Titolo RUOLO DELL’ETERODIMERIZZAZIONE DEI … · L'eterodimerizzazione del MOR con DOR conduce a...

UNIVERSITA’ DI PISA

FACOLTA’ DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Farmacia Tesi di Laurea

Titolo

RUOLO DELL’ETERODIMERIZZAZIONE DEI

RECETTORI A PROTEINA G

Candidato

TRONFI DAVIDE

Relatore Correlatore

Prof. Lucacchini Antonio Prof. Giannaccini Gino

Anno Accademico 2009-2010

Riassunto analitico

I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono una grande famiglia di recettori di

membrana che rivestono un ruolo cardine nella trasduzione del messaggio. I GPCR sono dei

componenti fondamentali di molti processi biologici, tra cui le attività del SNC, la regolazione

dell’appetito, della digestione, della pressione, del metabolismo e dell’infiammazione.

Alterazioni dei GPCR sono alla base di condizioni patologiche come l’asma, di malattie

neurodegenerative, il diabete… . L’attivazione dei GPCR e la conseguente trasmissione del

segnale, prevede una serie di eventi scatenati dal legame del farmaco al dominio extracellulare

che determina una modificazione della conformazione del GPCR seguita dall’attivazione della

proteina G e dell’effettore (enzimatico o canale). Viene affrontato il ruolo che

l’eterodimerizzazione gioca nella funzione di alcuni GPCR e viene affrontata l’importanza degli

eterodimeri nella patogenesi di alcune malattie. E’ stato discusso il meccanismo di attivazione

delle proteine G eterodimeriche che prevede la dissociazione del complesso Gβγ dal monomero

Gα, e si avvale dell’attività del canale Ca++ che viene usato come sensore dell’attività della

proteina G. Ciò suggerisce che gli eterodimeri dei recettori a proteina G rappresentano bersagli

farmacologici innovativi per l’identificazione di composti potenzialmente selettivi con meno

effetti collaterali.

INDICE INTRODUZIONE 1

1. ETERODIMERI DEL GPCR : NUOVE PROSPETTIVE DI RECETTORI 2

2. PRIMI STUDI SULL’ETERODIMERIZZAZIONE 7

3. RECETTORE GABA B 9

4. RECETTORI DELLA MODULAZIONE DEL DOLORE 11

5. COMPLESSO A2A/D2 18

6. COMPLESSO D2/D3 36

7. COMPLESSO SSTR5/SSTR1 38

8. COMPLESSO SSTR5/D2 39

9. COMPLESSO A1/D1 41

10. COMPLESSO mGluR1αA1 44

11. COMPLESSO P2Y1/A1 46

12. COMPLESSO mGLuR5/A2A 48

13. COMPLESSO B2/AT1 50

14. COMPLESSO GABA A/D5 52

15. COMPLESSI OLIGOMERICI E RECETTORI TIROSIN-CHINASICI 56

16. COMPLESSI CALCITONINA/RAMP1-3 58

17. COMPLESSO D1/CALCIONE 60

18. COMPLESSO A1/ADENOSINA DEAMMINASE 63

19. COMPLESSO A1/HSC 73 65

20. CONCLUSIONI 67

BIBLIOGRAFIA 69

1

INTRODUZIONE

I recettori accoppiati alle proteine-G (GPCR) sono proteine di membrana che convertono

informazioni extracellulari in segnali intracellulari, sono implicati in più processi fisiologici.

Come tali, questi recettori (GPCR) rappresentano bersagli importanti dei farmaci. Gli

avanzamenti nella conoscenza della biologia del GPCR suggeriscono che un dato recettore a

proteina-G sia implicato solitamente in più di un processo fisiologico. Di conseguenza, i farmaci

che mirano ad un tipo recettoriale dentro un contesto patologico specifico sono probabili ad

agire sullo stesso tipo recettoriale di altri tessuti che non sono implicati nella malattia, e

conducono agli effetti indesiderati del farmaco. Nell'ultimo decennio, parecchi meccanismi che

regolano la funzione e le proprietà dei GPCR sono stati identificati ed hanno mostrato che,

l’eterodimerizzazione [1] appare come processo importante nella specializzazione della funzione

del recettore e regolano eventi patologici. I recettori eterodimeri esistono in particolari tessuti e

rappresentano le entità funzionali che mediano le diverse risposte biologiche. Queste proprietà

suggeriscono che i recettori eteromeri possano essere usati come bersaglio di nuovi farmaci

perché i composti che mirano a specifici eterodimeri sono probabili a migliorare la specificità e a

ridurre gli effetti indesiderati.

2

1. ETERODIMERI DEL GPCR : NUOVE PROSPETTIVE DI RECETTORI

Un concetto emergente nella ricerca degli GPCR è la promozione di cascate di segnali

eterodimerici specifici che permettono la diversificazione degli effetti del recettore in un

contesto dipendente (figura 1). La modulazione delle proprietà di legame

dell’eterodimerizzazione dei GPCR sono state descritte per diverse coppie di recettori [2-5].

Questo è pensato per essere la conseguenza di un'alterazione nelle tasche di legame, rivelando

che qualche ligando potrebbe preferire i recettori nella loro struttura omomerica o

eterodimerica. Per esempio, una diminuzione nell’affinità e nella potenza dei recettori agonisti

selettivi è stata osservata nel caso dei recettori oppioidi δ−κ (DOR-KOR) [4], nel DOR-MOR [6] e

nel recettore della somatostatina sst2A-sst3 [7]. In contrasto, un aumento dell’affinità del

recettore β2 adrenergico (AR) il ligando era stato osservato per coppie di recettori β1−AR-

β2−AR [8]. Questi studi indicano che l'eterodimerizzazione altera il ligando che lega, ma i

cambiamenti nella farmacologia del recettore non sembrano seguire un modello comune

perché ogni coppia del recettore rappresenta un'unica alterazione nella farmacologia del

recettore. Questi cambiamenti potrebbero risultare dalla modulazione allosterica di un

protomero nella legatura del ligando all'altro protomero dentro l'eterodimero [9]. Studi hanno

mostrato che l’eterodimerizzazione del recettore cambia nell'agganciamento della proteina-G.

In molti casi, l'eterodimerizzazione conduce ad alterazioni nell'estensione dell’agganciamento

alla stessa proteina-G ma recenti scoperte mostrano che, in alcuni casi, c'è un cambiamento

nella natura della proteina-G agganciata. Un esempio di studio di un cambiamento

nell'estensione dell’agganciamento della proteina-G è l'eterodimero α2a-AR-MOR che legato

alla morfina inibisce il segnale di norepinefrina mediata a Gαi e a valle la cascata delle MAPK

[10]. Il trasferimento di energia di risonanza di Forster (FRET) ha rivelato un cambiamento di

conformazione che propaga da un recettore all'altro, causando una rapida inattivazione del

secondo recettore con frazioni cinetiche [11]. Queste scoperte suggeriscono che

l’eterodimerizzazione induce un cambiamento nella struttura del recettore che è responsabile

delle nuove proprietà dei recettori. L'eterodimerizzazione può risultare anche in un cambio nel

3

tipo della proteina-G agganciata. L'eterodimerizzazione tra DOR ed il recettore sensoriale

neurone specifico 4 era riportato a cambiamento da un Gαi/o a un Gαq [12].

L'eterodimerizzazione tra i recettori D1-D2 della dopamina sono stati trovati per cambiamento

da un Gαs/olf (D1R) o Gαi (D2R) a un Gαq/11, e l'eterodimerizzazione tra DOR e MOR è stata

mostrata per cambiamento da un Gαi a un Gαz [13-15]. Nuovi studi indicano che l’attivazione

degli eterodimeri conducono a un cambiamento nel reclutamento di diverse molecole di

segnale. Questo conduce alla specializzazione degli effetti a valle come l'attivazione

dell’espressione di fattori di trascrizione e di diversi geni. L'eterodimerizzazione dell’α2a-AR con

l’α2c-AR riduce la fosforilazione GRK e il reclutamento della β-arrestina, agendo a valle la

fosforilazione Akt [16]. L'eterodimerizzazione del MOR con DOR conduce a un cambio da uno

maggior mediato dalla proteina-g a uno mediato dalla b-arrestina, nel giro risultante

nell'attivazione di differenti fattori di trascrizione [17]. Un protomero può far da ponte nel

reclutare delle molecole di segnale che promuovono diversi segnali all'altro protomero, come

proposto nel caso dell’α2a-AR-MOR [10]. Tale meccanismo deve essere ancora esplorato per le

altre coppie del recettore, ma potrebbe rappresentare un mezzo generale per diversificare la

funzione dei GPCR. L'eterodimerizzazione del GPCR conduce a cambiamenti nell’agganciamento

sia qualitativi che quantitativi. Questi cambiamenti possono modulare la forza della risposta di

un agonista ad agganciarsi alle diverse proteine-G e/o di associati complessi di segnale. Queste

nuove proprietà evidenziano l'eterodimerizzazione del recettore come un maggior meccanismo

che allarga i vari effetti del GPCR ed i contributi alla descrizione funzionale dei recettori. Questo

suggerisce che mirare ad un specifico tipo di un recettore dentro un eterodimero potrebbe

consentire l'attivazione di un percorso fisiologico discreto, con gli effetti limitati sugli altri

processi che coinvolgono lo stesso recettore.

L’identificazione dei recettori eteromeri nel vivo e la loro implicazione nei processi

fisiopatologici è critica per il loro riconoscimento come nuovi bersagli di farmaci. Solo poche

tecniche tengono conto della rivelazione dei complessi GPCR nei tessuti nativi (Figura 2). Il

ligando Fluoroforo è stato sviluppato quale potrebbe essere usato per eseguire analisi FRET

interagendo tra i recettori endogeni. Gli eterodimeri del recettore riconoscono anticorpi

4

specifici e rappresentano gli strumenti utili per la rivelazione ed analizzano i complessi GPCR nel

vivo. Il ruolo di un eterodimero può essere facilitato dalla caratterizzazione e dalla mutazione

dei residui o dai domini implicati nell'associazione recettore-recettore. Diversi approcci, per

esempio modellare molecole, cambiando dimeri di recettore, crosslinking , tecniche biofisiche

ed il dominio di transmembrane (TM) sono stati usati per determinare tali domini. Questi studi

hanno dimostrato l'esistenza di interfacce di interazione multiple, compreso TM1 e compreso

TM4 nell’omomero D2R ed identificato come l’interfaccia della dimerizzazione mGluR2 TM 4/5

con 5HT2aR nel complesso 5HT2aR-mGluR2. Le strategie sono mirate a evitare o rompere

l'interazione recettore-recettore usando delle piccole molecole o di peptidi che potrebbero

produrre degli approcci alternativi per mirare all'attività degli eterodimeri.

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Figura 1. Modulazione della funzione del recettore dall’eterodimerizzazione

(a) L’eterodimerizzazione conduce alla formazione di un alterato sito di legame. Mostrato per DOR-KOR , DOR-MOR, e MOR-sst2A.

(b) L’eterodimerizzazione conduce a una diminuzione o aumento nell’accoppiamento alla proteina G. La diminuzione nell’accoppiamento era mostrata per l’eterodimero DOR-MOR; l’aumento nell’accoppiamento era mostrato per α2−AR-MOR, e AT1R-B2R.

(c) L’eterodimerizzazione conduce all’accoppiamento a una nuova proteina G. Mostrato per l’eterodimero MOR-DOR accoppiato a Gαz; l’eterodimerizzazione di due differenti recettori accoppiati conducono all’accoppiamento preferenziale a una proteina G dopo stimolazione. Mostrato per DOR-SNSR-4.

(d) L’eterodimerizzazione conduce a un cambio nell’accoppiamento del recettore, da proteina G a β-arrestina, e la successiva attivazione di differenti segnali e fattori di trascrizione. Mostrato per l’eterodimero MOR-DOR.

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Figura 2. Emergenti tecniche degli eterodimeri a scoprire (a-c) e a modulare (d-i) gli eterodimeri GPCR possono essere scoperti usando 3 principali approcci.

(a) Il ligando mediato fluoroforo agganciato FRET. Il ligando fluoroforo agganciato per due recettori può essere analizzato usando FRET solo se i loro due recettori analoghi sono in prossimità vicini in un complesso eterodimerico.

(b) Gli anticorpi eterodimerici selettivi che riconoscono solo l'eterodimero possono essere usati per studiare la localizzazione ed i livelli degli eterodimeri.

(c) Il ligando eterodimerico specifico può legare solo al recettore alterato che legandosi alla tasca ha formato un eterodimero. L'eterodimero del GPCR può essere modulato usando sei principali approcci.

(d) Gli agonisti eterodimerici specifici possono attivare un recettore solo se in una forma eterodimerica. (e) Gli antagonisti eterodimerici specifici possono bloccare un solo recettore se in una forma eterodimerica. (f) Gli anticorpi eterodimerici specifici possono bloccare il legame e/o il segnale del recettore solo se in una forma eterodimerica. (g) L’attivazione degli anticorpi eterodimerici specifici può attivare recettori solo se in una forma eterodimerica. (h) ligandi bivalenti possono legare e attivare recettori solo se i loro recettori sono in una forma eterodimerica. (i) I ligandi di un recettore possono agire come modulatori allosterici negativi o positivi della interazione recettoriale in un

eterodimero. I modulatori allosterici possono alterare le proprietà di legame e/o di segnale della interazione recettoriale.

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2. PRIMI STUDI SULL’ETERODIMERIZZAZIONE

Gli studi sui recettori a proteina-G (GPCR) hanno inizio nel 1979-1980 alla ricerca di una

spiegazione da dove tutte le recenti scoperte dei neuropeptidi nel cervello potrebbero

integrare i loro messaggi con quelli dei classici trasmettitori come le monoammine. Luigi F.

Agnati e Kjell Fuxe hanno postulato che un'interazione intramembrane tra i recettori dei

neuropeptidi e delle monoammine potrebbero essere coinvolte. Le prime osservazioni sono

state pubblicate nel 1980 [18], mostrando come la sostanza P potrebbe modulare la serotonina

con alta-affinità che lega dei siti nelle preparazioni di membrana del midollo spinale usando le

tecniche di legame biochimiche [19]. Successivamente si è scoperto che non solo i recettori dei

neuropeptidi e dl monoammine sono stati coinvolti nelle interazioni recettore/recettore

intramembrana ma anche in certi tipi di recettori del glutammato e dell’adenosina. Questi

risultati sono stati tutti ottenuti nel luogo di riconoscimento dei recettori, usando esperimenti di

saturazione e di legame competitivo. Un'indicazione di un effetto sull’accoppiamento della

proteina-G e perciò sull'efficacia del recettore modulato potrebbe essere ottenuto studiando

come la modulazione potrebbe controllare la scomparsa GTP-indotta dello stato di alta-affinità

del recettore. Questo implicherebbe un’attivazione della proteina-G con formazione di Gα-GTP

e dimeri βγ associati a regolazione incrociata di GPCR con scomparsa dello stato di alta affinità

del recettore. Gli studi sono stati estesi per mostrare le interazioni multiple recettore/recettore.

Nel 1993 [20], è stato introdotto il meccanismo molecolare per queste interazioni

recettore/recettore intramembrana fra GPCR e potrebbero essere la formazione dei complessi

eteromerici, il più semplice un eterodimero. Questo concetto è stato basato sull'indicazione al

tempo che la dimerizzazione in seguito a attivazione agonista potrebbe essere un fenomeno

generale essenziale per l'attivazione del recettore [21], il migliore esempio è la dimerizzazione

dei recettori tirosin chinasici [22,23,24]. Così, è stato presunto che GPCR esista principalmente

come l'omodimero che interagisce con gli altri tipi di omodimeri a formare gli eterodimeri. Le

proporzioni relative di omo e eterodimeri sarebbero determinate dalle concentrazioni dei due

trasmettitori, la densità dei due recettori ed i loro modelli di distribuzione, e le caratteristiche

8

uniche di ogni interazione recettore/recettore [25]. È stato postulato [26,27] che la formazione

e/o la stabilizzazione dei complessi eteromerici dei GPCR potrebbero essere migliorate

dall’associazione di proteine soprattutto nelle membrane sinaptiche. Deve essere notato che la

maggior parte del GPCR è localizzato nelle membrane extrasinaptiche e quindi i potenziali

complessi eteromerici discussi sopra potrebbero essere anche raggiunti dal segnale di

trasmissione di volume [28]. Dai dati di recenti esperimenti viene confermata

l’eterodimerizzazione (figura 3).

