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Tecniche molecolariper lo studio degli

acidi nucleiciProf.ssa Flavia Frabettiaa. 2010-11

(Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio)

Estrazione acidi nucleici (DNA o RNA)

Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio

Amplificazione o clonaggio molecolare

Sequenziamento degli amplificati

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pozzetti

28S (5000 basi)18S (2000 basi)5S+tRNA(100 basi)

Estrazione acidi nucleici: DNA o RNA

Verifica su gel elettroforesi della qualità e quantità di DNA o RNAestratti

Se si vuole studiare l’mRNA si procede preventivamente allaRETROTRASCRIZIONE da RNA e cDNA:

cDNA

RNA

cDNADNA copia o complementare

Trascrittasi inversa oDNA polimerasi -RNA dipendente

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Amplificazione o clonaggio molecolareCapacità di replicare, ottenere tante copieovvero clonare - specifici frammenti di DNAe di produrne in grandi quantità.

Metodo generale consente di purificare estudiare qualsiasi sequenza di DNA

Il clonaggio può essere realizzato con 2 modalità:1) Clonaggio genico con sistemi cellulari(in vivo)2) Reazione di Polimerizzazione a Catena o PCR(in vitro)

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PCR

"PCR has transformed molecular biology through vastlyextending the capacity to identify, manipulate and reproduce

DNA. It makes abundant what was once scarce -- thegenetic material required for experimentations."

Paul RabinowMaking PCR, A Story of Biotechnology, University of Chicago Press, 1996

PCR o reazione di polimerizzazione a catena

Kary Mullis premio Nobel per la chimica 1993

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• Amplificazione esponenziale di DNA.Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1milione di volte

• Permette di “estrarre” un piccoloframmento specifico di DNAdall’intero contesto in cui è immerso

• Semplice realizzazione• Estrema versatilità

Fine anni ‘80

1) DNA stampo che contenga la regione da amplificare

2) DNA polimerasi termostabile (non viene denaturata se portata a 95° C)

3) I 4 desossinucleotidi trifosfati (dNTPs)

4) Un buffer contenente Mg2+

5) Due oligonucleotidi complementari a due regioni chesi trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai latidella regione che si vuole amplificare

Elementi della reazione:

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Ogni ciclo consiste di tre fasi:

1- DENATURAZIONE: t 94°C. Il DNA stampo viene denaturato

2-APPAIAMENTO (annealing): t 40-60°C. I primers si appaiano con il DNA stampo in base alle sequenze specifiche

3- SINTESI: t 72°C Questa temperatura è ottimale per il funzionamento ad es. della Taq polimerasi (Thermus aquaticus)

Il processo di PCR prevede un certo numero di cicli di reazione.

S&R Fig. 6.1

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Verifica dei prodotti di PCRsu gel di agarosio

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Ottimizzazione della PCR• Concentrazione di Mg2+importante cofattore della

polimerasi• Scelta dell’enzima (ci sono diverse polimerasi, alcune

con la capacità di “correggere le bozze”cioè con attivitàesonucleasica 3′-5′) e sua concentrazione

• Progettazione dei primers, il primer senso è detto ancheforeward, l’antisenso è detto anche reverse

• Quantità e qualità dello stampo• Parametri dei cicli• Cross-contaminazioni con altri acidi nucleici; es. si può

evitare progettando i primer su esoni diversi

Progettazione PCR1) Scegliere la strategia (stampo DNA o RNA)2) Dimensioni della regione da amplificare (da 100bp a 5Kb max): la

migliore resa attorno a 1,5 Kb3) Usare programmi per progettare i primers nella regione scelta o le

regole generali: validità biochimica. I primers hanno lunghezzaminima di 22 n, con una composizione del 45-55% di CG. Meglio seal 3′ si trova una C o una G. La composizione in basi influirà sulla tdi annealing che si calcola empiricamente così: (4°C x numero diCG+ 2°x numero di AT)+2 o 3 gradi

4) Verificare la validità "biologica" dei primers tramite il softwareBLASTN che consente di ALLINEARE i primer con tutte lesequenze depositate online, per cercare eventuali somiglianze conaltre zone oltre quella attesa, nella stessa regione o nell'intero genoma

