LA BIOLOGIA MOLECOLARE IN LABORATORIO:

PRESENTE E FUTURO

Trento 26 Novembre 2012

P. Lanzafame

U.O. Microbiologia e Virologia - Trento

Come chi stando per terra raccoglie le mele da un albero alto e rigoglioso può raggiungere solo quelle pochissime situate vicino al tronco, mentre la quasi totalità rimangono lontane e irraggiungibili, così nella valutazione delle malattie umane fino ad ora si è potuto comprendere e quindi mettere in atto misure diagnostiche e terapeutiche solo di pochi e facilmente accessibili processi patologici

F. Collins 2001

La biologia molecolare è una branca della

biologia che studia gli esseri viventi a livello dei

meccanismi molecolari alla base della loro

fisiologia, concentrandosi in particolare sulle

interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine

e acidi nucleici (DNA e RNA).

Per biologia molecolare si definiscono, in

genere, una serie di tecniche che consentono la

rilevazione, l'analisi, la manipolazione,

l'amplificazione e la copia degli acidi nucleici

• 1960: Lei ha un’ epatite da siero

• 1970: Lei ha un’ epatite da virus non A-non B

• 1990: Lei ha un’ epatite da HCV

• 2000: Lei ha un epatite da HCV genotipo 1

• 2010: Lei ha un epatite da HCV genotipo 1 con

un polimorfismo CC del gene IL28B sul

cromosoma 19, le probabilità di risposta al

trattamento sono buone

• 2011: Il genotyping SNPs rs8099919 nel gene

IL28B è associato con la progressione

dell’epatite C ad infezione cronica e con il

fallimento terapeutico

• Alcuni esperimenti negli anni trenta e quaranta fornirono le basi su cui la disciplina sarebbe poi nata: nel 1935 si collegò per la prima volta l'ereditarietà ai cromosomi.

• Il termine biologia molecolare risale al 1938, coniato da Warren Weaver, direttore della fondazione Rockfeller,.

• Nel 1943 Avery correlò il trasferimento di tratti somatici tra ceppi batterici al DNA

• Nel 1953 Hershey e Chase dimostrarono che il materiale genetico è costituito dal DNA.

• La nascita della biologia molecolare si può però far risalire alla scoperta della struttura del DNA da parte di Watson e Crick.

• Meselson e Stahl nel 1958 dimostrarono il meccanismo di replicazione del DNA e poco dopo il codice genetico fu decodificato dal gruppo di Crick.

Nel 1953, la scoperta della struttura a doppia elica del DNA (James Watson e

Francis Crick ) ha segnato il passaggio alle biotecnologie innovative e la nascita dell’

“ingegneria genetica”

• Il dogma centrale della biologia molecolare è il principio secondo il quale il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale e parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine. In questo processo sono identificabili tre punti: l'informazione genetica èconservata nel DNA, che viene trasformato sotto forma di RNA, il quale viene successivamente tradotto in proteine, la forma "operativa" dell'informazione contenuta nel genoma.

• Questo costituisce il meccanismo di base dell'espressione dei geni e la direzione fondamentale del flusso di informazione genetica.

LA TRAVERSATA DEL DESERTO

• 1965 – 1972: Da scienza teorica a scienza pratica

– 1973: primi sequenziamenti di Maxam-Gilbert

– 1975: sequenziamento metodo Sanger

– 1977: sequenziamento nuovo metodo di Maxam-Gilbert

• 1975 – 1980: La realizzazione delle tecniche di ingegneria genetica

• 1955: scoperta della DNA – polimerasi (A. Kornberg)

• 1983: la Polymerase chain reaction

• Il sequenziamento del DNA è un processo che

serve a mettere in fila le basi che costituiscono il

frammento di DNA in analisi, in modo da poterlo

leggere propriamente ed analizzare.