Figura 3. Eterodimerizzazione tramite interazioni recettore-recettore intramembrana

9

3. RECETTORE GABA B

La prima prova che due sottotipi recettoriali del GABA B, GABA B R1 e GABA B R2 subiscono

l'eterodimerizzazione e che questo processo è essenziale per l'espressione della cellula di

superficie del recettore funzionale è stata data in tre studi pubblicati simultaneamente nel

dicembre 1998 da Kaupmann [29], da Jones [30] e da White [31]. Questo è stato anche

dimostrato da Kuner [32] e Ng [33] nel gennaio 1999 [34,35]. La pertinenza fisiologica di queste

scoperte è sostenuta dalla dimostrazione della coimmunoprecipitazione nelle membrane della

corteccia cerebrale delle proteine del GABA B R1 con GABA B R2, della loro localizzazione nelle

spine dorsali dendritiche [29] ed il sostanziale grado di co-espressione dei livelli di m RNA di

GABA B R1 e GABA B R2 in molte popolazioni cellulari nervose [32]. I cambiamenti sono accaduti

anche a livello del luogo di riconoscimento come risultato dell'eterodimerizzazione, poiché la

potenza degli agonisti e degli agonisti parziali è diventata aumentata [29]. Il cambiamento più

drammatico è comunque che l'eteromero recettoriale del GABA B formato, a differenza dei suoi

componenti monomerici, può diventare funzionale e accoppiarsi alle proteina-G portando

internamente alla regolazione della reattività dei canali k+, dei canali Ca++, e dell’adenilato-

ciclasi [36,37]. Così, sembra come se il recettore GABA B predominante nativo sia l'eteromero

del recettore GABA B. E’ stata presentata la prova che il dominio del COOH-terminale è

coinvolto nella formazione di quest'eterodimero da un'interazione tra gli avvolgimenti [32,38].

Nel 2000, è stata fatta l'osservazione importante in cui l'interazione a spirale al dominio del

COOH-terminale blocca una ritenzione al reticolo endoplasmatico del recettore GABA B R1 [25].

Comunque, anche se il mutante GABA B R1 il motivo di ritenzione era stato tolto e questo

recettore mutante potrebbe essere espresso sulla superficie della cellula, è rimasto

funzionalmente inattivo, sottolineando un probabile ruolo cruciale della eterodimerizzazione

del recettore GABA B nella trasmissione del segnale. Queste scoperte importanti danno un

esempio chiaro della importante funzione di interazioni recettore/recettore intramembrane

attraverso l'eteromerizzazione, compreso la maturazione recettoriale cellulare e l’espressione

del recettore sulla superficie cellulare, e nel segnale del recettore, cioè, nell’agganciamento alla

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proteina-G e in un’aumentata potenza di legame degli agonisti e degli agonisti parziaIi, in linea

con il lavoro precedente sulle interazioni recettore/recettore [20,39,40]. È ben saputo che il

ruolo dei recettori GABA B è distinto nel modulare le reti neuronali e che farmaci agonisti che

agiscono, su questi recettori appaiono per avere le proprietà anticonvulsive e ansiolitiche. È

quindi di interesse sostanziale che il composto anticonvulsivo gabapentin è un agonista seIettivo

all’eteromero GABA B R1a/GABA B R2 [41]. Questo è un esempio di come la composizione

moIecolare dell'eteromero determina il suo profilo farmacoIogico e provoca un nuovo agonista

selettivo recettoriale del GABA B per un certo tipo di recettore eteromero dipendente GABA B

sulla specie variante coinvolta. In questo studio, questi risultati sono stati messi in correlazione

con una capacità selettiva di aumentare il segnale del recettore GABA B postsinaptico senza

alterare la trasmissione del GABA a livello presinaptico [41]. Questo nuovo tipo di selettività

farmacologica basata sull'unico eteromero potrebbe avere quindi una considerevole attenzione

per lo sviluppo di farmaci, e serve per mostrare la rilevanza farmacologica di interazioni

recettore/recettore intramembrana che potrebbe dare origine a nuovi sottotipi recettoriali con

un’unica farmacologia basata sulla composizione dell'eteromero formato per cambiare le

caratteristiche biochimiche della tasca di legame del recettore.

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4. RECETTORI DELLA MODULAZIONE DEL DOLORE

Recettori oppioidi

I recettori oppioidi agonisti µ e κ sono stati considerati importanti nella modulazione del dolore,

e bersagli per la terapia dell’analgesia. Sfortunatamente, l’analgesia prodotta dal ligando

selettivo è limitata dagli effetti collaterali meccanismo-dipendenti. Più recentemente,

l'upregulation del sottotipo RGS4 della proteina regolatrice di segnale, è stata dimostrata nel

dolore neuropatico, una possibile spiegazione per l'efficacia ridotta della morfina in questa

condizione [42]. Questo suggerisce che l’inibitore sito specifico di RGS4 potrebbe migliorare

l'efficacia della morfina e ridurre forse gli effetti collaterali come la costipazione e la

depressione respiratoria. D'altra parte, il centro d'interesse della ricerca sui bersagli del

recettore degli oppioidi si è rivolto verso i recettori oppioidi δ (DORs), i ligandi a cui hanno la

potenza per l'efficacia analgesica con gli effetti collaterali minimi. Molti studi, compresi quelli

che coinvolgono la riduzione del recettore con l’oligonucleotide antisenso o la soppressione del

gene DOR [43]; hanno sostenuto il concetto che i ligandi selettivi δ, che comprendono agonisti

peptidici e non peptidici produce analgesia senza la notevole depressione respiratoria,

l'inibizione della motilità gastrointestinale o l'azione sedativa. Sebbene l'iperattività sia stata

notata con alcuni composti δ selettivi nei roditori, questo non è stato osservato nell’uomo. In

modo interessante, i ligandi DOR forniscono meno efficacia analgesica della morfina, sebbene

la loro efficacia appaia dipendere dalla natura dello stimolo del dolore e l'ambiente chimico, che

potrebbe essere determinante per l’espressione del recettore. Conseguentemente i ligandi δ

selettivi hanno efficacia analgesica bassa nei modelli di dolore acuto, ma mostrano un’avanzata

attività per somministrazione ripetitiva di morfina e dopo un episodio di infiammazione.

L'aumento di efficacia è stata attribuita a stimolazione indotta del DOR contenuto nelle

vescicole citoplasmatiche dalla loro localizzazione endocellulare, seguita dalla incorporazione

nelle membrane del nervo dopo fusione vescicolare [44]. Allo stesso modo l’aumento di traffico

del DOR accade nei neuroni sensoriali, dove la produzione del segnale calcio-dipendente

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dall'attivazione del nervo afferente migliora l'espressione della liberazione di GPCR e DOR nella

membrana del nervo [45]. La possibilità dell'eterodimerizzazione dei recettori oppioidi µ, δ e k

potrebbe spiegare l'esistenza di più di tre sottotipi recettoriali degli oppioidi come caratterizzato

farmacologicamente [46]. L'eteromero oppioide δ/K [4,6] è stato mostrato avere una

farmacologia unica con un’alta affinità piuttosto per ligandi non selettivi ma molto piccola

affinità per aumenti di δ e k selettivi. Così, un nuovo sottotipo del recettore oppioide legandosi

potrebbe essere apparso attraverso questa interazione recettore/recettore tramite

l'eterodimerizzazione del recettore δ/κ oppioide. Anche, il δ e k eteromero hanno avuto delle

conseguenze per l'internalizzazione dell’agonista-indotto del recettore oppioide δ, che si è

ridotto. Così, un altro ruolo funzionale di quest'interazione intramembrana del

recettore/recettore attraverso l'eteromerizzazione potrebbe essere il controllo

dell’internalizzazione del recettore. L'eteromero del recettore µ/δ oppioide, dimostrato da

George [6], mostra i cambiamenti mostrati nelle proprietà farmacologiche al sito di

riconoscimento con un'affinità ridotta per gli agonisti selettivi e un aumento di affinità per certi

peptidi encefalici. Può infatti l'eteromero µ/δ essere il bersaglio di distinti peptidi encefalici. Di

interesse speciale era la dimostrazione che l'eterodimero µ/δ, a differenza dei recettori µ e δ

quando espressi soli, potrebbero diventare resistenti alle proteine-G della tossina della

pertosse, come Gz. Così, alla proteina-G agganciata il segnale è diventato alterato

nell'eteromero. Infatti, la maggiore funzione dell’interazione recettore/recettore

intramembrana si basa sull'eteromerizzazione µ/δ, in cui potrebbe esserci un cambiamento

nella selezione dell’agganciamento alla proteina-G che coinvolge un cambiamento di

conformazione nell’interfaccia alla proteina-G del recettore eteromero µ/δ. L'altro

cambiamento della funzione è l’alterazione delle proprietà di legame del sito di riconoscimento

mentre un modello di nuova legatura del ligando è basato sui cambiamenti di affinità; una

nuova tasca di legatura sembra essere apparsa [47].

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Recettori cannabinoidi

I recettori Cannabinoidi sono molto distribuiti in ogni parte del sistema nervoso dei mammiferi

e i sistemi cannabinoidi sono stati dimostrati nella modulazione del dolore [48]. Nell’estratto

della cannabis e nei ligandi degli cannabinoidi è stata dimostrata l'efficacia clinica in un numero

di condizioni di dolore cronico, e c'è quindi grande fiducia che il recettore dei cannabinoidi (CB1

o CB2) e dei ligandi possa essere identificato con la migliore efficacia ed un ridotto profilo di

effetto collaterale. Comunque, ad oggi, sia l'analgesia e sia gli effetti collaterali sono stati

attribuiti ai recettori CB1 localizzati nel SNC, nel midollo spinale e nei neuroni sensoriali

periferici. Diversi nuovi approcci sono considerati per una migliore terapeuticità, per esempio, lo

sviluppo dei ligandi CB1 produce ad analgesia su un'azione periferica ed evita così gli effetti

collaterali nel SNC. D'altra parte, la localizzazione dei recettori CB2 fuori del SNC mantengono la

promessa dell’analgesia con una migliore sicurezza. Fino ad ora, i recettori CB2 sono stati solo

trovati nei tessuti periferici relativi all’infiammazione ed un numero di ligandi CB2 selettivi è la

dimostrazione degli effetti degli antinocicettivi in una varietà di modelli del dolore [49] senza gli

effetti collaterali nocivi. È attualmente non chiaro se al ligando CB2 selettivo riduca il dolore solo

nella periferia; forse inibendo la liberazione di mediatori infiammatori ed il trophins dai

macrofagi e cellule immuni. Ulteriori studi recenti suggeriscono che l'espressione CB2 accade

anche nel SNC, particolarmente nella microglia spinale seguendo le lesioni dolorose

neuropatiche [50], che alzano la possibilità di azioni addizionali nel SNC senza gli effetti

collaterali dei CB1. Finalmente, ci potrebbero essere delle opportunità nello sviluppare le

combinazioni di agonista oppioide µ e CB1 siccome la sinergia analgesica è stata dimostrata nei

modelli di dolore acuti, suggerendo che le basse dosi delle combinazioni di MU/CB1 forniranno

l'efficacia analgesica adeguata con gli effetti collaterali ridotti. È attualmente non chiaro se la

sinergia sarà trovata nelle condizioni di dolore più croniche e se la riduzione degli effetti

collaterali sarà sufficiente per offrire una finestra terapeutica vantaggiosa.

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Recettori dei neuroni sensoriali specifici

I recettori dei neuroni sensoriali specifici (SNSRs) sono una famiglia di GPCRs che sono espressi

selettivamente in un sottoinsieme di neuroni sensoriali dei gangli dorsali e del trigemino [51].

Questi recettori costituiscono un sottoinsieme di una più grande famiglia di geni affini che fa

riferimento ai geni Mas (Mrgs) [52]. Ci sono sei sottotipi del SNSR umano derivati dai geni

hMrgX, un solo sottotipo nei ratti e diversi da 50 a 60 nei topi. La diversità filogenetica della

famiglia del recettore Mrg non è attualmente capita. In modo importante, l’SNSRs è localizzato

preferenzialmente a IB4 POSITIVO di piccoli neuroni di diametro. Inoltre, approssimativamente

metà dei neuroni SNSR-POSITIVI contengono pure il dannoso recettore vanilloid 1 (TRPVR1),

indicando che i neuroni SNSR-POSITIVI potrebbero essere coinvolti in una gamma diversa di

funzioni sensoriali. Gli sforzi a identificare ligandi ha prodotto diversi attivatori per la famiglia di

SNSR/Mrg. Han [53] ha descritto peptidi affini RFamide che attivano dei membri di questa

famiglia, mentre Bender [54] ha identificato l'adenina come un attivatore di Mrg del topo. Non è

chiaro se questo ligando sarebbe coinvolto nella segnalazione del dolore. Comunque, di

pertinenza del dolore e la unica distribuzione di SNSRs è il fatto che i peptidi derivano dal gene

pro-encefalina A che è stato identificato e attiva il SNSRs. Così, il peptide della midollare del

surrene del bovino 22 (BAM22), e l'elaborazione endogena del frammentano BAM8-22 , attiva il

SNSRs umano nei test funzionali, ma erano approssimativamente di 10 cavità meno potente allo

SNSR del topo [51]. In modo interessante, BAM8-22 non ha attività su qualsiasi dei recettori

oppioidi, suggerendo che gli stessi prodotti di gene possono entrambi facilitare e possono

inibire dei neuroni sensoriali. Le scoperte inoltre, più recenti hanno dimostrato che γ2-MSH e

CT-γ2-MSH potentemente hanno attivato anche SNSR del topo. La valutazione ulteriore

funzionale di SNSRs con BAM8-22 ha rivelato l'aumento di eccitabilità vertebrale, indicato dalla

potenza di risposte nocicettive evocate dagli stimoli termici e meccanici. Inoltre, la

somministrazione vertebrale di intradermale e intratecale periferica di BAM8-22 e CT-γ2-MSH

ha causato dose dipendente hyperalgesia del compartimento termico. Questi dati sostengono

fortemente un ruolo per SNSRs nella modulazione di dolore ed il bisogno di un analgesico

antagonista.

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Recettore Neuromedina U

Il recettore Neuromedina U (NMU), un peptide di 23 amminoacidi era all'inizio isolato dal

midollo spinale del porcino, ma è anche trovato in un numero di altri tessuti centrali e periferici.

Un N-terminale più breve, di 8 amminoacidi è stato anche identificato che è apparentemente sia

sufficiente sia necessario per conferire la piena attività biologica del peptide. Due recettori per

NMU sono stati identificati, NMUR1 e NMUR2: NMUR1 mRNA appare per essere più

abbondante nei tessuti periferici ed in modo interessante negli strati di piccoli e medi dei

neuroni sensoriali; NMUR2, d'altra parte, appare per essere più specificatamente limitato al

SNC, sebbene un’ alta densità di mRNA del NMUR2 appare nella lamina vertebrale I e II,

indicando un ruolo possibile per NMU nella trasmissione del dolore [55]. Il sostegno ulteriore

per l'attività dei recettori NMU nella modulazione del dolore è indicato dalla dimostrazione che

la somministrazione vertebrale intratecale del ligando peptide NMU di 23 amminoacido ha

prodotto le risposte meccaniche e termiche di stimoli pro-nocicettive alla periferia. In più, 23

amminoacido del NMU hanno migliorato l'eccitabilità di neuroni del corno dorsale, come pure la

sensibilità agli stimoli meccanici dannosi, nel modello flessore-riflesso del topo [55]. Comunque,

il contributo dei sottotipi del recettore NMU alla modulazione dell’eccitabilità o del dolore

vertebrale è attualmente non chiaro, come i sottotipi agonisti selettivi e gli antagonisti non sono

disponibili.

