Tesi Chiara Demma
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Transcript of Tesi Chiara Demma
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”
Laurea Magistrale in Biologia Sperimentale e Applicata
Dipartimento di Scienze del Farmaco
DETERMINAZIONE DEL PROFILO METABOLICO DI
VINI BONARDA D.O.C. IN PUREZZA DELL’OLTREPÒ
PAVESE
Relatore:
Prof.ssa Maria Daglia
Correlatori:
Prof.ssa Maurizia Dossena
Dott.ssa Alessandra Leoni
Tesi Sperimentale di
Chiara Demma
Anno Accademico 2013/2014
PARTE COMPILATIVA
1 INTRODUZIONE .............................................................................................................. 9
1.1 VITI E IDENTITÀ .................................................................................................... 10
1.1.1 I VITIGNI ........................................................................................................... 11
1.2 CROATINA STORIA E TRADIZIONE .................................................................... 12
1.2.1 AMPELOGRAFIA E FENOLOGIA .................................................................. 13
2 I POLIFENOLI ................................................................................................................. 14
2.1 FLAVANOLI O FLAVONOIDI ( C6–C3–C6 ) ......................................................... 15
2.2 ANTOCIANINE ........................................................................................................ 16
2.3 FLAVANOLI .............................................................................................................. 17
2.4 FLAVONOLI ............................................................................................................. 18
2.5 I NON FLAVONOIDI .............................................................................................. 19
2.5.1 ACIDI FENOLICI .............................................................................................. 19
2.5.2 GLI ACIDI IDROSSICINNAMICI (HCA) ....................................................... 19
2.5.3 GLI STILBENI ................................................................................................... 20
PARTE SPERIMENTALE
INTRODUZIONE .................................................................................................................... 23
MATERIALI E METODI ......................................................................................................... 29
RISULTATI E DISCUSSIONE ................................................................................................ 31
CONCLUSIONI ....................................................................................................................... 54
ALLEGATO 1: Disciplinare ..................................................................................................... 63
ALLEGATO 2: Disciplinare ..................................................................................................... 70
PARTE COMPILATIVA
9
1 INTRODUZIONE
“ Ma per le vie del borgo dal ribollir de' tini va l'aspro odor de i vini l'anime a rallegrar.”
Giosuè Carducci, San Martino, da Rime nuove (1861-1887).
Il vino, come viene inteso comunemente, è prodotto attraverso la fermentazione del mosto
d'uva (Vitis vinifera L ) e rappresenta la bevanda fermentata di frutta maggiormente diffusa.
La storia della viticoltura inizia seimila anni fa nell'Anatolia orientale e nel Caucaso, e sotto
l'Impero Romano completa la sua diffusione in Europa. Nel corso dei secoli, ove
climaticamente era possibile coltivare la vite, si sono sviluppati modelli vitivinicoli assai
differenti in relazione alle varietà coltivate e alle tipologie di vino prodotte. Ancora oggi la
viticoltura moderna risente dell'impronta storico-geografica riconosciuta commercialmente
nei vini a denominazione di origine. Sulla base dei dati archeologici, si ritiene che le
popolazioni padane della tarda età del bronzo (secondo millennio a.C.) fossero grandi
raccoglitrici di more, fragole e corniole, oltre che di uva di vite selvatica, che utilizzavano per
produrre bevande vinose e conserve alcoliche. La trasformazione di questi frutti mediante la
fermentazione era dovuta alla necessità di conservarli anche per lungo tempo prima del loro
consumo evitando gli effetti nocivi per la salute umana, dovuti a contaminazioni batteriche e
fungine. L’uva, inizialmente proveniente da piante spontanee, divenne una vera e propria
coltivazione, man mano che le comunità umane si stabilirono nelle varie regioni, cominciando
a formare centri abitati e a utilizzare strumenti come l’aratro. La viticoltura odierna è quindi il
frutto del lungo cammino che si è sviluppato attraverso i secoli con il contributo di molte
popolazioni europee. Nel corso della seconda metà dell'Ottocento la viticoltura lombarda
attraversò una profonda crisi, conseguenza di una pluralità di fattori politici, economici,
tecnologici, ma anche di cause biologiche quali la diffusione di parassiti introdotti
dall'America: due malattie provocate da funghi (oidio, peronospora) e gli attacchi letali per gli
apparati radicali da parte di un insetto (la filossera).1
Gli effetti benefici del consumo di vino sulla salute sono noti fin dall’antichità,“Bonum vinum
laetificat cor hominum” (il buon vino rallegra il cuore dell'uomo) si legge nel Vecchio
Testamento. Recenti studi epidemiologici dimostrano che la mortalità dovuta a malattie
cardiovascolari diminuisce notevolmente dal nord al sud Europa ed è più bassa nel
Mediterraneo che in altri Paesi sviluppati, in funzione della diffusione del consumo di vino. Il
vino è un componente della dieta mediterranea e si pensa che un consumo moderato,
soprattutto di vino rosso, possa avere effetti benefici contro le patologie cardiovascolari. I
polifenoli, abbondanti specialmente nel vino rosso, grazie alle loro proprietà antiossidanti,
10
producono agenti cardioprotettivi come l'ossido nitrico (NO) e impediscono l'ossidazione
delle lipoproteine a bassa densità (LDL).2a, b
Lo studio della composizione chimica del vino
riveste un ruolo importante per la caratterizzazione del prodotto e per il miglioramento della
qualità. Con lo sviluppo di nuove tecniche analitiche, la conoscenza della composizione del
vino è andata via via aumentando e ha permesso di individuare alcune complesse reazioni che
avvengono durante le diverse fasi di vinificazione3,4
(Figura 1).
Figura 1- Il Vigneto con i suoi filari5
1.1 VITI E IDENTITÀ
Nella concezione attuale e più moderna del vino come espressione di un territorio nel suo
insieme di valori artistici, paesaggistici e culturali, i vitigni autoctoni o tradizionali
costituiscono un elemento di forte impatto perché sono i custodi di un patrimonio culturale
locale che si presenta originale, unico, autentico. L’interesse per i vitigni autoctoni, perfino
per i meno conosciuti, è molto diffuso, e si pone pertanto il problema di saper utilizzare,
imparando a conoscere e facendolo proprio, un patrimonio biologico molto complesso.
Esistono registri, aggiornati al 2000-2002, che elencano le varietà di vite coltivate in alcuni
importanti Paesi viticoli mediterranei, come Italia, Francia, Grecia e Spagna, e riportano che i
vitigni autoctoni da vino ufficialmente registrati nel nostro Paese, sono circa il doppio di
quelli catalogati in Francia e in Grecia e quasi il triplo di quelli riportati per la Spagna.
L’Italia, tra i numerosi altri Paesi viticoli europei, è forse il più ricco di “ampelo-diversità”. In
11
Italia sono stati censiti circa 2000 vitigni, alcuni rari e in via di abbandono che sono stati
recuperati negli ultimi 15 anni nella parte Nord-Occidentale dell'Italia.6
Le ragioni di ciò sono
numerose, ma tra le principali va ricordata la posizione geografica della nostra penisola che,
protesa al centro del Mediterraneo, è sicuramente servita da ponte, cioè da zona di passaggio
tra Nord e Sud, tra Est e Ovest, per le diverse specie vegetali mediterranee e per le loro
varietà, portate dai numerosi popoli che hanno occupato o percorso il nostro Paese.
1.1.1 I VITIGNI
L’uva è prodotta da piante appartenenti al genere Vitis. La famiglia delle Vitaceae, dal punto
di vista sistematico, appartiene al regno delle Plantae, Phylum Magnoliophyta (angiosperme),
classe Magnoliopsida (dicotiledoni), Ordine Rhamnales. Il genere Vitis è distinto in due
sottogeneri principali dal punto di vista tassonomico, entrambi diploidi, Muscandinia ed
Euvitis: al primo appartengono le viti con corredo cromosomico 2n=40 mentre al secondo
quelle con 2n=38, suddivise in base all'origine di coltivazione. Mentre il sottogenere Euvitis
è stato trovato nei depositi del Terziario sia in Asia che nel Nord America, Muscandinia
emerge soltanto tra i materiali fossili del nord America, il che suggerisce che questa divisione
si sia verificata prima del Quaternario cioè circa due milioni di anni fa. Pare che la famiglia
delle Vitacee sia comparsa sulla terra circa 140 milioni di anni fa, ma in seguito alle
glaciazioni molte specie di viti si estinsero, si salvò Vitis vinifera nell'area pontica (posta nel
Caucaso tra il Mar Caspio e il Mar Nero) e oggi è coltivata in tutto il mondo.
