Trasporto degli elettroni e

fosforilazione ossidativa

La fosforilazione ossidativa rappresenta il culmine del metabolismo energetico negli

organismi aerobici

Tutte le tappe enzimatiche della degradazione ossidativa dei carboidrati, degli acidi

grassi e degli amminoacidi convergono nella tappa finale della respirazione cellulare,

in cui l’energia prodotta da tali ossidazioni viene utilizzata per la sintesi dell’ATP

Negli eucarioti la fosforilazione ossidativa avviene nei mitocondri e comporta la

riduzione dell’O2 ad H2O. Gli elettroni vengono forniti dal “potere riducente” di

NADH + H+ e FADH2

La trasduzione energetica operante nella fosforilazione ossidativa si spiega con la

formazione di gradienti protonici transmembrana, secondo la teoria

chemiosmotica di Mitchell (Peter Mitchell, 1961)

Il flusso di elettroni “accoppiato” con la sintesi di ATP avviene nella membrana

mitocondriale interna, che può contenere anche più di 10000 gruppi di trasportatori

di elettroni (o catene respiratorie) e di complessi di ATP sintasi

Anatomia biochimica di un mitocondrioLe involuzioni (creste) aumentano

considerevolmente l’area della superficie della

membrana interna

La membrana mitocondriale esterna è facilmente

permeabile a piccole molecole (Mr < 5000)

ed agli ioni, che l’attraversano grazie a canali

denominati “porine”

La membrana mitocondriale interna, invece, è

impermeabile alle piccole molecole ad agli ioni,

compresi i protoni (H+)

Gli elettroni entrano in una “catena respiratoria

mitocondriale”, nella quale passano tra proteine

(per lo più integrali) di membrana, mediante: 1)

trasferimento diretto (come nella riduzione di

Fe3+ a Fe2+); 2) trasferimento di un atomo

d’idrogeno (H+ + e-); 3) trasferimento di uno

ione idruro (:H-)

La maggior parte degli elettroni che entrano nella catena respiratoria deriva

dall’azione delle deidrogenasi dipendenti da nucleotidi nicotinammidici

(NAD(P)H + H+) e delle flavoproteine contenenti un cofattore flavinico

(FMNH2 o FADH2)

Coenzima Q

Gli elettroni passano poi attraverso una serie di trasportatori legati alla membrana, tra

cui l’ubichinone (detto anche coenzima Q o Q) e due tipi diversi di proteine contenenti

ferro (i citocromi e le proteine ferro-zolfo)

L’ubichinone è un benzochinone liposolubile con una lunga catena laterale isoprenoide

Nei cloroplasti delle piante si trova il plastochinone, mentre nei batteri si trova il

menachinone

La riduzione completa dell’ubichinone richiede due elettroni e due protoni e può

avvenire con un radicale intermedio semichinonico

I citocromi sono proteine con un’elevata capacità di assorbire la luce visibile, dovuta ai loro gruppi prostetici eme

(contenenti ferro). Nei mitocondri vi sono citocromi a, b e c

L’eme C è legato covalentemente

alla proteina

del citocromo c mediante ponti

tioetere con due residui di Cys

I quattro atomi di azoto sono

coordinati con un atomo centrale

di Fe, che può essere nel suo stato

ridotto (Fe2+) od ossidato (Fe3+)

Ogni eme possiede

quattro anelli a cinque

membri, contenenti

azoto, disposti in una

struttura ciclica

detta porfirina

La ferro

protoporfirina IX

si trova nei citocromi

b ed anche nella

mioglobina e

nell’emoglobina

L’eme A ha una lunga

coda isoprenoide legata

ad un anello

I Citocromi

I legami doppi coniugati della porfirina (in

rosa nelle strutture precedenti) sono

responsabili dell’assorbimento della

luce visibile

Ogni citocromo ha tre bande di

assorbimento della luce visibile nel suo

stato ridotto (Fe2+)

La banda γ, nella regione blu dello spettro,

è anche detta “banda di Soret” ed è

utilizzata spesso per descrivere

l'assorbimento di molecole contenenti

eme

I citocromi a e b sono proteine integrali

della membrana mitocondriale interna,

mentre il citocromo c è solubile e si

lega alla superficie esterna della stessa

membrana mediante interazioni

elettrostatiche

Nelle proteine ferro-zolfo il metallo è associato ad atomi di zolfo inorganico

o ad atomi di zolfo di residui di Cys della proteina

Tali centri ferro-zolfo possono essere molto semplici (a) o molto complessi (b, c)

Le proteine ferro-zolfo di Rieske vedono il ferro coordinato con

due residui di His e non di Cys

Tutte le proteine Fe-S partecipano a reazioni redox in cui si trasferisce un elettrone alla

volta, sfruttando cambiamenti dello stato di ossidazione del Fe

Le proteine ferro-zolfo

Potenziali di riduzione standard della catena

respiratoria e dei suoi trasportatori di elettroni

I supercomplessi o respirosomi

Inibitori del trasporto e- e della fosforilazione ox

Complessi proteici della catena di trasporto

Vi sono quattro componenti proteici distinti (I-IV) nella catena di trasporto

degli elettroni mitocondriale

I: NADH-Coenzima Q reduttasi

II: Succinato-coenzima Q reduttasi

III: Coenzima Q-citocromo c reduttasi

IV: Citocromo c ossidasi

Panoramica dei complessi e delle vie nella catena di trasporto elettronico mitocondriale