Recettori della Galanina

C’è la prova dell'implicazione dei recettori galanin e recettori galanin nella trasmissione del

dolore. Galanin è stato localizzato alla radice del midollo spinale e gangli dorsali, e può essere

aumentato in queste aree seguenti queste ferite dolorose del nervo [56]. Negli studi funzionali,

il galanin ha prodotto i cambiamenti dell’eccitabilità nel midollo spinale che erano entrambi

eccitatori ed inibitori. Comunque, sotto le condizioni di ipereccitabiltà vertebrale dopo la ferita

dolorosa del nervo, il galanin ha ridotto l’attività riflessa del flessore C evocata dalla fibra e

l'allodynia indotta da un numero di stimoli sensoriali. Il sostegno ulteriore per un ruolo di

16

inibitore globale del galanin nel midollo spinale viene dal trattamento con un oligonucleotide

antisenso di galanin. Questo ha prodotto un’aumentata autotomia del limbo periferico

seguendo la transazione del nervo sciatico, suggerendo il dolore esagerato in mancanza di

galanin endogeno [57]. Oltre a modulare l'eccitabilità neuronale, è stato suggerito che il galanin

è un peptide trofico che è coinvolto nei processi di maturazione e rigenerazione del nervo. In

rapporto con questo, la soppressione del gene di galanin ha ritardato la rigenerazione di nervo

funzionale dopo le lesioni dolorose periferiche del nervo. Mentre diversi ruoli funzionali sono

stati identificati per il galanin nelle conseguenze di ferita periferica, non è chiaro attraverso cui

questi effetti sono mediati poiché un numero di sottotipi del recettore(Gal-R1, Gal-R2 e Gal-R3)

sono stati identificati. Tutti i tre sottotipi dei recettori sono localizzati nel midollo spinale e nei

gangli sensoriali, sebbene gli strumenti molecolari e i ligandi recettore selettivo sono implicati

Gal-R1 e Gal-R2 poiché essendo più particolarmente coinvolti nella modulazione del dolore.

Così, gli agonisti Gal-R2 hanno causato moderata antihyperalgesia in diversi modelli di dolore

cronico, mentre la riduzione di Gal-R1 seguendo il trattamento di antisense ha migliorato

l'hyperalgesia neuropatico [58], suggerendo che questo recettore inibisce anche l'eccitabilità

vertebrale. Comunque, nel globale c'è l'incertezza considerevole del ruolo specifico dei recettori

di galanin nella modulazione del dolore cronico. Ricerche in quest'area continuano, essere

ostacolate dalla mancanza di biodisponibilità dedli antagonisti selettivi.

Recettore dell’ormone Paratiroideo 2

Due sottotipi recettoriali dell’ormone paratiroide (PTH) sono stati identificati nei mammiferi. Il

recettore PTH1 è attivato dal peptide da PTH e PTH-affine, ed è responsabile principalmente

dell’omeostasi di calcio, e sviluppo di tessuto e rimodellazione. Il recettore PTH2 , che è attivato

da PTH, può essere anche attivato con affinità più grande e alta selettività dal recentemente

identificato ligando peptide di 39 amminoacidi (TIP-39), ottenuto dagli estratti ipotalamici di

bovini, che divide dell'omologia con PTH [59]. La prova di un ruolo per il recettore PTH1 nella

modulazione del dolore è limitato, poiché è distribuito molto nei tessuti periferici. Comunque, il

recettore PTH2 ha una distribuzione limitata del SNC (il talamo e la corteccia sensoriale), ed è

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espresso fortemente nei tratti di fibra e nelle estremità dentro la lamina superficiale e del

midollo spinale, come pure in una sottopopolazione di neuroni dei gangli dorsali. Veramente, la

somministrazione locale di TIP-39 sia il midollo spinale o in un membro periferico ha prodotto il

comportamento nocefensive, mentre la somministrazione vertebrale di neutralizzare l’anticorpo

TIP-39 risposte causate nei modelli di dolore acuti risposte antinociceptive [60]. Mentre non c'è

attualmente alcuna prova che il recettore PTH2 gioca un ruolo nel dolore cronico,con i dati

ottenuti si sostiene un ruolo per il recettore PTH2 nella modulazione delll'eccitabilità vertebrale

e suggerisce che un antagonista sarebbe essere l'antinociceptive.

In conclusione diversi GPCRs e loro ligandi giocano ruoli importanti nella modulazione del dolore

acuto e cronico. Gli oppioidi e i cannabinoidi nel particolare sono di valore stabilito terapeutico

per la gestione del dolore, e lo sfruttamento ulteriore dei sottotipi di GPCR specifici

(δ-OPPIOIDI,CB1 e CB2) per questi ligandi produrrà potenzialmente degli analgesici più potenti

con i profili di effetto collaterale favorevoli. Più recentemente, l'identificazione di un numero di

GPCRs nei percorsi del dolore, il SNSRs, il NMU, il Gal R1/2 e il PTH2, ed il ligando selettivo che

modula la trasmissione del dolore, hanno evidenziato per continuare le opportunità

terapeutiche. Finalmente, la scoperta e la caratterizzazione di proteine di RGS coinvolte nella

regolazione del GPCR sono una sfida ulteriore alla comprensione degli GPCRs nella modulazione

del dolore che aggiunge una dimensione addizionale dei bersagli per l'analgesia.

18

5. COMPLESSO A2A/D2

Interazioni tra recettori A2A e D2

Nel 1991, l'interazione antagonistica recettore/recettore A2A/D2 è stata dimostrata nelle

preparazioni della membrana dello striatal con recettori A2A riducendo l'affinità dei recettori

D2, soprattutto nello stato di alta affinità, per gli agonisti [61]. Questo ha offerto un

meccanismo alle nuove interazioni antagonistiche adenosina/dopamina trovate nel cervello [62-

66]. L’ interazione recettore/recettore intramembrana A2A/D2 accade in tutti i tipi di cellule ed

in altri recettori. D2L e D2S potrebbero subire la stessa modulazione dall’attivazione del

recettore A2A, almeno a livello del sito di riconoscimento. La specificità è dimostrata dal

fallimento dei recettori agonisti A1 ad alterare l’affinità dei recettori D2 [61]. Hillion [67] ha

recentemente riferito, in cui si è basato sugli esperimenti della coimmunoprecipitazione, che

l'eteromerizzazione del recettore umano A2A ed umano D2L esiste nello stato basaIe delle

cellule del neuroblastoma SH-SY5Y con i recettori D2L contengono i recettori nativi A2A, ed

esistono nelle cellule dei fibroblasti con il recettore umano D2L con etichettato il recettore A2A

del cane. Esiste anche lì un alto grado di localizzazione dei recettori D2 e A2A in queste cellule e

nelle culture primarie dei neuroni dello striatal del topo (figura 4). L'esistenza di monomeri e di

omomeri contro i complessi eteromerici rimane in queste cellule ad essere determinate come

semplice esistenza del complesso eteromerico, l’eterodimero A2A/D2 (figura 5). Di nuovo,

dovrebbe essere accentuato che questo complesso eteromerico esiste in mancanza di agonisti

esogeni e la specificità dell'eteromerizzazione del recettore A2A/D2 è mostrata dall'assenza del

recettore A2A/D1 nelle cellule che esprimono i recettori D1 e etichettati recettori A2A. Un

significato funzionale di quest'interazione intramembrana di recettore/recettore attraverso

l'eteromerizzazione è poi di ridurre l’affinità dello stato di agonista di alta-affinità dei recettori

D2. Altro significato è di neutralizzare il recettore D2 all’aggancio alla proteina-G, poiché

l’agonista A2A neutralizza la scomparsa del recettore D2 analogo indotto dal GTP nello stato di

alta affinità (RH) attraverso un sito di azione indipendente del sito di legame del GTP (figura 6).

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Così, l’essenza di questa eteromerizzazione del recettore A2A/D2 potrebbe essere nel

convertire il recettore D2 in uno stato di attività funzionale fortemente ridotta (figura 7). In

linea, con quest'attivazione del recettore A2A neutralizzato da risposte dei recettori D2 Ca++

intracellulari indotti [68] e l'inibizione del recettore mediato D2 della formazione di cAMP

[67,69]. E’ stato basato sugli studi delle chimere del recettoreD1/D2 [70-73] dove il dominio

TM 5 e 6 più il terzo loop del recettore D2 è stato sostituito dal dominio corrispondente del

recettore D1, è probabile che questi domini dei recettori D2 sono delle parti dell'interfaccia

A2A/D2, dall'affinità di questa chimera del recettore D1/D2 per la dopamina non può essere

modulata in lungo dall'attivazione di agonista del recettore A2A [73]. Fino ad ora non è stato

possibile per mostrare una reciproca regolazione di affinità del recettore A2A/D2 da cui il

recettore D2 controlla sull'attivazione l'affinità dell’agonista del recettore A2A. L'interazione

intramembrana recettore/recettore del recettore A2A/D2 attraverso l'eteromerizzazione ha

anche un impatto sul traffico del recettore [67]. Così, la coaggregazione dei recettori D2 e A2A

nelle cellule di membrana e nelle cellule del neuroblastoma potrebbero essere dimostrate dopo

trattamento con agonisti del recettore A2A o D2 per 3 h per mezzo della combinazione con

delle cellule non permeabilizzate. Il recettore D2 dell’aggregazione agonista indotto dei

recettori A2A era assente nelle cellule del neuroblastoma dei genitori, con un'espressione molto

ridotta dei recettori D2. L’aumentato di sviluppo dei recettori aggregati A2A/D2 sulla

membrana della cellula dopo trattamento prolungato con A2A o D2 è stato associato con un

agonista recettoriale A2A a incrementare i livelli di cAMP. Così, il recettore A2A/D2 aggregato

sviluppato era associato all'appartenenza di entrambe omologie e desensibilizzazione di

eterologhi del recettore mediato D2 dei recettori A2A. In contrasto, il recettore D2 non

desensibilizza sotto queste condizioni in termini di inibizione dell’accumulazione di cAMP, forse

collegato sostanzialmente alla più alta densità dei recettori D2, di cui potrebbe rappresentare

risparmio dei recettori. Un alto grado di localizzazione dei recettori A2A e D2 sono stati anche

trovati nelle colture dei neuroni dello striatal ed anche qui l'agonista A2A o l’agonista D2 dopo

un'esposizione prolungata potrebbe indurre la coaggregazione dei recettori A2A/D2. La

cointernalizzazione dei recettori A2A/D2 potrebbero essere dimostrati direttamente incubando

20

anche anticorpi fluorescenti dei recettori D2 ed A2A insieme a agonisti recettoriali A2A e D2 a

4°C per 2 h seguita dall'incubazione per 3 h a 37° C, consentendo di etichettare i recettori

A2A/D2 internalizzati sotto l'influenza dei due agonisti. Tale sinergismo per ciò che riguarda la

coaggregazione e la internalizzazione dei recettori A2A/D2 non potrebbero essere dimostrati

nei neuroni dello striatal. È di interesse sostanzioso che negli esperimenti di accumulazione del

cAMP sulle cellule del neuroblastoma, il trattamento combinato di agonista è stato associato

con lo sviluppo di una desensibilizzazione del recettore D2 mentre ha visto l’inibizione ridotta

dall’attivazione del recettore D2 dell'accumulazione di cAMP [67]. Così, il recettore dell’

eteromerizzazione A2A/D2 appare essere coinvolto nell’aggregazione, nell’internalizzazione e

nella desensibilizzazione dei recettori A2A e D2 [67]. Finalmente, quest'interazione

intramembrana recettore/recettore A2A/D2 attraverso l'eteromerizzazione potrebbe aiutarci a

capire la tolleranza trasversale e la sensibilizzazione trasversale trovata in vivo tra gli agonisti di

dopamina e nell’azione dei farmaci che agiscono sui recettori A2A [74,75] e anche la riduzione

dell'attività antiparkinsoniana [72].

Figura 4. Neurone efferente GABAergico dello striatal.

21

Figura 5. Spina dorsale dendritica del neurone GABAergic dello striatopallidal. Localizzazione dei recettori dell’adenosina A2A e della dopamina D2.

Figura 6. Meccanismi coinvolti nelle multiple interazioni biochimiche tra i recettori della dopamina D2 e dell'adenosina A2A.

22

Figura 7. Modello computerizzato dell’interazione tra il recettore D2 (lato sinistro) ed il recettore A2A (lato destro).

I domini di transmembrana che legano l’elica sono visti in una direzione parallela alla superficie della membrana, situata in cima del lato intracellulare. I numeri indicano le eliche 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7. I domini extracellulari sono grigi, poiché i loop intracellulari 1, 2 e 3 e la C-coda sono verdi, bianchi, viola e rossi, rispettivamente. In fondo, lo schema dei recettori D2 ed A2A con la posizione dell’interazione dell'epitopo.

23

Interazioni a livello biochimico

L’interazione tra i recettori A2A e D2 è stata mostrata usando i test della

coimmunoprecipitazione e la tecnica della risonanza di trasferimento di energia di fluorescenza

e bioluminescenza (FRET o BRET) su cervelli di topo sprague-dawley. A livello biochimico, due

tipi di interazioni antagonistiche del recettore A2A/D2 sono state scoperte e ciò potrebbe

spiegare le interazioni del recettore A2A/D2 che hanno descritto entrambi a livello neuronale e

del comportamento [76-80]. Dapprima, per mezzo di un'interazione allosterica nel recettore

eteromero, lo stimolo del recettore A2A diminuisce l'affinità del recettore D2 per i loro agonisti

[81]. Poi, la stimolazione del recettore D2 alla proteina G i/o inibisce l'accumulazione di cAMP

indotta dalla stimolazione del recettore A2A alle proteine G s/olf [76,79,80]. Nella buona

conoscenza del ruolo della dopamina nella malattia del Parkinson, della schizofrenia e

dell’abuso di farmaci, è stato suggerito che le interazioni del recettore A2A/D2 nel sistema

centrale nervoso potrebbero fornire dei nuovi approcci terapeutici per combattere questi

disordini [78,82]. Un'interazione elettrostatica epitopo-epitopo tra un epitope ricco di Arginina

del N terminal del terzo loop endocellulare (3IL) del recettore D2 ed un epitope contenente una

Serina fosforilata localizzata nella parte distale del C terminal del recettore A2A sono coinvolti

nell'interfaccia dell’eteromero del recettore A2A/D2 [83-85]. Lo stesso epitopo ricco di Arginina

del recettore D2 può interagire con la CaM [86-89]. In mancanza di residui fosforilati, adiacenti

gli aspartati o i glutammati, che sono abbondanti nella CaM, possono così formare complessi

non-covalenti con l'epitopo ricco di Arginina [90]. Quindi, la CaM può trasportare

potenzialmente un segnale Ca++ al recettore D2 attraverso un legame diretto al 3IL del

recettore D2 [86]. I dati di spettrometria di massa hanno mostrato che CaM del bovino può

formare dei complessi multipli non-covalenti con un peptide ricco di Arginina corrispondente

alla regione del N-terminaI del 3IL del recettore D2 (VLRRRRKRVN) [88] come pure un peptide

dal prossimale C terminal del recettore A2A [88]. Quest'epitopo, la cui sequenza è RIREFRQTFR

nel recettore umano A2A, contiene anche diversi residui di Arginina. Poiché la sospettata

interazione tra il recettore A2A e CaM attendevano la conferma dai test che usano delle

proteine complete, lo studio attuale è stato intrapreso per dimostrare l'esistenza di interazioni

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tra il recettore A2A e CaM entrambi in un sistema celIulare di espressione della proteina

ricombinante nel cervello. Un approccio proteomics è stato usato per la scoperta di interazioni

proteina-proteina tra il recettore A2A e CaM nel cervello del topo, poiché BRET nelle cellule del

trasporto ha dimostrato un'interazione diretta tra CaM e questo recettore. Inoltre, dall’uso di

BRET e le conseguenti tecniche di trasferimento di energia di risonanza (SRET) ed analizzando il

segnale MAPK nelle cellule di transporto, la prova è stata ottenuta per l’oligomerizzazione

CaM-A2A-D2 del recettore ed un selettivo Ca++ ha mediato la funzione della modulazione del

recettore A2A e D2 nel recettore eteromero A2A/D2 (figura 8). Dai test fatti c’e la prova per la

legatura della CaM ai recettori dell’adenosina A2A (figura 9). È stato dimostrato che la sequenza

RIREFRQTFR, che è presente nella parte prossimale del C terminale del recettore A2A, è il

dominio di legatura della CaM in questi recettori. Inoltre, formano la prova per

l’oligomerizzazione del recettore CaM-A2A-D2 e per una specifìca modulazione Ca++

dipendente della funzione del recettore eteromero A2A-D2. La legatura di CaM al recettore D2

rompe l'agganciamento di Gi/o e quindi la sua capacità di inibire l'attività dell’adenilato

ciclasico. I test suggeriscono che CaM e il recettore A2A potrebbero interagire, ma l'esistenza di

una terza proteina che costruisce un ponte non può essere esclusa. A questo scopo, i test di

BRET sono stati eseguiti nelle cellule transfected con il cDNAs per le proteine di fusione

A2ARRluc e CaMYFP. L'iperbole ottenuta aumenta il rapporto di YFP/Rluc indica che

un'interazione specifica tra CaM e il recettore A2A può accadere nelle cellule viventi.