A sua volta si distingue in due sottospecie: una coltivata, chiamata Vitis sativa e una selvatica
chiamata Vitis sylvestris. Il genoma di Vitis vinifera presenta un corredo cromosomico 2n=38
per un totale di 487 Mb equivalenti a circa 30.000 geni.7
L'Oltrepò Pavese è un'area della provincia di Pavia con superficie pari a circa 1.097 Km2
che
deve il suo nome alla peculiarità, per un territorio Lombardo, di trovarsi a sud del fiume Po, in
pieno Appennino Settentrionale, territorio geograficamente e morfologicamente molto simile
a quello appartenente all'Emilia (Figura 2). La viticoltura in quest'area è nota sin dai tempi
remoti e si è specializzata fino a caratterizzarne il paesaggio collinare diventando fulcro della
produttività agricola del territorio. Con l'istituzione della Denominazione di Origine
Controllata D.O.C. (Dpr, 12/07/1963, n.930, pubblicato in G.U. n.188, 15/07/1963) il
territorio pose le basi per adeguarsi ai tempi e nel 1970 nacque ufficialmente la D.O.C.
Oltrepò Pavese con il 98.72% di coltura specializzata in collina.8 Nel 1961 nacque il
"Consorzio di Tutela dei vini tipici e pregiati dell'Oltrepò Pavese" che identificò la zona
collinare come l'unica adatta a dare uve di pregio ai fini della vinificazione. Nel DPR
8/8/2007, art.3, venne definita geograficamente l'area di coltivazione delle viti. La produzione
12
di Croatina venne incrementata in conseguenza alla resistenza all'oidio e all’abbondante resa e
semplicità di vinificazione.9 Oggi il vino Bonarda è predominante nell’Oltrepò orientale
(4370 ettari).
Figura 2 - Cartina della Lomellina, del Pavese e dell’Oltrepò Pavese10
1.2 CROATINA STORIA E TRADIZIONE
La Croatina è fra i vitigni autoctoni pavesi quello sicuramente più noto al grande pubblico. Il
vino che si ricava (in purezza o in uvaggio principalmente con uva rara e barbera) è il
Bonarda Oltrepò Pavese (Figura 3). L’etimologia del termine croatina deriverebbe da
“croatta” (cravatta) e indicherebbe che il vino ottenuto da croatina si beveva nei giorni di
festa, quando si indossava la cravatta. In Oltrepò, in particolare nella zona di Rovescala, è
considerato presente fin dal Medio Evo ma è solo a partire dalla fine del 1700 che se ne hanno
tracce documentali. Numerose ricerche ampelografiche ne attestano la presenza e l’ampio
utilizzo già nel corso dei due decenni 1870 e 1880, ad esempio. A seguito dell’arrivo di oidio
(circa 1850), peronospora (1879) e fillossera (1897-1898) nella provincia di Pavia, la
superficie occupata da questo vitigno ha subito un forte incremento, in quanto la Croatina è
caratterizzata da una buona resistenza alle crittogame, nonché da una buona tolleranza ai
portainnesti di vite americana indispensabili per sopravvivere all’attacco della fillossera. Alla
fine del XIX secolo risultava essere il vitigno più diffuso in Oltrepò, in seguito questo primato
è stato più volte ceduto al Barbera fino a quando, nel 1970, si è iniziato a produrre Bonarda,
fatto questo che lo ha reso un vino gradevole e piacevole da bersi, capace di ottenere presto i
favori del mercato, soprattutto nelle grandi città del nord Italia. Nel 2007 la superficie vitata a
Croatina era di 4270, pari a quasi il 33% della superficie dell’intera D.O.C. Oltrepò Pavese.11
13
Figura 3 - Grappolo di Croatina
1.2.1 AMPELOGRAFIA E FENOLOGIA
Il germoglio dell’uva Croatina è cotonoso, verde, biancastro sfumato di rosa, con foglioline
apicali e di colore verde con sfumature bronzate (Figura 4). La foglia adulta è di media
grandezza, pentagonale trilobata, a volte quinquelobata; la pagina superiore è glabra,
l’inferiore aracnoidea (Figura 5). Il grappolo a maturità è grande, di forma piramidale talvolta
alato, compatto, con peduncolo di media lunghezza.
Figura 4 - Foglia di Croatina12
Figura 5 - Apice di Croatina
L’acino è di media grandezza (2,3 g), sferoidale, con buccia consistente, pruinosa e di colore
blu scuro, la polpa succosa e dal sapore astringente. La fioritura avviene normalmente tra la
prima e la seconda decade di Giugno, seguita nella seconda metà di Agosto dall’invaiatura. La
vendemmia della Croatina è effettuata generalmente durante la prima decade di Ottobre.
Mostra buona resistenza all’oidio e, in misura minore, alla Botritys cinerea; soffre la
peronospora e le gelate, viene coltivato in tutta la zona collinare e in particolare nei comuni di
Rovescala, S. Damiano al Colle, Montù Beccaria, Stradella, Canneto Pavese, Broni e Castana.
La Croatina è un vitigno di media vigoria e produzione che richiede terreni calcarei argillosi
non troppo ricchi di potassio. La produzione è buona ma incostante, la maturazione è tardiva.
14
2 I POLIFENOLI
I polifenoli hanno un’influenza benefica sulla salute umana in quanto sono composti ad
attività nutraceutica presenti negli alimenti e bevande di origine vegetale. Molte sono le
proprietà salutistiche ascritte ai vini, le loro capacità antiossidanti sono in maggior misura
attribuibili alla presenza di elevate concentrazioni di polifenoli, a cui appartengono i
flavonoidi (come catechine e antociani) e gli stilbeni (come il resveratrolo). Flavonoidi e
stilbeni sono presenti sia in forma libera che come glicosidi e, dopo l’assunzione con la dieta,
vengono assorbiti a livello intestinale con un aumento della capacità antiossidante del sangue
e un conseguente effetto sulla prevenzione di numerose patologie croniche quali alcune forme
di cancro, malattie cardiovascolari e stati infiammatori. Per quanto riguarda la struttura
chimica, sono caratterizzati dall'avere almeno un anello aromatico con uno o più gruppi
ossidrilici come sostituenti (Figura 6).
Figura 6 - Struttura generica dei flavonoidi.
Le strutture individuate a oggi sono più di ottomila e sono ampiamente diffusi in tutto il regno
vegetale. Esistono fenoli semplici, a basso peso molecolare, con un singolo anello aromatico e
composti più complessi come i tannini; possono essere classificati in base al numero e alla
disposizione degli atomi di carbonio e si trovano comunemente coniugati agli zuccheri e agli
acidi organici. Si suddividono in flavonoidi e non flavonoidi. I primi sono caratterizzati da
uno scheletro di difenilpirano, due anelli di benzene (anello A e B) uniti da una catena lineare
a tre atomi di carbonio, in (Figura 7) sono illustrate le formule di struttura di alcuni
flavonoidi.
Figura 7A - Formule di struttura di alcuni flavonoidi: quercetina,miricetina.
15
Figura 7B - Formule di struttura di alcuni flavonoidi: laricitrina, astilbina.
Più di 4000 flavonoidi sono stati individuati in frutta, verdura e bevande di origine vegetale
come il tè e il vino, e la lista è in costante crescita. A seconda dello stato di ossidazione
dell'anello piranosico centrale, possono essere a loro volta suddivisi in molte sottoclassi:
flavonoli, flavoni, flavanoni, antociani, flavanoli, e anche isoflavoni. Tra i non flavonoidi, gli
acidi fenolici, derivati dell'acido benzoico, come l’acido gallico e lo acido protocatecuico, e
derivati dell’ acido cinnamico, che consistono principalmente di acido cumarico, caffeico e
ferulico, seguiti dagli stilbeni, il cui principale rappresentante è il resveratrolo, che esiste nelle
forme isomeriche cis e trans. I polifenoli sono presenti nei tessuti vegetali principalmente
come glicosidi, associati a vari acidi organici o polimerizzati a formare complessi ad alto peso
molecolare, come i tannini.13,14,15
Nel corso degli ultimi 20 anni, tali composti sono stati
oggetto di studio per il loro potenziale coinvolgimento nella prevenzione di malattie croniche,
quali malattie cardiovascolari, cancro, osteoporosi, diabete mellito, e malattie
neurodegenerative. La loro azione protettiva è stata attribuita inizialmente alle loro proprietà
antiossidanti, alla capacità di inibire o ridurre differenti enzimi, come la telomerasi16
e
ciclossigenasi17,18
o lipossigenasi19,20
e di recente, all'interazione con le vie di trasduzione del
segnale.21,22
Inoltre, è stata ampiamente studiata l'attività antimicrobica di polifenoli contro
una vasta gamma di microrganismi presenti nei cibi di origine vegetale e nelle piante
medicinali. Tra i polifenoli, i flavan-3-oli, i flavonoli e tannini hanno ricevuto più attenzione
per la spiccata attività antimicrobica rispetto ad altri polifenoli.
