TropTrace“GeneticControlofTropicalTunaSustainabilityandTraceability”

Prof.FaustoTinti

PianodiFormazionedellaBorsadiStudio

Lefrodialimentarisonounfenomenodiffusoealtamentedannosotantopericonsumatoriquantoperle

imprese.L’erroneaetichettatura,indicatadallalocuzione“aliudproalio”,èunproblemachestacrescendo

soprattuttoperviadelsovrasfruttamentodideterminaterisorseerimpiazzoconspecieaffinidiminore

valorecommercialeeprovenientidadifferentiareegeograficherispettoaquelledichiaratesuiprodottiin

commercio.

Per fronteggiare la piaga del fenomeno fraudolento, l’utilizzo e lo sviluppo di metodologie per

l’autenticazionealimentaresonoandati incontroadunacresciutaesponenzialmentenell’ultimadecade.

Tra le diversemetodologie descritte negli ultimi anni, quelle basate sul DNA sono sicuramente le più

promettenti:essefornisconoinformazionimoltopreciseepossonoessereapplicateatuttelediversefasi

di vita di una specie e suquasi tutti i tipi di campioni (Lenstra 2003; Rasmussen andMorrissey 2008).

Pertanto l’analisidelDNAsiprofilacomeun’analisimoltoefficace,essendo ilDNAunamolecolamolto

stabile nell’ambiente, che presenta un profilo identico in tutte le cellule e manifesta una sufficiente

variabilità interspecifica, tale da consentire l’identificazione di specie (Céspedes et al.,2000). Queste

metodologiesibasanosolitamentesullaReazioneaCatenadellaPolimerasi(PCR),checonsentediprodurre

unaquantitàillimitatadicopiediunospecificomarcatoregeneticoingradodidiscriminaretralediverse

specie.Infunzionedituttociò,questimetodid’analisisonopassatidall’essereconsideratiun’areadinicchia

adiventareunadellepiùdiffuseapplicazionibiotecnologichealivelloglobale(Lou2015).

Sebbenelamaggiorpartedellecertificazioniecontrollistandardrimangonoprincipalmentefocalizzatisu

prodottiagricoliesuquelliderivantidall’allevamentodelbestiame(EuropeanCommission’sDatabaseof

Origin&Registration; http://ec.europa.eu/agriculture/quality/door/list.html), il settore nel quale si è

manifestata una presa di posizione netta sull’importanza dell’utilizzo di questi test è stato quello del

“seafood”(Marianietal.,2015).L’incrementodelleindaginimolecolarinelsettoredelseafoodhatuttavia

evidenziato una poca trasparenza nelle operazioni commerciali, sollevando polveroni mediatici spinti

soprattuttodaorganizzazioniambientaliste(Marianietal.,2014).

Nel settore seafood ci sono sicuramente delle specie focali: tra cui spiccano tutte quelle specie

comunemente raggruppate con l’indicazione “tonno”. Nel loro insieme, le sette specie di tonno

commercialmentepiù importantisonotra iprincipaliprodotti itticidelpianeta:nelsolo2014lecatture

totali ammontavano a circa 5,5milioni di tonnellate (FAO 2014), evidenziando l’importanza di questo

gruppotassonomicocomerisorsaalimentareperl’uomo.Lespecietropicalidestinateall’inscatolamento

fornisconoproteineabbondantiepococostoseperimercatidituttoilmondo,mentrepiccolequantitàdi

filettiesashimidispeciedipiùaltaqualità(i.e.Thunnusthynnus)sifannostradaversoimercatiricchiin

Asia,EuropaeNordAmerica. Il tonno inscatolarappresenta laconserva itticapiùvendutasulmercato

mondiale,conunvolumed’affarichesiaggiraintornoai19,3miliardidieurol’anno(FAO2014).Ilvalore

dimercatodeltonno inscatolaraggiunge livelliapicali in Italia,cherappresentaunodeipiù importanti

mercatimondialiedilsecondopiùgrandeproduttoreinEuropa.