Esperimenti simili sono stati eseguiti usando D2RRluc e CaMYFP a confermare che queste due

proteine potrebbero stabilire delle interazioni molecolari dirette. La specificità delle interazioni

CaM e recettore A2A o CaM e recettore D2 nelle ceIlule HEK è stata confermata dal non

specifico segnale di BRET ottenuto quando a testato A1RRluc e CaMYFP. L'immunoIocalizzazione

dei recettori e CaM sono stati eseguiti nelle cellule HEK tranfettate. Quando espresse in

mancanza dei recettori, la CaM ha mostrato una localizzazione citosolica. L’espressione della

CaM e qualsiasi dei due recettori non ha modificato la localizzazione del recettore (figura 10).

D'altra parte, una localizzazione significativa della membrana della CaM è stata solo osservata

quando la proteina era espressa con entrambi i recettori A2A o D2. Gli esperimenti di BRET sono

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stati eseguiti per dare conoscenza nel ruolo del Ca++ nell'interazione di CaM con entrambi i

recettori A2A o D2 (figura 11). Da una parte, questi dati indicano che Ca++ non ha avuto bisogno

per CaM di poter interagire con i recettori A2A o D2. D'altra parte, l’aumento di ionoforo induce

nella concentrazione intracellulare di Ca++ non rompe l'oligomerizzazione del CaM con i

recettori ma conduce ai cambiamenti di conformazione nella molecola CaM e/o i recettori che

altera la distanza tra Rluc e YFP (figura 12). Per mezzo delle sperimentazioni di competizione di

BRET eseguite con le cellule che esprimono A2A Rluc e CaM YFP, l'aumento dell’espressione del

recettore D2 non ha modificato il segnale di BRET dovuto a A2RRluc e CaMYFP (figura 13).

Analogamente, aumentando l'espressione di CaM non ha modificato il segnale di BRET dovuto a

A2RRluc e D2RYFP. Queste scoperte mettono in relazione la capacità potenziale dei recettori di

CaM ed A2A per legare a qualsiasi dei due epitopi ricchi di Arginina del 3IL del recettore D2L. La

specificità di questi effetti è stata dimostrata dall'indipendenza del segnale di BRET con

l'espressione crescente del recettore A1. Lo studio attuale dimostra l'esistenza delle interazioni

intermolecolari oligomeriche tra i recettori CaM, A2A e D2. Quando non espressi insieme, i

recettori A2A o D2 potrebbero legare potenzialmente la CaM, ma nelle cellule che esprimono gli

eteromeri del recettore A2A-D2, i legami del CaM preferenzialmente al recettore A2A (figura

14). Inoltre, la CaM trasduce i cambiamenti di Ca++ dipendenti delle MAPK che segnalano

nell’oligomero del recettore CaM-A2A-D2 (figura 15). Questo lavoro aggiunge delle nuove

informazioni della funzione degli eteromeri del recettore A2A-D2, che sono considerati come un

bersaglio per lo sviluppo degli agenti anti-parkinsonian.

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Figura 8. Identificazione del recettore oligomero CaM-A2A e CaM-D2 dagli esperimenti BRET.

Le curve di saturazione BRET sono state eseguite usando cellule HEK-293 che esprimono A2ARRluc e CaMYFP (A) o D2RRluc e CaMYFP (i triangoli); (B) o A1RRluc e CaMYFP (i quadrati). La tranfezione è stata eseguita con gli ammontari crescenti di plasmidio-YFP, poiché del plasmidio-Rluc formato è stato mantenuto costante. Sia la fluorescenza e sia la luminescenza per ogni campione sono state prima misurate, a confermare dell’espressione di donatore mentre controllando l'aumento dell'espressione di accettante. L'ammontare relativo di accettante è dato come il rapporto tra la fluorescenza dell'accettante (YFP) e l'attività luciferase del donatore (Rluc). I dati BRET sono espressi come media di 4–8 esperimenti diversi raggruppati come una funzione dell'ammontare di accettante BRET.

27

Figura 9. Identificazione del sito di legame CaM recettore A2A.

A, gli esperimenti di competizione BRET sono stati eseguiti con cellule HEK-293 tranfettate con A2ARRluc, CaMYFP e gli ammontare crescenti del corrispondente cDNA a A2AR (le sbarre bianche) o A2ARAAA (sbarre nere). Sia la fluorescenza e sia la luminescenza per ogni campione sono state controllate a confermare l'espressione di donatore e di accettante. L’espressione del recettore A2AR ed A2ARAAA è stata controllata dall’assorbimento. B, le curve di saturazione BRET sono state eseguite con cellule HEK-293 che esprimono A2ARAAARluc e gli ammontare crescenti di CaMYFP e non curato (i simboli bianchi) o trattato (10 min; simboli neri) con 1 µM di ionomicina nel tampone HBSS che contiene 1.26mM di CaCl2. Sia la fluorescenza e sia la luminescenza di ogni campione sono state controllate a confermare le espressioni simili di donatore mentre controllando l'aumento dell'espressione di accettante. L'ammontare relativo di accettante è dato come il rapporto tra la fluorescenza dell'accettante (YFP) e l'attività luciferase del donatore (Rluc). I dati BRET sono espressi come media di 4-6 esperimenti diversi raggruppati come una funzione dell'ammontare di accettante BRET. I risultati sono paragonati con la curva ottenuta per A2ARRluc e per CaMYFP.

28

Figura 10. La localizzazione della membrana di CaM con i recettori A2A o D2. Le cellule transfettate HEK-293 sono state lavate e risospese per 2,5 h in un tampone di HBSS contenente 1,26 ml di CaCl2 (A–D e I–L) o in un tampone di HBSS che contiene 1 ml di EDTA (E–H). Le immagini microscopiche di A, E e I, delle cellule HEK-293T che esprimono CaMYFP, A2ARRluc, o D2RRluc. Le immagini microscopiche B–D, F–H e J–L, delle cellule transfected HEK-293T descritte sopra di cDNA per CaMYFP ed di A2ARRluc (B, F, e J), CaMYFP e D2RRluc (C, G, e K), o CaMYFP ed A1RRluc (D, H, e L). Le cellule trattate con ionomicina sono mostrate nel I–L. La caM è stata identificata dalla fluorescenza di YFP (le immagini verdi) e nel costruire i recettore-Rluc sono stati identificati dall'immunocitochimica (usando un anticorpo monoclonale primario anti-Rluc e una cyanine-3-coniugata con l’anticorpo secondario). La localizzazione (gialla) è mostrata nei giusti pannelli.

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Figura 11. Effetto del Ca++ intracellulare sull'interazione tra CaM e i recettori A2A o D2 rilevati dagli esperimenti del BRET.

A–C, le curve di saturazione del BRET sono state eseguite usando cellule HEK-293 coespresse di A2ARRluc e CaMYFP (A), D2RRluc e CaMYFP (B), o A1RRluc e CaMYFP come controllo negativo (C). In tutti i casi, le cellule sono state trattate con il tampone HBSS che contiene 1.26mM di CaCl2 e 1 µM ionomicina a 10 min(blu), 5 min(il verde), o 2 min (rosso) prima della determinazione del BRET. Le curve di saturazione del BRET sono state paragonate con quella ottenuta in mancanza di ionomicina. L'ammontare relativo di accettante è dato come il rapporto tra la fluorescenza dell'accettante (YFP) e l'attività luciferase del donatore (Rluc). I dati di BRET sono espressi come media di 4 – 8 esperimenti diversi raggruppati come una funzione dell'ammontare di accettante di BRET. D, le cellule HEK-293 sono state transfected con 0,6 µg di cDNA per A2ARRluc (A2AR) o 1 µg di cDNA per D2RRluc (D2R) e 1 µg di cDNA di CaMYFP, e le membrane sono state ottenute 48 h dopo la tranfezione. Le membrane sono state risospese nel tampone libero HBSS e 1,26 mM di CaCl2 sono stati aggiunti per i tempi indicati prima della determinazione di BRET. I dati di BRET sono espressi come media di cinque esperimenti diversi. Le differenze significative sopra le cellule ionomycin-non-trattate sono state calcolate dall'analisi a senso unico della variazione e dal test Bonferroni.

30

Figura 12. L’interazione CaM con i recettori eterodimerici A2A-D2 scoperti dagli esperimenti di competizione BRET.

Gli esperimenti di competizione BRET sono stati eseguiti con cellule HEK-293 che esprimono donatore ed accettante a dare i valori submaximali BRET. A, le cellule erano tranfettate con il corrispondente cDNA a A2ARRluc e CaMYFP e l’ammontare crescente del cDNA D2R come competitore la cui espressione è stata controllata dall’assorbimento occidentale (il fondo) mBU, le unità milli-BRET. B, le cellule sono state tranfettate con il corrispondente cDNA a A2ARRluc ed a D2LRYFP e gli ammontare crescenti di cDNA CaMGFP2 come il competitore la cui l'espressione è stata controllata misurando la fluorescenza GFP. Per determinare la fluorescenza di YFP negli esperimenti BRET, la firma spettrale era considerata per controllare la contribuzione GFP al canale di rivelazione. Le cellule sono state tranfettate con il corrispondente cDNA a D2LRRluc o D2SRRluc e CaMYFP e gli ammontare crescenti di cDNA A2AR come competitore (le sbarre nere) o A1R come controllo negativo (le sbarre bianche), la cui l'espressione è stata controllata dall’assorbimento. In cima a ogni pannello, un progetto descrive le proteine espresse nei test di competizione BRET.

31

Figura 13. SRET per CaM, recettore A2A e recettore D2 nelle cellule viventi.

Le curve di saturazione SRET sono state eseguite nelle cellule HEK-293 espresse nel A2AR-Rluc, CaMGFP e gli ammontare crescenti di D2RYFP. La rete SRET è stata ottenuta controllando l'emissione di fluorescenza di YFP dopo l’aggiunta di coelenterazine H, con la sottrazione del valore ottenuto con le cellule che esprimono lo stesso ammontare di A2AR-Rluc e CaMGFP. Il significato della rete SRET è stata rilevata per l’agganciamento A2ARRluc-CaMGFP2-D2RYFP, poiché la trascurabile o lineare rete SRET è stata ottenuta nelle cellule che esprimono l’ammontare equivalente di A2ARRluc, CaMGFP2, e 5HT2BYFP o A1RRluc, CaMGFP2, e D2RYFP, che sono stati usati come controlli negativi. I valori, espressi come rete SRET, rappresentano cinque esperimenti indipendenti eseguiti in tre copie. In cima, un progetto descrive le proteine espresse nei test SRET.

32

Figura 14. Effetto del Ca++ intracellulare sulle interazioni molecolari tra CaM, i recettori A2A, and D2.

A, effetto dei livelli di Ca++ sull’eterodimerizzazione dei recettori A2A-D2 rilevati da BRET. Le curve di saturazione BRET sono state eseguite con cellule HEK-293 che esprimono A2ARRluc e gli ammontari crescenti di D2RYFP. Le cellule nel tampone HBSS contenendo 1.26mM di CaCl2 erano non curate o trattate con l'ionomicina per 2 min (rosso), 5 min (il verde) o 10 min (blu) prima della determinazione BRET. Entrambi fluorescenza e luminescenza per ogni campione sono state misurate a confermare le espressioni di donatore simili mentre controllando l'espressione dell’aumento di accettante. L'ammontare relativo di accettante è dato come il rapporto tra la fluorescenza dell'accettante (YFP) e l'attività luciferase del donatore (Rluc). I dati BRET sono espressi come di quattro esperimenti diversi raggruppati come una funzione dell'ammontare di accettante BRET. B, effetto dei livelli di Ca++ sull’oligomerizzazione CaM-A2A-D2 rilevata da SRET. Le curve di saturazione di SRET sono state eseguite nelle cellule HEK-293 che esprimono A2ARRluc, CaMGFP, e l’ammontare crescente di D2RYFP. Le cellule nel tampone HBSS che contengono 1.26mM di CaCl2 sono state trattate per 10 min prima della determinazione SRET e la curva di saturazione SRET è stata paragonata con quella ottenuta in mancanza di ionomicina.

33

Figura 15. Effetto del Ca++ intracellulare sulla fosforilazione mediata ERK 1/2 dei recettori eterodimeri A2A-, D2-, e A2A-D2.

Le cellule HEK-293 che esprimono il recettore A2A o il recettore D2 e CaM. (A); il recettore A2A, il D2R e il CaM (B); o il recettore A2A e il D2R (C) sono stati collocati nel contenere il tampone HBSS 1,26 ml di CaCl2 e trattato 3 min con il veicolo o con 1 µM di ionomicina prima dell'addizione del recettore agonista A2A CGS21680, il recettore agonista D2 quinpirole o entrambi. E’ mostrato un’assorbimento dai test della fosforilazione ERK 1/2. Nessuna differenze significative nei livelli basali sono state rilevate dalla presenza di CaM o di CaM più ionomicina. La banda immunoreattiva dagli esperimenti indipendenti 4-6 sono stati quantificati ed i valori rappresentano la media percentuale di aumento della fosforilazione sopra i livelli basali (100%) trovata nell’ionomicina-non curata o nelle cellule trattate. Le differenze significative di agonista trattato verso il basale o l'agonista trattato nella presenza verso l'assenza di ionomicina sono state calcolate dall'analisi a senso unico della variazione e dal test di bonferroni.

34

Ligandi bivalenti

E’ stato disegnato ed è stato sintetizzato per studiare gli eteromeri A2A/D2, una famiglia di

ligandi etero bivalenti che contengono collegato un agonista D2 e un antagonista A2A. Queste

scoperte indicano l'esistenza degli eteromeri dei recettori A2A/D2 e di una simultanea

interazione dei ligandi etero bivalente con entrambi i recettori. L'effetto cooperativo derivato

dall'interazione simultanea suggerisce l'evento degli eteromeri A2A/D2 nelle cellule

cotransfected e nello striatum del cervello. L’azione bivalente dopamina/adenosina potrebbe

costituire un nuovo concetto nella farmacoterapia del morbo del Parkinson. Nello studio

attuale, hanno sintetizzato test di ligandi eterobivalenti costituiti da due metà farmacoforiche,

XCC (1) come recettore A2A antagonista e (±)-PPHT-NH2 (2) come recettore D2 agonista, che

sono collegati tramite linkers Lys-Lys-[PEG/polyamide]n-Lys-Glu (figura 16). Questi risultati

indicano che un Iigando eterobivalente legato al D2R può successivamente localizzarsi nella

vicinanza del A2AR con una più alta affinità del corrispondere ligando A2AR monovalente. Allo

stesso modo, un composto eterobivalente al A2AR in seguito legato a D2R localizzato in più

vicino la prossimità con una più alta affinità del suo contrasto D2R monovalente. Questo indica

un fattore di concentrazione significativo esercitato dal Iigando eterobivalente che può essere

solo considerato se entrambi i recettori sono in una prossimità molto vicina. Così, il ligando

eterobivalente di dopamina-adenosina è usato per mostrare l'evento di questo eteromero nello

striatum del cervello e l'affinità aumentata di questo ligando ha rilevato che quando entrambi i

recettori sono presenti è un'indicazione forte di legatura all'eteromero del recettore A2A-D2. Le

potenti tecniche biofisiche come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) e

il trasferimento di energia di risonanza della bioluminescenza (BRET) sono stati decisivi nel

dimostrare la formazione di eteromeri nei sistemi di espressione dei sistemi eterologhi. Il

ligando eterobivalente sono degli strumenti di valore farmacologico che consente la

dimostrazione dell'esistenza degli eteromeri del recettore A2A-D2 anche nel tessuto nativo e

può essere usato per studiare il comportamento di un specifico dimero GPCR senza qualunque

modifica di recettore. Inoltre, le strategie di ligando etero bivalente possono essere sviluppate

per identificare gli eteromeri che coinvolgono gli altri recettori neuromodulatori e/o

35

neurotrasmettitori, che potrebbero condurre a nuovi approcci terapeutici nel combattere una

varietà di malattie neurologiche e neuropsichiatriche. In sintesi, nel lavoro attuale, abbiamo

disegnato ed abbiamo sintetizzato il ligando eterobivalente che serviamo da una sonda per gli

eteromeri del recettore A2A D2 nei tessuti nativi e potremmo aprire delle nuove strade per il

progetto di farmaci eteromeri-selettivi per il trattamento del morbo di Parkinson.

Figura 16. Disegno di ligandi mono e eterobivalenti.

