

- 16 -

� TASSONOMIA

Regno: Protista

Phylum: Apicomplexa

Classe: Sporozoa

Sottoclasse: Coccidia

Ordine: Eucoccidiorida

Sottordine: Eimeriorina

Famiglia: Sarcocystiidae

Genere: Neospora

Specie: Caninum

- 17 -

- 18 -

La prima descrizione di Neospora caninum risale al 1984, in Norvegia, dove

Bjerkås et al. (1991) isolarono un parassita strutturalmente assimilabile a

Toxoplasma gondii, dal cervello (Fig. 2) e dal tessuto muscolare di cani affetti

da una forma clinica di encefalopatia, senza però che gli animali avessero

logicamente anticorpi contro T. gondii.

Nel 1988, in USA, si isolò un parassita di caratteristiche simili in 10 cani che

soffrivano di alterazioni neurologiche, dimostrando, con l'utilizzo di tecniche

sierologiche e immunoistochimiche, che si trattava di un parassita differente a

Toxoplasma gondii, e per questo venne dato il nome di Neospora caninum

(Dubey et al., 1988).

Attraverso studi biologici e molecolari è stata confermata l’esistenza di

un’ulteriore specie di Neospora, isolata esclusivamente negli equini, agente

eziologico di turbe a carattere neurologico (mieloencefalite equina; EPM).

Marsh et al. (1999) proposero il nome di Neospora Hughesi, parassita molto

simile strutturalmente a N. caninum, oltre che a Sarcocystis neurona, altri

agenti eziologici di EPM: la loro differenziazione da un punto di vista

Fig. 2. Encefalite di tipo non purulento da Neospora caninum nel cane. (freccia: cisti contenente bradizoiti).

- 19 -

sierologico è molto difficile, l’unico test con alta specificità e sensibilità

risulta essere solo la PCR (Fenger et al., 1997; Schock et al., 2001; Dubey et

al., 2003).

Solo poi con l’identificazione e la sequenziazione amminoacidica di

particolari antigeni di superficie comuni del genere Neospora, si è potuto

comprendere al meglio le differenze specifiche tra N. caninum e N. hughesi.

Esiste infatti, tra N. caninum (Nc) e N. hughesi (Nh), fino ad un 6% di

variabilità nella sequenza amminoacidica dell’antigene di superficie SAG1,

proteina antigenica di 29-36 kDa, localizzata solo sulla superficie dei

tachizoiti, con funzione di adsorbimento durante la penetrazione nella cellula

ospite, e fino ad un 9% di differenza tra le due sequenze amminoacidiche di

SRS2, un antigene di 35-43 kDa esposta sia sulla superficie di tachizoiti che

bradizoiti (Dubey et al., 2002).

I polimorfismi di questi geni e della loro struttura proteica offrono un’ulteriore

sistema di differenziazione per distinguere appunto N. caninum da N. hughesi

(Marsh et al., 1999).

- 20 -

� CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E

DIFFERENZIALI DI N. CANINUM

Recenti studi su N. caninum sono stati effettuati per dimostrare le differenze

strutturali e morfologiche con Hammondia heydorni, un’altro protozoo

intestinale del cane, causa di diarrea in animali immunodepressi; l’obiettivo

era quello di definire come i due parassiti fossero effettivamente due specie

differenti (Nishikawa et al., 2002).

È stato inoltre eseguito uno studio con l’utilizzo della PCR, alla quale segue

un’elettroforesi in gel di agarosio che, in caso di positività, permette di

evidenziare in maniera amplificata il frammento genomico specifico di N.

Caninum (Nc5) (Müller et al., 2001) (Fig. 3). Questa sequenza nucleotidica,

specifica del genoma di N. caninum NC-1, è stata però riscontrata anche in H.

Heydorni, quindi i due protozoi risulterebbero indistinguibili (Ellis et al.,

1999; Mugridge et al., 1999; Schares et al., 2002). Solo nel 2002, Dubey et al.,

attraverso una nuova descrizione morfologica, ultrastrutturale e genetica,

riconobbero i due protozoi come due generi e specie distinte.

Fig. 3. Elettroforesi su gel di agarosio dei frammenti Nc5-PCR amplificati di: 1) H. heydorni; 2) controllo positivo per N. caninum Nc-1; 3) controllo negativo privo di DNA. Le bande di migrazione misurano approssimativamente 337 bp (freccia).

- 21 -

Il problema epidemiologico e diagnostico permane ancora per quanto riguarda

le oocisti di Neospora caninum ritrovate nelle feci di cane, le quali al

microscopio risultano morfologicamente e strutturalmente identiche alle

oocisti di Hammondia heydorni rinvenute nelle feci di cane (McAllister et al.,

1998; Reichel et al., 2007) (Fig. 4).

Esistono strutturalmente e chimicamente molte analogie tra T. gondii e N.

caninum, sostenute da diverse specifiche ricerche.

Xiao-lin, Grigg et al. (2002) rilevarono come la superficie di Toxoplasma

gondii fosse rivestita da glicosilfosfatidilinositolo, una peculiare proteina di

superficie (SRS), di cui SAG1 ne è il prototipo (dimensioni 1.7 Å). Le

proteine SRS hanno la funzione di regolare la virulenza del parassita stesso, in

quanto modulano il meccanismo dell'adsorbimento a livello di cellule

bersaglio: questo è sicuramente un parametro del successo della capacità

infettante di T. gondii.

Toxoplasma utilizza un vasto repertorio di proteine di superficie d’adesione

per penetrare nelle cellule bersaglio, responsabili anche dell’attivazione della

risposta immunitaria dell’ospite.

Fig. 4. Oocisti di Neospora caninum (sinistra) ed Hammondia heydorni (destra).

- 22 -

Oggigiorno si pensa che la famiglia proteica SRS funzioni come un set di

recettori capace di dar luogo ad una cascata di interazioni che permettono

appunto l’entrata del parassita nelle cellule bersaglio. Ad esempio, durante la

malattia acuta, SAG1 e SAG2 sono immunodominanti all'interno della

superfamiglia SRS, e in particolare SAG1 ha un ruolo critico per quanto

concerne la risposta immunitaria osservata durante le fasi iniziali di infezione.

SAG1 probabilmente ha addirittura un duplice ruolo, ossia di adesina e di

target per la risposta immunitaria.

Fig. 5. Allineamento delle sequenze della superfamiglia SRS (glicosilfosfatidilinositolo: antigene di 35-43 kDa). Differenze nella sequenza tra quello di Neospora caninum (NcSAG1; seconda riga) e gli altri geni che appartengono a Toxoplasma gondii. ROSSO: cisteina, legami disolfuro; GIALLO: parti di sequenze geniche maggiormente simili tra N. caninum e T. gondii.

- 23 -

Questo è avvalorato dal fatto che i bradizoiti di T. gondii, nei quali manca

naturalmente SAG1, non vengono attaccati dal sistema immunitario

dell’ospite e riescono così a persistere indisturbati all’interno delle cisti

tessutali nei quali sono contenuti.

Per il rilevamento di queste particolari proteine sono stati messi a punto degli

anticorpi marcati (mAb) che riconoscono nello specifico un epitopo di 36 kDa,

chiamato appunto P36 (Tomavo et al., 1991). Da allora mAb-P36 è usato

come marker per la ricerca di bradizoiti di Toxoplasma gondii e nello

specifico per la diagnosi differenziale da Neospora caninum, tra le quali

strutturalmente vi sono numerose proteine di superficie simili (Chahan et al.,

2003) (Fig. 5).

- 24 -

� STADI MORFOLOGICI

Gli Apicomplexa costituiscono un Phylum di protozoi che include alcune

migliaia di specie, caratterizzate dall’assenza di organi di movimento (ciglia o

flagelli). Il ciclo di riproduzione di questi parassiti è costituito dall’alternanza

di una fase asessuata (schizogonia) e una fase sessuata (gametogonia) che

porta alla formazione di forme infettanti dette sporozoiti (Fig. 6).

Sono aploidi durante tutto il ciclo vitale, salvo che nella fase di zigote, che

comunque è di brevissima durata.

N. caninum si presenta in vari stadi evolutivi:

1. stadio di tachizoita;

2. stadio di bradizoita;

3. stadio di oocista.

Fig. 6. Struttura generale di tachizoita e ciclo generale del Phylum Apicomplexa.

- 25 -

• STADIO DI TACHIZOITA

I tachizoiti sono di forma allungata o a semiluna, di dimensioni variabili dai 3

ai 7 µm per 1-5 µm (Dubey e Lindsay, 1988) (Fig. 7 e 10).

In questo stadio evolutivo di tipo asessuato il parassita è nettamente infettante,

si moltiplica rapidamente e quindi invade molti distretti e tessuti

dell’organismo dell’ospite intermedio.

Questo fenomeno prende il nome di

endodiogenesi e porta alla

formazione di due zoiti; consiste

sostanzialmente in un processo di

gemmazione interna (budding

process) col quale si formano appunto

2 cellule figlie (zoiti) all’interno della

cellula madre (Dubey e Lindsay,

1996).

I tachizoiti di N. caninum sono stati rinvenuti

in molte cellule tra le quali: neuroni,

macrofagi, miociti, epatociti, fibroblasti,

fibrocellule muscolari, nelle cellule degli

endoteli vasali e nell’epitelio tubulare renale

(Dubey e Lindsay, 1999); inoltre hanno la

capacità di attraversare la barriera placentare

ed essere così un’importante causa di

infezione del prodotto del concepimento.

Fig. 8. Vacuolo parassitofori (freccia) con tachizoiti di N.

caninum.

Fig. 7. Rappresentazione schematica di tachizoiti di N. caninum all’interno di una cellula ospite.

- 26 -

Il parassita può essere libero nel citoplasma o all’interno di vacuoli

parassitofori che possono essere anche più di uno in una cellula (Dubey e

Lindsay, 1996) (Fig. 8).

Una cellula può contenere anche fino a 100 tachizoiti e la penetrazione del

tachizoita nella cellula avviene in tempi molto ristretti (Dubey et al., 1996).

La struttura microscopica del tachizoita è caratterizzata da:

o nucleo;

o nucleolo;

o un complesso apicale costituito da:

� 2 anelli polari;

� rhoptrie;

� moltissimi micronemi (circa 150);

� il conoide;

o pochissimi granuli di aminopectina (granuli densi);

o 22 microtubuli sottopellicolari;

o un mitocondrio;

o apicoplasto;

o il plasmalemma;

o il reticolo endoplasmatico denso;

o apparato di Golgi (Dubey et al., 1988; Dubey e Lindsay, 1996).

- 27 -

Nel processo di invasione della cellula ospite, svolge un ruolo fondamentale il

complesso apicale, un insieme di strutture citoscheletriche e vescicolari

presente in tutti gli stadi invasivi degli Apicomplexa.

La componente citoscheletrica è costituita dal conoide, che è in grado di

estroflettersi durante l’invasione, mentre la componente vescicolare è

costituita dai micronemi e dalle rhoptrie, organelli che secernono il proprio

contenuto apicalmente.

Le rhoptrie sono strutture elettrondense quindi particolarmente visibili, anche

per le loro dimensioni decisamente superiori a quelle di altre strutture interne

del tachizoita (Dubey et al., 2002) (Fig. 9).

Il processo di invasione richiede 15-20 secondi, culminando nella formazione

di un vacuolo parassitoforo all’interno del quale il parassita si moltiplica.

Fig. 9. Struttura schematica di un tachizoite del phylum Apicomplexa (foto sopra). A sinistra la stessa cellula ripresa al microscopio elettronico a trasmissione (C= conoide; DG= granuli densi; MN= micronemi; N= nucleo; R= rhoptrie; barra=1 µm)

- 28 -

I micronemi contengono un corredo di proteine adesive le quali, esposte sulla

superficie del tachizoita (SAG1, MIC1, MIC4), contribuiscono alla

formazione della cosiddetta “giunzione mobile”.

Questa struttura, che crea un contatto tra la membrana di N. caninum e quella

della cellula ospite, dipende dall’interazione specifica tra domini adesivi delle

proteine dei micronemi e ligandi espressi sulla membrana della cellula

bersaglio. La secrezione del contenuto dei micronemi è un processo stimolato

dalla mobilizzazione delle riserve di Ca++ intracellulare del parassita, con

conseguente aumento della concentrazione intracellulare di questo ione.

Successivamente ai micronemi, sono le rhoptrie a rilasciare il proprio

contenuto di proteine (ROP2), per lo più coinvolte nella modificazione del

vacuolo parassitofori.

L’apicoplasto, infine, è un organello da molti considerato come una traccia di

un rapporto simbiotico mutualistico atavico tra i parassiti del Phylum

Apicomplexa e un’alga. Non

si conosce ancora del tutto la

sua funzione ma molto

probabilmente ha un ruolo

fondamentale nel

metabolismo del parassita

(Ajioka et al., 2001).

Fig. 10. Tachizoiti di N. caninum al microscopio elettronico (x7500).

- 29 -

• STADIO DI BRADIZOITA

Sono la forma latente del parassita e ne permette la notevole e durevole

resistenza nell’ospite intermedio.

Si localizzano all’interno di cisti tissutali, le quali si rinvengono soprattutto a

livello di sistema nervoso centrale (cervello, midollo spinale, nervi periferici)

e di retina (Dubey et al., 1988) (Fig. 11).

Una singola eccezione riguarda una cisti solitaria rinvenuta nel muscolo

oculare di un puledro (Lindsay et al., 1998). Più recentemente, cisti contenenti

bradizoiti sono state osservate anche a livello di muscolo in alcuni bovini

(Peters et al., 2001).

Le cisti tissutali di N. caninum possono raggiungere un diametro di 107 µm e

possono essere di forma ovale o rotonda (Dubey e Lindsay, 1996) e contenere

dai 20 ai 100 bradizoiti (Speer et al., 1999); lo spessore della parete può

variare dai 0,5 ai 4 µm: lo spessore varia in base all’età della cisti stessa

(Speer et al., 1999).

Fig. 11. Cisti tissutali contenenti bradizoiti.

- 30 -

Mediante l’uso dell’esame immunoistochimico e del microscopio è possibile

distinguere i bradizoiti di Neospora caninum dai tachizoiti (Peters et al.,

2001). Infatti i bradizoiti presentano un numero minore di rhoptrie e un

numero maggiore di granuli PAS-positivi rispetto ai tachizoiti (Fig. 12).

I bradizoiti hanno dimensioni variabili: 5,2 (±0,6) x 1,6 (±0,3) µm (Peters et

al., 2001).

Il nucleo lo si può rinvenire nella zona subterminale. (Peters et al. 2001).

Possono essere infestanti per via orale sia per l’ospite intermedio (Dubey e

Lindsay, 1988) che per quello definitivo (McAllister et al., 1998).

Nell’ospite intermedio, in particolare se parzialmente immunodepresso, in

corso ad esempio di una gravidanza, i bradizoiti si riattivano e si trasformano

rapidamente in tachizoiti, forma infettante attiva, capace di invadere

agevolmente il feto e causare aborto.

Fig. 12. Confronto tra tachizoiti di N. caninum (A) e bradizoiti (B) coltivati in vitro (Microscopio elettronico). Notare la parete della cisti di spessore maggiore (B) rispetto alla struttura contente tachizoiti (A). (barre: (A)=1,3 µm; (B)=0,8 µm)

- 31 -

Nel cane (ospite definitivo), che si infetta ad esempio ingerendo carne infetta

contenente bradizoiti, Neospora giunge a livello intestinale dove ha inizio la

fase sessuata del ciclo vitale del parassita, attraverso la quale si ha l’origine

delle oocisti non sporulate che possono venir disseminate nell’ambiente

esterno attraverso le feci.

I bradizoiti si formano a partire dai tachizoiti stessi i quali, nel momento in cui

si attiva la risposta immunitaria dell’ospite, reagiscono incistandosi. In questo

modo il parassita riesce a sottrarsi dall’azione del sistema immunitario e può

quindi resistere anche degli anni all’interno dell’organismo (Dubey et al.,

2002).

- 32 -

• STADIO DI OOCISTA

Lo stadio di oocisti, è lo stadio in cui il parassita, potenzialmente infettante,

viene eliminato dall’ospite definitivo. Il cane, infatti, elimina con le feci le

oocisti nella forma non sporulata, altamente resistenti nell’ambiente esterno

(McAllister et al., 1998; Lindsay et al., 1999). Solo all’esterno dell’ospite

definitivo e dalle 24 alle 72 ore dalla loro espulsione, le oocisti di Neospora

sporulano, diventando appunto oocisti sporulate, forma infestante, che

possono così venir ingerite dall’ospite definitivo od intermedio (Lindsay,

1998) (Fig. 13).

Fig. 13. Oocisti di Neospora caninum: (A) oocisti non sporulata; (B) oocisti sporulata (freccia grande: sporocisti; frecce piccole: sporozoiti.

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Ogni oocisti contiene due sporocisti, che a loro volta contengono quattro

sporozoiti (Dubey, 1999) (Fig. 14). Le oocisti hanno forma ovoidale o sferica,

sono costituite da una doppia parete e le dimensioni variano da 11,3 a 11,7 µm

(McAllister et al., 1998; Dubey, 2002).

Gli sporocisti contenuti all’interno dell’oocisti sporulata, sono di forma

ellissoidale e possiedono un nucleo posizionato centralmente o nella parte

posteriore (Lindsay et al., 1999).

Fig. 14. Oocisti di Neospora

caninum contenente i due sporocisti.

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CCCCICLO VITALE DI ICLO VITALE DI ICLO VITALE DI ICLO VITALE DI NNNNEOSPORA CANINUMEOSPORA CANINUMEOSPORA CANINUMEOSPORA CANINUM

Il ciclo vitale di N. caninum richiede la presenza di due ospiti:

� ospite intermedio;

� ospite definitivo.