2.1 FLAVANOLI O FLAVONOIDI ( C6–C3–C6 )
I flavonoidi sono caratterizzati da gruppi fenolici presenti nei due anelli aromatici, A e B,
legati tra di loro da un eterociclo C. Il termine è stato introdotto nel 1952 da Geissman e
Hinreiner, la radice “flavone” in latino significa giallo. L'espressione composti flavonoidi
16
indica generalmente l'intera classe dei fenoli vegetali, aventi struttura C6–C3–C6, ovvero due
anelli aromatici legati da una catena di 3 atomi di carbonio (Figura 8).
Figura 8- Formula di struttura di un flavonoide.
In questa grande famiglia sono compresi antociani, flavonoli, flavanoli e flavanonoli.
I flavanoli hanno come nucleo base la catechina e l'epicatechina; nelle bucce sono presenti
quasi integralmente in forma polimerica. Ad eccezione dei flavanoli, la maggior parte dei
polifenoli si trova nell'acino sotto forma di monomeri.23
Le caratteristiche dei differenti gruppi
flavonoidi dipendono principalmente dall'anello eterociclico centrale che consente la
classificazione dei vari flavonoidi in: flavanolo, flavandiolo, flavone, isoflavone, flavanone,
flavanonolo,flavonolo, calcone, antocianidina.
Nelle piante sono localizzati principalmente nelle cellule epidermiche, a livello dei vacuoli, e
svolgono diverse funzioni: proteggono dalle radiazioni UV, difendono contro i microrganismi
patogeni, contribuiscono alla germinazione del polline e svolgono una funzione cruciale nel
richiamare insetti impollinatori coinvolti nella dispersione dei semi.24
Nell'uomo esercitano
attività antimicrobica, antiallergica, antiaggregante, antinfiammatoria, antitumorale e
antiossidante. Quelli più studiati sono gli antociani, i flavanoli e gli isoflavoni perché hanno
potenziali effetti protettivi contro numerosi processi neurodegenerativi.
2.2 ANTOCIANINE
Le antocianine rappresentano una grande classe di pigmenti naturali presenti nella parte aerea
delle piante. Si trovano come forma glicosilata dello ione flavinio con sostituzioni di gruppi
idrossilico e metossilico in diverse posizioni dell’anello B che sono responsabili del loro
colore, infatti un aumento di sostituzioni di gruppi –OH, determina uno schift batocromico dal
rosso al viola. Altro fattore importante è la natura dello zucchero legato allo scheletro della
molecola, che contribuisce alla variazione della colorazione del pigmento (Figura 9).
17
Figura 9 - Struttura delle principali antocianine e le rispettive λ massime di assorbimento nel visibile.25
Il vino rosso è una bevanda in cui è presente una grande quantità di strutture diverse di
pigmenti fenolici, sia nella loro forma originale che come derivati sotto forma di antocianine
glicosilate ed esteri acilati, che reagiscono con composti fenolici e non fenolici durante il
processo di vinificazione e invecchiamento, per formare nuove antocianine derivate.26
Altre fonti alimentari di antocianine sono bacche come il lampone, mirtillo, fragola, ribes nero
e rosso, uva spina.27,28
Tuttavia, le antocianine sono presenti in molte altre piante ad uso
alimentare, dai cereali (come la varietà pigmentata di mais (Zea mays L.) e riso nero (Oryza
sativa L.), ad alcuni membri della famiglia Brassicaeae (come Brassica oleracea var. Capitata
f. rubra, e Raphanus sativus L.), cipolla rossa (Allium cepa L.), le arance pigmentate (Citrus
sinensis L.), tè Zijuan (una nuova cultivar di Camellia sinensis var. Kitamura, prodotto nella
provincia di Yunnan della Cina) e canna da zucchero cinese (Saccharum sinensis Roxb.).29,30
A causa delle innumerevoli e potenziali proprietà salutistiche attribuite alle antocianine,
l'influenza della digestione gastro-duodenale, l'assorbimento e il metabolismo di questi
flavonoidi sono stati oggetto di molti studi.31,32
Riguardo al loro potenziale effetto positivo
contro i processi neurodegenerativi, diversi studi suggeriscono che tali composti riescono ad
attraversare la barriera emato-encefalica e a localizzarsi in aree deputate all’apprendimento e
alla memoria, migliorando le funzioni cognitive.33
2.3 FLAVANOLI
I flavan-3-oli sono la più grande sottoclasse di flavonoidi costituiti da monomeri, oligomeri e
polimeri (Figura 10).
Figura 10- Struttura chimica dei flavan 3-oli.
18
I monomeri più comuni sono (+)-catechina e (-)- epicatechina, mentre (-)- catechina e (+)-
epicatechina sono meno diffusi. La presenza di quattro isomeri è dovuta ai due centri chirali
in C2 e C3 (Figura 11).
Figura 11- (+)-Catechina e (-)- Epicatechina.
Sono spesso esterificati con acido gallico per dare i derivati gallato (come (- gallato)-
epicatechina) e / o sono idrossilati sull’ anello B (cioè 3 ', 4' e 5 '), come (-) -epigallocatechina
gallato. Tra gli oligomeri e polimeri, ci sono le pro-antocianidine.
I flavan-3-oli si distinguono dagli antociani per il grado di ossidazione dell'anello( Figura12).
Figura 12 - Alcuni flavan 3-oli.34
2.4 FLAVONOLI
Sono un’altra importante classe di polifenoli, localizzati prevalentemente nelle bucce sia di
uve rosse e bianche e contribuiscono alla stabilizzazione del colore rosso dei vini, attraverso
fenomeni di co-pigmentazione35
e alla percezione di amarezza,36
inoltre svolgono un potente
ruolo antiossidante.37
Si trovano nelle bucce di uva sottoforma di 3-glicosidi (glucosidi, glucuronidi e galattosidi); i
principali flavonoli presenti negli acini di uva sono la quercetina (3-O-glucoside e 3-O-
glucuronide) e la miricetina (3-O-glucoside), ma anche altri composti, come il kaempferolo,
isoramnetina, laricitrina e syringetina sono stati identificati come glucosidi.38,39,40
Inoltre, è
stato anche trovato kaempferolo sottoforma di 3-glucuronide e i recenti risultati hanno
suggerito la presenza dei 3-galattosidi di kaempferolo e laricitrina come flavonoli minori.41
19
2.5 I NON FLAVONOIDI
I principali non-flavonoidi d’importanza alimentare sono gli acidi fenolici C6-C1, in
particolare l’acido gallico, che è il precursore di tannini idrolizzabili, gli acidi
idrossicinnamici C6-C3 e loro derivati coniugati e i polifenoli e stilbeni C6-C2-C6.
2.5.1 ACIDI FENOLICI
Gli acidi fenolici sono noti anche come idrossibenzoati, la componente principale è l’acido
gallico (Figura 13).
Figura 13 - Acido gallico.
Il nome deriva dalla parola francese “galle”, ovvero un rigonfiamento nel tessuto della pianta
dopo l' attacco da parte di parassiti. L'acido gallico è l'unità base dei gallotannini.
I tannini si legano alle proteine salivari, producendo un sapore astringente; una lieve
astringenza migliora il sapore e la consistenza di un numero di alimenti e bevande, in
particolare di tè e vini rossi. Molti tannini sono tanto astringenti da rendere i tessuti vegetali
non edibili.
2.5.2 GLI ACIDI IDROSSICINNAMICI (HCA)
Gli (HCA) sono il gruppo più abbondante di non flavonoidi presenti nel vino e nell’uva.
Negli acini, polpa e buccia di V. vinifera troviamo: l’acido caffeoil-tartarico, p-coumaroil-
tartarico e acido feroulil-tartarico i cui isomeri trans sono generalmente molto più abbondanti
rispetto alle forme cis.42
Gli acidi idrossicinnamici sono coinvolti nelle reazioni di
imbrunimento del mosto e del vino,43
inoltre sono precursori di fenoli volatili aventi capacità
antimicrobiche e antiossidanti.44
L’acido cinnamico è un composto C6-C3 che viene
convertito negli idrossicinnamati, i quali sono prodotti del gruppo dei flavonoidi, definiti
come fenilpropanoidi. Gli HCA più comuni sono: l’acido p-cumarico, acido caffeico e
ferulico (Figura 14), componenti comuni di frutta e verdura.
20
Figura 14 - Struttura degli acidi p- coumarico, caffeico, ferulico e cinnamico.