36

6. COMPLESSO D2/D3

I recettori D2 e D3 sono noti esistere come i monomeri e come gli omomeri [91,92]. Nel 2001,

l’ulteriore prova venuta dai recettori D2 e D3 possono formare gli eteromeri con le proprietà

uniche funzionali [93]. Usando la coimmunoprecipitazione si sperimentano differenti recettori

etichettati D2 e D3 ed hanno mostrato che i recettori D2 e D3 nelle cellule HEK-293 possono

formare un complesso eteromerico. Inoltre, potevano dimostrare che i frammenti della coda del

recettore di dopamina potrebbero formare i recettori di dopamina funzionali che limitano gli

agonisti e gli antagonisti della dopamina con un profilo farmacologico diverso paragonato con

recettori nativi D2 e D3, con l'affinità più alta di tutti essendo trovati con la combinazione dei

frammenti della coda. Così, gli eteromeri D2/D3 potrebbero essere formati attraverso il

meccanismo del cambio del dominio come proposto da Gouldson e da Reynolds [94,95] che si

sono basati sulle dimostrazioni della complementazione funzionale tra le chimere dei recettori

α2 adrenergici e M3 muscarinico [96]. In accordo con la formazione degli eteromeri D2/D3 nelle

cellule, questi tipi di frammenti del recettore D2 e D3, quando coespressi con i recettori nativi

D2 e D3, hanno ridotto l'espressione dei recettori della dopamina nativi indicando la complessa

formazione del recettore frammento/nativo. Comunque, non solo sono recettori D2 trunc/D3

tail e D3 trunc/D2 tail capaci di legare i ligandi ma possono agganciare anche in una maniera

inibitoria all’adenilato ciclasico e alla stessa estensione come il recettore nativo D2. È anche di

interesse sostanziale che il recettore D3 sotto le condizioni in cui non può inibire l’adenilato

ciclasico VI può sviluppare tale agganciamento dal trasporto con i recettori D2. È quindi possibile

che nel complesso del recettore eteromerico D2/D3 formato, il recettore D2 può fare il possibile

all’aggancio alla proteina-G del recettore D3 all’adenilato ciclasico VI. Altrimenti, il recettore D3

che lega la tasca sull'attivazione dagli agonisti D3 può, attraverso i cambiamenti di

conformazione, trasferire la tasca D2 dell’eteromero in uno stato attivato, conducendo

all’attivazione di Gi e all’inibizione di adenilato ciclasico VI. Finalmente, nel caso dell’attività

dell’adenilato ciclasico V, la coespressione dei recettori D2 e D3 sono risultati anche in

un’aumentata potenza dell’agonista D3 per inibire questo adenilato ciclasico paragonato con il

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recettore wild-tipo D2 quando attivato dagli agonisti D2. Una funzione del complesso

recettoriale eteromerico D2/D3 potrebbe essere quindi di consentire un agganciamento

inibitorio più forte dei recettori D3 all’adenilato ciclasico. La localizzazione dei recettori D2 e D3

è stata dimostrata nelle cellule nervose dei gangli basali [97,98] mostrando che c'è il potenziale

a formare l’eteromero funzionale D2/D3 anche nel vivo.

38

7. COMPLESSO SSTR5/SSTR1

Lo studio di Rocheville [99] dà una bell'illustrazione delle interazioni intramembrana

recettore/recettore sulla loro pertinenza funzionale e del rapporto dei monomeri, dei omomeri, e

degli eteromeri fra cinque sottotipi recettoriali di somatostatina. Usando l'analisi FRET, il sottotipo

recettoriale umano della somatostatina SSTR5 è stato mostrato per esistere come un monomero

nello stato basale, e sull'attivazione dell’agonista è stato convertito in un omomero. I dati hanno

suggerito che la dimerizzazione dell’agonista-indotto del recettore SSTR5 erano essenziali per

segnalare. L'eteromerizzazione dell’agonista-indotto dei recettori SSTR5 e SSTR1 e potrebbe

anche essere dimostrata per lo specifico sottotipo. Il suggerimento è stato fatto che l'alto livello

riferito dell’espressione dell’omomero basale del GPCR potrebbe essere dovuto all'over-

espressione del recettore. Le interazioni intramembrana recettore/recettore del SSTR5 e SSTRI

attraverso l'eteromerizzazione sono stati mostrati per avere delle conseguenze funzionali

importanti per i recettori che partecipano. Oltre ai cambiamenti nell'affinità dell’agonista che

sviluppano di solito sui cambiamenti nello stato di oligomerico, le alterazioni marcate

nell'internalizzare e nella regolazione dell’agonista-dipendente dei recettori SSTR1 sono accadute

attraverso la formazione di un eteromero con i recettori SSTR5. Così, il solo recettore SSTR1 ha

subito solo l'internalizzazione agonista-indotto come un eterodimero con il recettore SSTR5.

Inoltre, l'eteromerizzazione ha consentito all’agonista del recettore della somatostatina a indurre

la regolazione di legatura dell’agonista al recettore SSTRI. Il recettore SSTR5 che segnala alla

proteina-G non è coinvolto probabilmente in questa risposta dell'eteromero, poiché la coda del

COOH-terminale del recettore SSTR5 era stato cancellato abolendo la regolazione di adenilato

ciclasico. Questi risultati sono di interesse sostanziale da allora in questa maniera la

desensibilizzazione dei sottotipi recettoriali di somatostatina attivata può essere compensata da

una regolazione dei sottotipi del recettore della somatostatina non attivata, come SSTR1 ha fatto

il possibile attraverso l'eteromerizzazione. Così, un altro significato funzionale delle interazioni

intramembrane recettore/recettore tramite l'eteromerizzazione potrebbe essere la sensazione di

un isorecettore poiché l'altro isorecettore dell'eteromero subisce la desensibilizzazione.

39

8. COMPLESSO SSTR5/D2

La scoperta di quest'interazione intramembrana recettore/recettore attraverso l'etero

oligomerizzazione hanno dato una nuova maniera per capire le interazioni della

somatostatina/dopamina ben conosciute nel cervello, coinvolte per esempio nel controllo

dell’attività motoria [100-108]. In questo caso l'etero-oligomerizzazione ha coinvolto distinti

GPCR e non isorecettori che hanno lo stesso ligando endogeno. Era per mezzo della microscopia

FRET che l’interazione diretta recettore/recettore SSTR5/D2 potrebbe essere determinata e

l'oligomerizzazione era stata appena osservata nello stato basale ma solo dopo il trattamento

con l'altro agonista. Il trattamento simultaneo con i due tipi di agonisti non ha avuto ulteriore

azione insieme [109]. È saputo che recettori omomeri D2 esistono nello stato basale [92] e gli

omomeri della somatostatina sono indotti dagli agonisti del recettore della somatostatina.

Rimane per essere determinata quali eterodimeri sono formati o i più grandi complessi

oligomerici nel caso dell’eteromerizzazione SSTR5/D2. Il significato funzionale di

quest'interazione diretta intramembrana recettore/recettore appare avere diverse pieghe

[109]. Dapprima, la tasca obbligatoria del recettore SSTR5 è stato segnatamente alterato,

poiché un aumento di 30 pieghe nell'affinità è stata trovata sull'attivazione dell’agonista

recettoriale D2, poiché gli antagonisti del recettore D2 hanno ridotto l'affinità dei recettori

SSTR5 per l’agonista della somatostatina SST-14. Così, il differente stato conformazionale del

recettore D2 ha un'azione modulatoria sostanziosa sulla tasca obbligatoria del SSTR5. Il

riconoscimento dell'interazione al luogo di livello aveva anche migliorato l’affinità reciproca

dall'agonista della somatostatina del recettore D2 per gli antagonisti. Secondo, la proteina-G del

recettore SSTR5 è stata migliorata dall’attivazione del recettore D2, poiché la riduzione di

legatura di agonista del recettore SSTR5 dal GTP γ S è stata migliorata dall’agonista D2. Inoltre,

le risposte inibitorie sull'accumulazione di cAMP sono state considerevolmente migliorate dai

trattamenti simultanei di agonista, accentuando il miglioramento dell’attività funzionale

attraverso l'etero oligomero formato ed i cambiamenti di conformazione indotti dagli agonisti in

questo complesso. Infatti, questi cambiamenti funzionali nelle interazioni intramembrane

40

recettore/recettore indotti dagli agonisti SSTR5 e D2 potrebbero spiegare l’aumento di

neurotrasmissione mediato dei recettori della somatostatina e del D2 trovati nel vivo dopo

trattamenti con agonista somatostatina o dopamina. In questo studio, Rocheville [109] ha usato

anche il mutante recettoriale 318-SSTR5, con una soppressione della coda del COOH-terminale.

Questo recettore mutante SSTR5 era stato precedentemente mostrato per legare gli agonisti

della somatostatina con un’affinità immutata, ma diversa del recettore wild-tipo SSTR5, non può

produrre inibizione delll'accumulazione di cAMP indotta forskolin [110]. L’interessante scoperta

era con i recettori D2 e mutante 318-SSTR5 potrebbero restaurare l'agonista della

somatostatina a segnalare adenilato ciclasico fornito al sito di riconoscimento non è stato

bloccato da un antagonista D2. Queste osservazioni possono essere spiegate dalla formazione di

un etero-oligomero nelle cellule che usano CHO-K , in cui il SSTR5 la tasca di legatura quando

attivata dagli agonisti può segnalare tramite un cambiamento di conformazione nella tasca di

legatura della dopamina D2. Questo condurrebbe a un agganciamento del luogo di

riconoscimento D2 al sito della proteina-G seguita dalla sua successiva attivazione e la sua

inibizione di adenilato ciclasico. Questo cambiamento di conformazione non può accadere

quando la tasca di legatura D2 è in uno stato obbligatorio antagonistico. Indica infatti che il

recettore SSTR5 può segnalare tramite un cambiamento di conformazione nel recettore come

alla produzione dell’agonista D2. In altre parole, una cross-attivazione del recettore D2 può

accadere in mancanza di dopamina da un'interazione diretta recettore/recettore nelle

interfacce del recettore etero-oligomero. Così, il recettore SST attivato può non solo modulare

l'attivazione all’agganciamento recettoreD2/proteina G i all’adenilato ciclasico ma produce

anche un'attività costitutiva del recettore D2 quando non è chiuso a chiave in uno stato

antagonistico. Da un'altra prospettiva, rappresenta un esempio di come un GPCR mutante può

regolare il suo segnale attivando un altro recettore agganciato allo stesso tipo di proteina-G.

41

9. COMPLESSO A1/D1

L'articolo sugli eteromeri A1/D1 è stato pubblicato da un paio di mesi dopo la pubblicazione

dell'articolo del recettore oligomero SST5/D2 e dà un altro esempio di eteromerizzazione tra

distinti GPCR [104]. Un numero di osservazioni morfologiche e neurochimiche indicano che le

interazioni recettore/recettore di adenosina A1 e dopamina D1 esistono nei gangli basaIi

[63,65,111,113,114] e la localizzazione dei recettori A1 e D1 esistono nelle culture primarie

corticali [104]. L'articolo di Ginés [104] dà la prima prova che quest'interazione

recettore/recettore può coinvolgere i complessi recettoriali eteromerici A1/D1 poiché tali

complessi potrebbero essere dimostrati nel trasporto A1/D1 dei fibroblasti per mezzo della

coimmunoprecipitazione. Così, precedentemente sono stati trovati dei recettori A1 indotti del

recettore D1, ha dimostrato come la scomparsa del recettore indotto A1 dell'alta affinità del

recettore agonista D1 che si lega ai siti nelle preparazioni della membrana [65,111,112],

potrebbe essere il risultato di un'interazione fisica del recettore A1 con il recettore D1 in questo

complesso eteromerico, conducendo allo spaiare del recettore D1 alla sua proteina G in questa

interazione funzionale di complesso eteromerico. L'analisi della coimmunoprecipitazione

dimostra la sua esistenza già nello stato basale e la sua specificità per mostrare

l'eteromerizzazione del recettore A1/D2 nelle cellule di trasporto dei fibroblasti del recettore

A1/D2. Comunque, l'eteromerizzazione recettoriale A1/D1 nelle cellule di fibroblasti è stata

fortemente ridotta dal trattamento di agonista del recettore D1, mostrando una dipendenza

dell’agonista ed il blocco simultaneo del trattamento dell’agonista recettoriale D1 e A1 con

questa rottura del complesso eteromerico. Così, come lo studio di Rocheville [109], questo

studio mostra come trattamenti di agonisti soli o simultanei ai cambiamenti conformazionali

nelle loro rispettive tasche obbligatorie che sono trasmessi all'interfaccia eteromerica e

risultano nel rafforzare o nella distruzione del complesso. In questo caso, l'interazione fisica è

mantenuta quando il recettore A1 e D1 che lega delle tasche è simultaneamente attivato dagli

agonisti che consentono l'interazione antagonistica intramembrana recettore/recettore, cioè la

proteina-G che spaia con la scomparsa dello stato di alta affinità del recettore D1 per gli

42

agonisti. Un significato funzionale di quest'interazione intramembrana recettore/recettore spaia

quindi il recettore D1 dalla proteina-G s. Questo è nel miglioramento dell’attività funzionale dei

recettori oligomerici SSTR5/D2, soprattutto dopo il trattamento combinato di agonista [109]. Il

complesso del recettore eteromerico A1/D1 potrebbe dare quindi delle basi molecolari ben

documentate per le interazioni antagonistiche recettore/recettore A1/D1 trovate nel cervello

delle reti neuronali [63,65,113,114]. L'eteromerizzazione del recettore A1/D1 appare anche per

avere un impatto sul traffico del recettore [104]. Così, un agonista del recettore A1, dopo 3 h di

esposizione, ha prodotto una coaggregazione dei recettori A1 e D1. D'altra parte, un agonista

del recettore D1 dopo 3 h di esposizione ha prodotto solo un'aggregazione della immuno

reattività recettoriale D1 con una mancanza di coaggregazione in accordo con la capacità

dell'agonista del recettore D1 per rompere l'eteromerizzazione del recettore A1/D1. Il recettore

D1 che segnala e rimasto inalterato dalla formazione di gruppi di recettore D1 o A1/D1, mentre

ha visto in termini un cambio dalla stimolazione del recettore un'accumulazione di cAMP e così

con nessun segno della desensibilizzazione del recettore D1. In contrasto, i trattamenti

combinati dei recettori agonisti A1 e D1, sotto le stesse condizioni non sono risultati nella

formazione di gruppi del recettore A1/D1, ma il diffondere della localizzazione del recettore

A1/D1 è stata mantenuta. Inoltre, ora i segni della desensibilizzazione del recettore D1 hanno

sviluppato riduzioni negli aumenti dei livelli di cAMP del recettore indotto D1. Così, le

caratteristiche essenziali della desensibilizzazione del recettore D1 potrebbero mantenere

l’eteromerizzazione con nessun recettore A1/D1 coaggregato formato dopo esposizione

combinata prolungata al recettore agonista A1 e D1 con nessuna indicazione di internalizzazione

del recettore. Sembra possibile che la desensibilizzazione del recettore D1 potrebbe essere

principalmente causata da un cambiamento prolungato allosterico nel recettore D1 causato

dall'interazione recettore/recettore del A1/D1 dentro il complesso eteromerico, che potrebbe

essere raccontato ai cambiamenti successivi della fosforilazione e/o all'associazione con le

molecole β-arrestine [115,116], conducendo complessivamente a una riduzione del recettore

D1/proteina-G. Così, potrebbe essere suggerito che l’interazione intramembrana

recettore/recettore A1/D1 in questo complesso eteromerico è pertinente non solo per

43

l'antagonismo acuto di segnalazione del recettore D1 ma anche per un antagonismo persistente

di lungo termine che segnala il D1 alla proteina-G. I dettagli della composizione e la

stechiometria del complesso del recettore eteromerico A1/D1 sono sconosciuti, ed i recettori

A1 e D1 sono saputi per esistere come monomeri e come omomeri [92,117]. È sconosciuto se

eteromero è preferito quando i recettori A1 e D1 sono coespressi nelle stesse cellule.