Il ciclo ha inizio con l’ingestione, da parte di un animale (ospite intermedio o

definitivo), delle oocisti sporulate (contenenti 8 sporozoiti) emesse

nell’ambiente esterno dall’ospite definitivo (cane, coyote...) (Fig. 15; 1).

Nell’ospite definitivo, gli sporozoiti, arrivati a livello intestinale ad esempio

con l’alimento contaminato, escono dalla spora e penetrano ciascuno in una

cellula della mucosa intestinale, utilizzando il complesso apicale (1a).

Nella cellula si trasformano in trofozoiti che si nutrono della cellula stessa,

aumentando di dimensioni (2).

A questo punto prende il via la fase di riproduzione asessuata (schizogonia)

caratterizzata dalla moltiplicazione del nucleo dei trofozoiti, senza la

contemporanea suddivisione citoplasmatica. Da questo processo deriva una

forma multinuleata, denominata schizonte (3).

- 35 -

Successivamente segue la divisione cellulare con la formazione di numerosi

merozoiti, che escono dalla cellula ospite ormai distrutta e penetrano in altre

cellule intestinali vicine per ripetere tutto il processo di schizogonia (4).

Il numero di fasi di schizogonia non è conosciuto, molto probabilmente è

variabile ed in funzione dell’attivazione più o meno immediata della risposta

immunitaria dell’animale stesso.

A questo punto i merozoiti prodotti nell’ultimo ciclo di schizogonia, penetrano

ulteriormente in un enterocita dando inizio alla fase di riproduzione sessuata

di N. caninum. Una parte dei merozoiti dà origine a gameti “femminili”,

singoli, mononucleati ed ancora endocellulari (macrogameti) (5); un’altra

parte dà invece origine ai gameti “maschili”, mobili ed extracellulari

(microgameti) (6), che individuano le cellule contenti il gamete “femminile”,

vi penetrano fondendosi col macrogamete e dando origine all’unica fase

diploide (zigote) del parassita (7). Lo zigote quindi comincia a ricoprirsi di

una parete di protezione ed abbandona la cellula della mucosa intestinale,

cadendo nel lume intestinale e raggiungendo l’ambiente esterno con le feci

(oocisti non sporulata) (8). All’esterno avviene la fase di sporulazione

dell’oocisti (9), la quale, dopo circa 24-72 ore, si trasforma in una oocisti

sporulata costituita al suo interno da due sporocisti contenenti ognuno 4

sporozoiti (10).

L’ospite definitivo, può inoltre infettarsi attraverso l’ingestione di tessuti

contenenti cisti parassitarie di N. caninum (12). I bradizoiti, presenti nelle

cisti, similmente agli sporozoiti, si liberano nel lume intestinale e si

trasformano in tachizoiti i quali danno inizio alla fase di replicazione

asessuata, per terminare con la formazione dello zigote e quindi dell’oocisti

non sporulata (13).

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Quando invece le oocisti sporulate sono ingerite dall’ospite intermedio

(bovino, cavallo, ovi-caprini...), i trofozoiti, dopo essersi liberati della parete

cistica, vengono rilasciati nel lume intestinale e divengono tachizoiti.

I tachizoiti si dividono rapidamente e diffondono in tutto l’organismo,

invadendo le cellule di numerosi organi (fegato, reni, cuore, polmoni, muscoli,

derma e SNC) nelle quali avviene la moltiplicazione asessuata (scissione

binaria): lo stadio di tachizoite è associato ad infiammazione e necrosi nel sito

d’invasione. Nelle bovine gravide, i tachizoiti possono nel giro di poco tempo,

invadere il feto passando attraverso la placenta, ed essere così causa di aborto.

A seguito della risposta immunitaria dell’animale, i tachizoiti si “rifugiano”

all’interno di una cisti, trasformandosi in bradizoiti (1b).

Le cisti tissutali sono circondate da una parete cistica molto spessa e

resistente, e sono reperibili principalmente nei tessuti neuronali (cervello,

midollo spinale). I tessuti cistici inducono una reazione infiammatoria minima

e possono persistere nel bovino per lunghi periodi di tempo senza

manifestazioni cliniche. Si presume che, in corso di una gravidanza, i

bradizoiti latenti in queste cisti vengano attivati, e si differenzino nello stadio

di tachizoite, infettivo e mobile, che raggiunge, attraverso i tessuti, il sangue

e/o sistema linfatico, la placenta e il feto ed essere così causa di aborto (11).

Come risultato di questa "riattivazione" dei parassiti, ripetute infezioni fetali

possono verificarsi nella stessa madre infetta, nelle gravidanze successive.

- 37 -

Fig. 15. Ciclo vitale di Neospora caninum nell’ospite definitivo e intermedio.

- 38 -

� OSPITE INTERMEDIO

L’ospite intermedio, comprende il bovino, la capra, la pecora, il suino, il

cavallo, il cervo, la volpe, i roditori (topi, ratti...) e volatili da cortile

(Tabella 1.). In questi animali ha luogo il ciclo asessuato del parassita, che

comprende lo stadio di tachizoita e lo stadio di bradizoita (endodiogenesi).

Tra gli ospiti intermedi, sono da aggiungere la lontra di mare che vive in

Alaska (Enhydra lutris) e il delfino (Tursiops truncatas), nei quali sono stati

messi in evidenza anticorpi anti-Neospora (Dubey et al., 2007). Inoltre il DNA

del protozoo è stato isolato nel lama (Lama glama) e nell’alpaca (Vicugna

pacos) da un’equipe ispano-cilena. La sieroprevalenza in questi due camelidi è

importante, varia dal 30 al 40% (Pèreira-Bueno et al., 2000; Serrano-Martìnez

et al., 2004).

In un recente studio epidemiologico, anche l’esposizione a volpi rosse (Vulpes

vulpes) e volpi grigie (Urocyon cinereoargenteus) è stata identificata come un

fattore di rischio per l’infezione da N. caninum per i bovini al pascolo (Barling

et al., 2000), ma non è ancora chiaro come, essendo canidi, riescano ad

eliminare nell’ambiente esterno le oocisti: per questo motivo sono da

considerare ancora come ospiti intermedi (Schares et al., 2002).

In Belgio e Spagna, anticorpi anti-Neospora caninum sono stati dimostrati in

più del 17% delle volpi rosse (Vulpes vulpes) testate (Buxton et al., 1997;

Almeria et al., 2002), mentre nessuna sieropositività è stata rilevata in Svezia

nelle volpi saggiate (Jakubek, 2001). Questi animali sono da considerare

anch’essi ospiti intermedi.

- 39 -

Negli ultimi anni è stata riscontrata una significativa sieroprevalenza da N.

caninum anche nel lupo grigio (Canis lupus), nell’orso bruno (Ursus arctos)

e nel tasso (Meles meles) oltre che in diversi ruminanti selvatici come il cervo

a coda bianca (Odocoileus virginianus), il cervo rosso (Cervus elaphus), il

capriolo (Capreolus capreolus) e l’alce (Alces alces) (Gondim et al., 2004).

Tabella 1. Ospiti intermedi di Neospora caninum e loro distribuzione geografica; positività all’infezione dimostrata attraverso immunoistochimica (IHC) o PCR. (Dubey et al., 2007)

- 40 -

Una importante sorgente di infezione, soprattutto negli allevamenti, potrebbe

essere rappresentata dalla potenziale implicazione, nel ciclo domestico, dei

roditori (topo, ratto...), attraverso una trasmissione diretta, mediante cioè

l’ingestione di carne con cisti contenenti bradizoiti. Tuttavia, al momento,

l’infezione naturale del topo è stata dimostrata solo da un’equipe a Taiwan

(Huang et al., 2004). Questa rivelazione può essere una solida evidenza di

come il ciclo di Neospora caninum possa collegarsi al di fuori dei carnivori e

dei ruminanti.

Anche se i ratti probabilmente non sono ospite definitivi, essi in ogni modo

hanno la potenzialità di trasmettere N. caninum al bestiame!! Basti solo

pensare quando vengono effettuati i carichi per costituire l’unifeed attraverso i

carri trinciamiscelatori.

Non è di raro riscontro la presenza tra il fieno, la paglia, i mangimi, gli insilati,

della libera circolazione di topi e ratti, i quali possono involontariamente

essere caricati assieme agli alimenti, venir frantumati con l’unifeed e

distribuiti tranquillamente al bestiame in stalla.

I roditori, poi, vengono anche cacciati dai canidi (volpi, lupi, cani domestici...)

aumentando così indirettamente il rischio di infezione del bestiame

(McAllister et al., 2000).

Ci sarebbe inoltre necessità di eseguire una più approfondita indagine per

valutare l’eventuale implicazione nell’elenco di ospiti intermedi, degli uccelli

(piccioni, galline, anatre...). Due indagini epidemiologiche hanno comunque

riscontrato che la presenza di pollame negli allevamenti di vacche da latte, è

associata con un incremento del rischio di Neosporosi tra gli animali.

- 41 -

Sembrerebbe comunque improbabile che il pollame possa trasmettere

Neospora caninum direttamente al bestiame; ma se le galline e altri volatili da

cortile sono ospiti intermedi, allora potrebbero trasmettere l’organismo agli

eventuali cani presenti in allevamento (Otranto et al., 2003).

Non è ancora del tutto esclusa la possibilità di trasmissione di N. caninum

all’uomo. In uno studio condotto in Svezia da Petersen, Lebech, Jensen et al.

(1999) su 76 donne (dai 19 ai 41 anni di età) che accusavano ripetuti aborti o

morte intrauterina del feto, vennero eseguiti degli esami sierologici per

valutare la sieroprevalenza di N. caninum. I test utilizzati (ELISA, IFAT)

erano comunque basati su metodi usati per la ricerca anticorpale di T. gondii

(agente abortigeno nell’uomo): i risultati però esclusero la presenza di Ac-anti

N. caninum in queste donne testate. L’equipe giunse alla conclusione che

molto probabilmente l’infezione da N. caninum nell’uomo è potenzialmente

possibile, soprattutto in quei pazienti più sensibili perché ad esempio

immunodepressi. Quello che si deve continuare a fare, è ricercare sicuramente

un più valido ed attendibile test per la diagnosi indiretta di N. caninum

nell’uomo.

Tra questi certamente si annovera la PCR e l’immunoistochimica, effettuate su

biopsie od eventualmente su tessuti prelevati in corso di autopsie di feti

abortiti.

- 42 -

� OSPITE DEFINITIVO

Nell’ospite definitivo si ha il completamento del ciclo vitale di Neospora

caninum, attraverso le fasi della riproduzione sessuata, che porta alla

produzione di oocisti non sporulate, che solo nell’ambiente esterno, in adatte

condizioni di temperatura ed umidità, sporulano e divengono così infettanti.

Ancora prima della completa conoscenza del ciclo vitale di Neospora, ci si è

resi conto che la presenza di cani in allevamento aumentava il rischio di

aborto nelle bovine (Parè et al., 1998; Wouda et al., 1999).

Il cane (Canis familiaris), il dingos (Canis dingos) ed il coyote (Canis

latrans) eliminano le oocisti nelle feci dopo essersi alimentati con tessuti di

bovini o topi infetti da N. caninum; essi sono da considerare quindi come

ospiti definitivi di N. caninum (McAllister et al., 1998; Basso et al., 2001;

Gondim, Gao, McAllister, 2002).

Sino ad ora sono stati riportati tre casi di cani che eliminano naturalmente

oocisti di N. caninum. Uno di questi studi però riporta che cani alimentati con

feti bovini infetti da N. caninum non hanno eliminato oocisti (McAllister et

al., 1998; Lindsay et al., 1999).

- 43 -

� CICLO DOMESTICO E CICLO SELVATICO

Fig. 16. Ciclo selvatico e ciclo domestico di Neospora caninum.

- 44 -

La presenza del coyote e del dingos come animali selvatici eliminatori di

oocisti di Neospora caninum (ospite definitivo) e dei grandi erbivori selvatici

come ospiti intermedi, lascia intravedere un ciclo selvatico autonomo e molto

probabilmente interconnesso al ciclo domestico mantenuto dal cane: a

sostegno di ciò vi è una dimostrazione di come i giovani coyote (Canis

latrans) e i dingos australiani (Canis dingos), possono eliminare oocisti

nell’ambiente esterno, in seguito a ingestione sperimentale di tessuti

contaminati da Neospora caninum (Barling et al., 2000; Ferroglio, Rossi,

2001).

In questo ciclo, come in quello domestico, l’ospite definitivo elimina le oocisti

non sporulate all’esterno attraverso le feci, contaminando così l’ambiente in

cui pascolano i ruminanti selvatici, come cervi, gazzelle, alci...

Si è riscontrata, dai prelievi eseguiti, un indice di sieropositività più alto nei

cervi a coda bianca, rispetto alle alci. Ciò potrebbe essere il risultato della

diversa tipologia di alimentazione. Le alci, infatti, si cibano principalmente di

foglie e ramoscelli, mentre i cervi pascolano, mangiando più vicino al suolo

dove vi è un maggiore rischio di contaminazione fecale da parte di coyote o

cani randagi eventualmente presenti (Gondim et al., 2004).

Questi stessi ospiti definitivi selvatici possono essere fonte di infezione anche

per gli eventuali bovini “domestici” presenti al pascolo. D’altra parte sarà poi

possibile che gli eventuali feti abortiti in corso di Neosporosi al pascolo

possono venir ingeriti dai carnivori selvatici, i quali si infettano a loro volta

(Fig. 16).

La trasmissione fra animali selvatici e domestici è stata rilevata anche

attraverso studi sperimentali.

- 45 -

Nello specifico si è notato come il coyote sia in grado di eliminare oocisti non

sporulata nell’ambiente esterno, dopo essere stato alimentato con tessuti infetti

di vitello (Gondim et al., 2004), e come lo stesso evento accada in cani

alimentati con tessuti infettati da N. caninum di capriolo (Gondim et al.,

2002).

Questo studio è quindi a sostegno di un effettivo collegamento tra ciclo

selvatico e ciclo domestico.

- 46 -


EEEEPIDEMIOLOGIAPIDEMIOLOGIAPIDEMIOLOGIAPIDEMIOLOGIA::::

trasmissione di Neospora caninum trasmissione di Neospora caninum trasmissione di Neospora caninum trasmissione di Neospora caninum

nella vacca da lattenella vacca da lattenella vacca da lattenella vacca da latte

I bovini possono acquisire l’infezione da N. caninum mediante trasmissione

orizzontale (post-natale) o verticale (pre-natale).

� TRASMISSIONE ORIZZONTALE

La trasmissione orizzontale avviene per ingestione di alimenti o acqua

contaminati con oocisti eliminate dalle feci dell'ospite definitivo.

Diversi studi epidemiologici hanno dimostrato che l’infezione post-natale, per

via orizzontale, è molto probabilmente responsabile per le c.d. “tempeste

d’aborto” (abortion storm).

Per esempio, Dijkstra et al. (2002) hanno riportato la sieroconversione per N.

caninum di bovine da latte di razza Holstein in un periodo di 6 mesi.

- 47 -

In questa mandria, la presenza di anticorpi a bassa avidità (indice di una

recente infezione) e la mancanza di correlazione tra lo status sierologico delle

figlie e quello delle madri erano compatibili con un’infezione primaria per via

orizzontale.

E’ interessante rilevare che, l’elevata percentuale di sieroconversione non era

associata ad un aumento di aborti, indicando che una sieroconversione di

massa in mandrie di vacche da latte può passare inosservata (Dijkstra et al.,

2002).

In mandrie con infezione endemica che sono state testate in modo più esteso,

vi è evidenza sierologica che possa verificarsi un livello basso di infezione

post-natale da fonti ignote. Questo dato è in accordo con i risultati originati da

studi di modelli matematici che suggeriscono che l’infezione da N. caninum

scomparirebbe col tempo dalle mandrie bovine se la trasmissione orizzontale

fosse l'unica via di diffusione dell’infezione (Parè et al., 1996; Davison, Otter,

Trees, 1999; Hietala, Thurmond, 1999; Bergeron et al., 2001;Schares et al.,

2003).

- 48 -

� TRASMISSIONE VERTICALE

La trasmissione verticale comporta la trasmissione transplacentare di

tachizoiti dalla madre infetta al feto durante la gravidanza.

Si riconoscono 2 tipi di trasmissione verticale nel bovino:

1. trasmissione transplacentare esogena, caratterizzata dall’ingestione da

parte della vacca in gestazione, di oocisti non sporulate presenti

nell’ambiente, attraverso l’alimento o l’acqua da bere;

2. trasmissione transplacentare endogena, caratteristica delle vacche con

infezione cronica latente (cisti tessutali) e costituita da una riattivazione

e trasformazione dei bradizoiti di N. caninum in tachizoiti, i quali

possono attraversare la barriera placentare ed essere causa di aborto; la

quota di infezione transplacentare endogena decresce con le gravidanze

successive, indicando l’attivazione di un’immunità protettiva (Anderson

et al., 1995; Dijkstra et al., 2003; Romero e Frankena, 2003).

Le infezioni latenti, presenti nella vacca in gestazione, possono essere state

acquisite attraverso una trasmissione verticale (dalla propria madre)

(Anderson et al., 1997) o essere di origine post-natale (orizzontale), per

l’eventuale presenza in allevamento di cani eliminatori di oocisti (Moen et al.,

1998). Il meccanismo col quale queste infezioni latente si riattivano è davvero

ancora poco conosciuto. L’eventualità che un’immunosoppressione, dovuta ad

esempio ad infezioni concomitanti o per la presenza di micotossine

nell’alimento, possa essere la causa di questa recrudescenza dell’infezione per

la riattivazione dei tachizoiti, è tuttora in discussione e non supportata da dati

certi (Wouda et al., 1998; Bartels et al., 1999; Pfeiffer et al., 2002).