• Conoscere l'esatta sequenza delle basi è di

fondamentale importanza per tutti i modelli di

ricerca in biologia molecolare poiché rende

possibile stabilire la presenza di mutazioni, la

struttura primaria dei geni, la localizzazione di

specifici elementi (promotori, terminatori,

sequenze satelliti)

Sequencing methods: Sangersequencing

Gli studi sul DNA ed in particolare sul DNA ricombinante e l’evoluzione delle tecniche di sintesi chimica hanno permesso di realizzare sonde genetiche che, mediante reazioni di ibridazione degli acidi nucleici, sono state ampiamente impiegate per la rilevazione ed identificazione genica

Le basi teoriche della PCR furonodescritte da Gobind Khorana negli anni’70 (J Mol Biol 1971)

Suscitò particolare interesse solo nellametà degli anni ’80 quando Kary Mullis descrisse una tecnica che consentiva diottenere grosse quantità di DNA di geni a copia singola dal DNA genomico.

Sometimes a

good idea comes to youwhen you are not lookingfor it

K.B. Mullis

Prima della sua scoperta, per effettuare l'amplificazione del DNA con tecniche di laboratorio, era necessario aggiungere nuovo enzima dopo ciascun ciclo di riscaldamento, favorendo così la possibilità di inquinamento del campione e non permettendo la completa automazione del processo

• La procedura iniziale prevedeva l’utilizzo del frammentodi Klenow dell’enzima DNA polimerasi di E.Coli cheveniva aggiunto fresco ad ogni ciclo di amplificazione: questo enzima essendo termolabile veniva infattiinattivato durante il passaggio di denaturazione del DNA.

• L’avvento della Taq DNA polimerasi da Thermophilusaquaticus ha notevolmente facilitato l’automazione ditale procedura e ha permesso di lavorare a temperature di annealing e di estensione (72°C) molto più elevate, aumentando così la stringenza dell’ibridazione fra primer e templato e quindi la specificità del prodotto amplificato.

R. Williamson (Molecular genetics and the transformationof clinical chemistry, Atlanta 1989)

…la chimica clinica si trova in una crisi di identitàschiacciata fra le prime grandi esperienze di automazione e dal progredire della ricerca nell’ambito della diagnostica molecolare…..

….I grandi progressi analitici, la sempre migliore definizione delle patologie associate a difetti genetici e gli studi sulle basi molecolari della suscettibilità alle malattie complesse porteranno in un futuro non troppo lontano all’allargamento delle ricerche molecolari dai laboratori specialistici ai “laboratori tradizionali”.

Sta al chimico-clinico rispondere a questa sfida (o opportunità) riorganizzando e riqualificando la propria attività

……. dalla PCR convenzionale al multiplexing

alla Real Time PCR in «urgenza» a ……………!!!!!!!???

Hot start PCR Prevention of non-specific amplification

Nested PCR Designed mainly to increase sensitivity

RT-PCR Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) was developed to amplify RNA targets

Multiplex PCR Two or more sets of primers specific for different targets are introducedin the same tube, allowing multiple target sequences to be amplifiedsimultaneously

Broad-range PCR This application uses conserved sequences within phylogeneticallyinformative genetic targets to diagnose infection : e.g. universalprimers set to target herpesvirus infections

Arbitrarily primed PCR Involves the use of a single short (10-15 base) arbitrarily chosen primerto amplify genomic DNA under low-stringency conditions. Useful in determining whether 2 isolates of the same species are epidemiologically related

Quantitative PCR Normalization to internal or external standards. Value in determinig the clinical significance of a positive qualitative result for therapy, for clinical course and responsiveness to therapy

Variations and modifications of PCR

Sample extraction process

Instrument automates: manual steps are limited to loading and unloading, with reagents in sealed, bar-coded, ready-to-use cassettes for fast and accurate reagent data entry

Increasing use of automation

Automated Sequencing

HIV, HCV, HBV (viral genotyping and

resistance testing)

Assay for detection

•Chlamydia trachomatis•Neisseria gonorrhea•Mycobacterium avium•Mycobacterium intracellulare

Assay for quantification

•HIV-1 viral load quantification•CMV viral load quantification,•Hepatitis B virus (HBV) viral load•Hepatitis C virus (HCV viral load