44

10. COMPLESSO MGLUR1αααα////A1

C'è la prova che il gruppo 1 del recettore metabotropico del glutammato mGIuR1α e

dell’adenosina A1 sono localizzati in certi tipi di neuroni cerebrali e che le interazioni funzionali

accadono tra i recettori di adenosina e di glutammato nel cervello [118-120]. Gli esperimenti

della coimmunoprecipitazione sugli estratti solubili dalle sinapsi del cervelletto di topo hanno

mostrato quei recettori del mGIuR1α possono coimmunoprecipitare con gli anticorpi del

recettore anti-A1. Così, i recettori del mGIuR1α e dell’A1 potrebbero esistere come eteromeri in

certe popolazioni cellulari del cervelletto [119]. Successivi studi della coimmunoprecipitazione

sulle cellule di HEK-293 hanno mostrato quei complessi di recettore eteromerico del

mGluR1α/Α1 che esistono anche in queste cellule. La specificità del sottotipo del recettore è

stata mostrata dal fallimento della congiunzione della variante del COOH-terminale, il mGIuR1α

all'immunoprecipitato con il recettore A1, indicando l'implicazione della coda del COOH-

terminale nella formazione di questo complesso eteromerico. È sconosciuto come questo

complesso eteromerico si attacca al dimero del recettore mGIuR1, dove l'interfaccia modula il

sito di legatura del glutammato della regione extracellulare del recettore [121]. Il ruolo

funzionale di questa eteromerizzazione è stata soprattutto studiata nelle cellule HEK-293. E’

stato trovato che l'acido quisqualico ha migliorato sostanzialmente l'aumento di segnalazione

della produzione di Ca++ dall'attivazione del recettore A1, e lo stesso era vero quando la

modulazione della funzione del recettore A1 di mGIuR1α è stata studiata. Così, sembra come se

l'eteromerizzazione ha condotto allo sviluppo di risposte cooperative nell’attivazione simultanea

della segnalazione nel Ca++ sui recettori dentro l'eteromero del recettore di mGluR1α/A1.

Anche nelle culture primarie corticali, dove un’alta localizzazione è stata osservata alle posizioni

dendritiche, un'interazione sinergica è stata trovata in termini di una riduzione di neurotossicità

indotta di NMDA [119,120]. Una ridotta neuro protezione è stata osservata nel recettore

mancante A1 [122]. Sembra possibile che l’eteromerizzazione del recettore mGluR1α/A1 può

avere luogo indirettamente, poiché il COOH-terminale interagisce con le specifiche proteine di

bersaglio. Così, l'omero-1a della proteina con un permesso omologo VASP collega il dominio che

45

lega al COOH-terminale del recettore mGluR1α. L’omero 1-c può collegare insieme proteine

ricche di prolina (PPSPF) [123]. È di interesse sostanzioso che questo o un motivo simile hanno

trovato in entrambi la parte COOH-terminale del mGluR1α e nella parte COOH-terminale del

recettore A1. Così, l'omero può essere una parte importante di questo complesso eteromerico

come una proteina adattatore [124,125]. Esso dovrebbe essere anche notato che l'omero può

anche collegare mGIuR1α alla Canna, poiché contiene anche un motivo simile (PPEEF). La canna

è un’impalcatura multimerica di proteina postsinaptica che potrebbe portare il mGluR1α alla

posizione appropriata sulla superficie cellulare ed è parte del complesso PSD-95 del recettore

associato NMDA [123].

46

11. COMPLESSO P2Y1/A1

Nel 2001, la scoperta è stata fatta negli esperimenti della coimmunoprecipitazione sulle cellule

HEK-293 dei recettori purinocettori P1 e dell’adenosina A1 agganciati alla proteina Gi/o che

possono formare un complesso eteromerico con i recettori purinocettori P1 ATP e purinocettori

P2y1 agganciati alla proteina Gq [126], mostrando meno del 5% l’omoIogia con l'un l'altro [127].

La parte del COOH-terminaI dei recettori A1 non è stata mostrata essere coinvolta in questo tipo

di eteromerizzazione. Studi nell'immunofluorescenza hanno mostrato una localizzazione

marcata dei recettori A1 e P2Y1. Inoltre, la coimmunoprecipitazione dei recettori A1 con P2Y1

indicano che l'eteromerizzazione tra sottotipi recettoriali P1 e P2 potrebbero essere un

meccanismo piuttosto esteso per l’immediato cross-taIk tra, per esempio, i recettori inibitori A1

e recettori eccitatori P2Y1. Un cambiamento marcato nel segnalare è stato trovato nel

complesso eteromerico. Così, è diventato possibile per il recettore agonista P2Y1 ADPβS a

indurre un segnale tramite proteina Gi/o agganciata al recettore A1, un'azione bloccata dalla

tossina della tosse e il recettore antagonista A1 ma non dal recettore antagonista P2Y1. Questi

risultati interessanti sono sembrati essere spiegati dallo sviluppo di una capacità della riduzione

del ADPβS etichettato H N6-phenylisopropyladenosine legato dal complesso eteromerico nella

gamma di alta affinità. È stato quindi suggerito che la tasca del ligando del recettore A1

dell'eteromero aveva cambiato per legare segnatamente l’agonista P2Y1 associato con

l'attivazione della proteina di Gi/o. Così, è stato correttamente suggerito che l'associazione

eteromerica produce un recettore A1 P2Y1. Comunque, è anche possibile per proporre un altro

meccanismo molecolare. Così, potrebbe esistere un’interazione recettore/recettore A1/P2Y1 a

livello del sito di riconoscimento che cambia la farmacologia di altre tasche della legatura del

recettore A1 e P2Y1. Il cambiamento di conformazione dell’agonista indotto del recettore P2Y1

nel recettore P2Y1 che lega la tasca ora non solo comanda a un'attivazione delle proteine Gq ma

anche a un cambiamento nella struttura del recettore A1, convertendo in uno stato di agonista

capace di accendere alla proteina Gi/o. Tale cambiamento di conformazione non può più

accadere quando la tasca di legatura del recettore A1 è occupata dall'antagonista del recettore

47

A1 chiudendo in uno stato di antagonista. Il recettore antagonista P2Y1 non potrebbe bloccare

l'azione dell’agonista del recettore P2Y1 poiché sembra possibile che nel complesso

eteromerico l'antagonista usato non potrebbe avere l'affinità sufficiente per la tasca di legatura

del recettore P2Y1 [128]. Questo complesso di recettore eteromerico P2y1/A1 è di interesse

sostanzioso, poiché consente che l'attivazione eccitatoria del recettore P2Y1 ATP è subito

attivato nel meccanismo dell’inibizione parallela del recettore A1. In questa maniera,

l'eccitazione e l’aumento della spesa di energia sono causate dall'attivazione del recettore P2Y1

ATP e inizia a essere anche neutralizzato a un momento quando l'ATP extracellulare non è stato

guastato all'adenosina, il maggiore ligando per il recettore A1 [129-131].

48

12. COMPLESSO MGLUR5/A2A

Nel 2002, Ferré ha potuto dimostrare nella cellula HEK-293 una sostanziosa sovrapposizione

nella distribuzione dell’A2A e il gruppo 1 recettore metabotropico del glutammato mGluR5.

Inoltre, in queste cellule gli esperimenti della coimmunoprecipitazione hanno mostrato che i

recettori mGluR5 e A2A hanno formato i complessi eteromerici che sono apparsi essere selettivi

tali complessi non sono stati formati tra mGluR5 e mGluR1β. I complessi eteromerici

A2A/MGLUR5 sono stati anche dimostrati nelle preparazioni della membrana dello striatal del

topo con gli esperimenti della coimmunoprecipitazione [132]. Queste scoperte sono di interesse

speciale, poiché nei recettori A2A e MGLUR5 nello striatum sembrano avere un modello di

distribuzione simile nei neuroni del GABA dello striatopallidal con una localizzazione delle

sinapsi periferiche alle presunte sinapsi glutamatergiche postsinaptiche asimmetriche. Inoltre,

negli studi sul comportamento sinergico dei recettori agonisti A2A e mGluR5 nel neutralizzare i

recettori D2 indotti che cambiano il comportamento ai recettori di dopamina ipersensibili [133]

e, negli studi biochimici, sia recettori agonisti A2A e sia mGluR5 hanno ridotto l'affinità dei siti di

legame del recettore agonista D2 ad alta affinità [133-135]. Attualmente, è sconosciuto se il

recettore A2A e il recettore mGluR5 sono collegati insieme tramite l'eteromerizzazione diretta o

se, per esempio, le proteine citosoliche omeriche sono coinvolte e si possono legare alla parte

COOH-terminale del recettore mGluR5 e producono il loro gruppo. Le proteine di shank hanno

un ruolo nella impalcatura con i motivi di interazione multipla proteina/proteina come regioni

ricche di prolina e domini PDZ potrebbero anche essere coinvolte [136], soprattutto partecipano

collegandosi insieme il mGluR5 con i recettori NMDA [137]. Il complesso eteromerico del

recettore A2A/MGLUR5 nelle cellule HEK-293 non ha mostrato il sinergismo nella mobilitazione

del Ca++ e accumulazione di cAMP. Tuttavia, un sostanzioso sinergismo è stato trovato dopo i

trattamenti di agonista in termini di MAPK e l'espressione del c-fos nelle cellule HEK-293 [132]. È

adesso sconosciuto come i segnali dall'eteromero possono causare questo forte sinergismo

funzionale che è stato anche osservato nello striatum nel vivo dopo i trattamenti combinati di

agonista A2A e mGluR5. Così, il recettore mGluR5 e A2A potrebbe mediare il sinergismo

49

dell’adenosina e del glutammato in caso di espressione del c-fos nello striatum che coinvolge il

complesso eteromerico recettore A2A/mGluR 5. C'è una distinta possibilità che la combinata

attivazione dei due recettori del complesso eteromerico A2A/mGluR5 potrebbe condurre alla

ridotta desensibilizzazione del mGluR5 consentendo un incremento della defosforilazione per

sviluppare grazie all'incremento di attivazione e/o grazie alla disponibilità della proteina

phosphatase 2B al recettore mGluR5 [138,139]. Sembra probabile che il sinergismo dimostrato

nell'espressione dello striatal di topo del c-fos ha delle conseguenze funzionali importanti ,

poiché è stato uguagliato da un sinergismo del recettore agonista CHPG e del recettore agonista

CGS 21680 a neutralizzare l’attività motoria delle phencyclidine indotto nei topi, che è una

risposta del comportamento conosciuta per essere estremamente dipendente sulla funzione del

recettore D2. Sembra possibile che l'attivazione combinata dei recettori A2A e mGluR5 nello

striatum potrebbero neutralizzare il forte conosciuto tonico recettore D2 dalll'inibizione del

recettore mediato dall’adenilato ciclasico e l’espressione di immediati primi geni nei neuroni

GABA-ergici dello striatopallidal. Poiché gli immediati primi geni sono coinvolti nel collegamento

alle risposte neuronali adattabili tra breve a lungo termine, i complessi recettore eteromerici,

A2A/mGluR5 potrebbero avere un ruolo nella plasticità della depressione a lungo termine e

potenziare la sensibilizzazione ai psicostimolanti collegati all'espressione del c-fos dopamina-

indipendente. Finalmente, il trattamento cronico ma non acuto con un antagonista mGluR5 può

indietreggiare a un deficit cinetico nel modello 6-0H-dopamina della malattia del Parkinson

[140]. Questo potrebbe essere raccontato a un alterato traffico del recettore eteromero

A2A/mGluR5, conducendo alla sua interiorizzazione e/o alla ridistribuzione che consente un

predominio dei segnali D2.

50

13. COMPLESSO B2/AT1

Le prime indicazioni della possibile esistenza di un’interazione recettore/recettore di una

bradichinina/angiotensina II è stata ottenuta dall'autoradiografia quantitativa del recettore nel

nucleo solitarius tractus del cervello del topo, un centro centrale cardiovascolare [141]. Le

scoperte hanno suggerito che recettori della bradichinina B2 del nucleo solitarius tractus sono

stati coinvolti nel modulare in una differente maniera l'alta e bassa affinità che lega dei siti dei

recettori dell'angiotensina II senza gli effetti sui valori di Bmax dei siti di legatura di agonista

AT1. Così, l'affinità dello stato di agonista di alta-affinità dei recettori AT1 è stata ridotta dalla

bradichinina; mentre la bradichinina aumentava l’affinità dello stato dell’agonista di bassa

affinità che usa i radioligandi di agonista ed antagonista per il recettore AT1. È stato suggerito

che quest'interazione recettore/recettore può contribuire all'attività centrale di vasopressoria

della bradichinina riducendo la crescente trasmissione mediata AT1 agli stati di agonista di alta e

bassa affinità, considerati nell’essere coinvolti rispettivamente nell'attività di vasodepressoria e

vasopressoria [141]. Comunque, un'altra interpretazione dei risultati dagli esperimenti di

competizione con un antagonista del recettore AT1 iodinated contro l'angiotensina II è quella

bradichinina che riduce l’affinità del sito di legame dell'antagonista del recettore AT1,

consentendo una migliorata competizione dall'angiotensina II visto come una riduzione nei

valori IC50. Nel globale potrebbe essere considerato che lo stato di antagonista del recettore

AT1 può essere differenzialmente regolato dall’attivazione del recettore B2 contro lo stato di

agonista. La modulazione del sito di legame del recettore antagonista AT1 della bradichinina

tuttavia rimane ancora a essere determinato. Recentemente la scoperta è stata fatta con

recettori dell'angiotensina AT1 e bradichinina B2 che formano eteromeri nelle cellule dei

muscoli lisci e nelle cellule HEK-293, con espressi i recettori AT1 e B2 [142] che indicano che

questa potrebbe essere la base molecolare per le interazioni intramembrana

recettore/recettore precedentemente osservate tra questi due recettori. La cromatografia

dell’immuno-affinità è stata eseguita sulle proteine dalle cellule muscolari lisce e recettori

dimeri AT1 sono stati attaccati con gli anticorpi del recettore anti-B2. Poiché la bradichinina e

51

l'angiotensina II erano stati cross-linked agli anticorpi del recettore AT1 e B2 prima della

cromatografia di immuno-affinità, i risultati hanno suggerito che i recettori ad alta affinità di

AT1 e B2 formano i complessi eteromerici sulle cellule muscolari lisce. Le cellule HEK-293,

quando espresse solo su uno dei due recettori mostrati, formano un monomerico, ma quando

c’è co-espressione dei recettori AT1 e B2 è stato dimostrato che formano un eteromero,

coesistendo dei recettori AT1 e B2. Lo stabile recettore eteromero AT1/B2 potrebbe essere

dimostrato dalla sds-page e non era dipendente sugli agonisti ma sulla densità dei due recettori.

Così, sembra probabile che le interazioni intramembrana recettore/recettore [141] prima

riportate riflettono i cambiamenti di conformazione nelle tasche di agonista-indotto degli

eteromeri preformati che conducono alle alterazioni nell'affinità del ligando dell’altra tasca di

legatura. La scoperta più impressionante nell'articolo da AbdAlla [143] era l'aumento

dell'agganciamento del recettore AT1/proteina-G nel recettore eteromero AT1/B2. Questo è

stato visto, per esempio, dall’aumentato grado di ridistribuzione del AT-1 stimolato della

proteina Gα nel citosol, dall'aumento marcato di legatura della angiotensina II stimolata che

lega GTPγS e gli aumenti sostanziosi dei fosfati di inositolo. Un'analisi elegante con il recettore

mutante B2 ha dimostrato che l'aumento di segnale del AT1 nell’eteromero dipendeva

dall’interfaccia della proteina-G dei recettori B2 ma non sulla legatura della bradichinina ai

recettori B2. L'eteromero era comunque formato in modo indipendente dell’interferenza con

l'agganciamento della proteina-G e con la legatura della bradichinina. Così, una importante

funzione significativa dell'eteromero in questo caso è il miglioramento dell'agganciamento del

recettore AT1/proteina-G e così del recettore AT1 che segnala [143]. È stato anche mostrato che

la aumentata presenza del recettore eteromero AT1/B2 potrebbe contribuire allo sviluppo

dell’ipersensibilità di angiotensina II nella preeclampsia. Tuttavia un altro significato funzionale

potrebbe essere un cambiamento nel traffico recettoriale, poiché il recettore eteromero AT1/B2

diventa internalizzato attraverso un percorso dinamico dipendente in contrasto quando sono

espressi soli.