Differenti protocollimolecolari sono stati testati e validati per la corretta identificazioni delle speciedi

tonno all’interno delle scatolette, al fine di fornire alle autorità, all’industria e ai consumatori validi

strumentidicontrollochepossanogarantirelasicurezzaalimentareelacorrettacommercializzazionedi

questiprodotti.Tuttavia,l’applicabilitàdeiprotocollimolecolarisuitonniinscatolaèancoracircondatada

alcuneincertezzelegateprincipalmenteallaquantitàequalitàdelDNAestraibile.IlDNAdiquestiprodotti

risultainfattiesserealquantodegradatoeframmentatoacausadeiprocessidilavorazioneeconservazione

mediantecotturadellamateriaprimaesuccessivaimmersionenelliquidodigoverno,pergarantirelaloro

conservazioneamedioelungotermine(HammesandHertel2003).

DescrizioneIlprogettoTROPTRACEsiproponel'obiettivodieffettuareunaricercacheportiallasostenibilitàdella

pescadeitonnitropicali,allacaratterizzazioneedallasicuratracciabilitàdeiprodottilungolafiliera

produttivadeltonnoinscatola,attraversol’utilizzodistandardizzateeinnovativetecnichemolecolari,al

finedievidenziareecontrastarepossibilifrodialimentari,comeperesempioquelladell’erronea

etichettatura.

Sottoquestoobiettivogenerale,sonostatiidentificatiduequestioni-chiaveditiposcientifico:

1) Ledifficoltànelcombinareedarmonizzaredatieconoscenzeutiliallagestioneintegratadistock

condivisifralediverseCommissionitonniereelediverseareegestionalipossonoesseresuperate

dallamigliore comprensione delle dinamiche ecologiche ed evolutive delle popolazioni di tonni

tropicali su tutto l'arealedidistribuzione. Inparticolare,vièun’urgentenecessitàdi sviluppare

modelligestionalicheutilizzinodatiindipendentidaquellidapesca,perdescrivereledinamichedi

popolazione con maggiore realismo biologico e per armonizzare la gestione degli stock. In

particolare,glistockditonnopinnagialla(Thunnusalbacares),sonofortementesfruttatidaalcuni

decenniascalaglobale.Datigenomicirecentementesviluppatiindicanolapresenzadiunpiùalto

livello di strutturazione geneticadi quanto assuntodalle Commissioni tonniere (Pecoraro et al.,

2016).Lapresenzadistrutturaall’internodiunapopolazionepuòrappresentareunfattoredirischio

perlaperditadidiversitàselaspecieinesameèfortementesfruttatacomenelcasodeltonnopinna

gialla.Lesottopopolazionichesubisconounariduzioneindimensioneriesconoacontrobilanciare

attraversoilflussogenicolamaggioreperditadivariabilitàdovutoall’effettodelladerivagenetica.

Inognimodo,leconseguenzegenetichealungoterminesonoesasperateperlemetapopolazioniin

quanto subiscono frequenti colli di bottiglia associati ad eventi regolari di estinzione e

ricolonizzazione. A tal proposito, per stabilire se le popolazioni di tonnopinna gialla sono state

ridotte a livelli critici per ilmantenimento della diversità genetica, in questo progetto verranno

effettuatestimedelladimensionedellapopolazioneeffettiva(Ne),chenonsonomaistatepresein

esameperquestaspecie.