Automated PCR System

Vortex and Dispense Sample into Port S

2

Insert Cartridge and Start Assay

3

Insert Swab into Elution Reagent Vial and

Break at Scope

1

Total Hands-On time <1 Minute

TOTAL AUTOMATION

•I microarrays sono caratterizzati da una potenziale capacità di rilevazione ed identificazione di migliaia di

geni microbici

•Sebbene inizialmente applicati alla ricerca, ed in

particolare a studi di espressione genica, il loro utilizzo

nei laboratori di microbiologia clinica sta diventando una realtà destinata, nell’immediato futuro, a modificare la

diagnostica microbiologica

•La capacità di rilevare un gran numero di patogeni e/o

monitorare la variabilità delle popolazioni microbiche e l’approccio metagenomico potrebbero modificare la

nostra capacità di comprensione delle malattie infettive

Evoluzione di Virochip™

Metagenomics for microbial detection / discovery

GenomicsGenomics

Deep SequencingDeep Sequencing MicroarraysMicroarraysMassively ParallelMassively Parallel

PCR and massPCR and mass

spectrometry (PLEXspectrometry (PLEX--ID)ID)

• La tradizionale ricerca genomica sui microrganismi determina le sequenze di DNA di singoli microbi, esaminando ceppi coltivati. La metagenomica è un approccio basato sull'utilizzo di tecniche genomiche moderne per lo studio di comunità microbiche direttamente nel loro ambiente naturale, evitando così il problema del prelevamento e coltivazione in laboratorio.

• Nella metagenomica, l’informazione sulle sequenze di DNA viene estratta da intere comunità microbiche in situ.

• Si basa sul sequenziamento del genoma di microrganismi di uno stesso luogo, la cui analisi effettuata nel proprio habitat naturale viene definita metagenoma. La maggior parte di questi organismi sono di difficile coltivazione a causa delle loro particolari esigenze.

HTCV, a novel human cardiovirus in children with respiratory / gastrointestinal infection

(Chiu, et al, 2008, PNAS)

Microarray for Pathogen Discovery

ABV, the likely etiologic agent of PDD (Kistler, et al., 2008, Virol J)

XMRV, a gammaretrovirus associated a type of hereditary prostate cancer (Urisman, et al, 2006, PloS Pathogens)

A new monkey adenovirus(Chiu, Stewart, 2003 Vir.)

A Metagenomics Investigation of the 2009 Influenza A H1N1 Pandemic (n=17)

2009 H1N1 is More Similar to Swine than Human Influenza H1N1 by Virochip

The PLEX-ID system combines the sensitivity of nucleic acid amplification with the accuracy of high-performanceelectrospray ionization mass spectrometry followed by base-composition analysis to identify a broad array ofmicroorganisms, including bacteria, viruses, fungi, and parasites. Certain PLEX-ID assays also provide information about drug resistance, virulence, and strain type. Anticipatedpublic health and biodefense applications include epidemiologicresearch and identification of emerging or previously unknownagents.

Finora riservati quasi esclusivamente all’uso nella ricerca

–M. tuberculosis, Salmonella, Shigella

–Sepsi

–SNPs (B19v, HCV)

Applicazioni in ClinicaStudio dei profili di espressione genica

Determinazione dei polimorfismi genomici dell’ospite

Proteomics meets microbiology

The ever increasing number of completed sequences for important

human pathogens will lead to a similar rise in demand for new methods to

facilitate identification and functional analysis of the gene products

Proteomics can be defined as the

study of the full set of proteins

expressed by an organism, tissue

or cell, and the change in their

expression patterns under different

conditions

PROTEOMA

«PROTEins within a genOME»

Carolyn I. Phillips et al. Proteomics meets microbiology: technical advances in the global mapping of protein expression and function Cellular Microbiology (2005)7(8),1061

Il proteoma è l'insieme di tutti i possibili prodotti proteici espressi in una cellula, incluse tutte le isoforme e le modificazioni post-traduzionali. Il proteoma è dinamico nel tempo, varia in risposta a fattori esterni e differisce sostanzialmente tra i diversi tipi cellulari di uno stesso organismo

Attualmente la proteomica si sviluppa su tre diversi livelli:

• Proteomica sistematica: identificazione e caratterizzazione del proteoma

• Proteomica differenziale: espressione differenziale delle proteine in cellule diverse di uno stesso organismo ed in momenti di vita diversi di una stessa cellula;

• Proteomica funzionale: comprende lo studio delle interazioni tra proteine (interattomica), lo studio delle interazioni tra una proteina ed i suoi substrati (metabolomica) e lo studio delle funzioni specifiche delle proteine (genomica enzimatica, genomica biochimica).