52

14. COMPLESSO GABA A/D5

L'interazione diretta tra proteine/proteine dei recettori GABAA e dopamina D5 sono stati

riferiti in una rivista di Liu [144]. Una localizzazione dei recettori del GABAA e D5 è stata

dimostrata nei neuroni dell’ippocampale coltivati per mezzo di studi dell’immuno fluorescenza

nella combinazione con la microscopia di laser. Questo era in linea con il lavoro indicato

precedentemente che i recettori D5 nei neuroni dell’ippocampale esistono sugli alberi dendritici

e nel colle di axon, le regioni ricche nelle sinapsi del GABA [145,146]. Nelle macchie Occidentali,

i recettori del GABAA dell’ippocampale potrebbero essere dimostrati dopo la precipitazione

dell’affinità con il D5 ma non le proteine di fusione GST dei recettori D1 COOH-terminali. Inoltre,

le proteine di fusione GST con il secondo loop intracellulare del recettore GABA A γ2 hanno

precipitato l'ippocampale del D5 ma non i recettori D1. Questi risultati hanno indicato

un'interazione fisica tra la parte del COOH-terminale del recettore D5 e la subunità γ2 del

recettore GABA A, più esattamente il secondo loop intracellulare. L’eteromerizzazione del

recettore GABAA/D5 è stato dimostrato negli esperimenti della coimmunoprecipitazione. Nei

test di copertura della macchia, è stato mostrato che la sds-page ha separato la proteina della

fusione GST della subunità γ2 ma nessun’altra sottounità potrebbe legare direttamente il

peptide tradotto in vitro [S]metionina del D5 COOH-terminale. Similmente, la [S]methionine del

secondo loop intracellulare della subunità γ2 potrebbe legare direttamente alla proteina di

fusione del recettore GST-D5 COOH-terminale. Dovrebbe anche essere considerato che la

proteina di fusione GST del secondo loop intracellulare della subunità β2 non potrebbe legare

alla parte COOH-terminale del recettore D5 nel test di copertura della macchia malgrado il fatto

che questa parte può immunoprecipitare recettori D5. Quest'interazione potrebbe essere quindi

indiretta tramite le proteine associate o coinvolgere altri parti del recettore D5 COOH-terminale.

Comunque, questa parte del recettore GABAA potrebbe avere anche un ruolo nella formazione

del complesso del recettore eteromerico del GABAA/D5. È di interesse che esiste lì una proteina

associata recettore GABAA che può interferire con la capacità della coda COOH-terminale del

recettore D5 nell’interagire con il loop γ2 intracellulare [147]. Gli studi nelle cellule HEK-293

53

hanno dimostrato che la coattivazione degli agonisti dei recettori D5 e GABAA era necessario

per aver luogo la coimmunoprecipitazione. Così, i cambiamenti di agonista-indotto nel secondo

loop intracellulare della subunità γ e nella parte del COOH-terminale del recettore D5 è

essenziale per la formazione di questo complesso eteromerico. Un significato funzionale di

quest'eteromerizzazione appare per essere concessa reciprocamente la cross-talk inibitoria a

prendere posto. Così, nelle cellule HEK-293 la ridotta attivazione del recettore D5 e del GABAA

diminuisce la pendenza della curva di voltaggio. Questi cambiamenti sono stati causati da un

meccanismo cAMP-indipendente ed erano per mezzo delle chimere dei recettori D1/D5 che si è

dimostrato essere completamente dipendenti sull’interazione del recettore D5 COOH-

terminale/γ2 nel complesso eteromerico formato. Così, questi risultati indicano che D5 può

ridurre la forza sinaptica sopra i recettori del GABAA tramite questo complesso. In accordo con

questa veduta, questi studi elettrofisiologici nelle parti dell’ippocampale hanno mostrato che un

agonista D1/D5 potrebbe ridurre l'ampiezza inibitoria della miniatura del recettore mediato

GABAA e le correnti post-sinaptici indipendenti del PKC e PKA. L'iniezione di un peptide GST-

codificato D5 COOH-terminale nel neurone registrato ha evitato quest'azione. Questo

complesso eteromerico potrebbe essere quindi di pertinenza nel vivo, dove potrebbe

controllare la forza sinaptica del recettore GABAA e segnalare come sopra il recettore D5 era nel

giro modulato dal recettore GABAA in una maniera inibitoria. Così, nelle cellule coespresse dai

due recettori, il recettore GABAA ha ridotto la massima attivazione dell’adenilato ciclasico della

dopamina da 45%, che era selettivo per il D5 contro il recettore D1. Quest'azione non ha

coinvolto dei cambiamenti nel luogo di riconoscimento del D5 mentre ha mostrato dall'assenza

dei cambiamenti nell'affinità di agonista e antagonista del recettore di dopamina né avevano

alcun cambiamento nei valori di Bmax dei siti osservati del D5 antagonista. Invece, sembra che

l'attivazione di GABAA di questo complesso eteromerico riduca il recettore D5/proteina-Gs

attraverso l’interazione fisica del secondo loop intracellulare γ2/recettore D5 COOH-terminale.

Così, l'espressione dei minigeni che codificano la sequenza del secondo loop intracellulare γ2 o

le sequenze del COOH-terminale del recettore D5 hanno bloccato la modulazione di GABAA del

D5 hanno indotto l'accumulazione di cAMP. L'uso delle chimere D1/D5 hanno dato l’ulteriore

54

prova per l'implicazione cruciale del complesso COOH-terminale del recettore D5 dell’agonista-

indotto/γ2 nella regolazione dell’agganciamento alla proteina G del recettore D5. Un altro

significato funzionale di questo dinamico complesso eteromerico potrebbe essere un ruolo nel

traffico del recettore [147]. Così, esistono lì delle indicazioni che l'attivazione del l’un l’altro

recettore agonista GABAA o il D5 fa l'endocytosis possibile di entrambi i recettori e il così

cotrafficking [147]. Dovrebbe essere anche considerato che la subunità γ2 potrebbe essere

essenziale per il gruppo dei recettori del GABAA postsinaptici. Un ruolo potente di questo

complesso recettore GABAA/recettore D5 nella patofisiologia della schizofrenia è stato anche

postulato nella veduta dei fatti che le alterazioni nel D1/D5 e nel GABAA γ2 contengono i

recettori e le loro funzioni potrebbero esistere nel cervello schizofrenico [148-151]. Molto

recentemente Liu ha ottenuto la prova che i recettori D1 possono interagire direttamente

tramite interazione proteine/proteine con i recettori NMDA. Così, l'eteromerizzazione del

NMDA/D1 potrebbe avere un ruolo nella regolazione della trasmissione del glutammato. La

dimostrazione del GABAA/D5 e forse dei complessi del recettore NMDA/D1 stimola molto,

poiché aprono una nuova maniera per capire come i segnali della trasmissione di volume (VT) e

la trasmissione di cablaggio (WT) possono diventare integrati [20,152,153]. Così, i recettori

GABAA e NMDA sono dei classici recettori, sinaptici veloci che operano tramite la regolazione

dei loro canali ionici, poiché il GPCR è lento e principalmente localizzato estrasinapticamente e

raggiunto dai segnali VT nello spazio extracellulare. L'eteromerizzazione dei recettori di canale

ionico e GPCR offre un nuovo meccanismo per l'integrazione di WT e VT e su come controllare la

forza sinaptica di importanza cruciale per apprendere e memorizzare [154]. Potrebbe essere

menzionato che diversi anni fa abbiano ottenuto delle indicazioni che gli agonisti del recettore

GABAA potrebbero modulare le caratteristiche obbligatorie dei recettori D2-like nelle

preparazioni di membrana dello striatal [155]. Così, il muscimol agonista del GABAA ha ridotto

l'affinità dell'agonista del recettore D2 di alta affinità situato mentre ha mostrato competizione

negli esperimenti con [H]raclopride contro la dopamina. Così, i complessi di recettore

eteromerici di GABAA/D2 potrebbero anche esistere, poiché tali interazioni al livello di

riconoscimento sono state considerate [20] come gli indicatori biochimici dell'esistenza di un

55

complesso eteromerico, in questo caso tra i recettori GABAA e D2. È anche di interesse che

potremmo riferire la capacità dei recettori agonista-attivato α2 adrenergico e D1

sostanzialmente per modulare [H]nicotine che lega nelle preparazioni di membrana dalle regioni

encefaliche [156,157]. Quanto visto sopra, sembra pertinente per testare l'esistenza dei

complessi eteromerici tra recettori nicotinico e α2 adrenergico e tra i recettori nicotinico ed i D1

coinvolti nel controllo dei meccanismi allosterici ai recettori di acetilcolina nicotinici [158]. È

anche di interesse sostanziale che la cross-inibizione tra certi canali di catione trasmettitore-

recintati è stata mostrata esistere sulla loro coattivazione [159] riflettendo probabilmente

l'eteromerizzazione tra questi due recettori di canale ionico quando coattivati.

56

15. COMPLESSI OLIGOMERICI E RECETTORI TIROSIN-CHINASICI

Recentemente, è stato riportato che i recettori del fattore di crescita epidermico (EGF) possono

diventare frequenti con i recettori dell'ormone della crescita (GH) e con i recettori β2 agonisti

sulla loro stimolazione rispettivamente dai recettori GH e β2 agonisti [160,161]. La prova è

stata fornita dalla dimostrazione che la loro associazione fisica è risultata in una trans

attivazione del recettore EGF. Gli esempi, si concentreranno su come il recettore β2 adrenergico

può produrre la dimerizzazione del recettore EGF, l'autofosforilazione della tirosina e

l'internalizzazione del recettore EGF conducendo all'attivazione delle MAPK. Un presupposto

per tale trans attivazione del RTK appare essere la formazione di β2 agonista-indotto di un

complesso multiproteico che contiene non solo il recettore β2 e il recettore EGF ma anche la β-

arrestina e il c-Src, un recettore tirosin chinasico. Gli esperimenti della coimmunoprecipitazione

dimostrata dei complessi eteromerici dei recettori β2 adrenergici/EGF che hanno formato

rapidamente un picco dopo il trattamento correlato di β2 agonista con l’attivazione di MAPK β2

agonista indotto. Questo complesso potrebbe anche essere rilevato sotto le condizioni basali e

probabilmente ha connesso alla costitutiva attività del recettore β adrenergico, poiché questo

complesso del recettore β2 adrenergico/EGF è stato segnatamente ridotto da un recettore β2

adrenergico agonista inverso. È stato mostrato che gli inibitori della Src kinase hanno bloccato la

formazione del complesso recettoriale β2 adrenergico/EGF e attivazione delle MAPK, indicando

un ruolo critico dell’attività catalitica Src. Inoltre, la β-arrestina recluta la proteina c-Src al

recettore β2 adrenergico [162] dopo che la β-arrestina è venuta ha collegarsi al recettore β2

adrenergico attraverso la sua fosforilazione di agonista indotto tramite il recettore della

proteina-G chinasica. È stato notato che la trans attivazione dell'EGFR dal recettore β2

adrenergico è stato bloccato dall'inibizione endocytosis mediata di clathrin. Potrebbe essere

quindi che la clathrin ha ricoperto dei buchi che possono rappresentare i micro domini per

ottimizzare il segnalare fra le proteine montate, conducendo all'attivazione di RAS-dipendente

del Raf dopo che è accaduta la trans attivazione del recettore EGF. Maudsley [161] notò che

questi risultati aprono un meccanismo importante per come i GPCRs ed anche i recettori delle

57

citochine [163,164] potrebbero controllare il segnalare tropico, cioè attraverso i complessi

eteromerici di agonista-indotti con i recettori EGF che conducono alla regolazione della trans

attivazione seguita dall'attivazione delle MAPK. Questi studi sono degli ottimi esempi di come i

complessi delle multiproteine formano un ruolo cruciale anche nel segnale tropico.

58

16. COMPLESSI CALCITONINA/RAMP1-3

I peptidi della famiglia della calcitonina, come calcitonina, peptidi gene connessi con calcitonina

(CGRP), adrenomedullin, e amylin agiscono tramite GPCR. Fra gli altri, il recettore calcitonin-

recettore-like (CRL) è stato clonato ma non potrebbe legare il peptide CGRP. Come tentativo è

stato quindi fatto clonare il gene per il recettore CGRP dall’espressione di clonazione [165]. In

questo studio, un singolo cDNA è stato finalmente mostrato segnatamente per migliorare le

risposte a un recettore CGRP endogeno nell'oocytes Xenopus. Il cDNA è stato mostrato per

codificare una proteina con un singolo dominio TM e uno extracellulare NH2 terminale (RAMP1).

L’espressione di questa proteina ha migliorato selettivamente le azioni di CGRP-indotto

nell'oocytes. Questo era la maniera in cui è stato scoperto il RAMP1 [165]. Gli esperimenti

successivi sulle linee cellulari (HEK-293 T ) hanno dimostrato che la coespressione del RAMP1 era

necessaria per la legatura del ligando del recettore CRL e la funzione in termini di accumulazione

di cAMP. La domanda era come RAMP1 abbia causato lo sviluppo di un recettore funzionale CGRP

basato sulla coespressione del recettore CRL e sul RAMP1. Per mezzo del recettore CRL epitopo-

etichettato e per mezzo del RAMP1 nella combinazione con la classificazione cellulare di

fluorescenza-attivata, è stato mostrato che la loro coespressione ha fatto il possibile per

l'espressione sulla superficie cellulare di entrambi i recettori. Era di interesse sostanzioso che la

sds-page potrebbe mostrare cross-linking dei I-CGRP1 a due proteine dalla superficie delle cellule

HEK-293 T. Le due bande sono sembrate corrispondere al recettore nativo CGRP ed a RAMP1,

rispettivamente, che potrebbe formare un complesso eteromerico facilmente rotto secondo

queste scoperte. Gli ulteriori esperimenti hanno dimostrato che la coespressione del RAMP1

dell’epitopo-etichettato e il recettore CRL hanno condotto alla scomparsa di una banda di 58 kDa

trovata con l'espressione del recettore CRL solo con l'apparenza di una banda che diffonde a 66

kDa che mette in correlazione nella misura con la banda cross-linked a I-CGRP1. Quest'aumento

addizionale della misura da 8 kDa potrebbe non essere dovuto a un'associazione con il RAMP1 del

epitopo-etichettato che ha una misura di M 14 kDa. Invece, gli esperimenti con l'endoglycosidases

F e H hanno indicato che è stato collegato a una glicosilazione terminale del recettore CRL, non

59

hanno trovato quando è stato solo espresso e soggetto solo al centro della glicosilazione. Il

recettore CRL della glicosilazione terminale trovato in presenza del RAMP1 indica che il recettore

CRL può essere ora espresso sulla superficie cellulare come una glicoproteina matura, capace di

essere un recettore CGRP. Tuttavia, sembra probabile che anche il RAMP1 coespresso con il

recettore CRL terminalmente glicosilato sulla superficie cellulare e capace di diventare cross-

linked con I-CGRP1 può contribuire alla regolazione della selettività e alla funzione dei ligandi del

recettore CRL dalle interazioni fisiche e/o indirette. Recentemente è stato anche osservato che i

recettori multipli di amylin possono essere formati dalle interazioni di RAMP con il prodotto

genetico del recettore della calcitonina [166]. Due altre proteine di RAMP sono chiamate RAMP2 e

RAMP3 che sono state anche scoperte [165], ed è stato trovato che RAMP2 ed il recettore CRL

potrebbero generare un recettore per l'adrenomedullin (ADM). È stato trovato che RAMP2 ha

consentito il trasporto all’espressione di un recettore CRL glicosilato al centro sulla superficie

cellulare. Questo è stato mostrato per non essere una regolazione del recettore CGRP. È stato

dimostrato in modo elegante che oocytes esprime i recettori RAMP2 e i CRL rispondono

sostanzialmente alle concentrazioni basse di frammenti di ADM ma solo debolmente a CGRP.

Nella coespressione delle cellule HEK-293 T queste proteine specifiche di legame con ADM e

aumenti di ADM-mediato dell’accumulazione di cAMP potrebbero essere dimostrati. Così, il

recettore CRL trasportato RAMP2 diventa recettore ADM sulla superficie della cellula. Tutti questi

processi potrebbero condurre alla diversità di sviluppo dei recettori con le specificità dei differenti

ligandi e CGRP, ADM, ed i sottotipi del recettore amylin [167,168] può essere formato basato sulle

interazioni del recettore CRL e sulla calcitonina con i diversi tipi di RAMP. Così, il recettore di CRL e

forse altro GPCR possono alterare segnatamente la sua tasca obbligatoria dalle interazioni con le

sole proteine di dominio TM. Il ruolo della glicosilazione centrale e terminaIe contro le interazioni

di proteina del recettore/RAMP che risultano nei presunti complessi eteromerici rimane essere

determinato. Quando leggendo sui RAMP uno si rende conto della possibilità che molti recettori

non potrebbero funzionare nella loro propria ragione ma principalmente come i partner nei

complessi eteromerici e nell'associazione con le altre proteine di membrana-associate.

