Tecnologie innovative nella lotta alle frodi un approccio multidisciplinare

Parte seconda

Dr.ssa Giovanna EspositoS.S. Genetica ed Immunobiochimica

FOOD AUTHENTICITY:creazione di un network europeo per il

contrasto alle frodi alimentari. Torino, 18/10/17

1. Introduzione alla spettrometria di massa

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati)

4. Ricerca dei composti polari in oli di frittura (metodo accreditato)

5. Ricerca acido lattico in uova ed acido 3-idrossibutirrico in ovoprodotti (metodi accreditati)

Agenda

Perchè la spettrometria di massa?

➢Determinazione del peso molecolare➢Delucidazione della struttura molecolare➢Identificazione di componenti di una miscela➢Indagini quantitative➢Indagini di screening➢Analisi targeted o untargeted

Intervallo di PM fino a centinaia di kDaSensibilità dell’ordine delle picomoli o inferioreAcquisizione veloce dei datiInterfacce con metodi separativiAlta e bassa risoluzione

Nell’ambito della sicurezza alimentare, il controllo delle materie prime e dei prodotti finiti richiede metodi sempre più affidabili, veloci e poco costosi.

1. Introduzione alla spettrometria di massa

produce ioni a temperatura ambiente e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z).

Crea

Separa

Misura

Chimica alimentareChimica forenseChimica clinicaTossicologiaRicerca contaminanti

Applicazioni

Cosa fa lo spettrometro di massa accoppiato alla DSA?1. Introduzione alla spettrometria di massa

Rapidità dell’analisiRiduzione dei costi

Risoluzione 12000Accuratezza 5 ppm

Frodi alimentari ricercate

Aggiunta illecita di coloranti vietati (Sudan I-IV) in matrici alimentari

Stato di freschezza/Degradazione dei prodotti ittici

Distinzione tra allevato/pescato, contraffazione dei prodotti ittici

DSAIdentificazione Oli/etichettatura

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

L'aggiunta di sostanze chemigliorano o mascheranol'aspetto dei cibi siconfigura come una frodecommerciale e/o sanitaria.

Sudan IIC18H16N2OSudan I

C16H12N2O

Sudan IIIC22H16N4O

Sudan IVC24H20N4O

I coloranti Sudan sono composti solubili nei grassi caratterizzati da azo-gruppi (-N=N-).Essi sono metabolizzati in composti che agiscono con il DNA e possono produrre effetti cancerogeni, pertanto sono VIETATI

SUDAN I-IV2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Reggio Emilia: ritirato olio di palma del Ghana con colorante cancerogeno Sudan IV. Scatta allerta in Europa ( 2015, il Fatto alimentare)

Le partite di peperoncino, curcuma, olio di palma importati in UE devono essere accompagnate da un rapporto di analisi che attesti l’assenza di Sudan dyes.

Allerte SUDAN

https://webgate.ec.europa.eu/rasff

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Decision 2003/460/EC; 2004/92/EC; 2005/402/EC

Estrazione dei Sudan

2 g di salsa+

2 ml n-exane

2 g di olio di palma+

2 ml acetonitrile

0.5 g di peperoncino+

2ml acetonitrile

TIC: Corrente ionica totale EIC: Corrente ionica estratta

• Preparazione dei campioni fortificati(aggiunta di una concentrazione nota di colorante)

• Estrazione

• Acquisizione in positivo [M+H]+

SUDAN I-IV2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Il picco dello ione pseudomolecolare è spesso accompagnato da altri picchi, in genere più deboli, a massa M+1, M+2, ecc. dovuti alle molecole contenenti isotopi degli elementi che le costituiscono. In questo caso ione [M+H]+1 è dovuto all'sotopo 13C

Ione pseudomolecolare

Lista dei candidati che hanno composizione elementaree rapporti isotopici che soddisfano i criteri di ricerca e relativo errore e probabilità

Elaborazione ed interpretazione dello spettro di massa2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

EU LOD0.5-1 mg/Kg

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Sciuto et al. J Food Prot. 2017 Apr;80(4):640-644.

100 campionianalizzati

Ammine biogene possibile marker?

Istamina TrimetilamminaC5H9N3 C3H9N C4H12N2 C5H14N2

La vendita di pesce in cattivo stato di conservazione rappresenta sia una frode commerciale che una possibile frode sanitaria.

Attualmente non ci sono limiti di legge sui quantitativi ammessi per tali composti nei pesci.Per l'istamina il Regolamento (CE) n. 2073/2005 fissa il suo contenuto a 100-200ppm perquestioni legati alle allergie.