2) Mantenerelatracciabilitàdeiprodotti inunafilieracomplessacomequelladeltonno,èimpresa

assai ardua. Ricostruire la storia di ogni confezione, attraverso tutti i fornitori a livello globale,

evitandodiandare incontroaderroridietichettaturadichiarandonelleconfezioniunaspecieal

postodiun’altra,èundovereperleaziendeproduttriciedunanecessitàpericonsumatori.Atal

proposito, TropTrace si prefigge di costruire un sistema di tracciabilità genetica in grado di

monitorareilpercorsodellamateriaprimadalmarealletavoledeiconsumatori.Unsistemache

possaessereassociatoaquelligiàadoperatidalleaziendeechepossafarsigarantedellalottaalle

frodialimentarieallapescaillegale.Unchiaroobiettivodelprogettoèquellodiutilizzaretessuti

delle specie di tonno comunemente inscatolate, che sono andati incontro a diversi processi di

lavorazione,inmododasvilupparedegliefficaciapproccimolecolaricheconsentanodidiscriminare

tralediversespecieindipendentementedallaqualitàedellaquantitàdelDNAadisposizione.Un

sistema in grado di assicurare la completa tracciabilità dei prodotti, in grado di smascherare

eventualifrodiechepossaconsentireintempibrevidirisalireadpossibilianomalielungolafiliera

produttiva.

Programmadiformazione

Il progetto di formazione sarà articolato al fine di ottenere dati scientifici per assicurare la

caratterizzazioneetracciabilitàdellespeciediimportanzacommercialelungolafilieraproduttiva

deltonnoinscatola.

Il/Laborsistasaràformatonelleseguentiattività

ü Campionamento

Lostudiosifocalizzeràsullequattroprincipalispecieditonnodestinateall’inscatolamento:i)tonno

pinnagialla(Thunnusalbacares);ii)tonnoobeso(Thunnusobesus);iii)tonnettostriato(Katsuwonus

pelamis)eiltonnoindopacifico(Thunnustonggol).Perognispecieverrannoanalizzatitessuticon

quattro diversi livelli di lavorazione (crudo, cotto, sterilizzato1 e sterilizzato2), che verranno

campionatipressoiprincipaliimpiantiditrasformazioneecommercializzazionedeltonnoalivello

globale.Alfinedigarantirelasignificativitàstatistica,leanalisiperognilivelloverrannoripetutein

modoindipendente3volteall’internodellaspecie,dellivellodilavorazioneedell’areadipesca,

peruntotaledi168campioni(Tabella1).

Tabella1_Disegnodicampionamento

AreaYFT BET SKJ TTON

crudo cotto ster.1 ster.2 crudo cotto ster.1 ster.2 crudo cotto ster.1 ster.2 crudo cotto ster.1 ster.2

AO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X

IO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X

EPO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X

WCPO 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X 3X

ü EstrazioneDNA

Ladifficoltàmaggiorenell’analisidelDNAprovenientedamatricicomplesse,comequelladeltonno

in scatola, è rappresenta certamente dalla sua estrazione. Risulta quindi fondamentale

l’ottimizzazionedellemetodicheestrattiveattraversoilbilanciamentodialcunicriteridigiudizio,

comeperesempio:buonaresafinaleequalitàdelDNAestratto,rapiditàdiesecuzione,economicità

e capacità di processare contemporaneamentemolti campioni. In una prima fase del progetto,

differentiprotocollidiestrazionedelDNAverrannotestatisullediversetipologieditessuto,alfine

divalutareecompararelaloroefficaciainfunzionedeicriteridigiudiziosopracitati.Nellospecifico,

verrannocomparati5metodidiestrazionealfinedivalutarelediverserese,interminidiqualitàe

quantitàdelDNAestratto (Chapelaetal.,2007):1)WizardDNACleanUpSystem(Promega);2)

Nucleospin (Clontech);3) GenomicPrep (Amersham Pharmacia Biotech); 4) CTAB precipitation

method;GeneralRapidEasyExtractionSystem(GREES)DNAKit(InCuraSrl,Italy);5)SSTNE.

Tuttigliestratti(triplicati)verrannoquantificatialQubit,misuandol’assorbanzadelDNAestrattoa

260nm,econtrollandol’impuritàdeiprodottiproteicia280nm.

ü DNAbarcoding

IprocessidilavorazionedeltonnoinscatolacausanoladegradazionedelDNAefannoemergere

difficoltà oggettive nella scelta di regioni target, che possano consentire la discriminazione

diagnosticatralespecieconsideratenelpresentestudio.