Il complesso I ossida il NADH e riduce il Coenzima Q

Il complesso II ossida il succinato e riduce il coenzima Q

La prima tappa della β ossidazione degli acidi grassi è catalizzata dalla flavoproteina acil-CoA

deidrogenasi, che non cede elettroni al Complesso II, ma alla flavoproteina ETF, che

a sua volta li cede alla ETF:Q ossidoreduttasi, la quale riduce il coenzima Q

Anche il glicerolo 3-fosfato “salta” il Complesso II, cedendo elettroni direttamente al coenzima Q

attraverso la glicerolo 3-fosfato deidrogenasi

Il complesso III media il trasporto

degli e- dal coenzima Q al citocromo c

Il complesso III media il trasporto

degli e- dal coenzima Q al citocromo c

Il complesso IV trasferisce gli e- dal cit c

per ridurre l’O2 sul lato della matrice

L’energia associata al trasporto elettronico viene efficientemente conservata sotto forma di

gradiente di protoni, che si genera a livello dei Complessi I, III e IV

(per quest’ultimo viene rappresentata una semi-seazione)

L’energia elettrochimica contenuta nel gradiente di concentrazione protonica e nella

separazione delle cariche elettriche genera una forza protomotrice (o forza motrice

protonica, ΔG), che è formata da due componenti: energia potenziale chimica

(gradiente protonico, ΔpH) ed energia potenziale elettrica (gradiente elettrico, Δψ)

[R, costante universale dei gas

T, temepratura assoluta

Z, carica elettrica dello ione

F, costante di Faraday

Δψ, potenziale di membrana]

Modello chemiosmotico di Mitchell

[Reazione generale: ADP + Pi + nHP+ → ATP + H2O + nHN

+]

L’accoppiamento del trasferimento

elettronico con la sintesi di ATP nei

mitocondri richiede la presenza di

ADP + Pi e di un substrato

ossidabile (come il succinato)

L’accoppiamento è bloccato da

inibitori della citocromo ossidasi

(come il cianuro, CN-) o dell’ATP

sintasi (come la venturicidina e

l’oligomicina)

Gli “agenti disaccoppianti” (come il

dinitrofenolo, DNP) bloccano la

sintesi di ATP, pur consentendo la

respirazione

I disaccoppianti chimici della

fosforilazione ossidativa

possiedono un protone

dissociabile (sono acidi deboli) e

sono molto idrofobici

Essi agiscono trasportando

protoni attraverso la membrana

mitocondriale interna e

dissipando così il gradiente

protonico (ΔpH)

ATP sintasi

La reazione ADP + Pi ↔ ATP + H2O è facilmente reversibile sulla superficie di

F1, dove l’ATP viene stabilizzato più dell’ADP ma viene rilasciato grazie al

gradiente protonico

Il meccanismo catalitico di F1 è stato in gran parte chiarito, anche grazie ad

esperimenti di scambio di 18O in presenza di acqua marcata (a) Lo stato di

transizione più probabile per l’idrolisi e la sintesi di ATP è stato identificato (b)

Diagrammi delle coordinate di reazione dell’ATP sintasi e di un enzima modello

Anche se la variazione di energia libera per la formazione di ATP da ADP e Pi in una soluzione

acquosa è grande e di segno positivo, il legame molto saldo dell’ATP all’enzima

F1 fornisce una quantità di energia di legame che abbassa l’energia libera dell’ATP

legato a valori simili a quella dell’ADP + Pi

L’energia libera richiesta per il rilascio dell’ATP è fornita dalla forza protomotrice

Il modello della “modificazione del

legame” dell’ATP sintasi si basa sul

fatto che il complesso F1 possiede tre

siti non equivalenti per il legame dei

nucleotidi adenilici, uno per ciascuna

coppia di subunità α e β. In ogni

momento, uno di questi siti si trova

nella conformazione β-ATP (che lega

saldamente l’ATP), il secondo in

conformazione β-ADP (che lega

debolmente l’ATP) ed il terzo in

conformazione β-vuota (che lega molto

debolmente l’ATP)

La forza protomotrice provoca la

rotazione dello stelo centrale (la

subunità γ, in verde) che, toccando un

sito alla volta, ne modifica la

conformazione, permettendo la sintesi

ed il rilascio di ATP

Meccanismo di catalisi rotazionale

La teoria chemiosmotica supporta stechiometrie frazionarie per la sintesi di ATP

ed il consumo di ossigeno (rapporto P/O)

xADP + xPi + 1/2O2 + NADH + H+ → xATP + H2O + NAD+

dove il valore di x rappresenta il “rapporto P/O” (o rapporto P/2e-)