- 49 -

È di poco tempo fa la rilevazione, ad esempio, di come, con un’inoculazione

di progesterone durante la gravidanza, si abbia un aumento del rischio di

aborto nelle vacche infettate (sieropositive) da N. caninum (Bech-Sabat et al.,

2007).

La trasmissione verticale sembra essere la via di trasmissione predominante

d’infezione in Europa e negli Stati Uniti, con una percentuale di efficienza tra

l’65 ed il 95%, mentre percentuali più basse (23,5-60%) sono state rilevate in

Nuova Zelanda (Parè, Thurmond, Hietala, 1996; Wouda, Moen, Schukken,

1998; Davison, Otter, Trees, 1999; Sanderson et al., 2000).

In allevamenti con infezione endemica, la maggioranza dei vitelli nati da

vacche sieropositive sono sieropositivi. Inoltre, la percentuale di

sieropositività nella mandria non è correlata all'età delle bovine, il che

suggerisce che la percentuale d’infezione post-natale sia bassa.

Per di più, i vitelli congenitamente infetti hanno un'infezione persistente

cronica che può essere trasmessa per via transplacentare alla loro discendenza.

- 50 -

� ALTRE FONTI DI TRASMISSIONE

Uggla et al. (1998) hanno riportato che vitelli inoculati per via orale con

tachizoiti aggiunti al colostro, sono diventati sieropositivi a circa 5 settimane

post-infezione. Tuttavia, non sono state osservate lesioni da N. caninum, ne

positività immunoistochimica; il parassita non è stato, inoltre, isolato in

seguito all’inoculo di tachizoiti in animali da laboratorio. Il DNA di N.

caninum è stato però ritrovato nel cervello, attraverso PCR. I dati, confermati

anche da Davison et al. (2001), suggeriscono che il colostro potrebbe essere

un fonte di infezione post-natale.

Moskwa et al. (2003) recentemente hanno

descritto il ritrovamento di DNA di N. caninum

nel latte prodotto da bovine infette. Se questo

evento venisse confermato come fonte di

tachizoiti vivi e vitali, sarebbe da considerare

un’ulteriore pericolosa sorgente di infezione di

tipo orizzontale, tra madre e vitello, oltre che per l’uomo.

Dubey et al (2007) hanno riportato comunque che non esistono segnalazioni in

natura dell’infezione di N. caninum con colostro, latte, etc.

Altri ricercatori hanno ipotizzato, infine, come l’ingestione di placenta o

liquido amniotico espulso dalle bovine infette fosse un’ulteriore fonte di

trasmissione orizzontale tra bovini (Ho et al., 1996; Bergeron et al., 2001;

Dijkstra, 2001). Questo non è stato finora verificato da Davison et al. (2001).

- 51 -

È stata inoltre ipotizzata l’eventualità della trasmissione di Neospora caninum

per via genitale. Un’equipe madrilena (Serrano et al., 2006) ha contaminato,

in via sperimentale alcune giovenche, inseminandole con sperma addizionato

con 1x107 tachizoiti. Le manze hanno subito una sieroconversione e la

presenza del parassita è stata dimostrata (il DNA di Neospora caninum è stato

riscontrato nel loro sangue).

Tuttavia, quando il DNA di N. caninum è stato quantificato nello sperma di

tori naturalmente infettati, questi stessi ricercatori hanno ritrovato solo

l’equivalente di 5-10 parassiti per millimetro di sperma (Caetano da Silva et

al., 2004; Ferre et al., 2005; Ortega-Mora et al., 2003).

Inoltre, non si conosce ancora del tutto il destino del parassita in caso di

congelamento dello sperma, anche se è molto probabile che perda

completamente la virulenza (Canada et al., 2006).

- 52 -


PPPPATOGENESI E ATOGENESI E ATOGENESI E ATOGENESI E SSSSINTOMATOLOGIAINTOMATOLOGIAINTOMATOLOGIAINTOMATOLOGIA

Nelle vacche che abortiscono in conseguenza dell’infezione da N. caninum,

non si rilevano segni clinici di malattia. I feti abortiti sono in preda ad autolisi,

senza lesioni macroscopiche e di solito non si ha ritenzione placentare (Fig.

17).

Fig. 17. Feto mummificato (sinistra) e feto abortito (destra) nati da vacche sieropositive per N. caninum.

- 53 -

L’aborto può derivare da tre processi patogenetici potenzialmente

concomitanti (Dubey et al., 2006):

1. una perturbazione dell’equilibrio delle citochine placentari, che

determina lo sviluppo di un processo infiammatorio locale;

2. una somma di microscariche di prostaglandine conseguenti al

passaggio placentare di Neospora caninum, che determinano una lisi del

corpo luteo;

3. un’infestazione incontrollata del giovane feto, quindi fatale per il

prodotto del concepimento.

Fig. 18. Distribuzione temporale delle principali cause di aborto in base allo stadio di gestazione.

- 54 -

Gli aborti avvengono a partire dai 3 mesi di gestazione fino alla fine della

gravidanza, ma la maggioranza degli aborti da N. caninum avviene nel

secondo trimestre di gravidanza.

Questo modello che prevede l’aborto a metà gestazione è fattore di diagnosi

differenziale nei confronti di altre cause diagnosticate di aborto infettivo nelle

bovine da latte, che tendono a verificarsi più tardi nel corso della gestazione

(Fig. 18).

Non è noto se l’infezione da N. caninum possa provocare problemi riproduttivi

nel primo trimestre di gestazione; comunque sono stati riscontrati casi di

mummificazione fetale associati a focolai di Neosporosi (Fig. 17).

Gli aborti da N. caninum avvengono durante tutto l'anno e sono stati riportati

sia in bovine da latte che da carne.

Gli aborti da Neospora caninum si osservano quindi più frequentemente tra il

V ei VII mese di gravidanza (Anderson et al., 1991; Thurmond, 1995; Sager,

Fischer, Furrer, 2001; Wouda et al., 1997).

L’influenza della fase di gestazione potrebbe essere legata a una maggiore

recettività fetale; si tratta di un’ipotesi avvalorata anche da studi istologici e

sierologici. In effetti, prima del VI mese di gravidanza, il feto bovino può

essere considerato totalmente non immunocompetente. Inoltre, esami

istologici hanno evidenziato lesioni più gravi nei feti giovani, rispetto a feti di

età maggiore (Ogino et al., 1992). L’infezione del feto nel primo trimestre di

gravidanza sfocia sistematicamente in aborto, mentre nel corso del secondo

trimestre l’infezione non causa necessariamente un processo abortivo, poiché

il feto è in grado di contrastare l’infezione parassitaria.

- 55 -

Trees et al. (2002) hanno infatti dimostrato sperimentalmente come

l’importanza del periodo di gestazione durante il quale avviene la l’infezione

da N. caninum sia fondamentale. Nello studio, l’inoculazione, ad esempio, di

una dose di 7x105 tachizoiti di Neospora caninum a 70 giorni di gestazione,

causa aborto nella totalità delle vacche; se l’inoculazione, invece, avviene

dopo il 160° giorno di gestazione, le vacche danno alla luce vitelli

clinicamente sani, ma sieropositivi.

Le manze con infezione congenita possono a loro volta trasmettere l'infezione

alla futura progenie. Ricordiamo, infatti, che questo meccanismo di

trasmissione verticale è il fattore principale di mantenimento dell’infezione da

N. caninum nella mandria.

Le bovine sieropositive, inoltre, hanno un rischio di aborto aumentato. In uno

studio condotto in California, vacche sieropositive con infezione congenita

avevano un rischio di aborto aumentato di 7,4 volte nel corso della loro prima

gravidanza. Il rischio alla seconda gravidanza era notevolmente più basso,

anche se questo dato potrebbe essere stato influenzato, in qualche modo,

dall’eliminazione selettiva di vacche che hanno abortito alla prima gravidanza

(Thurmond e Hietala, 1997).

Nei Paesi Bassi, un aumento di 3 volte del rischio di aborto, comparato a

quello di fattrici sieronegative, era associato alla presenza di vacche

sieropositive (Wouda et al., 1998).

Un aumentato rischio di aborto e di nascita di feti morti o disvitali, un elevato

tasso di riforma per inefficienza riproduttiva, un ridotto accrescimento post-

svezzamento e un ridotto tasso di trasformazione dell’alimento è stato

riscontrato anche in bovine da carne (Barling et al., 2001).

- 56 -

Oltre all’aborto ed all’infezione congenita, l’infezione da N. caninum può

provocare una riduzione della produzione di latte ed un accorciamento della

vita produttiva, come evidenziato da uno studio nel corso del quale vacche

sieropositive hanno prodotto meno latte e sono state eliminate più

precocemente delle fattrici sieronegative (Thurmond e Hietala, 1996 e 1997).

� ABORTO NELLA BOVINA: modelli epidemiologici

Sono stati descritti due modelli di aborto da N. caninum nella vacca da latte:

l’aborto endemico e l’aborto epidemico.

• ABORTO ENDEMICO

Nel modello caratterizzato dall’aborto endemico, la mandria è colpita da una

percentuale di aborto superiore al 5% annuo, percentuale che persiste per anni.

Nel corso di indagini effettuate in due allevamenti da latte in California che

presentavano aborti endemici da N. caninum, la percentuale di aborto annuale

attribuibile alla Neosporosi in questi allevamenti è stata valutata pari al 10,6%

e al 17,3% (Thurmond et al., 1995).

• ABORTO EPIDEMICO

Il modello di aborto epidemico è meno comune ed è caratterizzato da aborti in

un gran numero di bovine gravide distribuiti su un periodo di tempo

relativamente breve.

- 57 -

In alcuni casi, più del 30% delle bovine gravide ha abortito per Neosporosi nel

giro di alcuni mesi (Thornton et al., 1994). Un insieme di questi modelli può

essere osservato in alcune mandrie che hanno sperimentato una storia

prolungata di casi sporadici di aborto da N. caninum e focolai occasionali di

aborti attribuibili a N. caninum.

Infezioni primarie sono molto probabilmente la causa di focolai di aborto

indotto da N. caninum nei bovini (Fig. 19), mentre un aumento della

percentuale di aborto annuale può essere una conseguenza della trasmissione

verticale.

In molti casi, le bovine che abortiscono un feto infetto da N. caninum

andranno incontro sia ad aborti che a infezioni fetali ulteriori alle gravidanze

successive (Barr et al., 1993; Anderson et al., 1995; Dubey et al., 1996). Le

conseguenze cliniche in queste gravidanze successive sono variabili, ma una

bovina sieropositiva che presenta un aborto, avrà un rischio di aborto

aumentato di 5,7 volte alla gravidanza successiva (Thurmond e Hietala, 1997).

Fig. 19. Feto abortito. Non sono visibili particolari lesioni.

- 58 -

� SINTOMATOLOGIA NEL VITELLO

Una manifestazione non comune d’infezione fetale da N. caninum è la nascita

di un vitello a termine clinicamente colpito da infezione, che mostra diversi

segni neurologici, che si manifestano come disfunzioni limbiche, che variano

da lievi deficit propriocettivi sino alla completa paralisi.

Microscopicamente si rileva un’encefalomielite multifocale protozoaria, che

può essere localizzata in particolare nella materia grigia del midollo spinale

(Barr et al., 1993; Dubey et al., 1996) (Fig. 20).

La maggioranza dei vitelli che contraggono un'infezione da N. caninum

durante la gestazione nasce clinicamente normale. Questi vitelli avranno un

titolo anticorpale precolostrale alto per N. caninum, utile per rivelare

un’infezione uterina.

Fig. 20. Feto bovino abortito: miocardio con accumulo di tachizoiti di N. caninum tra le fibrocellule muscolari (sinistra); area di necrosi nel SNC (destra).

- 59 -


TTTTECNICHE DIAGNOSTICHEECNICHE DIAGNOSTICHEECNICHE DIAGNOSTICHEECNICHE DIAGNOSTICHE

� DIAGNOSI DIRETTA

Considerando la sieroprevalenza della Neosporosi in allevamento e l’elevato

tasso di trasmissione verticale, è importante poter dimostrare l’esistenza di

lesioni parassitarie (con o senza oggettivazione del parassita) o far ricorso a

tecniche in grado di mettere in evidenza le lesioni caratteristiche per

confermare che l’evento abortivo sia dovuto a N. caninum.

I prelievi fetali principali vanno effettuati nel tessuto nervoso centrale e a

livello di cuore, fegato e placenta. Le condizioni di consegna al laboratorio

variano in base alla tipologia di metodica diagnostica.

- 60 -

Una diagnosi accurata dell'aborto da N. caninum si può ottenere se il

diagnostico prende in esame, prima di stabilire quale infezione sia la causa di

aborto:

1. il periodo di gestazione e le condizioni post-mortem del feto (autolisi);

2. la presenza di lesioni infiammatorie disseminate e compatibili;

3. la presenza di parassiti rilevabili con immunoistochimica o del DNA del

parassita con la PCR;

4. l’assenza di altri agenti abortivi.

La diagnosi diretta di infezione da N. caninum si effettua attraverso metodiche

diverse che comprendono l’esame istologico ed immunoistochimico, la

cultura cellulare e l’inoculo in animali da laboratorio e l’applicazione di

metodiche molecolari, quale la PCR.

- 61 -

• ESAME ISTOLOGICO

L’esame istologico è ancora considerato come la tecnica di riferimento

(Kramer et al., 2007). Consiste nell’osservazione di lesioni di tipo

infiammatorio, necrotico non suppurativo. Inoltre, è importante determinare se

le lesioni possono essere responsabili della morte del feto e se, per l’aborto, va

ricercata un’altra causa.

Alcuni studi riferiscono che le lesioni sono più gravi e più numerose nei feti

provenienti da focolai epidemici rispetto a feti provenienti da focolai endemici

e nei feti a meno di 6 mesi di gestazione (Collantes-Fernandez et al., 2006).

L’osservazione di parassiti all’interno delle lesioni non è sistematica, tanto più

se nel feto sono iniziati fenomeni autolitici e la distribuzione per

microrganismo non è omogenea all’interno dell’organo (Collantes-Fernandez

et al., 2006). In tal caso, può essere utile effettuare due serie di sezioni

istologiche a diversi livelli del tessuto esaminato.

Le lesioni più caratteristiche si trovano a livello di tronco encefalico e

peduncoli cerebellari, e consistono in aree di encefalite multifocale di tipo non

purulento. Queste aree infiammatori sono caratterizzate da una zona centrale

di necrosi che in alcune occasioni si presentano con fenomeni di calcificazione

(González et al., 1999).

Le altre lesioni istologiche che si rinvengono costantemente includono

epicarditi e/o miocarditi non suppurative, miositi focali non suppurative ed

epatiti portali non suppurative, frequentemente con necrosi epatica focale e

polmonite interstiziale focale non suppurativa.

- 62 -

Le lesioni al cuore, fegato e tessuto muscolare scheletrico, normalmente sono

di difficili rilevazione per la precoce comparsa di fenomeni autolitici

(Anderson et al., 1994; Barr et al., 1991).

Le lesioni istopatologiche offrono una diagnosi presuntiva della malattia.

L'assenza di lesioni nel cervello non esclude la diagnosi di Neospora; bisogna

tenere in considerazione che tale negatività può essere dovuta per l'esame di

zone prive di lesioni specifiche o che tali lesioni si trovino in altri organi, ad

esempio la placenta.

Per confermare la diagnosi istologica si impiegano tecniche di

immunoistochimica, che ci permettono di evidenziare la presenza di tachizoiti

tra le aree di proliferazione microgliare o nell'infiltrato infiammatorio che

circonda la zona necrotica.

Grande specificità ma bassa sensibilità, dovuta alla scarsa presenza del

parassita nelle lesioni, è la rilevazione e la relativa osservazione delle cisti

tessutali contenenti bradizoiti di Neospora caninum (Gonzales et al., 1999).

- 63 -

• IMMUNOISTOCHIMICA

L’immunoistochimica, basata sul riconoscimento del parassita grazie ad

anticorpi specifici, consente una maggiore sicurezza in termini di

identificazione, ma necessita anche dell’analisi di diversi campioni e della

disponibilità di un laboratorio specializzato.

La specificità della tecnica dipende dall’anticorpo utilizzato. I sieri

iperimmuni, policlonali, possono presentare delle reazioni di cross-reattività

con Toxoplasma gondii (Dubey et al., 2007).

Con l’impiego degli anticorpi monoclonali di topo (mAb 6G7) che reagiscono

selettivamente contro i tachizoiti di N. caninum (NC-1) alla prova IFAT, Cole

et al. (1993) constatarono che questi stessi anticorpi non reagivano con

tachizoiti e bradizoiti di T. gondii, H. hammondi, sporozoiti di Isospora suis e

merozoiti di Eimeria bovis, schizonti e merozoiti di Sarcocystis cruzi, S. canis,

S. neurona, oocisti di Cryptosporidium parvum, amastigoti di Leishmania spp,

e molti altri parassiti. Questa osservazione fu un’ulteriore conferma dell’alta

specificità del test immunoistochimico nei confronti di tessuti con lesioni

compatibili a Neospora caninum. Infatti, secondo van Maanen et al (2004), ad

esempio, l’immunoistochimica ha bassa sensibilità (40%), ma altissima

specificità (93%) nel confermare la diagnosi di aborto da N. caninum.

- 64 -

• CULTURA CELLULARE E INOCULO IN ANIMALI DI

LABORATORIO

Sono state descritte numerose linee

cellulari , anche di origine murina (es. linea

primaria di astrociti murini) (Figg. 21-22).

Queste tecniche attualmente sono riservate

ai laboratori di ricerca, in ragione della

lunghezza intrinseca della tempistica per la

risposta e delle difficoltà di realizzazione,

soprattutto con feti in autolisi.