Freschezza dei prodotti ittici2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

➢Preparazione dei campioni fortificatiaggiunta di 0-30 mg/100g di TMA in campioni freschi

➢Estrazione da T0 a T20 gg

➢Acquisizione in positivo [M+H]+

5g di pesce+

10ml MeOH:H2O(50:50)

Prodotti della pesca studiatiOrate, Polpi e Triglie

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Analisi della TMAR² = 0,9909

0 5 10 15 20 25 30-2,00E+007

0,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

TMA (mg/100g)

pea

k ar

ea

Linearity

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

n° di campioni=60provenienza= mercatoittico di Savona

pesce fresco= 0-5 mg/100 g TMA

pesce in corso di alterazione= 5-20 mg/100 g TMA

avariato = >20 mg/100 g TMA

Houet M.N.(2001) Webzine Sanità Pubblica Veterinaria

pesce fresco= 0-5 mg/100 g TMA

pesce in corso di alterazione= 5-20 mg/100 g TMA

avariato = >20 mg/100 g TMA

10% 20% 10%

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

n° di campioni =20 per specieprovenienza = supermercati Torinesi

Houet M.N.(2001) Webzine Sanità Pubblica Veterinaria

La vendita di pesce allevato come pescato rappresenta una frode commercialeGli acidi grassi sono un possibile marker?

Pesce allevato/pescato

Acido ArachidonicoC20H32O2

Acido LinoleicoC18H32O2 Acido Docosaesaenoico (DHA)

C22H32O2

Acido Eicosapentaenoico (EPA)C20H30O2

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Estrazione

Acquisizione in negativo [M-H]-

5g di pesce+

10ml n-esanoProdotti ittici analizzati:

Orate, Branzini

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

Risultati preliminari

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Branzini DHA/AA

allevato pescato

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

0

2

4

6

8

10

12

OrateDHA/AA

allevato pescato

Ottenuti con la sola spremitura meccanica a basse temperature (max 27°)

Olio extravergine di oliva: contenuto in acidità inferiore allo 0.8%

Olio vergine di oliva: acidità fino al 2%

Olio lampante e derivati olio ricavato dalle olive raccolte da terra quindi molto mature e con alto grado di acidità

Olio di oliva vergine lampante: ottenuto mediante spremitura meccanica, presenta alta acidità o altri difetti organolettici

Olio di oliva rettificato: prodotto della rettificazione chimica dell'olio lampante, volta ad eliminarne il contenuto in acidità; mancano totalmente i tipici sapori e profumi dell'olio d'oliva

Olio di oliva: composto di oli raffinati e oli di oliva vergini con acidità non superiore all'1% (la direttiva non fissa una percentuale minima di olio vergine!)

Classificazione dell’olio di olivaL'olio d'oliva è considerato uno dei prodotti agricoli italiani più importanti e rappresenta un prodotto di eccellenza importante sia in termini di benessere che di economia.

3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati)

Ottenuti da lavorazioni chimiche o da scarti di lavorazione (deacidificazione, decolorazione, deodorazione) o con miscele di oli raffinati e vergini

Olio di sansa e derivati La sansa è ciò che resta dopo l'estrazione dell'olio. Contiene ancora delle piccole quantità di olio. L'olio di sansa non è commestibile ma viene deodorato, decolorato e deacidificato e solo dopo l'aggiunta di una certa quantità di olio di oliva vergine diventa commestibile.

Olio di sansa di oliva greggio: ottenuto dai residui della spremitura mediante solventi chimici

Olio di sansa di oliva rettificato: olio di sansa greggio sottoposto ad una ulteriore rettificazione chimica

Olio di sansa di oliva: olio di sansa rettificato miscelato con olio vergine

Classificazione dell’olio di oliva3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati)

Le principali frodi sull’olioolio extravergine che contiene oli raffinati, sia di oliva che di semi (taglio).

Oli con tenori analitici non rispondenti ai requisiti previsti dai regolamenti comunitari (ad esempio un'acidità superiore ai limiti previsti per quella determinata categoria).

Oli annacquati

Oli di semi variamente colorati venduti come oli di oliva (soprattutto quello di mandorla e di arachide).

Oli non corrispondenti all’etichetta

Le nuove frodi dell’olio extra vergine: deodorazione, cambio di origine e di etichetta«Il Fatto alimentare»-2015

3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca e metodi accreditati)

Diluizione

Acquisizione in negativo [M-H]-

10ul di olio+

1ml isopropanolo

Metodo di screening per identificazione oli

2. Applicazioni della spettrometria di massa accoppiata a DSA (metodi di ricerca)

picco ricorrente

Campioni analizzati-40 extravergini-20 oliva raffinati-15 semi

X= molecola incognita

Acido LinoleicoC18H32O2

Acido OleicoC18H34O2

Analisi semi-untargeted3. Identificazione Oli di oliva (metodi di ricerca)

Il regolamento europeo n. 2568/91 (e s.m.i ) definisce le caratteristiche e i parametri dell'olio d'oliva e i metodi per la differenziazione degli oli, al fine di rilevare l'adulterazione.