2.5.3 GLI STILBENI
Grande attenzione è stata rivolta alle proprietà salutistiche degli stilbeni e in particolare al
resveratrolo, lo stilbene più comune e al piceatannolo, un derivato naturale del resveratrolo,
sintetizzato negli acini d’uva solo durante la maturazione, nonché ai derivati mono-glucosilati
del reveratrolo quali il piceide e il resveratroloside. I membri della famiglia degli stilbeni
hanno struttura C6-C2-C6, come i flavonoidi. Gli stilbeni sono fitoalessine, composti prodotti
da piante in risposta agli attacchi fungini, agenti patogeni batterici e virali (Figura 15). Sono
noti anche composti oligomeri del resveratrolo chiamati viniferine con azione
antinfiammatoria decisamente superiore. Le principali fonti alimentari di stilbeni includono
uva, vino, soia e arachidi. Il trans-resveratrolo presente nel vino rosso ha effetti
cardioprotettivi; inoltre è stato dimostrato che è in grado di inibire l’ossidazione delle LDL,
nella fase iniziale dell’aterosclerosi45
Figura 15 - Strutture degli stilbeni resveratrolo e resveratrolo-3-O-glucoside
21
PARTE SPERIMENTALE
22
23
INTRODUZIONE
Questa tesi è finalizzata allo studio del Bonarda, vino prodotto nell’Oltrepò Pavese “Bonarda
dell’Oltrepò Pavese DOC ” e approvato con DPR del 06.08.1970 G.U.27.10.1970.
Questo vino, come riportato nel Disciplinare di produzione allegato alla tesi, può essere
composto da uve:
▪ Croatina: dall’ 85% al 100%
▪ Barbera,Ughetta (Vespolina), Uva rara: congiuntamente o disgiuntamente, fino a un
massimo del 15%.
Tipologie di vino simili esistono anche in altre zone del Nord Italia, come riportato nel
Registro Nazionale delle Varietà della Vite” edito dal Ministero delle Politiche agricole e
forestali46
. Il vino ottenuto dalla Croatina, in base al registro nazionale delle varietà della vite,
risulta essere prodotto in Piemonte, Lombardia , Emilia Romagna e Sardegna (Figura 16),
con i nomi commerciali per i vini a denominazione di origine controllata D.O.C. riportati in
Tabella 1 e con i nomi commerciali per i Vini a indicazione geografica tipica IGT riportati in
Tabella 2.
Figura 16 - Cartina d’Italia con le zone di produzione47
Idonea alla coltivazione
Idonea e consigliato
24
Tabella 1. Elenco dei nomi commerciali dei vini Bonarda D.O.C.
VINI D.O.C.
1. BONARDA DELL’OLTREPO’ PAVESE 2. BRAMATERRA
3. BUTTAFUOCO DELL’OLTREPO’ PAVESE O
BUTTAFUOCO 4. CASTEGGIO
5. CISTERNA D’ASTI 6. COLLI DI PARMA
7. COLLI PIACENTINI 8. COLLI TORTONESI
9. COLLINE NOVARESI 10. COSTE DELLA SESIA
11. GUTTURNIO 12. OLTREPO’ PAVESE
13. PIEMONTE 14. SAN COLOMBANO AL LAMBRO O SAN
COLOMBANO
15.SANGUE DI GIUDA DELL’OLTREPO’ PAVESE O
SANGUE DI GIUDA 16. VALLI OSSOLANE
Tabella 2. Elenco dei nomi commerciali dei vini Bonarda IGT.
VINI IGT
1. BARBAGIA 2 BERGAMASCA
3. COLLI DEL LIMBARA 4 .COLLINA DEL MILANESE
5. DELLE VENEZIE 6. EMILIA O DELL’EMILIA
7. FORLÌ 8. ISOLA DEI NURAGHI
9. MARMILLA 10. NURRA
11. OGLIASTRA 12. PARTEOLLA
13. PLANARGIA 14. PROVINCIA DI NUORO
15.PROVINCIA DI PAVIA 16. RAVENNA
17. ROMANGIA 18. RONCHI
19. VARESINI 20. RUBICONE
21. SEBINO 22. SIBIOLA
23. TERRE LARIANE 24. THARROS
25. TREXENTA 26. VALLAGARINA
27. VALLE DEL TIRSO 28. VALLI DI PORTO PINO
29. VENETO 30.VERONA O PROVINCIA DI VERONA O VERONESE
31. ALTO MINCIO 32. PROVINCIA DI MANTOVA
33. QUISTELLO 34. SABBIONETA
35.TERRAZZE RETICHE DI
SONDRIO
Dalle tabelle riportate si può osservare che i vini ottenuti per vinificazione dell’uva Croatina,
sia in purezza, sia con altre uve, scelte tra quelle provenienti dalla zona di produzione sono
25
molto numerosi. Per quanto riguarda i vini DOC, la sola provincia di Pavia utilizza la
Croatina nella produzione di ben 5 tipologie di vini e i territori limitrofi (vicino Piemonte e
Piacentino) producono altrettanti vini utilizzando la Croatina. Il Ministero per le Politiche
Agricole e Forestali ha riconosciuto tuttavia, il Bonarda come vino proveniente solo dalla
Provincia di Pavia. La Croatina è disponibile sottoforma di cloni che derivano dall’incrocio
(solitamente per innesto) di due vitigni differenti, differiscono per alcuni aspetti fenotipici e
vengono studiati e messi a punto per ottenere viti con maggiore resistenza alle malattie e vini
con migliori caratteristiche organolettiche e maggiore resistenza all’invecchiamento, rispetto
ai due biotipi incrociati. Attualmente il Ministero riconosce solo alcuni cloni, ottenuti e
coltivati in purezza presso alcuni vivai specializzati tra cui anche il Centro di Riccagioia.
S.C.p.a., Centro di Ricerca Formazione e Servizi della Vite e del Vino, con sede a Torrazza
Coste (PV). L’elenco dei cloni ammessi per la produzione commerciale del Bonarda
dell’Oltrepò Pavese è riportato nella tabella 3 sottostante.
Tabella 3.elenco dei cloni ammessi per la produzione commerciale del Bonarda dell-Oltrepò Pavese.
Codice Clone Data emanazione Gazzetta Ufficiale del
001 I - RAUSCEDO 2 1969-12-24 D.P.R. 1164/69 in G.U. 48 1970-02-
24
002 I - MI-CR 9 1976-04-29 G.U. 153 1976-06-
11
003 I - MI-CR 10 1976-04-29 G.U. 153 1976-06-
11
004 I - MI-CR 12 1976-04-29 G.U. 153 1976-06-
11
005 I - PC-BO-1 1979-11-16 G.U. 347 1979-12-
21
006 I - PC-BO-16 1979-11-16 G.U. 347 1979-12-
21
007 I - CVT 38 2009-01-12 G.U. 93 2009-04-
22
008 I - CVT 43 2009-01-12 G.U. 93 2009-04-
22
009 I - Cro 2 2014-05-15 G.U. 127 2014-06-
04
010 I - Cro 4 2014-05-15 G.U. 127 2014-06-
04
011 I - Cro 5 2014-05-15 G.U. 127 2014-06-
04
26
Tuttavia esistono molti altri cloni che da tempo vengono coltivati e studiati nella speranza di
individuare caratteristiche organolettiche, nutraceutiche e colturali maggiormente vantaggiose
per la produzione del Bonarda; tali cloni o presunti cloni (se la loro struttura genetica
necessita di ulteriori verifiche o conferme) sono oggetto di studio a Riccagioia e vengono
vinificati, in piccole quantità (100 l al massimo), ogni anno e degustati al termine del processo
di vinificazione registrando di volta in volta le condizioni colturali, l’andamento del prodotto
in cantina e le osservazioni fatte durante le varie degustazioni.
In questa tesi sono stati presi in considerazione
N. 2 cloni di croatina già omologati (Cro 2 e Cro 5)
N. 2 cloni in attesa di omologazione (Cro 48 e Cro 63)
ed un presunto clone (Bonarda TQ).
Le differenze tra i cloni riguardano alcuni aspetti della pianta e quindi dell’uva e non sono
così facilmente riconducibili alle caratteristiche chimico-fisiche ed organolettiche del prodotto
finito, tuttavia tutti i vini analizzati provengono dalla stessa vendemmia (2012) e hanno subito
gli stessi trattamenti di cantina, a partire dalla macerazione sulle bucce, con durata pari a otto
giorni per tutti i vini analizzati. Per questo motivo le differenze riscontrate nel vino sono da
ascriversi solamente alle caratteristiche dell’uva di partenza.
I vini oggetto di studio nella tesi sono stati selezionati perché prodotti con croatina in purezza,
per escludere il contributo dovuto ad altre uve, ma in questo caso si è avuta la possibilità di
conoscere le procedure di lavoro durante l’intero processo produttivo con la garanzia di
ottenere un vino finito in cui le caratteristiche intrinseche, dipendevano esclusivamente dalle
caratteristiche dell’uva di partenza.