Inoltre, considerando il passaggio verticale

quasi sistematico nella specie bovina, l’isolamento di un ceppo non consente

sempre di attribuire l’aborto a Neospora caninum. Sarebbe necessario quindi

abbinare questa metodica

diagnostica all’esame istologico.

L’isolamento di N. caninum in

coltura cellulare resta comunque un

metodo di diagnosi diretta molto

indaginoso e che non trova

applicazione routinaria in

laboratorio poiché spesso il parassita

perde la propria vitalità in seguito

all’autolisi degli organi fetali.

Fig. 21. Coltivazione in vitro di oocisti di Neospora caninum (Prof.

Dr. Andrew Hemphill, Universität

Bern, 2003)

Fig. 22. Tachizoiti di Neospora caninum coltivati in cellule Vero.

- 65 -

Ne è prova l’esiguo numero di ceppi del protozoo che sono stati finora isolati

nel mondo in laboratori specializzati degli Stati Uniti, Svezia, Gran Bretagna,

Giappone ed Italia.

Hemphill A. e Vonlaufen N. dell’Istituto di Parassitologia dell’Università di

Berna (2005), in molti loro esperimenti, utilizzarono comunque la metodica

della cultura su monostrato cellulare di N. caninum, con lo scopo di studiare

ed approfondire, ad esempio, la capacità di conversione morfologica da

tachizoita a bradizoita, sotto particolari condizioni di stress, condizioni che si

possono poi riscontrare nell’ospite dove Neospora può albergare.

Sotto queste particolari condizioni di stress, si è potuto notare che il parassita

ferma di proliferare ed esprime antigeni bradizoiti-specifici che conducono al

suo incapsulamento in una cisti tissutale.

Gli esperimenti effettuati applicavano alla cultura cellulare varie condizioni di

stress:

1. modifiche della temperatura di incubazione;

2. variazione della concentrazione in CO2;

3. variazioni di pH;

4. esposizione ad immunomodulatori come IFN-γ e TNF-α;

5. reazione con anticorpi anti-Neospora caninum;

6. trattamento con ossido nitrico (nitroprussito di sodio (SNP).

Ad esempio, in un esperimento, una cultura cellulare di cheratinociti

epidermici di topo venne infettata con tachizoiti di Neospora caninum, e la

cultura infetta fu trattata con una dose elevata (70 µm) di nitroprussito di sodio

per 8 giorni.

Come stimato da PCR in tempo reale, la proliferazione del parassita nella

cultura cellulare sotto particolari condizioni di stress era notevolmente ridotta.

- 66 -

Una up-regulation dell'espressione di antigeni bradizoiti-specifici era

evidenziabile attraverso un’immunofluorescenza diretta (Fig. 23) utilizzando

nello specifico anticorpi marcati, diretti contro l'antigene bradizoita-specifico

NcBAG1, ed in parallelo, si otteneva una down-regulation dell'espressione di

antigeni tachizoiti-specifici come NcSAG1 o NcSRS2. Dopo 8 giorni con

trattamento della cultura cellulare con SNP, l'antigene di superficie della cisti

di Neospora caninum NcCC2 fu celato dal parassita stesso (Nishikawa et al.,

2001; Min Liao et al., 2005).

Al microscopio elettronico a trasmissione si ottenne la rivelazione che

Neospora caninum si era localizzata all’interno di compartimenti intracellulari

chiamati vacuoli parassitofori, e che la maggioranza dei parassiti presenti

all'interno dei vacuoli parassitofori erano in grado di costituire una parete

cistica, tipica dello stadio del bradizoita.

Fig. 23. Conversione in vitro di Neospora caninum analizzate attraverso la doppia-immunofluorescenza diretta. Notare nella figura C la progressiva down-regulation dell’espressione degli Ag NcSAG1 espressi dallo stadio di tachizoita e la progressiva up-regulation degli Ag NcBAG1 espressi dai bradizoiti, dovuta alla reazione di Neospora caninum a particolari condizioni di stress..

- 67 -

• BIOLOGIA MOLECOLARE

Le tecniche di amplificazione genica (PCR) del DNA di Neospora caninum

sono sempre più utilizzate.

Sono stati descritti e utilizzati numerosi geni bersaglio. Attualmente, si è

concordi nell’amplificazione del gene pNc-5 presente in tutti gli stipiti, ma la

cui funzione non è ancora stata completamente chiarita (Gottstein et al., 1998).

Questa metodica può essere impiegata per mettere in evidenza tutte le forme

del parassita attualmente descritte: negli organi, nelle feci dell’ospite

definitivo e nello sperma.

Nonostante queste tecniche siano molto sensibili, si raccomanda di estrarre il

DNA a partire da un omogenato di tessuto, piuttosto che da un campione di

piccole dimensioni, in ragione dell’eterogenicità della distribuzione del

parassita.

Considerando il passaggio verticale di N. caninum, un risultato positivo non

consente da solo di concludere sulla reale responsabilità del parassita

nell’aborto. Tuttavia, uno studio condotto in Svizzera, ha evidenziato una

correlazione pari a circa l’85% tra i risultati positivi ottenuti in PCR e le

lesioni compatibili con un aborto attribuibile a Neospora caninum. Questa

tecnica sembra dunque ben adattarsi a una diagnosi di Neosporosi in prima

intenzione (Sager, Fischer, Furrer et al., 2001).

La scelta della PCR come metodica routinaria per la diagnosi diretta di

infezione è soprattutto per la sua praticità, in quanto l’esame può essere

eseguito anche su campioni di tessuti fetali congelati o fissati in formalina e

consente di disporre di un esito in tempi brevi (l’esecuzione completa della

prova richiede 2 giorni).

- 68 -

I materiali che è opportuno esaminare di preferenza, quelli dove esami

immunoistochimici hanno rivelato che più spesso è rinvenibile Neospora

caninum, sono il cervello, il cuore, il rene e il fegato.

Timothy, Baszler et al. (1999) ottimizzarono la tecnica di PCR per la ricerca e

amplificazione del gene pNC-5, utilizzando due coppie di primers: Np4-Np7 e

Np6-Np7. Studi preliminari utilizzando sangue e tessuto nervoso bovino

mostrarono che la coppia di primers Np4-Np7, quando usata in una procedura

standard o quando usata prima della coppia di primers Np6-Np7, fornisce

ottimi risultati sui tessuti bovini testati. La coppia di primers Np4-Np7

amplifica un frammento di DNA di 275 bp, mentre la coppia Np6-Np7

amplifica un frammento di 227 bp. La PCR effettuata sfruttando prima la

coppia di primers Np4-Np7 seguita dalla coppia Np6-Np7 aumenta

notevolmente la sensibilità del test.

Per escludere eventuali, ma rari, falsi-negativi, dovuti soprattutto alla scarsa

qualità del DNA da testare (tessuti con spiccati fenomeni di autolisi), si può

ricorrere alla PCR multipla, che utilizza, oltre alle coppie di primers di N.

caninum, una coppia di primers relativa al gene della prolattina bovina (PRL)

espresso appunto dalle cellule di origine bovina. La coppia di primers PRL

HL033-HL035 amplifica un frammento di 156 bp di DNA (Fig. 26).

La sensibilità della PCR è del:

1. 77% per tessuto nervoso fresco (Fig. 24).

2. 100% se effettuata su tessuti fissati in formalina e per quelli allestiti con

paraffina (Fig. 25);

- 69 -

La specificità, invece, è del:

1. 94% per tessuti fissati in formalina o allestiti con paraffina;

2. 100% per cervello fresco.

Un ulteriore metodica PCR allestita è diretta all'amplificazione di una parte

del gene che codifica la subunità 18S del ribosoma di N. caninum, un gene del

quale è nota la bassa variabilità intraspecifica, con l'intento di poter rilevare

qualsiasi ceppo riferibile alla specie N. caninum. Il prodotto della reazione

PCR, nel caso di presenza di coccidi nel campione esaminato, è un frammento

di DNA che viene rilevato agevolmente mediante una elettroforesi su gel di

agarosio. Successivamente all’amplificazione, la digestione enzimatica del

prodotto della reazione ad opera dell'endonucleasi permette di identificare i

protozoi del genere Neospora differenziandoli nel contempo da altri protozoi

di interesse veterinario (T. gondii e Sarcocystis spp.) che possono essere

rilevati nei feti bovini.

- 70 -

Fig. 24. PCR effettuata su DNA di tachizoiti di Neospora caninum isolato da cervello di bovino infetto. Il DNA è stato analizzato con l’impiego della coppia di primers Np4-Np7 per l’amplificazione del gene pNC-5. È stata quindi effettuata un’elettroforesi su gel di agarosio.

� CAMPIONE 1: massa molecolare conosciuta (100kb);

� CAMPIONI 2-9: cervello di bovino infettato sperimentalmente con 5000, 500, 50, 40, 30, 20, 10, 0 tachizoiti di N. caninum rispettivamente;

� CAMPIONE 10: controllo positivo (DNA estratto da tachizoiti di N. caninum coltivati in cultura di cellule Vero;

� CAMPIONE 11: controllo negativo (acqua distillata);

� freccia a sinistra: prodotto della PCR da parte della coppia di primers Np4-Np7 di 275 kb, che si riscontra a livello dei campioni dal 2 al 7 e campione 10.

- 71 -

Fig. 25. PCR effettuata su tessuti infetti da Neospora caninum appartenenti a feti abortiti, fissati in formalina e allestiti con paraffina. L’amplificazione del gene pNC-5 è stata ottenuta utilizzando la coppia di primers Np4-Np7.


� CAMPIONE 2: controllo positivo (DNA di Neospora caninum);

� CAMPIONE 3: rene (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 4: cervello (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 5: fegato (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 6: controllo negativo (paraffina);

� CAMPIONE 7: rene (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 8: polmone (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 9: fegato (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 10: cuore (positivo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;


� CAMPIONE 12: controllo negativo (paraffina);

� CAMPIONE 13: tessuto cerebrale (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto abortito per infezione della madre da IBR;


� CAMPIONE 15: cuore (negativo per la ricerca di N. caninum) di feto infetto;

� CAMPIONE 16: controllo negativo (acqua distillata).

� Freccia sinistra: prodotto della PCR da parte della coppia di primers Np4-Np7 di 275 kb.

- 72 -

Fig. 26. PCR multipla effettuata su DNA di tachizoiti di Neospora caninum e PRL di tessuti fetali fissati in formalina ed allestiti con paraffina derivati da feti abortiti. Il DNA è stato analizzato con l’impiego della coppia di primers Np4-Np7 per l’amplificazione del gene pNC-5 e l’impiego della coppia di primers HL033-HL035 per l’amplificazione del gene che codifica la PRL bovina. È stata quindi effettuata un’elettroforesi su gel di agarosio.


� CAMPIONI 2-4: rispettivamente fegato, cuore e cervello di feti negativi per N. caninum, analizzati solo con primers per PRL;

� CAMPIONI 5 e 6: rispettivamente cervello e rene di feti negativi per N.

caninum e PRL;

� CAMPIONI 7 e 8: rispettivamente cervello e polmone di feti negativi per N.

caninum e PRL;

� CAMPIONE 9: cervello di feto positivo per Neospora caninum analizzato con primers per DNA Neospora e PRL;

� CAMPIONI 10-14: controllo negativo per PRL bovina (cultura di cellule Vero infettate da Neospora caninum);

� CAMPIONI 15 e 16: controllo negativo (acqua distillata);

� freccia a sinistra: prodotto della PCR da parte della coppia di primers Np4-Np7 di 275 kb, che si riscontra a livello dei campioni dal 9 al 14 e prodotto della PCR da parte della coppia di primers HL033-HL035 di 156 kb, che si riscontra a livello dei campioni dal 2 al 4 e campione 9.

- 73 -

� DIAGNOSI INDIRETTA

• RISPOSTA ANTICORPALE NEL BOVINO

Tutti i bovini infettati da Neospora caninum producono specifici anticorpi che,

durante la vita dell’animale subiscono continue fluttuazioni nel titolo, sia per

quanto riguarda animali infettati sperimentalmente che naturalmente.

In particolare durante la gravidanza, l’interazione tra il sistema immunitario

dell’ospite e il parassita causa il rapido picco e il progressivo calo del livello

anticorpale. Questo evento fa si che la concentrazione sierica anticorpale arrivi

ad un livello inferiore al cut-off dei più comuni test sierologici utilizzati

(Stenlund et al., 1999; Guy et al., 2001; Sager et al., 2001; Maley et al., 2001;

Trees et al., 2002).

I vitelli alimentati con colostro proveniente da madri sieropositive ricevono

anticorpi colostrali di Neospora caninum. Hietala e Thurmond (1999)

mostrarono che, dopo un mese, tale trasmissione passiva di anticorpi può

essere ancora rilevata nel 50% dei sieri di vitelli non infettati. Comunque nella

maggior parte dei vitelli, anticorpi colostrali non vengono più riscontrati dopo

due mesi.

- 74 -

• TEST SIEROLOGICI

Per la diagnosi indiretta della Neosporosi, il sangue o altri liquidi corporei

(liquor, versamenti cavitari, latte) degli animali infetti vengono esaminati per

ricercarvi anticorpi specifici verso N. caninum. La prima metodica messa a

punto è stata l’immunofluorescenza indiretta (IFAT), una tecnica

caratterizzata da buona sensibilità e specificità e che non rileva anticorpi

diretti verso altri protozoi che possono infettare il bovino (Sarcocystis spp.,

Toxoplasma gondii); a questa hanno fatto seguito diverse metodiche

immunoenzimatiche (ELISA) che si differenziano tra loro per la tecnica di

preparazione dell’antigene. Tra metodiche ELISA e IFAT si osserva una

buona concordanza in termini sia di sensibilità sia di specificità, anche se la

prova IFAT appare più affidabile; in ogni caso la praticità delle metodiche

ELISA potrebbe farle preferire sempre più in futuro per l’applicazione

routinaria.

Per un significativo risparmio di tempo e di costi di esecuzione e ai fini

dell’identificazione delle aziende infette, è stato inoltre proposto l’utilizzo di

una metodica ELISA anche per l’esame del latte di massa: in questo caso, la

prova riesce a rilevare gli anticorpi nei confronti di N. caninum se alla

costituzione del campione esaminato ha concorso il latte di bovine

sieropositive in una proporzione di almeno il 10-15% del totale dei soggetti

munti (Varcasia et al., 2006).

La sierologia comprende un insieme di tecniche diagnostiche i cui principali

vantaggi sono: la possibilità di realizzazione ante-mortem e il costo limitato.

- 75 -

Nel caso di patologie come la Neosporosi, in cui l’agente patogeno permane

nell’ospite (cisti cerebrali), gli anticorpi persistono.

Il titolo anticorpale può tuttavia variare, in particolare in funzione della fase di

gravidanza, scendendo anche al di sotto della soglia di rilevamento dei metodi

correttamente utilizzati.

Inoltre, attualmente, non esiste un test sierologico che consenta di distinguere

tra animali con infezione naturale e bovini vaccinati (Reichel et al., 2006).

La sierologia può essere utilizzata

sulle madri e sui fluidi fetali (Fig. 27),

con diverse interpretazioni. Si è ormai

concordi sull’utilità della sierologia

materna come strumento nella

diagnosi di aborto. Un risultato

sierologici negativo esclude quasi con

certezza l’ipotesi eziologica di

Neospora caninum come causa di

aborto. Al contrario, tenendo in considerazione la prevalenza dell’infezione in

allevamento e la trasmissione verticale del patogeno, un risultato positivo

viene interpretato solamente come un sospetto e non consente in alcun caso di

stabilire una diagnosi di certezza.

In tal caso può essere utile effettuare analisi sierologiche e analisi statistiche

negli animali a rischio (vacche in gravidanza), per stimare se gli aborti sono

significativamente associati ad animali sieropositivi.

L’analisi sierologica dei fluidi fetali dà luogo a un’interpretazione opposta. Un

risultato positivo va considerato come un forte sospetto, mentre un risultato

sierologici fetale negativo non consente di escludere un aborto da Neospora

caninum.

Fig. 27. Feto abortito: prelievo di fluidi fetali dalla cavità cardiaca (prelievo endocardiaco).

- 76 -

In effetti, il sistema immunitario del feto bovino è immaturo, soprattutto nei

primi 2/3 della gravidanza, e il lasso di tempo tra un’infezione fetale e la

morte del prodotto del concepimento è breve (Wouda, Dubey, Jenkins, 1997).

La sierologia può essere anche utilizzata all’atto dell’acquisto di un animale o

nel quadro di uno screening d’allevamento. È necessario in questi casi

ricercare la presenza di linee familiari di bovini infetti. Il veterinario di campo

non deve esitare nel testare nuovamente un animale caratterizzato da risultati

non coerenti rispetto alla genealogia o ai risultati complessivi del gruppo di

animali.

La valutazione sierologica dell’allevamento consente di:

1. stimare l’importanza della contaminazione di gruppo;

2. definire la modalità principale di contaminazione (verticale od

orizzontale);

3. fornire un aiuto nella scelta delle tecniche da mettere in atto per

combattere l’infezione (eliminazione selettiva, scelta delle femmine

riceventi o da incrociare per far nascere vitelli da carne, ecc.).

I test utilizzano tachizoiti di N. caninum o specifici antigeni derivati. I

laboratori che utilizzano uno qualsiasi dei test sierologici per N. caninum,

dovrebbero stabilire appropriati valori di “cut off”, utilizzando sieri da bovini

infetti e non infetti. Un solo campione di siero, proveniente da una singola

bovina, può non riflettere in modo accurato il suo stato d’infezione, dato che i

titoli degli animali positivi possono fluttuare e possono scendere sotto il valore

soglia per un certo periodo di tempo (Björkman, Uggla, 1999).