Proteomic methods

• High resolution two-dimensional electropresis (D-GE)• High performance liquid chromatografy (HPLC)• Mass spectrometry (MS)• Protein microarray

Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)

S. Emonet, et al. Application and use of various mass spectrometry methods

in clinical microbiology . Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1604–1613

The development of automated, high-

throughput proteomic technologies such

as MALDI-TOF MS has enabled large

numbers of samples to be analyzed

simultaneously in a short time

J. B. Fenn and K.TanakaNobel Prizes in Chemistry 2002 "for their

development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological

macromolecules"

1-2 min

Measurement

- high accurate - reproducibile- low cost -analysis

Small amount ofbiological materialThe first description of the use of MS for bacterial identification

Anhalt JP, Fenselau C. Identification of bacteria using mass-spectrometry. Anal Chem 1975; 47: 219–225.

MALDI-TOF MS

- Automated and rapid molecularidentification of microorganisms

• Enterobacteriaceae• Non-fermenting bacteria• Staphylococci• Enterococci• β-haemolytic streptococci• Anaerobes• Yeast• Mycobacteria

-Virulence/resistance factors

Challenges

• Sample type , quality, specific storage• Hardware/software/database Maier, T. , Klepel, S. , Renner, U. , & Kostrzewa, M. . (2006).

Fast and reliable MALDI-TOF MS-based microorganism identification.

Nature Methods Application Notes, 25(2), 68-71

VanBogelen RA, Abshire KZ, Moldover B, Olson ER, Neidhardt FC.

Escherichia coli proteome analysis using the gene-proteindatabase. Electrophoresis. 1997 Aug;18(8):1243-51.

Il laboratorio di diagnostica molecolare

Ottimizzazioneflusso di lavoro

AffidabilitàAmpio menu

applicativoFacilità d‘utilizzo

Gestione di varitipi di campione

Soluzioni basatesu costo-efficacia

Conformità alle normative(CE-IvD)

Sicurezza diprocesso

Risparmiodi tempo

Tracciabilitàdel campione

Flessibilità

Standardizzazione

Convenienza

Consolidamento

La dotazione tecnologica di cui disponiamo

deve essere inserita in una organizzazione del

lavoro tale da garantire dei risultati di qualità

analitica di eccellenza in tempo utile per la cura

del paziente.

Solo così i nostri risultati diventano

clinicamente significativi.

Principali criteri per individuare l’utilità e la valenza clinica di un nuovo test diagnostico

• C’è un razionale perché il test sia richiesto dal

clinico?

• Il test è utile per la salute del paziente?

• Un test più semplice può fornire informazioni

equivalenti?

• Il test aumenta il livello di conoscenza clinica?

• E’ possibile fare a meno del test?

Principali criteri per la scelta di un test diagnostico

• Utilità clinica: capacità di un test di modificare la

decisione del medico in senso diagnostico,

prognostico e terapeutico

• Efficacia: capacità di fornire informazioni utili per

la gestione del paziente

• Efficienza: capacità di raggiungere l’obiettivo

con la migliore allocazione delle risorse

Ma…….

Problemi interpretativi che da sempre sono alla base della valutazione clinica del referto microbiologico sono

frequentemente “amplificati”dalle tecniche molecolari: non sempre il dato strettamente biologico correla con la malattia …….

Highly sensitiveHigh contamination risk

Not highly sensitiveLow contamination risk

Pros e Cons of moleculardiagnostic methods

Not highly specificWide identification range

Highly specificFalse negatives

Based on single or fewmarkers = incomplete viewLow cost and fast

Genome-wide or Metagenome-wide identificationHigh cost, time-consuming

DILEMMAS

…..ciò richiede una capacità di interpretazione del referto molecolare che oltre alla garanzia che si èproceduto secondo uno standard qualitativo di eccellenza sia anche il frutto di una attenta valutazione clinica

……..Il futuro dipende soprattutto da noi…….

• Riduzione di operatori con formazione specialistica specifica

• Riduzione delle capacità critiche sperimentali e di valutazione tecnica

• Emergenza di nuove professioni

…Stay hungry, stay ………

GRAZIE

PER

L’ATTENZIONE