Il prodotto commerciale è in genere ottenuto da una miscela delle varietà di uva ammesse dal
disciplinare e pertanto parte delle caratteristiche della Croatina vengono attenuate dalla
presenza della Barbera, attenuando l’individualità del Bonarda. Inoltre, osservando le
caratteristiche chimico-fisiche e organolettiche riportate dal Disciplinare di Produzione, si
osserva che per il Bonarda è ammessa la vinificazione in molte tipologie di prodotto, dal
momento che :
27
▪ la sovrapressione può arrivare fino a 2,5 atm per il vino frizzante,
▪ la concentrazione di glucosio fruttosio varia da 0,1 g/l nel prodotto secco a 50 g/l per il
Bonarda frizzante dolce;
▪ il titolo alcolometrico svolto può variare da 9 % v/v a 14 % v/v per i vini più corposi
destinati all’invecchiamento.
Le innumerevoli sfaccettature che questo vino può assumere nella sua produzione destinata
alla grande distribuzione, ne hanno fatto un prodotto di massa, talvolta di basso valore
commerciale e purtroppo spesso privo di una sua connotazione caratteristica, nonostante il suo
indubbio valore organolettico. Il Bonarda dell’Oltrepò Pavese D.O.C. risulta un prodotto
tipico della Provincia di Pavia, ma vini simili e con composizioni analoghe vengono prodotti
anche nelle aree limitrofe, anche se con nomi differenti Gotturnio nel Piacentino e Cisterna
d’Asti, in Piemonte, ad esempio.
L’insieme di tutti questi fattori ha contribuito negli anni a rendere il mercato di questo vino,
(con un destino comune a tanti altri in Italia), quanto mai debole e soggetto a subire le
influenze della concorrenza e della contraffazione, fatto questo che ha determinato il
progressivo livellamento dei prezzi al consumo, anche se i costi di produzione nel contempo
sono in continuo aumento per un insieme di fattori .
La ricerca svolta presso il Laboratorio di Chimica degli Alimenti e Nutraceutica del
Dipartimento di Scienze del Farmaco dell'Università degli Studi di Pavia ha avuto lo scopo di
determinare il profilo metabolico di cinque campioni di vino Bonarda in purezza, derivati da
cloni differenti di Croatina.
Da alcuni anni, il Dipartimento di Scienze del Farmaco collabora con Riccagioia SCPA, in un
progetto di ricerca che ha la finalità di mettere a punto un protocollo di analisi specialistiche
tali da costruire una carta di identità dei principali vini dell’Oltrepò Pavese, per
▪ individuarne le principali caratteristiche chimico-fisiche,
▪ analizzare le loro caratteristiche organolettiche, per descriverle anche dal punto di
vista analitico,
▪ evidenziare le loro potenzialità sia dal punto di vista organolettico sia dal punto di
vista salutistico
▪ e infine tutelare il prodotto difendendolo da eventuali contraffazioni, se non addirittura
da frodi.
La scelta di considerare il Bonarda come vino su cui sperimentare questo protocollo deriva
essenzialmente dal fatto che è il vino più diffuso tra i vini dell’Oltrepò Pavese, di cui
28
rappresenta oltre il 40 % della produzione e che per questo motivo è possibile effettuare una
valutazione statistica dei risultati ottenuta dall’applicazione del protocollo analitico al
prodotto commerciale. Nella fase attuale della ricerca sono stati considerati dei campioni di
Bonarda prodotti in cantine sperimentali per poter evidenziare caratteristiche analitiche
relative alla sola uva croatina, dal momento che per il prodotto commerciale non è facile
escludere la presenza di uve barbera nell’uvaggio finale.
In questa tesi sono stati quindi considerati cinque campioni, ricavati da cloni di bonarda
appartenenti alle collezioni di Riccagioia, vinificati in piccole o medie quantità (sotto i 5 hl),
sicuramente in purezza per analizzare anche dal punto di vista organolettico, le caratteristiche
di ciascun prodotto.
I vini Bonarda considerati nella tesi rispondono completamente ai parametri indicati dal
disciplinare di produzione e quindi l’attenzione è stata focalizzata, in questa ricerca, sul
riconoscimento di polifenoli (flavonoidi, come catechine e antociani, stilbeni come il
resveratrolo) strettamente legati alle capacità antiossidanti dei vini.
Di alcuni campioni abbiamo anche dei dati analitici che alleghiamo a titolo di esempio
(Tabella 4).
Tabella 4.Dati analitici relativi ai cloni Cro2,Cro 48 e Cro 63.
CLONE Alcool Ac. Fissa Ac. Volatile pH antociani totali polifenoli
totali
Cro 2 14,7 5,1 0,30 3,52 1550 2906
Cro 48 15,9 5,1 0,37 3,53 916 2999
Cro 63 13,4 5,5 0,29 3,34 900 2988
29
MATERIALI E METODI
Reattivi:
Metanolo Sigma Aldrich (HPLC grade)
Acido formico 1M Sigma Aldrich
Acetonitrile Sigma Aldrich (LC grade)
Acqua Millipore grade
Descrizione e preparazione del campione:
I vini Bonarda D.O.C. dell’Oltrepò Pavese sono prodotti nella cantina sperimentale
dell’azienda viti-vinicola Riccagioia. Questi vini, derivanti da micro e mesovinificazioni della
cantina sperimentale sono stati selezionati per avere la garanzia di potere disporre di un vino
prodotto esclusivamente con uva croatina in purezza e poter quindi escludere i possibili
contributi derivanti da un utilizzo di uva barbera, sia nella fase di vinificazione sia nella fase
di affinamento in cantina fino all’imbottigliamento. I vini analizzati, sono stati prodotti nella
vendemmia precedente per potere meglio valutare la presenza di composti polifenolici ed
antocianici in un vino “giovane” escludendo quindi i fenomeni ossidativi che normalmente
avvengono durante l’invecchiamento.
In questo studio sono stati analizzati 5 campioni di vino Bonarda : TQ, Cro2, Cro5, Cro63,
Cro48. Ciascun campione è stato filtrato con filtri Millex-HV in PVDF con porosità di 0,45 e
0,22 μm e successivamente sottoposto ad analisi UHPLC-PDA-hESI-MSn.
Analisi UHPLC-PDA-hESI-MSn :
L’analisi dei campioni di vino è stata condotta utilizzando un sistema Jasco X-LC
(Jasco,Easton,MD,USA) dotato di una pompa quaternaria, un detector UHPLC-PDA e uno
spettrometro di massa a trappola lineare LTQ-XL (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)
attraverso una sorgente h-ESI (Figura 17).
30
Figura 17- UHPLC-PDA-hESI-MSn
La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna Purospher® RP-18 (5 μm)
LiChroCART® 250-4 (250 mm x 4 mm i.d., 5 μm) (Merck) con la corrispondente precolonna
(Merck). La fase mobile è rappresentata da acqua acidificata con acido formico allo 0,1 %
(eluente A) e acetonitrile (eluente B), il flusso è stato impostato a 1 mL/min e il volume
d’iniezione a 5 μL. Il gradiente di eluizione è mostrato nella (tabella 5) :
Tabella 5- Gradiente di eluizione del metodo analitico.
Tempo (min) Acqua acida
(H3O+)
Acetonitrile
(CH3CN)
5 98 2
40 60 40
45 0 100
47 0 100
52 98 2
57 98 2
La temperatura del sistema è stata mantenuta a 24 °C. I cromatogrammi sono stati registrati a
λ 280 nm (oltre che a 220, 254, 366, 520 nm); gli spettri sono stati registrati nel range 200-
650 nm per tutti i picchi. La trappola ionica ha operato nelle condizioni di data dependent, full
scan (80-1500 m/z), zoom scan e in modalità MSn. Per ottenere gli ioni frammento è stata
applicata un’energia di collisione del 35%; il voltaggio è stato tenuto a 3 kV per la
ionizzazione negativa e 5 kV per quella positiva, la temperatura del capillare era 275 °C, il
flusso di gas nella guaina era di 20 unità arbitrarie e l’ Auxiliary/sweep gas flow rate era di 17
unità arbitrarie.