- 77 -

L’impiego della sierologia per Neospora caninum è anche un efficace metodo

per rilevare elevati livelli di anticorpi nel siero di vitelli con infezione

congenita, o in feti infetti abortiti a 6 o più mesi di gestazione (Barr et al.,

1995; Wouda et al., 1997).

I principali test utilizzati sono:

� IFAT: indirect-fluorescent antibody test;

� ELISA: enzyme-linked immunoassay;

� Avidity test;

� Immunocromatografia (ICT).

- 78 -

1. IFAT

L’IFAT si basa essenzialmente sull’utilizzo di tachizoiti interi di N. caninum

fissati su appositi vetrini. Il siero in esame, correttamente diluito, viene

applicato sul vetrino ed, in seguito, viene aggiunto un anticorpo anti-IgG di

bovino coniugato ad un fluorocromo. La positività sierologica è rilevata al

microscopio a fluorescenza (Dubey et al., 1996).

Le principali sostanze utilizzate come

fluorocromo, sono la fluorescina, che

emette luce verde in caso di positività del

test (Fig. 28), e la rodamina che invece

emette luce rossa.

Uno svantaggio della metodica IFAT è il

fatto che il risultato che si ottiene è di

tipo soggettivo, in quanto valutato

dall’occhio più o meno esperto di un

tecnico di laboratorio, a differenza del

test ELISA, per il quale la risposta si ottiene attraverso una diagnosi

strumentale (spettrofotometro) di tipo oggettivo, standardizzabile e quindi

costante nel tempo. L’approccio che si deve assume in un laboratorio è quindi

di far leggere quando possibile allo stesso tecnico addetto i vetrini di IFAT, in

modo da ottenere un risultato più coerente possibile.

L’impiego di IFAT nella sierologia per Neospora caninum è un metodo

efficace ed accurato nel rilevare elevati livelli di anticorpi nel siero di vitelli

con infezione congenita (esame precolostrale), o in feti infetti abortiti nella

seconda metà di gravidanza.

Fig. 28. IFAT. In verde sono visibili i tachizoiti di Neospora caninum evidenziati attraverso anticorpi marcati con fluorescina.

- 79 -

Ciò nonostante, un titolo IFAT negativo per N. caninum nei fluidi fetale non

esclude la possibilità d’infezione, ed un titolo positivo non dimostra che

questa infezione fosse l’effettiva causa di aborto.

Il test IFAT (specificità: 97%; sensibilità: 97%; Wapenaar et al., 2007), si è

comunque dimostrato un esame affidabile ed accurato e sicuramente, rispetto

al test ELISA, ha una maggiore specificità: IFAT infatti viene molto spesso

utilizzato come test di riferimento per la valutazione dell’affidabilità di altri

test sierologici (golden test).

2. ELISA

Il test ELISA può essere utilizzato nella valutazione dello status sierologico

della mandria, oltre che nelle indagini di routine nei casi individuali di aborto.

A differenza di IFAT, gli antigeni utilizzati in ELISA possono essere diversi:

tachizoiti interi; antigene crudo di tachizoiti sonificati; antigeni di superficie,

ad esempio una proteina immunodominante di 65 kDa (p65) esposta sulla

superficie dei tachizoiti di Neospora caninum.

L’esame viene preparato ponendo l’antigene di Neospora caninum sul fondo

di particolari pozzetti; viene aggiunto il siero in esame e quindi, in un secondo

tempo, gli anticorpi anti-IgG di bovino (isotipo IgG1), coniugati con un

enzima perossidasi. Successivamente viene aggiunto il substrato per l’enzima

(perossido di idrogeno) coniugato al cromogeno (tetrametilbenzidine) e si

lascia incubare per circa 20 minuti.

- 80 -

Si aggiunge quindi la soluzione che blocca la reazione enzimatica (acido

fosforico) e si passa immediatamente alla lettura con spettrofotometro dei vari

pozzetti occupati dai sieri in esame (specificità: 99%; sensibilità: 96%; VMRD

Inc.).

Negli ultimi tempi sono state messe a punto nuove metodiche ELISA, come

ELISA-competitiva (CI-ELISA) e l’ISCOM-ELISA, nel tentativo di

aumentare la specificità e la sensibilità.

Il primo test utilizza, insieme al siero da analizzare, un anticorpo monoclonale

(isotipo IgM), specifico contro la proteina 4A4-2 (65 kDa) presente sulla

superficie dei tachizoiti di Neospora caninum (questi anticorpi sono specifici

in quanto non reagiscono con T. gondii e S. spp.).

Il legame specifico tra mAb 4A4-2 e gli antigeni presenti sulla superficie dei

tachizoiti di Neospora caninum, viene inibito dai sieri dei bovini infetti da N.

caninum (siero positivi) e non inibito dai sieri degli animali non infetti (siero

negativi). Dunque, il valore di densità ottica in caso di positività sierologica

sarà inferiore al valore ottenuto con sieri da animali non infetti. Il vantaggio

principale della tecnica è l’utilizzo del solo anticorpo secondario anti-topo

contro l’mAb. Dunque, è un test che può essere utilizzato per diverse specie

animali (Baszler et al., 2004).

L’ISCOM-ELISA, invece, utilizza come antigene i tachizoiti di N. caninum

sonificati e successivamente incorporati in complessi immunostimolante

(ISCOM). Gli Iscom permettono che gli antigeni esposti sul fondo del

pozzetto siano per la maggior parte proteine di superficie di N. caninum

(Björkman, 1997; Frössling, 2003).

- 81 -

In generale, il test ELISA per la ricerca degli anticorpi contro N. caninum

offre un semplice, rapido e versatile, ma accurato, metodo per

l’identificazione dello status di infezione in un allevamento bovino.

Oltre che sul siero, il test ELISA può essere utilizzato anche per la ricerca

indiretta di Neospora caninum nel latte di eventuali bovine infette (Björkman,

Holmdahl, Uggla, 1997; Schares et al., 2004). È particolarmente indicato

l’utilizzo dell’ISCOM-ELISA. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che le

vacche con elevati livelli sierici di anticorpi, hanno poi anche una significativa

positività al test ELISA effettuato sul latte. Inoltre, lo stesso test può essere

effettuato sul latte di massa con buoni risultati (Niskanen et al., 1993;

Björkman et al., 1997; Sargeant et al., 1997; Kramps et al., 1999; Nylin,

Stroger, Ronsholt, 2000; Beaudeau et al., 2001; Chanlun et al., 2002).

In quanto economico e di rapida esecuzione questo test ELISA sul latte di

massa può certamente essere considerato un valido esame per controlli

programmati negli allevamenti, al fine di valutare la sieroprevalenza e

l’eventuale circolazione di N. caninum (Frössling et al. 2002; Schares et al.,

2003).

Tuttavia, nel pool di latte prelevato ed esaminato non sono compresi animali

non in lattazione (animali giovani, tori, vacche in asciutta) e vacche per le

quali il latte viene escluso, in quanto affette da mastiti o perché sotto terapia

farmacologica. Per ovviare a questo problema ciò che si può fare è effettuare

ripetuti prelievi nel tempo.

Infine, la sensibilità del test ELISA sul latte di massa è ovviamente influenzata

dal tasso di infezione dell’allevamento. Varcasia et al. (2006) hanno riportato

che i casi di siero-prevalenza inferiore a 10-15%, il rischio di falsi negativi

non è trascurabile.

- 82 -

3. AVIDITY TEST

L’accertamento dell’indice di “avidità” degli anticorpi contro N. caninum, ha

reso possibile differenziare gli eventi abortivi in seguito alle infezioni recenti

(bassa avidità) da quelle in seguito alla riattivazione di un’infezione cronica

(avidità alta). Gli anticorpi prodotti all’inizio dell’infezione da Neospora

caninum, infatti, hanno una bassa affinità (potere legante) rispetto agli

anticorpi prodotti più tardi; si possono così differenziare gli animali infettatisi

di recente, da bovini che si sono contaminati da tempo.

Attraverso opportuni test sierologici (ELISA) si può misurare questa

differenza di affinità degli Ac-anti Neospora caninum, definita appunto come

avidità (avidity test) (Björkman et al., 1999; Schares et al., 2002; Sager et al.,

2001).

Björkman et al. (2003), hanno seguito un allevamento di vacche da latte per 3

anni dall’insorgenza dell’aborto endemico (introduzione di N. caninum per via

orizzontale). Gli autori hanno riportato come l’avidità delle IgG negli animali

sieropositivi aumenti da un valore di 30, all’inizio del periodo di osservazione,

fino a valori di 74 anche dopo 3 anni.

In particolare si è scoperto che il valore dell’avidità delle IgG può subire

queste variazioni nell’arco di tempo:

1. 21-40: periodo immediatamente successivo all’introduzione di N.

caninum in allevamento (minore avidità);

2. 41-60: dopo 1 anno;

3. 61-80: dopo 2-3 anni (maggiore avidità).

- 83 -

Concludendo, l’analisi dell’avidità di queste specifiche IgG rispecchia la

durata dell’infezione di N. caninum nei bovini. In particolare, l’avidità

aumenta durante il corso dell’infezione e rimane consistentemente alta negli

animali con infezione cronica (Björkman et al., 1999; Björkman et al., 2006).

4. IMMUNOCROMATOGRAFIA

Per la rapida ricerca di anticorpi nei bovini infetti da Neospora caninum può

essere impiegato il test di immunocromatografia (ICT) che utilizza un

antigene ricombinante di superficie di Neospora caninum (NcSAG1). L’ICT è

utilizzata soprattutto per discriminare i bovini sieropositivi dai bovini

sieronegativi al test IFAT.

Rispetto ai normali antigeni di superficie, gli antigeni ricombinanti utilizzati

per l’ICT hanno diversi vantaggi: sono di facile produzione, se ne producono

in grande quantità e possono essere facilmente e rapidamente standardizzati

per l’utilizzo. L’antigene NcSAG1 fatto esprimere da Escherichia coli, è

risultato un affidabile antigene per la diagnosi indiretta di Neospora caninum,

anche se utilizzato con test ELISA. L’ELISA rimane comunque un esame

laborioso, che richiede materiali ed attrezzature speciali per la sua

realizzazione. Al contrario il test ICT, è un test rapido che lo rende adatto alla

diagnosi in campo (Dubey, 2003).

Xuan, Zhang et al. (2004) sperimentarono questa tecnica mettendo a contatto

le strisce ottenute, con siero di animali siero positivi per l’infezione da

Neospora e con siero di animali positivi per l’infezione da T. gondii ma

negativi per Neospora caninum.

- 84 -

Le strisce si positivizzarono nel primo caso, mentre negli altri sieri testati non

si ottenne nessuna banda colorata sulle strisce (Fig. 29). Questi risultati

definirono L’ICT come un valido test per la ricerca di anticorpi contro N.

caninum, ma anche un valido test per discriminare in modo indiretto

l’infezione da Neospora da quella da Toxoplasma, infezioni che possono

naturalmente colpire cani, bovini, pecore, cavalli (Lindsay, Dubey et al.,

1999).

Fig. 29. ICT: campioni 1, 4 e 6 sono positivi per la ricerca di anticorpi anti-Neospora

caninum.

- 85 -


TTTTERAPIAERAPIAERAPIAERAPIA

E’ stata osservata in vitro la sensibilità del parassita a diversi principi attivi,

fra i quali i sulfamidici potenziati con gli inibitori della diidrofolato reduttasi

e alcuni farmaci anticoccidici (ionofori e non); occorre però ricordare che il

ciclo vitale del protozoo in vivo prevede lo sviluppo di stadi parassitari (le

cisti tissutali) resistenti, dati i loro caratteri fisici, all’azione dei farmaci

(Magnino et al., 2001).

I presidi farmacologici potrebbero dunque rivelarsi efficaci solo nei confronti

delle forme circolanti del parassita (tachizoiti), quando esso è in fase di

mobilitazione prima di infettare il feto e prima di raggiungere i tessuti nervosi

dove si insedierà in forma di cisti; al riguardo, non si dispone però di rilievi

oggettivi in base ai quali sia possibile consigliare tempi e durata di un

eventuale trattamento preventivo nei riguardi delle manifestazioni cliniche

della Neosporosi.

- 86 -

Peraltro, nonostante l’efficacia in vitro di alcuni farmaci, occorre anche

ricordare che il ciclo vitale di N. caninum non è assimilabile a quello dei

coccidi intestinali, che colonizzano le sole cellule dell’intestino e in quella

sola sede esplicano la loro azione patogena. In questo senso, soltanto studi

clinici accerteranno se i farmaci utilizzati per la terapia e profilassi delle

coccidiosi intestinali siano efficaci anche per il controllo della Neosporosi.

L’orientamento generale della comunità scientifica è peraltro di pronunciato

scetticismo, se non addirittura di radicale opposizione, nei riguardi di ogni

ipotesi di trattamento farmacologico della Neosporosi, anche perché non si

ritiene che alcun farmaco possa garantire la completa guarigione degli animali

infetti.

Anche se vari agenti antimicrobici sono stati testati, in vitro, contro N.

caninum, non c'è al momento un approccio terapeutico in grado di guarire una

bovina infetta.

Nel corso di uno studio effettuato da Kritzner, Sager et al. (2002) attraverso

l’utilizzo di vitelli infettati sperimentalmente con tachizoiti di N. caninum

(metà dose per via intravenosa e metà per via sottocutanea) e trattati con

Toltrazuril-sulfone (Ponazuril) per 6 giorni consecutivi, a partire dal primo

giorno successivo all’infezione, si sono ottenuti i seguenti risultati:

A) non è stato rilevato DNA del parassita (PCR) in tessuti potenzialmente

infettati da N. caninum, in vitelli sacrificati;

B) si è avuto un picco febbrile di minor intensità e durata (T° max 39,5),

rispetto agli animali non trattati nei quali si sono raggiunti anche i 40°

di temperatura rettale;

C) è stato rilevato un livello significativamente inferiore di anticorpi

verso N. caninum, rispetto ai controlli non trattati.

- 87 -

Infine, in un ulteriore esperimento, venne valutata la sensibilità in vitro di N.

caninum alla Nitazoxanide benzamide (2-acetolyloxy-N-(5-nitro 2-tiazolo)

(Esposito et al., 2004).

La Nitazoxanide è stata in origine utilizzata soprattutto come antielmintico ad

uso veterinario; oggigiorno se ne conosce invece l’ampio spettro d’azione

contro ad esempio parassiti intestinali, parassiti tessutali ed enterobatteri, che

possono infettare sia l’uomo che gli animali.

L’applicazione di questo farmaco include il trattamento in pazienti umani

affetti in particolare da Criptosporidiosi (Cryptosporidium spp.), parassita di

tipo intestinale, appartenente al Phylum Apicomplexa; per questa caratteristica

se ne studiò l’effetto in altri generi dello stesso Phylum, come Neospora

caninum e Toxoplasma gondii.

L’esperimento iniziò con l’infezione in vitro di un monostrato cellulare di

fibroblasti umani, inoculandolo con tachizoiti di N. caninum da una parte, e T.

gondii dall’altra. Venne in un secondo tempo aggiunta la Nitazoxanide; questo

trattamento durò per 8 giorni.

L’effetto del trattamento farmacologico sulla proliferazione dei tachizoiti fu

rilevata con PCR in tempo reale; si ebbe la dimostrazione di una distinta

inibizione della proliferazione di N. caninum, ma non dei tachizoiti di T.

gondii.

Il farmaco induceva nello specifico un’alterazione ultrastrutturale di N.

caninum, dimostrabile attraverso il microscopio elettronico a trasmissione,

come un’inibizione dell’attitudine da parte di N. caninum di penetrare e

colonizzare le cellule del monostrato. Il parassita non era infatti più in grado di

costituire una membrana intatta a livello di vacuoli parassitofori.

L’esperimento permise di definire la Nitazoxanide un farmaco ad effettiva

azione parassitocida per Neospora caninum.

- 88 -

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PPPPROFILASSIROFILASSIROFILASSIROFILASSI

� IGIENICO-SANITARIA

Allo stato attuale, non c'è un metodo efficace di controllo della Neosporosi

bovina. Occorre, dunque, in definitiva orientarsi a interventi di profilassi

diretta quali:

a) impedire ogni possibile contatto tra animali esterni o interni

all’allevamento e feti abortiti, invogli fetali o vitelli morti;

b) smaltimento controllato di feti abortiti e invogli fetali;

c) divieto di accesso dei cani stessi e a tutti gli altri animali estranei (volpi,

lupi, volatili, roditori...) alle aree adibite al deposito degli alimenti per i

bovini, per evitarne la contaminazione;

d) interventi che si devono comunque associare a quelli miranti alla

ricostituzione di un effettivo aziendale non infetto;

- 89 -

Il principale modo di trasmissione di N. caninum nella mandria è attraverso

l'infezione di feti in bovine cronicamente infette (trasmissione verticale).

Queste vacche cronicamente infette possono essere identificate sulla base dei

loro titoli sierologici o per una storia precedente di aborto da N. caninum o

d’infezione congenita (Moen, Wouda, Mul et al., 1998).

Sulla base di queste conoscenze, il controllo dell'infezione potrebbe

concentrarsi sulla riduzione del numero di vacche infette nella mandria e sulla

limitazione dell’introduzione di bovine da rimonta infette nella mandria.

La decisione di riformare anticipatamente vacche che hanno avuto una

diagnosi certa di aborto da N. caninum può essere presa sulla base del dato che

c'è un rischio più elevato di aborto ripetuto in questi animali (Thurmond,

1997).

Vacche sieropositive hanno anche un maggior rischio di aborto, e vi è una

probabilità molto alta d’infezione congenita nei vitelli nati da queste vacche

(Parè, Thurmond, Hietala, 1996; Waldner et al., 1998; Wouda, Moen, 1998).