5) Verificare la sequenza del prodotto di amplificazione previsto

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PCRVANTAGGI:• Sensibilità e rapidità• Analisi simultanea di molti campioni• Analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione• Analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato

SVANTAGGI:• Sensibilità (rischio di contaminazioni-falsi positivi)• Efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificaree messa a punto delle coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)• Può sintetizzare frammenti relativamente corti (< 5000 bp)• La sintesi è imprecisa e può introdurre errori nella sequenza(la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:PCR in seguito a retrotrascrizione (RT-PCR)

1) Estrazione dell’RNA2) Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA): si può

omettere mettendo primer poli-T per innescare la sintesidi cDNA da parte della trascrittasi inversa

3) Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa (DNApolimerasi RNA-dipendente

AAAAAAAA 3’5’TTTTTTTT 5’3’

mRNA

cDNA

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PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:PCR in seguito a retrotrascrizione (RT-PCR)

AAAAAAAA 3’5’TTTTTTTT 5’3’

mRNA

cDNA

• Amplificazione della sequenza di interesse con oligonucleotidi diinnesco specifici

AAAAAAAA 3’TTTTTTTT 5’3’

5’ 3’

5’3’

• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)

Applicazioni della PCR

• Tipizzazione di marcatori genetici• Screening mutazionale di mutazioni non caratterizzate• Identificazione di mutazioni puntiformi• Clonaggio di cDNA e DNA genomico• Sequenziamento del DNA• Mutagenesi in vitro• Studi di espressione genica

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RT-PCR utilizzata per quantificare unospecifico mRNA

• Reazione analizzata a compimento: PCR semiquantitativa (controllo interno)

• Reazione analizzata in tempo reale(real time PCR)= QUANTITATIVA

(Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio)

Estrazione acidi nucleici (DNA o RNA)

Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio

Amplificazione o clonaggio molecolare

Sequenziamento degli amplificati

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Sequenziamentoautomatico

SEQUENZIAMENTOQuesta tecnica ha subito il maggiore avanzamento negliultimi anni tanto che già costituisce, e sempre di più lofarà, uno dei principali metodi diagnostici nella routinemedica.Ora si parla già di NGS (next generation sequencing)

automazione delsequenziamento

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Il sequenziamento automatico• Si basa sul metodo di Sanger (1977) con alcune piccole

modifiche• E’ una reazione di polimerizzazione, ma con un singolo

primer (dunque lineare)Componenti:

1) Stampo (es. un amplicone

=prodotto della PCR)

2) Un solo primer

3) La polimerasi

4) dNTPs +

5) didesossinucleosidi trifosfati(ddNTPs).

Cosa sono i didesossinucleosidi trifosfati ?

Definizione: un desossinucleotide che manca del gruppoidrossilico in 3´OH ed è perciò incapace di formare unlegame 3´-5´ fosfodiesterico necessario per l’allungamentodella catena. Quando viene casualmenteincorporato nella polimerizzazione la catena qui si blocca.

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Metodo di Sanger con ddNTP radioattivi messi in 4miscele diverse

Nel sequenziamento automatico i didesossinucleosidi trifosfati sonoognuno coniugato con un fluorocromo diverso che viene eccitatodal laser man mano che i frammenti migrano attraverso il gel.

A = verde, T = rosso, C = blu, G = nero

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Confronto tra il sequenziamento automatico (A) edil metodo di Sanger (B)

A

B

4 colori/1 lane (A) versus 1 colore/4 lane (B)

Confronto tra i due metodi

La lettura dei picchi è fatta a partire dai frammentipiù piccoli che migrano di più a quelli più grandi.Ogni frammento differiràdi 1 nucleotide solocosì da rendere possibilela lettura sequenzialedel campione.

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Ancora un altro esempio…

più piccolo

più grande Per sequenziare, leggerein ordine le basi dal piùpiccolo al più grande deiframmenti

TCGAAGACGTATC

Fibrosi cistica:es. di mutazione in eterozigosi332C>T (sostituzione aa. P67L)

es.:Una delezione di una singola base3659 del C nell’esone 19.La sequenza che segue la delezionerisulta confusa poiché riflette lasovrapposizione delle sequenze deidue alleli in eterozigosi (gli stampisono sfasati nella lettura). Lamutazione andrebbe confermatasequenziando anche il filamentoantisenso.Da Strachan e Read: Genetica umana molecolare