31
RISULTATI E DISCUSSIONE
La ricerca svolta presso il laboratorio di Chimica degli Alimenti e Nutraceutica del
Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università degli Studi di Pavia è stata finalizzata a
determinare il profilo metabolico di cinque campioni di vino Bonarda in purezza: Bonarda
TQ, Cro 2, Cro 5, Cro 63, Cro 48, derivati da cloni differenti di Croatina mediante un metodo
messo a punto appositamente:UHPLC-PDA-hESI-MSn. Dal confronto dei cromatogrammi
ottenuti, tenendo conto del tempo di ritenzione, dello spettro UV e spettro MS e MS2, è stato
possibile identificare 68 composti di natura polifenolica, alcuni presenti in tutti i campioni di
vino analizzati, altri presenti solo in alcuni. Più in particolare:
nel campione di vino Bonarda TQ sono state identificate 35 sostanze di cui 2
acidi organici (Tabella 7), 5 acidi idrossicinnamici (Tabella 8), 11 flavonoidi
(Tabella 9) di cui 17 antociani (Tabella 10).
nel campione di vino Croatina Cro 48 sono state identificate 29 sostanze di cui 2
acidi organici (Tabella 11), 5 acidi idrossicinnamici (Tabella 12), 12 flavonoidi
(Tabella 13) di cui 10 antociani (Tabella 14).
nel campione di vino Croatina Cro2 sono state identificate 27 sostanze di cui 2
acidi organici (Tabella 15), 3 acidi idrossicinnamici (Tabella 16), 12 flavonoidi
(Tabella 17) di cui 10 antociani (Tabella 18).
nel campione di vino Croatina Cro 63 sono state identificate sostanze di cui 3
acidi idrossicinnamici (Tabella 19), 16 flavonoidi (Tabella 20) di cui 16
antociani (Tabella 21) nessun acido organico.
nel campione di vino Croatina Cro 5 sono state identificate sostanze di cui 2
acidi organici (Tabella 22), 6 acidi idrossicinnamici (Tabella 23), 21 flavonoidi
(Tabella 24) di cui 7 antociani (Tabella 25).
Nella seguente tabella sono riportati i numeri relativi ai composti presenti nei diversi cloni di
Croatina (Tabella 6).
32
Tabella 6. Numeri relativi ai composti presentii nei vari cloni di Croatina.
CLONE Acidi organici Acidi idrossicinnamici Flavonoidi Antociani
Cro 2 2 3 12 10
Cro 5 2 6 21 7
Cro 48 2 5 12 10
Cro 63 0 3 16 16
TQ 2 5 11 17
Si può osservare che i flavonoidi sono la famiglia di composti numericamente più
abbondante, seguiti dagli antociani, mentre acidi organici e acidi idrossicinnamici sono
presenti con pochi composti.
Ogni vino è stato analizzato come precentemente descritto e a seguito sono riportati il
cromatogramma e gli spettri di massa relativi ai principali composti identificati.
BONARDA TQ
Figura- Cromatogramma total ion current, del campione di vino Bonarda TQ.
Tabella 7. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi organici presenti nel campione di vino Bonarda TQ.
ACIDI ORGANICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
7.81 169 125 Acido gallico
70.86 197 153 Acido siringico
33
Figura 10- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido gallico con tempo di ritenzione 7.81 min
Figura 11- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido siringico con tempo di ritenzione 70.86 min.
Tabella 8. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione di vino Bonarda TQ.
ACIDI IDROSSICINNAMICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
13.47 311 149,179 Acido cis-caftarico
16.23 295 163,149 Acido cis-trans coutarico
17.36 325 193 Acido trans feruriltartarico
17.63 179 135 Acido trans-caffeico
45.97 194 193,134,149 Acido ferulico
34
Figura 12- Spettro MS e spettro MS2 del composto cis-caftaric acid con tempo di ritenzione 13.47 min.
Figura 13- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido cis/trans coutarico con tempo di ritenzione 16.23 min.
Figura 14- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido trans feruil tartarico con tempo di ritenzione 17.36 min.
35
Figura 15- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido trans-caffeico con tempo di ritenzione 17.63 min.
Figura 16- Spettro MS e spettro MS2del composto acido ferulico con tempo di ritenzione 45.95 min.
Tabella 9. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai
flavonoidi presenti nel campione di vino Bonarda TQ.
FLAVONOIDI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
11.17
305
179
Epigallocatechina
13.69 577 425,289 Procianidina dimero
15.21 447 401 Isoramnetina-3-O-glucoside
15.25 465 303 Diidroquercetina derivati
15.60 289 245,205,179 Epicatechina
15.84 865 577,289 Procianidina trimero
20.45 479 317 Miricetina-O-glucoside
22.81 493 331 Laricitrina-3-glucoside
23.15 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide
24.92 507 345 Siringetina-3-glucoside
25.86 389 227 Resveratrolo-trans-glucoside
36
Figura 17- Spettro MS e spettro MS2del composto epigallocatechina con tempo di ritenzione 11.17 min.
Figura 18- Spettro MS e spettro MS2del composto procianidina dimero con tempo di ritenzione 13.69 min.
Figura 19 Spettro MS e spettro MS2del composto isoramnetina 3-O-glucoside con tempo di ritenzione 15.21 min.
37
Figura 20- Spettro MS e spettro MS2del composto derivati della diidroquercetina con tempo di ritenzione 15.25 min.
Figura 21- Spettro MS e spettro MS2del composto derivati della epicatechina con tempo di ritenzione 15.60 min.
Figura 22- Spettro MS e spettro MS2del composto procianidina trimero con tempo di ritenzione 15.78 min.
38
Figura 23- Spettro MS e spettro MS2 del composto miricetina-3-glucoside con tempo di ritenzione 20.45 min.
Figura 24- Spettro MS e spettro MS2 del composto laricitrina 3-glucoside con tempo di ritenzione 22.81 min.
Figura 25- Spettro MS e spettro MS2 del composto quercetina 3-O-glucuronide con tempo di ritenzione 23.15min.
39
Figura 26- Spettro MS e spettro MS2 del composto siringetina 3-glucoside con tempo di ritenzione 24.92 min.
Figura 27- Spettro MS e spettro MS2 del composto resveratrolo trans-glucoside con tempo di ritenzione 25.86 min.
40
Tabella 10. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli antociani presenti nel campione di vino Bonarda TQ.
ANTOCIANI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z Struttura proposta
2,93 603 543,471 Vitisina di Malvidina-3 acetil
glucoside
7.09 493 331 Malvidina-3-glucoside
9.46 651 443,605 Malvidina-3-acetil glucoside-4
vinilfenolo
15.25 465 303,285 Delfinidina-3-O-glucoside
18.51 449 287 Cianidina-3-O-glucoside
18.52 517 355 malvidina-3-o-glu-acetaldeide
19.06 559 353,515 Vitisina tipoB di Malvidina-3-
acetil glucoside
20.10 809 357,519,647 Malvidina-3-O-glucoside-8-etil-
(epi)catechina
20.28 507 327,492 Delfinidina-3-acetil glucoside
20.47 479 317 Petunidina-3glucoside
20.70 1093 931 Piranomalvidina-3-glucoside PC
20.85 809 357,519,647 Malvidina-3-glucoside
metilmetina cat.
22.20 625 579 Malvidina-3-glucoside-4vinil
catecolammina
22.24 781 493,583 Malvidina-3 glucoside-cat
24.07 303 285 Delfinidina
24.19 955 665,357 Malvidina-3-cumaroil glucoside-
metilmetina catechina
42.07 331 313 Malvidina
Figura 28- Spettro MS e spettro MS2 del composto (Vitisina) malvidina 3 acetil glucoside con tempo di ritenzione 2.93min.
41
Figura 29- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-glucoside con tempo di ritenzione 7.09 min.
Figura 30- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3- acetil glucoside-4 vinilfenolo con tempo di ritenzione 9.46
min.
Figura 31- Spettro MS e spettro MS2 del composto delfinidina 3- O-glucoside con tempo di ritenzione 15.25 min.
42
Figura 32- Spettro MS e spettro MS2 del composto cianidina 3- O-glucoside con tempo di ritenzione 18.51min.
Figura 33- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-O glucoside acetaldeide con tempo di ritenzione 18.52 min.
Figura 34- Spettro MS e spettro MS2 del composto vitisina tipo B malvidina 3-acetil glucoside con tempo di ritenzione
19.06 min.
43
Figura 35- Spettro MS e spettro MS2del composto malvidina 3-O-glucoside-8-etil-(epi)catechina, con tempo di ritenzione
20.10 min.
Figura 36- Spettro MS e spettro MS2del composto delfinidina 3-acetil glucoside con tempo di ritenzione 20.28 min.
Figura 37- Spettro MS e spettro MS2del composto petunidina 3-glucoside con tempo di ritenzione 20.47 min.
44
Figura 38- Spettro MS e spettro MS2del composto piranomalvidina 3-glucoside PC con tempo di ritenzione 20.70 min.
Figura 39- Spettro MS e spettro MS2del composto malvidina 3-glucoside metil metin catechina con tempo di ritenzione
20.85 min.
Figura 40- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-glucoside 4-vinil catecolamina con tempo di ritenzione
22.20 min.
45
Figura 41- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-glucoside cat.con tempo di ritenzione 22.24 min.
Figura 42- Spettro MS e spettro MS2 del composto delfinidina con tempo di ritenzione 24.07 min.
Figura 43- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina-3-cumaroil glucoside metilmetin catechina con tempo di
ritenzione 24.19 min.
46
Figura 44- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina con tempo di ritenzione 42.07 min.
CROATINA 48
Figura 45 - Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro 48.
Tabella 11. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi organici presenti nel campione Cro48.