Inoltre, è stato dimostrato che manze sieropositive hanno una ridotta

produzione lattea. Studi epidemiologici condotti in bovine da latte e da carne

hanno dimostrato che le bovine sieropositive hanno una più alta percentuale di

riforma anticipata per varie ragioni.

Tuttavia, la riforma di vacche o manze sieropositive, può essere una pratica

economicamente non attuabile in mandrie con elevata sieroprevalenza.

Il trasferimento di embrioni (embryo-transfer) in riceventi sieronegative è

stato dimostrato un metodo efficace nel prevenire la trasmissione verticale

(Baillargeon et al., 2001; Campero et al., 2003).

- 90 -

Non sono noti metodi provati ed efficaci per prevenire l’infezione post-natale

(trasmissione orizzontale). Comunque, sulla base dell'evidenza che il cane e

il coyote possano essere ospiti definitivi e della correlazione positiva tra la

presenza di cani negli allevamenti e la sieroprevalenza nella mandria, sarebbe

prudente prendere misure atte a ridurre il potenziale rischio di questo tipo di

trasmissione. Sarebbe consigliabile soprattutto la rimozione dall’ambiente dei

tessuti potenzialmente infetti, come feti abortiti e placente, che possono

fungere da potenziale fonte di infezione per gli ospiti sensibili.

Inoltre, dovrebbe essere minimizzata la contaminazione fecale di alimenti e

fonti di abbeverata da parte degli altri animali.

L’obiettivo deve mirare ad ottenere un’azienda Neospora-free.

- 91 -

� IMMUNIZZANTE

Per quanto riguarda la profilassi vaccinale, è stato

di recente messo a punto un vaccino inattivato,

ma non è stata ancora del tutto valutata la sua

efficacia nella riduzione delle infezioni fetali e

degli aborti in bovine infette, né nella prevenzione

dell’infezione postnatale di animali non infetti.

Bovilis NeoGuard®, un vaccino di Neospora

caninum, prodotto da Intervet Inc. (Schering-

Plough), si è stato dimostrato in grado di ridurre gli aborti in manze gravide

sane, infettate con N. caninum (Barajas et al., 2004). Il vaccino contiene

tachizoiti inattivati ed è adiuvato in SPUR (Havlogen). Viene somministrato

nel primo trimestre di gravidanza per assicurare la massima protezione

durante il secondo trimestre di gestazione, nel quale ci sono appunto i

maggiori rischi di aborto per N. caninum.

- 92 -

Tuttavia, sono scarsi i dati sulla vera efficacia di questo vaccino.

Il futuro sviluppo di una strategia immunizzante protettiva nei confronti di N.

caninum dipenderà dall’identificazione di uno o più antigeni

immunodominanti, da produrre in forma ricombinati e da somministrare

eventualmente insieme ad opportuni adiuvanti. Numerosi gruppi di ricerca

attualmente stanno identificando diversi antigeni di N. caninum

potenzialmente immuno-protettivi (Staska et al., 2000; Pinitkiatisakul et al.,

2004; Alaeddine et al., 2005; Wikman et al., 2005;).

- 93 -

PPAARRTTEE

SSPPEERRIIMMEENNTTAALLEE

- 94 -

SCOPO

Presso il Dipartimento di Produzioni Animali, con la collaborazione del

Dipartimento di Malattie Infettive dell’Università di Medicina Veterinaria di

Parma, è stato avviato uno studio sierologico riguardo la potenziale attitudine

di N. caninum di attraversare la barriera placentare, invadere il prodotto del

concepimento e causare quindi aborto o infezione congenita.

Lo studio è stato condotto attraverso la ricerca di anticorpi nel siero di sangue

prelevato da vitelli appena nati, ancora prima che questi potessero assumere

colostro dalla madre (prelievo precolostrale) ed assorbire quindi eventuali

anticorpi materni, divenendo di riflesso opportunamente sieropositivi, nel caso

di una madre infettata da N. caninum (passaggio immunità passiva colostrale).

L’eventuale riscontro di sieropositivà nel vitello in esame, deriva quindi da

un’attivazione dell’immunità attiva umorale dello stesso vitello, il quale

durante la vita intrauterina è venuto in diretto contatto con i tachizoiti ed

essendo in quel momento già immunocompetente ha avuto una propria attiva

produzione di anticorpi.

Inoltre, abbiamo messo a confronto due diversi esami sierologici, in

particolare un esame IFAT e un esame ELISA, col fine di capire quale dei due

test fosse più attendibile nel diagnosticare un’effettiva sieropositivà

nell’animale in esame.

- 95 -

MATERIALI E METODI

� Allevamento

Il lavoro che ho effettuato ha avuto l’obiettivo di valutare la sieroprevalenza di

N. caninum nel sangue precolostrale di vitelli nati nell’arco di 15 mesi (03/04-

06/05) in un allevamento nel veronese, nel quale è stata più volte riscontrata la

sieropositività per N. caninum.

L’allevamento è situato in pianura e non è circondato da altri allevamenti. È

costituito da animali vaccinati regolarmente per IBR e per BVD.

Vi è inoltre la presenza di 3 cani, che girano liberamente all’interno e

all’esterno dell’allevamento, i quali possono venir così in stretto contatto con

le vacche presenti. L’allevatore non ha escluso la possibilità che i cani

possano aver assunto placente o invogli fetali nella loro vita, per il motivo che

molte volte le vacche abortivano di notte e l’allevatore ne veniva a conoscenza

solo il giorno seguente. Non è stato possibile il prelievo di sangue in questi

animali.

� Animali

Sono state analizzate un totale di 106 vacche da latte in riproduzione, di età e

razza diverse. Inoltre, sono stati eseguiti i prelievi di sangue pre-colostrale da

tutti i vitelli nati nell’arco di tempo di osservazione dell’allevamento. In totale

sono stati controllati 46 vitelli. Infine, è stato eseguito un prelievo dei liquidi

accumulati nella cavità toracica ed addominale di tutti i feti abortiti. In totale

si sono avuti 8 aborti.

- 96 -

� Esami sierologici

All’ inizio dello studio, tutti gli animali in riproduzione dell’allevamento sono

stati analizzati per valutare la sieroprevalenza di Neospora caninum.

Dopodiché, ogni qualvolta si aveva la nascita di un vitello nell’allevamento, si

eseguiva il prima possibile:

1. prelievo di sangue al vitello, prima ancora dell’assunzione di colostro

dalla madre (prelievo precolostrale);

2. prelievo ematico alla madre stessa, per capire se nel frattempo l’animale

potesse aver subito una sieroconversione; 5 vacche hanno infatti subito

una sieroconversione (trasmissione orizzontale).

I prelievi sono stati eseguiti attraverso l’utilizzo di provette vacutainer senza

anticoagulante per permettere la separazione del coagulo dal siero. Nella

vacca il prelievo è stato eseguito dalla vena coccigea, nel vitello invece

attraverso la vena giugulare.

• IFAT

Le analisi con test IFAT, sono state eseguite presso l’Istituto di Malattie

Infettive dell’Università di Parma. Per l’esame si è proceduto in questo modo.

In una piastra a fondo piatto si pongono 290 µl di tampone per fluorescenza

(PBS) per pozzetto. In ogni pozzetto si aggiungono 10 µl di siero in esame

(diluizione 1:30) e dei controlli positivi a 1:300 e un controllo negativo (siero

fetale bovino). Si agita e si trasferiscono con una pipetta 10 µl della soluzione

ottenuta in precedenza, in una nuova piastra (piastra figlia). Si aggiungono

quindi alla piastra figlia 90 µl di PBS, ottenendo così una diluizione del siero

1:300.

- 97 -

Si distribuiscono sui vetrini contenenti l’antigene (tachizoiti interi di N.

caninum), 15 µl di siero diluito 1:300 per pozzetto. Si pongono quindi i vetrini

ad incubare in camera umida 1 ora a 37° C, dopodiché si effettua un lavaggio

(30 passaggi in PBS e 30 in acqua deionizzata) e si asciuga.

In ogni pozzetto del vetrino asciutto si pongono 15 µl di globulina anti-IgG

bovina, coniugata con fluorescina (Sigma®), si mette ad incubare in camera

umida 1 ora a 37°C dopodiché si effettua un ulteriore lavaggio (30 passaggi in

PBS e 30 in acqua deionizzata) e si asciuga. Si procede infine alla lettura al

microscopio a fluorescenza.

I sieri risultati positivi (fluorescenza verde) alla diluizione 1:300, vengono

testati alla diluizione 1:600 per accertarne la positività sierologica. Si parte

dalla diluizione precedentemente operata (1:300). Si prelevano 150 µl della

diluizione 1:300 e si pongono su una piastra a fondo piatto, unitamente a 150

µl di PBS (diluizione 1:600). Si agita, e si trasferiscono 15 µl di sospensione

così preparata di siero diluito 1:600 nei pozzetti dei vetrini per fluorescenza.

Si mette ad incubare il tutto in camera umida (1 ora a 37°C).

Si esegue poi un lavaggio (30 passaggi in PBS e 30 in acqua deionizzata) e si

asciuga. In ogni pozzetto del vetrino asciutto si pongono 15 µl di globulina

anti-IgG bovina coniugata con fluorescina (Sigma®) e si lascia incubare in

camera umida 1 ora a 37°C. Si procede quindi ad un lavaggio (30 passaggi in

PBS e 30 in acqua deionizzata), quindi si asciuga e si procede infine alla

lettura dei vetrini al microscopio a fluorescenza.

- 98 -

• ELISA

Tutte le analisi sono state eseguite presso il Laboratorio di Immunologia

dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, nella sede di Padova.

Tutti i campioni di siero prelevati, sono stati analizzati per la ricerca di

anticorpi verso N. caninum utilizzando il kit ELISA di tipo non competitivo

(ISCOM-ELISA).

ELISA non competitiva (Neospora caninum ISCOM-ELISA SVANOVIR)

Tale reazione utilizza un antigene ottenuto da proteine di membrana di N.

caninum, incorporate in un complesso immunostimolante (ISCOM): si tratta

di particelle del diametro di circa 40 nm, contenenti saponina, colesterolo e

fosfolipidi, che hanno la proprietà di catturare in modo selettivo le proteine

anfipatiche, quali quelle della membrana del parassita, riducendo quindi la

presenza delle proteine intracellulari, principali responsabili delle reazioni

aspecifiche (Björkman et al., 1997).

Il test prevede la diluizione 1:100 dei campioni in esame nell’apposito

tampone diluente. Gli anticorpi verso N. caninum, se presenti, si legano

all’antigene fissato sul fondo del pozzetto.

L’anticorpo monoclonale anti-IgG di bovino coniugato con l’enzima

perossidasi, aggiunto successivamente, si lega al complesso antigene-

anticorpo determinando, dopo contatto con il substrato enzimatico, lo

sviluppo di una reazione colorimetrica quantificabile mediante lettura della

OD allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda pari a 650 nm.

- 99 -

RISULTATI

I risultati della valutazione di sieroprevalenza dell’azienda sono riportati nelle

Figure 30, 31 e 32, e mostrano una sieropositivà all’infezione da N. caninum

del 23% (24/106).

Tra questi animali, nel periodo in cui ho esaminato l’allevamento, nacquero 46

vitelli. Nove delle vacche che hanno partorito in questo periodo era

sieropositive per N. caninum al primo prelievo effettuato all’inizio dello studio

(Fig. 30, 33 e 34). Tutti i 9 vitelli sono risultati positivi al prelievo

precolostrale all’esame IFAT ed all’esame ELISA per N. caninum (Fig. 30 e

34).

Fig. 30. Diagramma della sieroprevalenza di Neospora caninum nelle vacche testate, sulla loro discendenza e sui feti abortiti.

- 100 -

Figura 31: sieroprevalenza da N. caninum

nell'allevamento

0

20

40

60

80

100

SIEROPREVALENZA

NELL'ALLEVAMENTO

24 82

VACCHE POSITIVE VACCHE NEGATIVE

Figura 32: percentuale di sieroprevalenza da

N. caninum in allevamento

23%

77%

VACCHE POSITIVE

VACCHE NEGATIVE

- 101 -

0

5

10

15

20

25

30

35

40

numero animali

Figura 33: relazione sierologica tra madre e

vitello

VITELLO NEGATIVO

VITELLO POSITIVO

VITELLO NEGATIVO 0 31

VITELLO POSITIVO 9 6

MADRE POSITIVA MADRE NEGATIVA

0

2

4

6

8

10

Numero

animali

VITELLO

NEGATIVO

VITELLO

POSITIVOSieroprevalenza dei vitelli

nati da madre

sieropositiva

Figura 34: vitelli nati da MADRE SIEROPOSITIVA

all'esame IFAT

0

10

20

30

40

Numero

animali

VITELLO

NEGATIVO

VITELLO

POSITIVO

sieroprevalenza

dei vitelli nati da

madre

Figura 35: vitelli nati da MADRE SIERONEGATIVA

all'esame IFAT

- 102 -

Nelle Figure 34 e 35, vengono riportati i risultati riguardanti la trasmissione

verticale dell’infezione da N. caninum, e dimostrano che:

1. le madri sieropositive che hanno partorito, hanno dato alla luce tutti

vitelli sieropositivi (Figura 34 );

2. le madri sieronegative hanno partorito, invece, soprattutto animali

sieronegativi, ma talvolta anche animali sieropositivi (Figura 35).

Infine, è stato eseguito l’esame sierologico IFAT sui versamenti toracici ed

addominale degli 8 feti abortiti, 5 dei quali nati da madri sieropositive per N.

caninum. Le vacche hanno abortito fra i 4 e i 6 mesi di gravidanza. Tutti i

campioni testati hanno avuto esito negativo, anche nei casi di madri

sieropositive per N. caninum.

Per quanto riguarda il confronto tra esame IFAT ed ELISA i risultati che si

sono ottenuti sono per lo più concordanti tra loro.

La quasi totalità degli animali sieronegativi con IFAT, risultarono

sieronegativi anche con test ELISA, mentre alcuni animali sieronegativi con

esame IFAT risultavano positivi con ELISA (Fig. 36). Questo risultato è la

prova della maggiore sensibilità del test ELISA ma sicuramente della

maggior specificità dell’esame IFAT.

- 103 -

Figura 36: relazione tra risultati ottenuti con

esame IFAT ed esame ELISA sul totale delle

vacche esaminate

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

ANIMALE POSITIVO

IFAT

ANIMALE NEGATIVO

IFAT

risultati esame IFAT

nu

me

ro a

nim

ali

ANIMALE NEGATIVO

ELISA

ANIMALE POSITIVO

ELISA

- 104 -

DISCUSSIONE DEI RISULTATI

In presenza di un eccesso di aborti nell’azienda e una volta avanzato più volte

il sospetto diagnostico di Neosporosi, sulla base dell’anamnesi,

dell’epidemiologia (presenza di cani in allevamento) e degli aspetti clinici

rilevati, sono stati necessari accertamenti specifici di laboratorio sul siero del

sangue degli animali presenti in allevamento e sui rispettivi vitelli, ed esami

sui feti abortiti.

Prima di tutto, lo studio, anche se condotto su un numero esiguo di animali, ha

ulteriormente confermato l’efficacia della trasmissione verticale di N.

caninum, nel nostro caso del 100% (Fig. 30 e 34).

Ciò che è inoltre emerso, è la nascita di vitelli sieropositivi all’esame

precolostrale, nati da madri sieronegative al momento del parto (ma

sieropositive al primo prelievo ematico). Questo peculiare evento può essere

dovuto ad una caratteristica fluttuazione del titolo anticorpale della vacca nel

periodo peri-parto (Pereira-Bueno et al., 2000; Conrad et al., 1993).

Questo evento è stato riscontrato anche da numerosi altri ricercatori (Davison

et al., 1999; Sager et al., 2001).

Questa osservazione può venir rilevata anche durante la gravidanza (Dannatt

et al., 1998; Parè et al., 1997), durante un aborto (Guy et al., 2001; Schares et

al., 1999; Wouda et al., 1998) o appunto immediatamente dopo il parto

(Stenlund et al., 1999).

- 105 -

Il livello anticorpale può quindi scendere al di sotto del limite di sensibilità del

test sierologico utilizzato (cut-off) e può essere così causa di falsi-negativi

(Dannatt et al., 1998; Dijkstra et al., 2003; Wouda et al., 1998).

Le bovine sieronegative all’esame IFAT ed ELISA e gravide portavano invece

a termine regolarmente la gravidanza, con la nascita di vitelli a loro volta

sieronegativi.

Tra la totalità degli animali testati, erano presenti anche 7 figlie di vacche

ancora presenti in allevamento: 3 di queste figlie testate (sangue non

precolostrale) sono risultate sieropositive, appoggiando la potenziale

implicazione di una trasmissione orizzontale di N. caninum in allevamento,

dovuta appunto alla presenza di cani (e/o topi?).

Nel complesso, durante il periodo dello studio, si sono avuti 8 aborti. Solo 5 di

questi erano di vacche sieropositive per N. caninum all’esame sierologico. Le

altre 3 bovine sono invece risultate sieronegative. Questo potrebbe far pensare

alla presenza di un’ulteriore agente eziologico (infettivo od alimentare) in

allevamento.

Dai feti abortiti, inoltre, è stato fatto un prelievo dei versamenti toracico ed

addominale fetale e su questi materiali è stata eseguita una titolazione

anticorpale. La sieronegatività è stata rilevata in tutti i campioni in esame.

Questo risultato deve comunque essere interpretato con attenzione, poiché il

feto è immunocompetente a partire dai 4-5 mesi di vita endouterina: i feti

abortiti quindi prima di questa età possono risultare sieronegativi anche se

infetti.

- 106 -

Ugualmente gli anticorpi non saranno rilevabili nel caso che il decorso

dell’infezione sia breve e porti rapidamente a morte il feto.