60

17. COMPLESSO D1/CALCIONE

In un tentativo di capire come i recettori D1 possono agganciare alle proteine-G multiple,

Goldman, Rakic e Bergson hanno iniziato a cercare l’interazione delle proteine al recettore D1

[169]. Hanno trovato una singola proteina transmembrana di 24 kDa, chiamata calcyon, che

potrebbe interagire con il recettore D1 e produrre miglioramenti del segnale recettore

D1indotto Ca++. Il calcyon potrebbe essere quindi considerato come un RAMP dove

l'interazione è concentrata sull'agganciamento alla proteina-G e non sulla selettività

obbligatoria della tasca poiché descritto sopra per RAMP1-2. Il calcyon appare per avere un

NH2-terminale localizzato nella porzione extracellulare e un COOH-terminale localizzato nella

porzione intracellulare il dominio-like del RAMP1-3 contiene anche l'oligosaccaride del N-linked.

L’immunocitochimica hanno dimostrato che il recettore D1 e calcyon sono localizzati nella

stessa popolazione cellulare a piramide della corteccia cerebrale ed in uno strato contenenti i

recettori D1 dello striatal. È di interesse che sia i recettori calcyon e sia i recettori D1 sono stati

localizzati nelle spine dorsali perifericamente a una posizione postsinaptica. Esperimenti sulla

coimmunoprecipitazione hanno indicato che il recettore D1 ed il calcyon hanno formato un

complesso eteromerico nelle cellule HEK-293. Inoltre, usando una proteina di fusione GST con la

sequenza di esca del recettore D1 (GSTD1) ed una proteina di fusione batterica con la parte di

COOH-terminale del calcyon (S-calcyon), potrebbe essere mostrato che GSTD1 venga diretta alla

S-calcyon. Così, un'interazione diretta COOH-terminale potrebbe essere coinvolta nella

formazione di questo complesso eteromerico calcyon/recettore D1, dove le sequenze 421-435

del recettore D1 COOH-terminale appaiono cruciali poiché questo peptide ha evitato la legatura.

La formazione del complesso eteromerico calcyon/recettore D1, è risultato in un cambiamento

marcato nel segnale del recettore D1 nelle cellule HEK-293. Dopo la carica attivazione dei

recettori ATP P2Y, i recettori D1 agonisti SKF 81297 hanno prodotto un aumento rapido nel

segnale dipendente Ca++ sulla liberazione dalla scorta intracellulare di Ca++ fornito che il

calcyon era stato eseguito. Questa risposta Ca++ era simile nella misura a quel prodotto dal

recettore P2Y collegato a Gq/11. Questi risultati possono essere spiegati presumendo che

61

l’attivazione p2Y può aumentare l'agganciamento del recettore D1 alla proteina Gq/11, un

aumento che potrebbe essere rafforzato dalla formazione del complesso recettore D1/calcyon.

In contrasto, il recettore D1 che segnala sopra il Gs, all’adenilato ciclasico conduce agli aumenti

di accumulazione di cAMP era inalterato dalla formazione di questo complesso. Così, il doppio

segnale del recettore D1 con l'implicazione anche del segnale del Ca2 + tramite Gq/11 diventa

più pronunciato da questo complesso eteromerico con il calcyon. La formazione di questo

complesso è apparsa essere inibita dall'espressione nelle cellule del D1, che ha ridotto le

risposte di Ca++ del recettore D1 stimolato probabilmente gareggiando con il recettore D1 per il

calcyon. La formazione del complesso eteromerico è aumentata dall'attivazione del recettore

D1 e ha ridotto da un inibitore del PKC. Infatti, la parte del COOH-terminale del calcyon può

diventare fosforilata da PKC e potrebbe legare fosfoinositol-4,5- bifosfato. Queste osservazioni

danno un’aumentata comprensione all'importanza dell'interazione diretta tra le parti di COOH-

terminale del recettore D1 e il calcyon per l'aumento dell’agganciamento della proteina Gq/11

del recettore D1 con l'attivazione della fosfolipase C (PLC) e la formazione di inositol 1,4,5-

trifosfato (lP3). È di interesse sostanzioso che la stimolazione dei recettori endogeni muscarinici

M1 agganciati Gq/11 come attivazione ATP P2Y, prima dell'attivazione del recettore D1 ha fatto

anche un possibile forte aumento del recettore-indotto nel segnale Ca2 + dal complesso

eteromerico recettore D1/calcyon. Sembra possibile che il meccanismo basilare delle azioni

primarie dell’attivazione recettoriale di ATP ed M, può essere severalfold con il risultato finale

che è un aumento dell’agganciamento Gq/11 del recettore D1. Così, l'indicazione delle

interazioni del recettore multiplo con la formazione di alti complessi eteromerici di ordine che

contiene ATP recettori D1e calcyon o recettori di M1 e D1 ed il calcyon potrebbero essere

considerati condurre all'aumento dell’agganciamento del recettore D1 alla proteina Gq/11.

L'attivazione di cascate della fosforilazione intracellulare che coinvolge, per esempio, PKC può

essere anche coinvolta con la fosforilazione del calcyon COOH-terminale, soprattutto poiché

l'azione prima è stata solo osservata fino ad ora con GPCR agganciato al Gq/11. Il lavoro

pionieristico di Goldman-Rakic ha dimostrato il ruolo prominente del recettore D1 nella

corteccia cerebrale nella modulazione del recettore di glutammato che segnala durante le

62

operazione di memoria. Questo lavoro avrà quindi la pertinenza per capire la plasticità corticale.

Ispira anche che i recettori M1, come i recettori D1, sono localizzati sulle cellule nervose

piramidali delle spine dorsali [170]. Così, l'interazione recettore/recettore M1/D1 tramite i

possibili complessi eteromerici potrebbe esistere quindi nelle spine dorsali dendritiche ed ha

una pertinenza funzionale [171].

63

18. COMPLESSO A1/ADENOSINA DEAMMINASE

Franco e collaboratori [172-174] hanno ottenuto la prova che l’adenosina deaminase (ADA) può

formare un complesso eteromerico con i recettori di adenosina A1. ADA è un enzima capace di

convertire l’adenosina nell'inosina. ADA è anche una proteina multifunzionale che appare sulla

superficie cellulare ancorata alle diverse proteine [175-177]. Può agire quindi enzimaticamente

ma anche extra enzimaticamente [172,178] come nel caso della formazione di complessi del

recettore ADA/A1. La formazione di complessi del recettore ADA/A1 è stata dimostrata negli

esperimenti che coinvolge la microscopia di laser, la coimmunoprecipitazione e la cromatografia

di affinità. Così, i recettori coimmunoprecipitati di ADA e A1 ed i recettori A1 sono stati

trattenuti in una matrice di ADA-Sepharose. Finalmente i recettori A1 sono localizzati con ADA

sulle membrane della cellula, compreso la superficie cellulare dei neuroni corticali [179]. La

legatura di ADA ai recettori A1 appare per essere essenziale per la legatura di agonista di alta-

affinità dei recettori A1, dando un ruolo funzionale di quest'interazione fisica nella trasmissione

recettore-mediato di A1 [180-182]. Così, ADA ha un ruolo non solo come un ectoenzyme

degradante ma anche come un recettore A1 di proteina attività-modulante. Esso quindi viene di

interesse nel studiare un ruolo possibile di ADA nel complesso del recettore eteromerico A1/D1.

In uno studio recente [183] è stato usato lo stesso recettore A1/D1 delle linee cellulari dei

fibroblasti come descritto sopra, la prova di ciò è stata ottenuta nelle cellule non permiabilizzate

del recettore A1/D1, ma non nelle cellule con il recettore D1, ADA esiste sulla plasma

membrana. Questi risultati hanno indicato che ADA può essere mirato alla membrana dai

recettori A1 ma non dai recettori D1. Inoltre l'agonista del recettore A1 risulta preincubato nella

coaggregazione di entrambi i recettori A1 e ADA e recettori D1 e ADA nelle cellule dei fibroblasti

del recettore A1/D1. Questi risultati hanno suggerito che dopo il trattamento di agonista del

recettore A1 con la coaggregata eteromerizzazione del A1/D1 sono formati che contengono

l'alto-ordine di strutture molecolari [183] coinvolgendo i complessi eteromerici ADA/recettore

A1/recettore D1 e altri che interagiscono delle proteine che hanno un ruolo speciale funzionale,

soprattutto nel traffico del recettore. Comunque, ADA non sembra essere direttamente

64

collegato ai recettori D1. In linea con questa veduta, questi aggregati del recettore ADA/D1 non

sono più presenti dopo il pre trattamento di agonista del recettore D1 rompendo

l'eteromerizzazione del recettore A1/D1 che conduce al solo recettore D1 aggregato, mentre

l'immunoreattività del recettore ADA/A1 rimane diffusamente localizzata [183]. L’impatto del

complesso del recettore ADA/A1 sul segnale del recettore D1 è stato dimostrato dal blocco

agonista-indotto del recettore A1, dal blocco irreversibile del recettore D1 della funzione ADA

che usa il deoxycoformycin. Questa controazione non era correlata all'alba di livelli di adenosina

endogeni [183]. Così, ADA è la parte del complesso del recettore eteromerico A1/D1

direttamente collegato solo al recettore A1, dove rende possibile lo stato di alta-affinità del

recettore A1 per gli agonisti, consentendo che lui modula l'operazione del recettore D1.

65

19. COMPLESSO A1/HSC 73

Sarriò e collaboratori [184] hanno dimostrato che i recettori adenosina A1 interagiscono con

una proteina della famiglia delle proteine della scossa di calore. Dalla cromatografia di affinità la

scossa di calore proteina analoga hsc73 è stata identificata come un componente del cytosolic

capace di interagire con il recettore del terzo loop intracellulare. Come dimostrato dalla

risonanza di superficie del plasmon, i recettori A1 purificati interagiscono specificatamente con

hsc73 con una costante di dissociazione nella gamma nanomolar (0,5 ± 0,1 nM). L’interazione

recettore hsc73/A1 conduce a una riduzione marcata nell'affinità dei ligandi di agonista del

recettore A1, una riduzione di legatura di antagonista del recettore A1 ed evita l'attivazione

delle proteine G, come dedotto da [S]GTPyS i test di legatura. In modo interessante,

quest'effetto sulla legatura di agonista del recettore A1 era più forte di quello esercitato

dall’analogo nucleotide della guanina, che separa dei recettori dalle proteine G ed è stato

completamente evitato da ADA, che interagisce con i domini extracellulari dei recettori A1.

Come valutato dall'immunoprecipitation, un'alta percentuale di recettori A1 nelle cellule lysates

sono agganciati a hsc73. I membri della famiglia dell'hsp70 interagisce con un numero di

proteine cellulari. Dovuto alla funzione della compagnia molecolare delle proteine hsp70,

appaiono capaci del riconoscimento delle forme delle proteine non-native. Questo non è il caso

per i recettori A1 per alcune ragioni. Uno è dovuto al fatto che i recettori A1 solubilizzati sono

molto sensibili alla composizione del mezzo, che colpisce la legatura dei ligandi alla molecola

solubile. Così, una combinazione precisa di detergente ed i sali è richiesta a conseguire un’alto

recupero dei siti di legame nelle preparazioni solubilizzate dei recettori A1. L'effetto forte della

concentrazione nanomolare del hsc73 sulla legatura di ligandi ai recettori A1 purificati solubili è

la prova per un'interazione specifica tra hsc73 ed i recettori A1 funzionali. La specificità

dell'interazione è stata dimostrata anche nelle culture primarie dei neuroni dove altri GPCR non

sono colocalizzati con hsc 73. D'altra parte, la colocalization tra i recettori A1 e hsc73 non è

limitata a una zona specifica della cellula, anche nelle cellule esprimendo naturalmente le

proteine, e questo è la prova che l'interazione accade con i recettori completamente piegati

66

funzionali. A prescindere dal ruolo regolatore dell'interazione nella legatura di ligandi, ci sono

dei dati che sostengono l'idea che hsc73 è pertinente per il traffico dei recettori A1. In realtà, la

localizzazione tra hsc73 ed i recettori A1 è stato rilevato nelle regioni specifiche del cervelletto

del topo e nei corpi cellulari nervosi dei neuroni corticali ma non nelle dendriti o nelle sinapsi.

Inoltre, sembra che l’internalizzazione del recettore di agonista-indotto conduce all'endocytosis

dei recettori A1 da due tipi di vescicola qualitativamente diversi, uno in cui è localizzato nei

recettori A1 e hsc73 ed un altro in cui hsc73 è assente. Questi risultati aprono la possibilità

interessante che il segnale ed il traffico di GPCR potrebbe essere regolato dalle proteine di

scossa di calore. Le nuove scoperte presentate da Sarriò [184] suggeriscono un ruolo specifico

per le proteine hsp70 nel regolare l'attivazione e l'operazione di recettori A1. Sebbene un ruolo

pertinente per la compagnia nel segnalare dai recettori di ormone steroide è stato già

dimostrato, i nostri risultati sono la prima prova che suggerisce un controllo da hsc73 del

segnale tramite GPCR di plasma membrana. Dovrebbe essere anche notato che questo membro

del GPCR può essere diversamente regolato da una proteina che interagisce con i domini

extracellulari del recettore e da una proteina del cytosolic che interagisce con il terzo loop

intracellulare del recettore.

67

20. CONCLUSIONI

Questa nuova strada nel studiare la formazione dei complessi eterodimerici apre la possibilità di

scoprire i meccanismi molecolari, fisiologici e patologici finora sconosciuti ed allo stesso tempo

apre anche un campo nello sviluppo di farmaci che dovrebbero essere specificatamente mirati a

influenzare la formazione di complessi proteina/proteina o a modulare la funzione di questi

complessi proteici. Bisogna tener conto che le interazioni proteina/proteina molto spesso

includono parti della sequenza proteica. Così è difficile sviluppare molecole di basso peso

molecolare capaci di alterare l’interazione della proteina G. Comunque, anche piccole proteine

sono troppo grandi ad essere usate come farmaci. Così, diviene importante l'uso di piccoli

peptidi o meglio molecole peptidiche mimetiche come farmaci. Un approccio importante nello

sviluppo di peptidi che ostacolano le interazioni proteina/proteina è quello di sostituire qualche

amminoacido naturale con amminoacido non naturali.

Come possibili bersagli per l'azione dei farmaci sui complessi eteromerici, il recettore a proteina

G o l'adenilato ciclasi sono i migliori bersagli.

Oltre al classico approccio mirato all'attivazione o all'inibizione del recettore dovuto

all'occupazione del farmaco nella tasca di legame per il ligando naturale, è possibile concepire

altri interventi farmacologici utilizzando sequenze del recettore utilizzabili per la localizzazione

del farmaco.

a) Il farmaco è sviluppato per un recettore centrale per modulare un altro recettore centrale a

livello del sito di riconoscimento. Un esempio è di avere un antagonista A2A che agisce sul

recettore centrale A2A nei complessi dei recettori eterodimerici antagonisti A2A/D2 a produrre

il miglioramento del segnale del recettore D2. Tale farmaco potrebbe diventare un nuovo

farmaco antiparkinsoniano con meno effetti collaterali. Il migliore approccio sarà di bloccare

selettivamente la tasca di legame A2A nel complesso eterodimerico e non quei recettori A2A

non collegati ai recettori D2.

b) Il farmaco è sviluppato per un recettore centrale per indirizzare l'agganciamento della

proteina G e la selettività della proteina G di un altro recettore centrale o l'attività di un

68

recettore a canale ionico esistente nello stesso complesso eterodimerico. Un esempio è il

complesso eterodimerico del recettore D5/GABA A dove l’attivazione del recettore D5 può

ridurre la forza sinaptica del recettore GABA A. Tali farmaci potrebbero essere utilizzati nel

trattamento dei disordini neuropsichiatrici.

c) Il farmaco è sviluppato per uno o entrambi i recettori centrali al controllo del traffico del

recettore del complesso eterodimerico. Un esempio è il complesso eterodimerico A2A/D2 dove

il trattamento prolungato combinato con gli agonisti dei recettori centrali per l’A2A e il D2 ha

prodotto una forte internalizzazione e desensibilizzazione coinvolgendo anche il recettore D2.

Questo farmaco darà una nuova conoscenza nel sviluppare bersagli per il trattamento di

malattie neuropsichiatriche.

69

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Titolo RUOLO DELL’ETERODIMERIZZAZIONE DEI … · L'eterodimerizzazione del MOR con DOR conduce a...

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