ACIDI ORGANICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
3.10 133 115,87 Acido malico
20.93 197 153 Acido siringico
47
Tabella 12. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro48.
ACIDI IDROSSICINNAMICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
13.22 311 149,179 Acido-cis/trans caftarico
16.17 295 163,149 Acido-cis/trans coutarico
17.36 325 193,235,265 Acido-trans-feruil tartarico
21.12 165 147 Acido diidrossicumarico
45.92 194 179,194,163 Acido ferulico
Tabella 13. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
ai flavonoidi presenti nel campione Cro 48.
FLAVONOIDI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
10.18 593 425,407,289,467 (epi)gallocatechina
(epi) catechina
11.14 305 179,219,261,165.125 Epigallocatechina
13.71 577 425,289 Procianidina B3
15.50 289 245,205,179 Catechina
15.72 865 287,289,299 Procianidina trimero
20.21 479 317,316 Miricetina-3-O-
glucoside
20.71 493 317 Miricetina-3-
glucuronide
22.74 493 331 Laricitrina-3-
glucoside
23.19 477 301 Quercetina-3-O-
glucuronide
23.54 449 303,285,151 Astilbina
24.71 507 344 Siringetina-3-
glucoside
25.89 389 227 Resveratrolo/trans
glucoside
48
Tabella 14. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli antociani presenti nel campione Cro48.
ANTOCIANI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z Struttura proposta
2.92 603 543,471 Vitisina di Malvidina 3-
acetil glucoside
15.23 465 303,285 Delfinidina-3-O-
glucoside
18.34 449 287,303,285,269 Cianidina-3-glucoside
19.01 559 353,515 Vitisina-tipoB-di
Malvidina3-acetil
glucoside
20.33 507 327,492 Delfinidina-3-acetil
glucoside
20.44 479 317 Petunidina-3-O-
glucoside
22.25 781 493,583 Malvidina-3-glucoside-
cat
22.80 493 331 Malvidina-3-glucoside
37.85 303 285,187 Delfinidina
41.99 331 313 Malvidina
CROATINA Cro 2
Figura 46 - Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro2.
Tabella 15. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi organici presenti nel campione Cro2.
ACIDI ORGANICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z Struttura proposta
3..07 133 115,132,87 Acido malico
4.79 191 111,173 Acido citrico
49
Tabella 16. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro2.
ACIDI IDROSSICINNAMICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z
Struttura proposta
13.52 311 148,179 Acido-trans-caffeil tartarico
15.68 295 149,163 Acido Coutarico/trans
21.24 165 147 Acido-diidrossi-coumarico
Tabella 17. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
ai flavonoidi presenti nel campione Cro2.
FLAVONOIDI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z
Struttura proposta
10.24 593 425 (epi)gallocatechina(epi)
catechina
13.88 577 425,289,451,407 Procianidina B3
15.29 465 303,285 Taxifolina-3-O-glucoside
18.07 289 245,205,179 Epicatechina
20.59 479 317 Miricetina-3-O-glucoside
20.75 493 317 Miricetina-3-glucuronide
22.77 493 331 Laricitrina-3-O-galattoside
22.96 463 301 Quercetina-3-O-galattoside
23.22 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide
23.67 449 303 Astilbina
24.80 507 344 Siringetina-3-O-glucoside
25.90 389 227 Resveratrolo-trans glucoside
50
Tabella 18. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli antociani presenti nel campione Cro2.
ANTOCIANI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z
Struttura proposta
2.95 603 543,471 Vitisina di Malvidina 3-acetil
glucoside
15.29 465 303,285 Delfinidina-3-O-glucoside
18.53 449 287,269 Cianidina-3-O-glucoside
19.11 559 353,515 Vitisina-tipoB-Malvidina-
3acetil glucoside
20.51 479 317 Petunidina-3-O-glucoside
22.63 625 579 Petunidina-3-p-Coumaroil
glucoside
22.73 493 331 Malvidina-3-O-glucoside
22.96 463 301 Peonidina-3-O-glucoside
24.92 507 303 Delfinidina-3-O-acetil
glucoside
42.05 331 313 Malvidina
CROATINA Cro 63
Figura 47- Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro63.
Tabella 19. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro63.
ACIDI IDROSSICINNAMICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z
Struttura proposta
21.27 165 119 Acido diidrossicumarico
36.62 329 167 Hexose-estere-dell’acido
vanillico
45.90 193 179,194 Acido ferulico
51
Tabella 20. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
ai flavonoidi presenti nel campione Cro63.
FLAVONOIDI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z
Struttura proposta
10.17 593 425 Epi-gallocatechina-epi
11.10 305 179 Epigallocatechina
13.72 577 425,289 Procianidina B3
15.44 289 245,205,179 Catechina
15.70 865 287,289 Procianidina trimero
15.98 447 401 Isoramnetina-3-O-glucoside
16.00 447 401 Camferolo-3-O-glucoside
20.49 479 317 Miricetina-3-O-galattoside
20.57 479 317 Miricetina-O-glucoside
22.26 781 601,583 Punicalina A
22.75 493 331 Laricitrina-O-glucoside
23.17 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide
23.62 449 303,285,151 Astilbina
24.88 507 345 Siringetina-3-glucoside
25.96 389 227 Trans-resveratrolo glucoside
36.06 227 185 Resveratrolo
Tabella 21. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli antociani presenti nel campione Cro63.
ANTOCIANI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z
Struttura proposta
2.97 603 543,471 Vitisina Malvidina-3-acetil glucoside
18.43 449 287 Cianidina 3-O-glucoside
18.52 517 355 Piranomalvidina 3-glucoside
19.04 559 353,515 Vitisina tipoB di Malvidina-3-acetil
glucoside
19.07 561 399 Carbossipirano Malvidina-3-glucoside
20.57 479 317 Petunidina-3- glucoside
20.68 1093 931 Piranomalvidina-3-glucoside PC
20.86 809 357 Malvidina-3-glucoside-metilmetin
catechina
22.26 781 493,583 Malvidina-3 glucoside catechina
22.54 625 579 Malvidina-3-glucoside-4-vinil-
catecolamina
22.64 625 579 Petunidina-3-p coumaroil glucoside
22.83 493 331 Malvidina-3-O-glucoside
24.21 955 665,357 Malvidina-3-p coumaroil glucoside 4
etil catechina
24.93 805 643 Piranomalvidina 3-glucoside catechina
24.96 507 303 Delfinidina 3- O-acetil glucoside
42.07 331 313 Malvidina
52
CROATINA Cro 5
Figura 48 - Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro5.
Tabella 22. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi organici presenti nel campione Cro5.
ACIDI ORGANICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]-
MS² m/z
Struttura proposta
7.87 169 125 Acido gallico
20.93 197 153 Acido siringico
Tabella 23. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro5.
ACIDI IDROSSICINNAMICI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z
Struttura proposta
2.14 193 149 Acido ferulico
13.71 311 149,179 Acido-cis/trans caftarico
16.52 295 149,163 Acido-cis/trans coutarico
17.50 325 193 Acido-trans-feruil tartarico
17.53 179 135 Acido trans caffeico
21.24 165 147 Acido diidrossicoumarico
53
Tabella 24. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
ai flavonoidi presenti nel campione Cro5.
FLAVONOIDI
Tempo di
ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z
Struttura proposta
10.42 593 425 Epi-gallocatechina(epi)catechina
11.14 305 179,219,261,165,125 Epigallocatechina
13.96 577 425,289 Procianidina B3
14.10 577 425,289 Procianidina B1
14.15 577 425,289 Procianidina B4
14.30 577 425,289 Procianidina B2
15.25 465 303 Diidroquercetina derivati
15.50 289 245,205,179 Catechina
15.72 865 287,289,299 Procianidina trimero
16.00 447 401 Camferolo 3-O-glucoside
17.03 577 425,289 Prociandina B5
18.07 289 245,205,179 Epicatechina
20.54 479 317 Miricetina-3-O-galattoside
20.74 493 317 Miricetina 3-O-glucuronide
20.94 197 169,125 Etil-gallato
22.85 493 331 Laricitrina-3-O-galattoside
22.96 463 301 Quercetina-3-O-galattoside
23.31 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide
23.68 449 303 Astilbina
24.91 507 345 Siringetina-3-O-glucoside
25.90 389 227 Resveratrolo trans glucoside
Tabella 25. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa
agli antociani presenti nel campione Cro5.