Un’ulteriore evenienza di falsa sieronegatività dei feti è dovuta alla

degradazione degli anticorpi in rapporto all’autolisi del feto, suffragata dal

fatto che molte volte i feti abortiti durante la notte, venivano prelevati

dall’allevatore la mattina.

Comunque, un titolo IFAT negativo per N. caninum nel feto non esclude la

possibilità d’infezione, ed un titolo positivo non dimostra che questa infezione

sia l’effettiva causa dell'aborto.

Per quanto riguarda, infine, il raffronto dei risultati ottenuti testando gli

animali con esame IFAT ed ELISA, ciò che si è ottenuto è che la quasi totalità

degli animali sieronegativi con IFAT, sono risultati sieronegativi anche con

test ELISA. Solo 12 animali su 106 sono risultati sieropositivi al test ELISA in

disaccordo con il risultato del test IFAT (Fig. 36).

Inoltre, ciò che ho riscontrato dal confronto dei risultati ottenuti con i due test,

è che 4 vitelli all’esame precolostrale sono risultati positivi al test ELISA (ma

sieronegativi al test IFAT), sebbene nati da madri sieronegative con entrambi i

test.

Questo risultato è la prova della maggiore sensibilità del test ELISA ma

sicuramente della maggior specificità dell’esame IFAT.

- 107 -

CONCLUSIONI

La Neosporosi Bovina è un’importante malattia protozoaria responsabile di

aborto nell’allevamento bovino. Il peso economico è ingente, sia per quanto

concerne le conseguenze sanitarie, sia per quanto riguarda i mezzi di controllo

da mettere in atto.

Oggigiorno è difficile applicare un protocollo univoco per la gestione sanitaria

ed economica della Neosporosi.

Una migliore conoscenza delle modalità di infezione e di trasmissione di

Neospora caninum, unitamente all’implicazione delle conoscenze sui

potenziali vaccini ed eventuale chemioprofilassi, potranno consentire di

combattere in maniera migliore questa patologia.

Per poter far ciò, sicuramente la prima cosa da mettere in atto è quella

dell’esatta formulazione di una diagnosi di certezza che, spesso, passa

attraverso un lavoro unitario tra diversi soggetti dell’allevamento. È

consigliabile, comunque, utilizzare l’esame sierologico per una diagnosi

aziendale piuttosto che limitarlo a singoli animali, prelevando quindi anche

campioni di sangue da soggetti non coinvolti nell’episodio di aborto ma

potenzialmente recettivi: il confronto dei risultati degli esami eseguiti,

permetterà di giudicare al meglio se N. caninum è veramente coinvolto

nell’episodio di malattia osservato. Tutto deve essere accompagnato da un

bagaglio di conoscenze sulle diverse metodiche diagnostiche utilizzabili, per

sapere quali sono i pregi ma anche gli eventuali limiti applicativi.

- 108 -

Per il momento, la combinazione dell'esame sierologico e della ricerca diretta

del parassita si è dimostrata una strategia utile per identificare gli allevamenti

infetti e ha permesso di rivelare l'ampia diffusione di N. caninum nelle aziende

bovine italiane; questi strumenti applicati su larga scala potranno permettere di

definire ancor meglio la prevalenza della Neosporosi bovina nel patrimonio

zootecnico del nostro Paese e offriranno il necessario supporto diagnostico per

il controllo dell'infezione una volta che ci si orienti al risanamento delle

aziende.

- 109 -

BIBLIOGRAFIA

1. “Filiere” n° 209 (3 novembre 2004) inserto de “La settimana veterinaria” n° 451.

2. Ajioka et al. (2001) Toxoplasma gondii genomics: shedding light on pathogenesis and

chemotherapy. Expert Reviews in Molecular Medicine, Cambridge University Press.

3. Alaeddine F, Müller N, Hemphill A. (2005) Reduced infection and protection from

clinical signs of cerebral Neosporosis in C57BL/6 mice vaccinated with recombinant

microneme antigen NcMIC1. COST 854: “New aspects on transmission and

diagnosis of ruminant protozoal abortifacients”; Derio, Spain 17. - 19. June 2004.

4. Anderson ML, Blanchard PC, Barr BC et al. (1991) Neospora-like protozoan

infection as a major cause of abortion in California dairy cattle. J. Am. Vet. Med.

Assoc. 198; 241-244.

5. Anderson ML, Barr BC, Conrad PA. (1994) Protozoal causes of reproductive failure

in domestic ruminants. Vet Clin North America. Food Animal Practice 10; 439-461.

6. Anderson ML, Palmer CW, Thurmond MC, Picanso JP, Blanchard PC, Breitmeyer

RE, Layton AW, McAllister M, Daft B, Kinde H, Read DH, Dubey JP, Conrad PA e

Barr BC. (1995) Evaluation of abortions in cattle attributable to Neosporosis in

selected dairy herds in California. J. Am. Vet. Med. Assoc. 207; 1206–1210.

7. Anderson ML, Reynolds JP, Rowe JD. (1997) Evidence of vertical transmission of

Neospora infection in dairy cattle. J Am Vet Med Assoc 210; 1167-1172.

8. Anderson ML, Andrianarivo AG, Conrad PA. (2000) Neosporosis in cattle. Animal

Reproduction Science; 60-61, 417-431.

9. Barling KS, Sherman M, Peterson MJ. (2000) Spatial associations among density of

cattle, abundance of wild canids, and seroprevalence to Neospora caninum in a

population of beef calves. J Am Vet Med Assoc 217; 1361-1365.

10. Barling KS, Lunt DK, Snowden KF et al. (2001) Association of serologic status for

Neospora caninum and postweaning feed efficiency in beef steers. J Am Vet Med

Assoc 219; 1259-1262.

11. Barr BC, Anderson ML, Dubey JP, Conrad PA. (1991) Neospora-like protozoal

infections associated with bovine abortions. Vet Pathol 28; 116.

- 110 -

12. Barr BC, Conrad PA, Breitmeyer R, et al. (1993) Congenital Neospora infection in

calves born from cows that had previously aborted Neospora-infected fetuses: four

cases (1990-1992). J Am Vet Med Assoc 202; 113-117.

13. Barr BC, Anderson ML, Sverlow KW, Conrad PA. (1995) Diagnosis of fetal

Neospora infection with the Neospora indirect fluorescent antibody test (IFAT). Vet

Rec 137; 611-613.

14. Bartels CJM, Wouda W e Schukken YH. (1999) Risk factors for Neospora caninum-

associated abortion storms in dairy herds in the Netherlands (1995 to 1997).

Theriogenology 52; 247–257.

15. Basso W, Venturini L, Venturini MC. et al. (2001) First isolation of Neospora

caninum from feces of a naturally infected dog. J Parasitol 87; 612-618.

16. Beaudeau F, Belloc C, Seegers H, Assie S, Sellal E, Joly A. (2001) Evalutation of a

blocking ELISA for the detection of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) antibodies

in serum and milk. Veterinary Microbiology 80; 329-337.

17. Baillargeon P, Fecteau G, Parè J. et al. (2001) Evaluation of the embryo transfer

procedure proposed by the International Embryo Transfer Society as a method of

controlling vertical transmission of Neospora caninum in cattle. J Am Vet Med Assoc

218; 1803-1806.

18. Bech-Sabat G, Lopez-Gatius F, Santolaria P, Garcia-Ispierto I, Pabon M, Nogareda C,

Yaniz JL e Almeria S. (2007) Progesterone supplementation during mid-gestation

increases the risk of abortion in Neospora-infected dairy cows with high antibody

titres. Vet. Parasitol. 145; 164–167.

19. Bergeron N, Fecteau G, Villeneuve A, Girard C, Parè J. (2001) Failure of dogs to

shed oocysts after being fed bovine foetuses naturally infected by Neospora caninum.

Veterinary Parasitology 97; 145-152.

20. Bjerkås I, Mohn SF, Presthus J. (1984) Unidentified cyst-forming sporozoan causing

encephalomyelitis and myositis in dogs. Z. Parasitenkd 70; 271-274.

21. Bjerkås I, Dubey JP. (1991) Evidence that Neospora caninum is identical to the

Toxoplasma-like parasite of Norwegian dogs. Acta Vet Scand 32; 407-410.

- 111 -

22. Björkman C, Holmdahl OJ, Uggla A. (1997) An indirect enzyme-linked

immunoassay (ELISA) for demonstration of antibodies to Neospora caninum in

serum and milk of cattle. Veterinary Parasitology 68; 251-260.

23. Björkman C, Näslund K, Stenlund S, Maley SW, Buxton D, Uggla A. (1999) An IgG

avidity ELISA to discriminate between recent and chronic Neospora caninum

infection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 11; 41-44.

24. Björkman C, Uggla A. (1999) Serological diagnosis of Neospora caninum infection.

Int J Parasitol 29; 1497-1507.

25. Björkman C, McAllister M, Frössling J, Näslund K, Leung F, Uggla A. (2003)

Application of the Neospora caninum IgG avidity ELISA in assessment of chronic

reproductive losses after an outbreak of Neosporosis in a herd of beef cattle. Journal

of Veterinary Diagnostic Investigation 15; 3-7.

26. Björkman C, Alvarez-Garcia G, Conraths FJ, Mattsson JG, Ortega-Mora LM, Sager

H. e Schares G. (2006) Neospora caninum IgG avidity tests: an interlaboratory

comparison. Vet Parasitol 140; 273-280.

27. Baszler TV, Knowles DP, Dubey JP, Gay JM, Mathison BA, McElwain TF. (2004)

Serological diagnosis of bovine Neosporosis by Neospora caninum monoclonal

antibody-based competitive inhibition enzyme-linked immunosorbent assay (CI-

ELISA). J Am Vet Med Assoc, may 15; 1597-1604.

28. Caetano-da-Silva A, Ferre I, Collantes-Fernandez E, Navarro V, Aduriz G, Ugarte-

Garagalza C e Ortega-Mora LM. (2004) Occasional detection of Neospora caninum

DNA in frozen extended semen from naturally infected bulls. Theriogenology 62;

1329–1336.

29. Campero CM, Moore DP, Lagomarsino H, et al. (2003) Serological status and

abortion rate in progeny obtained by natural service or embryo transfer from

Neospora caninum seropositive cows. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 50;

458-460.

30. Canada N, Meireles CS, Ferriera P, da Costa JMS e Rocha A. (2006) Artificial

insemination of cows with semen in vitro contaminated with Neospora caninum

tachyzoites failed to induce Neosporosis. Vet. Parasitol. 139; 109–114.

- 112 -

31. Chahan B., I. Gaturaga X., Huang M., Liao S., Fukumoto H., Hirata Y., Nishikawa

H., Suzuki C., Sugimoto H., Nagasawa K., Fujisaki I., Igarashi T., Mikami and X.

Xuan. (2003) Serodiagnosis of Neospora caninum infection in cattle by enzyme-

linked immunosorbent assay with recombinant truncated NcSAG1. Vet. Parasitol.

118; 177-185.

32. Chanlun A, Näslund K, Aiumlamai S, Björkman C. (2002) Use of bulk milk for

detection of Neospora caninum infection in dairy herds in Thailand. Veterinary

Parasitology 110; 35-44.

33. Chi J, Van Leeuwen J, Weersink A. et al. (2002) Direct production losses and

treatment costs from bovine viral diarrhoea virus, bovine leukosis virus,

Mycobacterium avium subspecies paratubercolosis and Neospora caninum. Prev. vet.

Med. Vol. 55, n° 2, pp. 137.

34. Cole R.A., Lindsay D.S., Dubey J.P., Blagburn B.L. (1993) Detection of Neospora

caninum in tissue sections using a murine monoclonal antibody. Journal of Veterinary

Diagnostic Investigation, Vol. 5, Issue 4; 579-584.

35. Collantes-Fernandez E, Rodriguez-Bertos A, Arnaiz-Seco I et al. (2006) Influence of

the stage of pregnancy on Neospora caninum distribution, parasite loads and lesions

in aborted bovine foetuses. Theriogenology 65; 629-641.

36. Conrad PA, Sverlow KW, Anderson ML, et al. (1993) Detection of serum antibody

responses in cattle with natural or experimental Neospora infections. J Vet Diagn

Invest 5, 572-578.

37. Dannatt, L. (1998) Neospora caninum antibody levels in an endemically infected

dairy herd. Cattle Practice 5; 335–337.

38. Davison HC, Otter A, Trees AJ. (1999) Estimation of vertical and horizontal

transmission parameters of Neospora caninum infections in dairy cattle. Int J Parasitol

29; 1683-1689.

39. Davison HC, Guy CS, McGarry JW, Guy F, Williams DJ, Kelly DF, Trees AJ. (2001)

Experimental studies on the transmission of Neospora caninum between cattle.

Research in veterinary science 70; 163-168.

- 113 -

40. Dijkstra T., Eysker M., Schares G., Conraths F.J., Wouda W., Barkema H.W. (2001)

Dogs shed Neospora caninum oocysts after ingestion of naturally infected bovine

placenta but not after ingestion of colostrums spiked with Neospora caninum

tachyzoites. Int J Parasitol 31; 747-752.

41. Dijkstra T, Barkema HW, Eysker M, Hesselink JW, Wouda W. (2002) Natural

transmission routes of Neospora caninum between farm dogs and cattle. Vet Parasitol

105; 99-104.

42. Dijkstra T, Barkema HW, Hesselink JW, Wouda W. (2002) Point source exposure of

cattle to Neospora caninum consistent with periods of common housing and feeding

and related to the introduction of a dog. Vet Parasitol 105; 89-98.

43. Dijkstra T, Barkema HW, Eysker M, Beiboer ML e Wouda W. (2003) Evaluation of a

single serological screening of dairy herds for Neospora caninum antibodies. Vet.

Parasitol. 110; 161–169.

44. Dubey JP, Carpenter JL, Speer CA, Topper MJ, Uggla A. (1988) Newly recognized

fatal protozoan disease of dogs. J Am Vet Med Assoc 192; 1296-1285.

45. Dubey JP, Lindsay DS. (1996) A review of Neospora caninum and Neosporosis. Vet

Parasitol 67; 1-59.

46. Dubey JP. (1999) Neosporosis in cattle: biology and economic impact. J. Am. Vet.

Med. Assoc. 214; 1160-1163.

47. Dubey JP, Barr BC, Barta JR, Bjerkås I, Björkman C, Blagburn BL, Bowman DD,

Buxton D, Ellis JT, Gottstein B, Hemphill A, Hill DE, Howe DK, Jenkins MC,

Kobayashi Y, Koudela B, Marsh AE, Mattsson JG, McAllister MM, Modry D, Omata

Y, Sibley LD, Speer CA, Trees AJ, Uggla A, Upton SJ, Williams DJ e Lindsay DS.

(2002) Redescription of Neospora caninum and its differentiation from related

coccidia. Int J Parasitol. 32; 929-946.

48. Dubey JP. (2003) Review of Neospora Caninum and Neosporosis in animals. Korean

J Parasitol 41; 1-16.

49. Dubey JP, Buxton D, Wouda W. (2006) Pathogenesis of bovine Neosporosis. J Comp

Pathol. 134; 267-289.

- 114 -

50. Dubey JP, Schares G. e Ortega-Mora LM. (2007) Epidemiology and control of

Neosporosis and Neospora caninum. Clinical Microbiology Reviews, vol. 20, n. 2;

323-367.

51. Esposito M, Stettler R, Leepin A, Rossignol JF and Hemphill A. (2004) In vitro

efficacy of the 5-nitrothiazole analogue Nitazoxanide against Neospora caninum and

Toxoplasma gondii tachyzoites. COST 854: “New aspects on transmission and

diagnosis of ruminant protozoal abortifacients”; Derio, Spain 17. - 19. June 2004.

52. Fenger C.K., Granstrom D.E., Langemeier J.L., Stamper S. (1997) Epizootic of

equine protozoal myeloencephalitis on a farm. J. Am. Vet. Med. Assoc. 210: 923-927.

53. Ferre I, Aduriz G, del-Pozo I, Regidor-Cerrillo J, Atxaerandio R, Collantes-Fernandez

E, Hurtado A, Ugarte-Garagalza C e Ortega-Mora LM. (2005) Detection of Neospora

caninum in the semen and blood of naturally infected bulls. Theriogenology 63;

1504–1518.

54. French NP, Clancy HC, Davison HC, Trees AJ. (1999) Mathematical models of

Neospora caninum infection in dairy cattle: transmission and options for control. Int.

J. for Parasitology 29; 1671-1704.

55. Frössling J, Bonnett B, Lindberg A, Björkman C. (2002) Validation of a Neospora

caninum Iscom ELISA without a gold standard. Preventive Veterinary Medicine 57;

141-153.

56. Frössling J, Lindberg A, Björkman C. (2003) Evaluation of an Iscom Elisa used for

detection of antibodies to Neospora caninum in bulk milk. Preventive veterinary

medicine 63; 135-141.

57. Gondim LFP, Gao L, McAllister MM. (2002) Improved production of Neospora

caninum oocysts, cyclical oral transmission between dogs and cattle, and in vitro

isolation from oocysts. J Parasitol 88; 1159-63.

58. Gondim LFP, McAllister MM, Pitt WC, Zemlicka DE. (2004) Coyote (canis latrans)

are definitive hosts of Neospora caninum. Int J Parasitol 34; 159-161.

59. Gondim LFP, McAllister MM, Mateus-Pinilla NE, Pitt WC, Mech LD, Nelson ME.

(2004) Transmission of Neospora caninum between wild and domestic animals. J

Parasitol 90; 1361-1365.

- 115 -

60. Gonzales L., Buxton D., Atxaerandio R., Adùriz G., Maley S., Marco J.C. (1999)

Abortos en la especie bovina asociados a Neospora caninum en el norte de España.

Veterinary Record.