L’amplificazionedelgeneperilcitocromob(cytb),chesitrovasulgenomamitocondriale,verrà

eseguita, utilizzando un cocktail di primer, che consentirà di scegliere sequenze target

sufficientemente corte (come descritto in Botti and Giuffrà 2010). La struttura dei primer che

compongonoilcocktail(dal5’al3’)include:

1) unaporzionedel“universalsequencingprimer”(i.e.M13)(partialuniversalprimer,PUP),

chehalafunzionedifacilitarelaseguenteletturadell’interasequenzatarget,partendoda

unsingolofilamentoattraversol’allungamentodelframmentodiPCRamplificato;

2) unaporzione‘readstart’(RS),chefacilital’interpretazionedellasequenzediognifilamento

amplificato.

3) una porzione complementare alla regione fiancheggiante della sequenza target (cocktail

portion,CP).Lacomposizionedellaregionein3’nelleporzioniforwardereversedelcocktail

diprimerèdeterminatainbaseaipolimorfisminotidelleregioniCP,alfinediamplificarele

speciedinostrointeresse.

Fig.1_Rappresentazionegraficadeiprocessidiamplificazioneesequenziamento.

Gliampliconiottenutiverrannosequenziatiusando:i)unprimeruniversale(UP)al5’;ii)laregione

RS;iii)unaporzionenonpolimorficadelCPal3’(Fig.1).

InfunzionedelgradodidegradazionedelDNAestratto,sarannoamplificati3diversiframmentidi

lunghezzadiversa:

1) frammentoABdi226bpcon85SNPsidentificati;

2) frammentoAdi109bpcon45SNPsidentificati;

3) frammentoBdi95bpcon36SNPsidentificati.

Perogniframmentoverrannoutilizzatidiversicocktaildiprimereprimerdisequenziamento.

ü Analisidati

LesequenzeottenuteverrannoanalizzateconilprogrammaMEGA7(MolecularEvolutionGenetics

Analysis)edinfinelesequenzeconsensoverrannoconfrontateconlesequenzepresentiinGenBank

usandoilBLAST(BasicLocalAlignementSearchTool)dellaNCBI(NationalCenterforBiotecnology

Information,USA)perl’identificazionedelframmento.

1. Risultatiattesi

GliobiettiviprincipalidiTropTracesonoquellidiotteneredatiscientificisolidieindipendentidai

datidipescaperridurre il rischiodideterioramentodellepopolazionidi tonnopinnagialla,eal

tempostessodicreareunsistemaditracciabilitàsicuroedefficacechepossagarantirelacorretta

commercializzazionedeitonnitropicali,smascherandopotenzialifrodialimentari.

Gli obiettivi e i risultati del progetto TropTrace avranno un considerevole impatto su diversi

utilizzatorifinali: ilprogrammadiricercamiraarisponderesiaalleesigenzesocio-economichedi

consumatori, produttori e organizzazioni gestionali, sia alle necessità di avanzamento tecnico-

scientifico,fornendostrumentichepossonomigliorareigiàesistentisistemiditracciabilitàlungola

complessafilieraproduttivadeltonnoinscatola.

Generando informazioni accurate e affidabili sulla dimensione effettiva di popolazione (Ne) si

potrannomigliorare imodelli attuali di valutazione delle risorse, con potenziali benefici per gli

organidecisionaliprepostiallagestioneecosistemicadegli stock.Allo stesso tempo, sipotranno

delineare validi riferimenti per azioni di contrasto alle frodi alimentari e alla pesca illegale da

intraprenderedapartedell'industriadellapesca.Leindustrieconservierepotrannotrarrevantaggio

daidatierisultatidiTropTracepervalutaresoluzionitecnologichealternativeagliattualisistemidi

tracciabilità e rendere così i loro prodotti più sostenibili, attribuendo valore aggiunto con

certificazionidiqualitàambientale.