ANTOCIANI
Tempo di ritenzione
(min)
m/z [ M+H]+
MS² m/z
Struttura proposta
18.81 517 355 Piranomalvidina-3 glucoside
18.95 561 399 Carbossipirano-Malvidina-3-
glucoside
20.51 479 317 Petunidina-3-O-glucoside
20.88 809 357,319,647 Malvidina-3-glucoside metilmetin
catechina
22.73 493 331 Malvidina-3-O-glucoside
24.27 955 665,357 Malvidina-3-p-coumaroilglucoside
4-etil catechina
24.92 507 303 Delfinidina-3-O-acetil glucoside
54
CONCLUSIONI
La ricerca condotta sui campioni di vino Bonarda TQ, Croatina Cro 2, Cro 5, Cro 48, Cro 63,
ha permesso di ottenere per ciascuno di essi una parziale caratterizzazione chimica da cui
emerge la presenza di almeno 162 prodotti appartenenti ai seguenti gruppi :
acidi organici
acidi idrossicinnamici
flavonoidi , di cui antociani
In tutti i vini analizzati, con eccezione del solo clone Cro 5, è stata identificata anche la β-
alanina, proveniente forse dai lieviti utilizzati durante la fermentazione.
ACIDI ORGANICI
Il Bonarda TQ e il clone Cro 5 presentano analogie in quanto contengono entrambi sia l’acido
gallico sia l’acido siringico, che è un estere metilico del primo composto.
Si differenzia il clone Cro 2 che possiede solo gli acidi malico e citrico, mentre il clone 48
oltre all’acido siringico, contiene anche acido malico.
Acido gallico, acido siringico, acido malico e acido citrico sembrano completamente assenti
nel clone Cro 63( Tabella 26).
Tabella.26 Acidi organici presenti nei vari campioni di vino.
ACIDI ORGANICI COMPOSTO Bonarda TQ Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro 63
Acido gallico √ √
Acido siringico √ √ √
Acido malico √ √
Acido citrico √
ACIDI IDROSSICINNAMICI
I vini Bonarda TQ e quelli ottenuti dai cloni Cro 5 e Cro 48 presentano il maggior numero di
composti appartenenti alla famiglia degli acidi idrossicinnamici, pur con differenze tra i vini
perché nel campione Bonarda TQ manca l’acido diidrossicumarico e nel clone Cro 48 manca
l’acido trans-caffeico.
I vini ottenuti dai cloni Cro 2 e Cro 63 sono invece caratterizzati da un minor numero di acidi
idrossicinnamici, tre composti per ciascun vino tra cui solo l’acido diidrossicumarico è
comune tra i due (Tabella 27).
55
Tabella 27. Acidi idrossicinnamici presenti nei vari campioni di vino.
ACIDI IDROSSICINNAMICI COMPOSTO Cro
TQ
Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro 63
Ac. cis-caftarico √ √ √
Ac. cis-trans coutarico √ √ √ √
Ac.trans-feruriltartarico √ √ √
Ac. trans-caffeico √ √
Ac. ferulic √ √ √ √
Ac. diidrossicumarico √ √ √ √
Ac. trans caffeil- tartarico √
hexose estere dell’acido
vanillico
√
FLAVONOIDI
Il vino che presenta la maggiore abbondanza numerica di flavonoidi è quello ottenuto dal
clone Cro 5 in cui sono presenti tutti i composti in elenco con eccezione di procianidina
dimero, isoramnetina 3-O glucoside, diidroquercetina derivati, miricetina-O-glucoside,
laricitrina 3-glucoside, quercetina 3-O glucoside, siringetina 3-glucoside, punicalina A,
resveratrolo, astilbina.
Interessante osservare anche che il vino ottenuto dal clone Cro 5 è l’unico a contenere tutte le
procianidine (procianidina B1, B2, B3, B4, B5 e procianidina trimero).
Differente è il contenuto in flavonoidi degli altri vini che sono accomunati dal fatto che sono
stati osservati tra 11 e 16 flavonoidi in ciascuno di essi, e che presentano tutti i seguenti
composti: acido diidrossicumarico, quercetin 3-glucoronide, miricetina 3-glucoside, laricitrina
3-glucoside, siringetina 3-glucoside, (epi)gallocatechina (epi)catechina. Interessante osservare
anche che il resveratrolo in forma libera è presente solo nel vino ottenuto dal clone C 63,
mantre la sua forma glucosidata manca solo nel vino ottenuto dai cloni Cro 2 e Cro 48
(Tabella 28).
56
Tabella 28. Flavonoidi presenti nei vari campioni di vino
FLAVONOIDI
COMPOSTO Bonarda
TQ
Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro 63
Epigallocatechina √ √ √
Procianidina dimero √
Isoramnetina3-O-glucoside √ √
Diidroquercetina derivati √
Epicatechina √ √ √
Procianidina trimero √ √ √
Miricetina-O-glucoside √ √ √
Laricitrina 3-glucoside √ √
Quercetina 3-O-glucoside √ √
Siringetina 3-glucoside √ √
Resveratrolo transglucoside √ √ √
(epi)gallocatechina(epi) catechina √ √
Procianidina B3 √ √ √
Taxifolina-3-O-glucoside √
Miricetina-3-Oglucuronide √ √
Laricitrina-3-O-galattoside √ √
Quercetina-3-O-galattoside √ √
Astilbina √ √
Siringetina-3-O-glucoside √ √
Catechina √ √
Camferolo 3-O-glucoside √ √
Miricetina 3-O-galattoside √ √
Punicalina A √
Resveratrolo √
Quercetina3-O-glucuronide √ √
Astilbina √
Diidroquercetina derivati √
Prociandina B5 √
Etil-gallato √
Procianidina B1 √
Procianidina B4 √
Procianidina B2 √
ANTOCIANI
Molto interessante è l’osservazione sulla distribuzione degli antociani nei vari vini.
Il Bonarda TQ, proveniente da un presunto clone in fase di studio, per verificarne le
caratteristiche fenologiche, presenta una grandissima abbondanza numerica di antociani. A
questo proposito si osserva che mancano solo la peonidina e pochi derivati della malvidina.
Il vino ottenuto dal clone Cro 63 è quello che presenta dopo al Bonarda TQ la maggior
abbondanza numerica di antociani, con i suoi 16 composti identificati e riconducibili per la
maggior parte alla malvidina e ai suoi derivati. I vini ottenuti dai cloni Cro 2, Cro 5 e Cro 48,
57
evidenziano al massimo la presenza di una decina di antociani. Molto interessante osservare
che solo il vino ottenuto dal clone Cro 2 contiene Peonidina 3-O glucoside e solo il vino
ottenuto dal clone Cro 48 contiene la delfinidina. Molte altre osservazioni possono essere fatte
sulla presenza degli antociani e dei loro derivati nei vari vini, ma è difficile riscontrare
analogie tra questi (Figura 29).
Tabella 29. Antociani presenti nei vari campioni di vino
ANTOCIANI COMPOSTO Bonarda
TQ
Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro63
Vitisina-Malvidina-3-acetil
glucoside
√ √ √ √
Malvidina-3-acetil glucoside- 4
vinilfenolo
√
Delfinidina3-O-glucoside √ √ √
Cianidina 3-O-glucoside √ √ √ √
malvidina-3-o-glu-acetaldeide √
Vitisina tipo B di Malvidina 3-
acetil glucoside
√ √ √ √
Malvidina3-O-glucoside √ √ √ √ √
Malvidina-3-o-glucoside-8-etil-
(epi)catechina
√
Delfinidina-3-O-acetil glucoside √ √ √ √ √
Petunidina-3-Oglucoside √ √ √ √ √
Piranomalvidina-3glucoside PC √ √
Malvidina-3-glucoside
metilmetin catechina
√ √ √
Malvidina-3-glucoside4-vinil
catecolammina
√ √
Petunidina3-p-coumaroil
glucoside
√ √ √
Malvidina-3glucoside-catechina √ √ √
Delfinidina √ √
Malvidina-3-cumaroil
glucoside-metilmetina catechina
√
Malvidina √ √ √ √
Peonidina-3-O-glucoside √
Piranomalvidina- 3-glucoside √ √
Carbossipirano-Malvidina-3-
glucoside
√ √
Malvidina-3-p-coumaroil
glucoside 4 etil catechina
√ √
Piranomalvidina-3-glucoside
catechina
√
58
Per concludere, si può affermare che lo studio del profilo metabolico dei 5 vini Bonarda in
purezza ottenuti da altrettanti cloni o pseudocloni di uva Croatina, ha permesso di individuare
in totale 67 composti differenti di natura polifenolica di cui solo 3 antocianine ( Malvidina 3-
O - glucoside, Delfinidina 3- O-acetil glucoside e Petunidina 3-O- glucoside) sono comuni a
tutti e 5 i vini. Questo risultato indica che la scelta del clone condiziona fortemente la
composizione in metaboliti secondari del vino pronto per il consumo. Ulteriori indagini
verranno pertanto svolte per correlare la composizione chimica in polifenoli alle proprietà
sensoriali determinate sia mediante analisi sensoriale tradizionale condotta con panel di
degustatori addestrato, sia mediante tecniche analitiche avanzate quali naso e lingua
elettronica.
59
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