61. Guy CS, Williams DJL, Kelly DF, McGarry JW, Guy F, Björkman C, Smith RF,

Trees AJ. (2001) Neospora caninum in persistently infected, pregnant cows:

spontaneous transplacental infection in associated with an acute increase in maternal

antibody. Veterinary record 149; 443-449.

62. Hemphill A., Vonlaufen N. (2003) Generation of parasite cysts in cultured cells

instead of living animals. Peter Maier, Scientific Adviser of the 3R Research

Foundation.

63. Hemphill A., Vonlaufen N. (2005) Development of an in vitro culture model to

generate Neospora caninum and Toxoplasma gondii oocysts and sporozoites. 3R-

Project 85-03.

64. Hietala SK, Thurmond MC. (1999) Postnatal Neospora caninum transmission and

transient serologic responses in two dairies. International Journal for Parasitology 29;

1669-1676.

65. Ho MS, Barr BC, Marsh AE, Anderson ML, Rowe JD, Tarantal AF, Hendricks AG,

Sverlow K, Dubey JP, Conrad PA. (1996) Identification of bovine Neospora parasites

by PCR amplification and specific small-subunit rRNA sequence probe hybridization.

Journal of clinical microbiology 34; 1203-1208.

66. Huang X., Xuan X., Hirata H., Yokoyama N., Xu L., Suzuki N. and Igarashi I. (2004)

Rapid immunochromatographic test using recombinant SAG2 for detection of

antibodies against Toxoplasma gondii in cats. J. Clin. Microbiol. 42; 351-353.

67. Kramer L e Buxton D. (2007) Toxoplasma, Diagnostic techniques in Protozoal

Abortion in Farm Ruminants, Guidelines for Diagnosis and Control. Eds Ortega-Mora

LM, Gottstein B., Conraths F.J. and Buxton D. CABI (Oxfordshire, UK), pp. 122-

136.

- 116 -

68. Kramps JA, van Maanen C, Stienstra G, Quak S, Brinkhof J, Ronsholt L, Nylin B.

(1999) A simple, rapid and reliable enzyme-linked immunosorbent assay for the

detection of bovine virus diarrhoeas virus (BVDV) specific antibodies in cattle

serum, plasma and bulk milk. Veterinary Microbiology 64; 135-144.

69. Kritzner S, Sager H, Blum J, Krebber R, Grief G and Gottstein B. (2002) An

explorative study to assess the efficacy of Toltrazuril-sulfone (Ponazuril) in calves

experimentally infected with Neospora caninum. Annals of Clinical Microbiology

and Antimicrobials, vol.1.

70. Lindsay DS, Dubey JP, Duncan RB. (1999) Confirmation that the dog is a definitive

host for Neospora caninum. Vet Parasitol 82; 327-333.

71. Lindsay DS, Lenz SD, Dykstra CC, Blagburn BL and Dubey JP. (1998) Vaccination

of mice with Neospora caninum: response to oral challenge with Toxoplasma gondii

oocysts. J. Parasitol. 84; 311-315.

72. Magnino S, Bandi C, Vigo PC, Bazzucchi C, De Giuli I, Fabbi M e Genchi C. (2001)

La Neosporosi del bovino: aggiornamento su una malattia emergente. OEVR.org.

73. Marsh A.E., Howe D.K., Wang G., Barr B.C., Cannon N, Conrad P.A. (1999)

Differentiation of Neospora Hughesi from Neospora caninum based on their

immunodominant surface antigen, SAG1 and SRS2. International Journal for

Parasitology, volume 29, number 10; 1575-1582.

74. Marquer A. (1999) Epidémiologie et diagnostic de la néosporose bovine. Revue

bibliographique. Thèse pour le doctorat vétérinaire. Alfort; p.117.

75. McAllister M. (2000) Neospora caninum: ITS oocysts and ITS identity: an opinion.

Parasitol Res (short communication).

76. McAllister MM, Dubey JP, Lindsay DS, Jolley WR, Wills RA and McGuire AM.

(1998) Dogs are definitive hosts of Neospora caninum. Int. J. Parasitol. 28; 1473-

1478.

77. McAllister MM, Dubey JP, Lindsay DS, Jolley WR, Wills RA, McGuire AM. (1998)

Dogs are definitive hosts of Neospora caninum. In J Parasitol 28; 1473-1478.

- 117 -

78. Min Liao, Zhang S, Xuan X, Zhang G, Huang X, Igarashi I, Fujisaki K. (2005)

Development of rapid immunochromatographic test with recombinant NcSAG1 for

detection of antibodies to Neospora caninum in cattle. Clinical and diagnostic

laboratory immunology, vol. 12, n. 7; pp. 885-887.

79. Moen AR, Wouda W, Mul MF, Graat EAM e van Werven T. (1998) Increased risk

of abortion following Neospora caninum abortion outbreaks: a retrospective and

prospective cohort study in four dairy herds. Theriogenology 49; 1301–1309.

80. Moskwa B, Cabaj W, Pastusiak K, Bien J, Wojdan J, Sloniewski K. (2003) The

suitability of milk in detection of Neospora caninum infection in cows. Conference

proceedings, COST 854 “Protozoal reproduction losses in farm animals”,

Wusterhausen, Germany, 9.

81. Müller N., Sager H., Hemphill A., Mehlhorn H., Heydorn A. O., Gottstein B. (2001)

Comparative molecular investigation of Nc5-PCR amplicons from Neospora caninum

NC-1 and Hammondia heydorni. Pub Med.

82. Nishikawa Y, Claveria FG, Fujisaki K and Nagasawa H. (2002) Studies on

serological cross-reaction of Neospora caninum with Toxoplasma gondii and

Hammondia heydorni. J. Vet. Med. Sci. 64; 161-164.

83. Nishikawa Y, Kousaka Y, Tragoolpua K, Xuan X, Makala L, Fujisaki K, Mikami T

and Nagasawa H. (2001) Characterization of Neospora caninum surface protein

NcSRS2 based on baculovirus system and its application for Serodiagnosis of

Neospora infection. J. Clin. Microbiol. 39; 3987-3991.

84. Niskanen R. (1993) relationship between the levels of antibodies to bovine viral

diarrhoea virus in bulk tank milk and the prevalence of cows exposed to the virus.

Veterinary Record 133; 341-344.

85. Nylin B, Stroger U, Ronholt L. (2000) A retrospective evaluation of a Bovine

Herpesvirus-1 (BHV-1) antibody ELISA on bulk tank milk samples for classification

of the BHV-1 status of Danish dairy herds. Preventive Veterinary Medicine 47; 91-

105.

- 118 -

86. Ortega-Mora LM, Ferre I, del Pozo I, Caetano da Silva A, Collantes-Fernandez E,

Regidor-Cerrillo J, Ugarte-Garagalza C e Aduriz G. (2003) Detection of Neospora

caninum in semen of bulls. Vet. Parasitol. 117; 301–308.

87. Otranto D, Lazari A, Testini G, et Al. (2003) Seroprevalence and associated risk

factors of Neosporosis in beef and dairy cattle in Italy. Vet Parasitol 118; 7-18.

88. Parè J, Thurmond MC, Hietala SK. (1996) Congenital Neospora caninum infection in

dairy cattle and associated calf hood mortality. Canadian Journal of veterinary

research 60; 133-139.

89. Parè J, Thurmond MC e Hietala SK. (1997) Neospora caninum antibodies in cows

during pregnancy as a predictor of congenital infection and abortion. J. Parasitol. 83;

82–87.

90. Parè J, Fecteau M, Fortin M, et al. (1998) Seroepidemiology study of Neospora

caninum in dairy herds. J Am Vet Med Assoc 213; 1595-1598.

91. Pereira-Bueno J, Quintanilla-Gozalo A, Seijas-Carballedo A, Costas E e Ortega-Mora

LM. (2000) Observational studies in Neospora caninum infected dairy cattle: pattern

of transmission and age-related antibody fluctuations. Int. J. Parasitol. 30; 906–909.

92. Peters M., Lütkefels E., Heckeroth A.R., Schares G. (2001) Immunohistochemical

and ultrastructural evidence for Neospora caninum tissue cysts in skeletal muscles of

naturally infected dogs and cattle. International Journal for Parasitology, Volume 31,

Issue 10, August 2001; 1144-1148.

93. Petersen E, Lebech M, Jensen L, Lind P, Rask M, Bagger P, Björkman C, Uggla A.

(1999) Neospora caninum infection and repeated abortions in humans. Emerging

infection disease 5; 278-280.

94. Pfeiffer DU, Williamson NB, Thornton RN. (1997) A simple spreadsheet simulation

model of the economic effects of Neospora caninum abortions in dairy cattle in New

Zealand. Epidémiologie et santé animale, 31-32.

95. Pfeiffer DU, Williamson NB, Reichel MP, Wichtel JJ e Teague WR. (2002) A

longitudinal study of Neospora caninum infection on a dairy farm in New Zealand.

Prev. Vet. Med. 54; 11–24.

- 119 -

96. Pinitkiatisakul S, Mattsson JG, Wikman M, Friedman M, Bengtsson KL, St åhl S,

Lundén A. (2004) Immunisation of mice against Neosporosis with recombinant

NcSRS2 iscoms. COST 854: “New aspects on transmission and diagnosis of

ruminant protozoal abortifacients”; Derio, Spain 17. - 19. June 2004.

97. Reichel MP, Ellis JT. (2006) If control of Neospora caninum infection is technically

feasible does it make economic sense? Vet. Parasitol.

98. Reichel MP, Ellis JT, Dubey JP. (2007) Neosporosis and hammondiosis in dogs. The

Journal of Small Animal Practice, Volume 48, Number 6, June 2007; 308-312.

99. Romero J J e Frankena K. (2003) The effect of the dam-calf relationship on serostatus

to Neospora caninum on 20 Costa Rican dairy farms. Vet. Parasitol. 114; 159–171.

100. Sager H, Fischer I, Furrer K, Strasser M, Waldvogel A, Boerling P, Audige L,

Gottstein B. (2001) A Swiss case-control study to assens Neospora caninum

associated bovine abortions by PCR, histopathology and serology. Veterinary

Parasitology 102; 1-15.

101. Sanderson MS, Gay JM, Baszler TV. (2000) Neospora caninum seroprevalence and

associated risk factors in beef cattle in the north western United States. Vet Parasitol

90; 15-24.

102. Sargeant JM, Kelton DF, Martin SW, Mann ED. (1997) Evaluation of a bulk-milk

ELISA test for t he classification of herd-level bovine leukaemia virus status.

Preventive veterinary medicine 31; 223-230.

103. Schares G, Rauser M, Zimmer K, Peters M, Wurm R, Dubey JP, de Graaf DC,

Edelhofer R, Mertens C, Hess G e Conraths FG. (1999) Serological differences in

Neospora caninum-associated epidemic and endemic abortions. J. Parasitol. 85; 688-

694.

104. Schares G, Barwald A, Staubach C, et al. (2002) P38-avidity-ELISA: examination of

herds experiencing epidemic or endemic Neospora caninum-associated bovine

abortion. Vet Parasitol 106; 293-305.

- 120 -

105. Schares G, Barwald A, Staubach C, Ziller M, Kloss D, Wurm R, Rauser M, Labohm

R, Drager K, Fasen W, Hess RG, Conraths FJ. (2003) Regional distribution of bovine

Neospora caninum infection in the German state of Rhineland-Palatinate modelled by

Logistic regression. International Journal for Parasitology 33; 1631-1640.

106. Schares G, Barwald A, Staubach C, Wurm R, Rauser M, Conraths FJ, Schroeder C.

(2004) Adaptation of a commercial ELISA for the detection of antibodies against

Neospora caninum in bovine milk. Veterinary Parasitology 120; 55-63.

107. Schock A, Innes EA, Tamane I, Latham SM, Wastling JM. (2001) Genetic and

biological diversity among isolates of Neospora caninum. Parasitol 123; 13-23.

108. Serrano E, Ferre I, Osoro K, Aduriz G, Mateos-Sanz A, Martìnez A, Atxaerandio R,

Hidalgo CO e Ortega-Mora LM. (2006) Intrauterina Neospora caninum inoculation of

heifers. Vet. Parasitol. 135; 197–203.

109. Serrano-Martìnez E, Collantes-Fernandez E, Rodriguez-Bertos A, Casas-Astos E,

Alvarez-Garcia G, Chavez-Velasquez A e Ortega-Mora LM. (2004) Neospora

species-associated abortion in alpacas (Vicugna pacos) and llamas (Llama glama).

Vet. Rec. 155; 748–749.

110. Staska LM, Davies CJ, Brown WC, McGuire TC, Suarez CE, Park JY, Mathison BA,

Abbott JR, Baszler TV. (2000) Identification of vaccine candidate peptides in the

NcSRS2 surface protein of Neospora caninum by using CD4+ cytotoxic T

lymphocytes and gamma interferon secreting T lymphocytes of infected Holstein

cattle. Veterinary Parasitology 125; 89-93.

111. Stenlund S, Kindahl H, Magnusson U, Uggla A, Björkman C. (1999) Serum antibody

profile and reproductive performance during two consecutive pregnancies of cows

naturally infected with Neospora caninum. Vet Parasitol 85; 227-234.

112. Thilsted JP, Dubey JP (1989) Neosporosis-like abortions in a herd of dairy cattle. J

Vet Diag Invest 1; 205-209.

113. Thornton RN, Gajadhar A, Evans J. (1994) Neospora caninum abortion epidemic in a

dairy herd. N.Z. Vet J. 42; 190-191.

114. Thurmond MC, Anderson ML, Blanchard PC (1995) Secular and seasonal trends of

Neospora abortion in California diary cows. J Parasit 81; 364-367.

- 121 -

115. Thurmond MC, Hietala SK (1996) Culling associated with Neospora caninum

infection in dairy cows. Am J Vet Res 57; 1559-1562.

116. Thurmond MC, Hietala SK (1997) Effect of congenitally-acquired Neospora caninum

infection on risk of abortion and subsequent abortions in dairy cattle. Am J Vet Res

58; 1381-1385.

117. Thurmond MC, Hietala SK. (1997) Effect of Neospora caninum infection on milk

production in first-lactation dairy cows. J Am Vet Med Assoc 210; 672-674.

118. Thurmond MC, Hietala SK, Blanchard PC (1999) Predictive values of fetal

histopathology and immunoperoxidase staining in diagnosing bovine abortion caused

by Neospora caninum in a dairy herd. J Vet Diagn Invest 11; 90-94.

119. Timothy V, Baszler, Lawrence JC, Gay C, Maureen Long T, Bruce Mathison A.

(1999) Detection by PCR of Neospora caninum in fetal tissues from spontaneous

bovine abortions. Vet Parasitol 72; 32-43.

120. Uggla A, Stenlund S, Holmdahl OJ, Jakubek EB, Thebo P, Kindahl H, Björkman C.

(1998) Oral Neospora caninum inoculation of neonatal calves. International Journal

for Parasitology 28; 1467-1472.

121. Van Maanen C, Wouda W, Schares G, Von Blumröder D, Conraths FJ, Norton R,

Williams DJ, Esteban-Redondo I, Innes EA, Mattsson JG, Björkman C, Fernandez-

Garcia A, Ortega-Mora LM, Müller N, Sager H e Hemphill A. (2004) Vet Parasitol

126; 351-364.

122. Varcasia A, Capelli G, Ruiu A, Ladu M, Scala A e Björkman C. (2006) Prevalence of

Neospora caninum infection in Sardinian dairy farms (Italy) detected by ISCOM-

ELISA on tank bulk milk. Parasitol. Res. 98; 264-267.

123. Waldner CL, Janzen ED, Ribble CS. (1998) Determination of the association between

Neospora caninum infection and reproductive performance in beef herds. J Am Vet

Med Assoc 213; 685-690.

124. Wapenaar W, Barkema HW, Vanleeuwen JA, McClure JT, O’Handley RM, Kwok

OC, Thulliez P, Dubey JP e Jenkins MC. (2007) Comparison of serological methods

for the diagnosis of Neospora caninum infection in cattle. Vet. Parasitol 143; 166-

173.

- 122 -

125. Wouda W, Dubey JP, Jenkins MC. (1997) Serological diagnosis of bovine fetal

Neosporosis. J Parasitol 83; 545-547.

126. Wouda W, Moen AR, Schukken YH. (1998) Abortion risk in progeny of cows after a

Neospora caninum epidemic. Theriogenology 49; 1311-1316.

127. Yaeger MJ, Shawd-Wessels S, Leslie-Steen P. (1994) Neospora abortion storm in a

Midwestern dairy. J Vet Diagn Invest 6; 506-508.

- 123 -

SITI INTERNET

1. http://niah.naro.affrc.go.jp

2. http://www.aipvet.it/APIVMeetings/2003_ATTI_APIV/ATTIAPIV2003.htm

3. http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol5no2/petersen.htm

4. http://www.dapschagen.nl

5. http://www.encolombia.com/veterinaria/acovez26101evaluacion

6. http://www.forschung3r.ch

7. http://www.k-skate.edu

8. http://www.memorias.ioc.fiocruz.br

9. http://www.neosporosis.com

10. http://www.oevr.org

11. http://www.patologiaveterinaria.cl

12. http://www.scielo.org.pe/scielo

13. http://www.ucm.es

14. http://www.uni-sz.bg

15. http://www.utu.edu.uy

16. http://www.veterinariosursf.com.ar

17. http://www.veths.no

18. http://www.vetmed.wisc.edu/pbs/vetpara/gallery.html

19. http://www.visionveterinaria.com/rojas/tpp0303volumen3neosporosis.htm

20. http://www.vuien.ac.at/i116/neospora/images/Neospora_EZ.jpg

21. http://www.vu-wien.ac.at

22. http://www.zoologix.com/horse/Datasheets/EquineProtozoalMyeloencephalitis.htm

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