Prova di Wood

Acidità libera

Quantità di iodio

Numero di perossidi

Spettrofotometria

Gascromatografia

Metodi ufficiali per identificazione oli 3. Identificazione Oli di oliva (metodi accreditati)

Determinazione dell'aciditàSi misura mediante titolazione. Si esprime come percentuale in acido oleico

(grammi di acido oleico in 100 grammi di campione)

Determinazione del numero di perossidiSi misura mediante titolazione. Si esprime in milliequivalenti di

ossigeno attivo per kg di olio.Un aumento del numero di perossidi indica aumento dei processi ossidativi

Ricerca di dieni e trieni con spettrofotometria UVSi misura mediante letture UV a 232 nm e 268 nm.

Si esprime come coefficiente di estinzione specifica KUn aumento di tale valore può indicare fenomeni ossidativi.

3. Identificazione Oli di oliva (metodi accreditati)Metodi ufficiali per identificazione oli

Categoria olio d’oliva Kƛ 232 Kƛ 268 ΔK Acidità % N° perossidi meq O2/KgOlio d’oliva extra vergine ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 ≤ 0,8 ≤ 20

Olio d’oliva vergine ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 ≤ 2,0 ≤ 20

Olio d’oliva lampante — — -— > 2,0 —

Olio d’oliva raffinato — ≤ 1,25 ≤ 0,16 ≤ 0,3 ≤ 5Olio d’oliva composto da oli d’oliva raffinati e oli d’oliva

vergini

— ≤ 1,15 ≤ 0,15 ≤ 1,0 ≤ 15

Olio di oliva di sansa greggio — — — - —

Olio di oliva di sansa raffinato — ≤ 2,00 ≤ 0,20 ≤ 0,3 ≤ 5

Olio di sansa di oliva — ≤ 1,70 ≤ 0,18 ≤ 1,0 ≤ 15

Limiti di riferimentoREG UE 2095/2016 del 26/09/2016 GU L 326 del 01/12/2016

3. Identificazione Oli di oliva (metodi accreditati)

2017

10%

PRISA/NAS

35%

Metodi ufficiali per identificazione oli

2016

2017

OLIO DI FRITTURAOli e grassi sottoposti a trattamenti termici

Trasformazioni della loro composizione chimica

Aumento dei composti polari

4. Ricerca dei composti polari in oli di frittura (metodo accreditato)

Implicazione sanitaria

COMPOSTI POLARI < 25 g/100 g

TECNICHE DI ANALISI DEGLI OLI DI FRITTURA

METODO UFFICIALE (Circ. MINSAN 11.1.9 n.1): determinazione dei composti polari mediante

cromatografia su colonna

METODI RAPIDI DI SCREENING test colorimetrici

4. Ricerca dei composti polari in oli di frittura (metodo accreditato)

B = 29 g/100 gA = 22 g/100 g

A B30%

2017

Frodi commerciali in uova e ovoprodottiTMC > 28 gg

lavate non dichiaratecomunitarie o extra vendute come italiane

falsa dichiarazione del metodo di allevamentofalsa dichiarazione di biologico

annacquamento miscela fresco-congelato

uso di uova di specie diverseFrodi sanitarie in uova e ovoprodotti

sporche e incrinatecon residui di farmaci/ insetticidi (fipronil)

lavate o refrigerateuso di sostanze per correggere il pH

miscela vecchio / nuovo impiego di uova vecchie (alta carica batterica) o

decomposte, non idonee al consumo

5, Ricerca acido lattico in uova ed acido butirrico ovoprodotti (metodi accreditati)

UOVA E OVOPRODOTTI

Regolamento 853/2004

Acido 3-idrossi butirrico

Il tenore di acido 3-OH-butirrico non deve essere superiore a 10 mg/kg di ovoprodottopastorizzato allo stato di materia secca

È indicativo dei prodotti del metabolismo microbico e della decomposizione; la determinazione della sua concentrazioneserve a rilevare l'utilizzo di uova incubate o decomposte

È il prodotto della fermentazione del lattosio ad opera dell'attività microbica. La sua concentrazione è correlata alla carica batterica totale e rappresenta un utile indicatore del buono stato di conservazione delle uova

Acido Lattico

Il tenore di acido lattico delle materie prime impiegate non deve essere superiore a 1 g/kg di materia secca

5. Ricerca acido lattico in uova ed acido butirrico ovoprodotti (metodi accreditati)

ConclusioniOlio di frittura

Identificazione oli

Deterioramentouova

Identificazione oliColoranti vietati

in matrici alimentari

Freschezza prodotti ittici

Pescato/allevato

RingraziamentiS.S. Genetica ed ImmunobiochimicaDr. Acutis Pier LuigiDr.ssa Sciuto SimonaDr.ssa Dell’Atti LuanaDr.ssa Maniaci Maria GraziaSig.ra Veronese Ida

Dr.ssa Tarasco RenataDr.ssa Martucci Francesca