Moltissimi studi sperimentali hanno prodotto rapporti P/O compresi tra 2 e 3, quando il

donatore di e- è il NADH, e tra 1 e 2, quando il donatore è il succinato. Presumendo che

P/O dovesse essere un numero intero, per anni si è convenuto che esso valesse 3 a partire

dal NADH e 2 a partire dal succinato

Tuttavia, l’accettazione universale della teoria chemiosmotica ha permesso d’ipotizzare

anche valori frazionari per il rapporto P/O. Stabilito concordemente che:

▪ i protoni pompati fuori dal mitocondrio per ogni coppia di elettroni sono 10 per il

NADH e 6 per il succinato;

▪ servono 4H+ per la sintesi di un ATP (di cui uno è necessario per trasportare Pi, ADP ed

ATP attraverso la membrana mitocondriale)

si è arrivati a concludere che il rapporto P/O è pari a 2.5 (10/4) per il NADH e 1.5 (6/4)

per il succinato

Queste stechiometrie sono largamente accettate, ma diventeranno definitive solo quando i

dettagli del meccanismo di reazione di F0F1 saranno completamente definiti

ATP sintasoma

Shuttle del malato-aspartato

Shuttle del glicerolo 3-fosfato

Regolazione della fosforilazione ossidativa

La completa ossidazione di una molecola di glucosio a CO2 rende 30 o 32 molecole di ATP (a

seconda dello shuttle utilizzato), mentre la glicolisi si ferma a 2 molecole soltanto

La fosforilazione ossidativa è regolata dal fabbisogno energetico cellulare,

secondo vari meccanismi:

a) Controllo da accettore della respirazione, vale a dire dipendenza della velocità di

consumo di O2 dalla concentrazione di ADP, l’accettore del gruppo fosforico.

Si definisce rapporto di controllo da accettore quello tra la velocità massima

di consumo di O2 in presenza di concentrazioni ottimali di ADP e la velocità

basale in assenza di ADP (con valori anche superiori a 10)

b) Rapporto di azione di massa del sistema ATP-ADP, vale a dire [ATP]/([ADP][Pi])

La sintesi di ATP continua fino a che il rapporto di azione di massa non

raggiunge il suo valore massimo, un evento che fa rallentare

la respirazione cellulare

c) Proteine regolatrici contribuiscono a regolare i livelli di ATP.

Per esempio, un inibitore proteico (IF1) impedisce l’idrolisi dell’ATP durante l’ipossia

(per esempio, per un attacco cardiaco od un colpo apoplettico)

IF1 (84 amminoacidi) si lega contemporaneamente a due molecole

di ATP sintasi, inibendone l’attività ATPasica

L’inibitore è attivo solo nella sua forma dimerica, che può esistere

a pH < 6.5 (metabolismo anaerobico!)

Un problema rilevante della fosforilazione ossidativa è la formazione di ROS, a causa di

“perdite” di elettroni lungo la catena respiratoria. Servono, quindi, meccanismi di

detossificazione efficienti (in blu), per difendere il mitocondrio e la cellula

Il fattore inducibile dell’ipossia (HIF-1) regola l’espressione genica

per ridurre la formazione di ROS

I meccanismi di regolazione delle vie

che producono ATP sono coordinati

Le interconnessioni delle regolazioni della

glicolisi, dell’ossidazione del piruvato, del ciclo

dell’acido citrico e della fosforilazione ossidativa

sono dipendenti dalle concentrazioni relative di

ATP, ADP, AMP, NADH e NAD+

L’azione del citrato nell’inibire la glicolisi

ed il ciclo dell’acido citrico è coordinata

con quella dei nucleotidi adeninici

Il tessuto adiposo bruno

Le P-450 ossigenasi (o citocromi P-450) mitocondriali catalizzano l’ossidrilazione

degli steroidi nella ghiandola surrenale, specializzata appunto nella sintesi degli

ormoni steroidei

Le P-450 ossigenasi del reticolo endoplasmatico degli epatociti catalizzano

reazioni simili a quelle degli enzimi P-450 mitocondriali, ma i loro substrati

sono composti idrofobici, tra cui molti xenobiotici (sostanze non presenti in

natura, ma sintetizzati industrialmente)

I mitocondri hanno un ruolo primario anche nella

fase iniziale dell’apoptosi

All’inizio di questo processo, la membrana

mitocondriale esterna aumenta notevolmente la sua

permeabilità, a causa dell’apertura del complesso del

poro di transizione della permeabilità (PTPC), una

proteina multimerica

Il citocromo c può così uscire nel citosol, dove

interagisce con i monomeri della proteina Apaf-1

(fattore-1 di attivazione della proteasi dell’apoptosi),

causando la formazione di un apoptosoma

(composto da 7 molecole di Apaf-1 e 7 molecole di

citocromo c)

Questo complesso costituisce una piattaforma sulla

quale la proteasi procaspasi-9 viene attivata a caspasi-

9, che porta avanti una cascata proteolitica nel

processo apoptotico

[Tutte le caspasi sono proteasi a cisteina, che tagliano

i legami peptidici dal lato carbossilico di un acido

aspartico (da cui il nome)]