Sviluppo e Ottimizzazione di un metodo LC-MS/MS applicato...

Sviluppo e Ottimizzazione di un metodo LC-MS/MS applicato alla determinazione di cianotossine

in campioni d’acqua destinata e da destinare al consumo umano

Federica Nigro Di Gregorio

Reparto Igiene delle Acque Interne Dip. Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria

“ Aggiornamento di procedure di campionamento e test in situ,

implementazione di sistemi analitici per la determinazione

di tossine acquatiche e cianotossine “

Foggia, 7-8 febbraio 2012

\

LC-MS

\

Conforme ai criteri normativi

-limite di rivelazione < 0.1 µg/L -accuratezza e precisione idonei allo scopo

-rapido -automatizzabile

MCs

R1

R2

Dem-MC-RR Arginina Arginina

MC-RR Arginina Arginina

MC-YR Tirosina Arginina

Dem-MC-LR Leucina Arginina

MC-LR Leucina Arginina

MC-LA Leucina Alanina

MC-LY Leucina Tirosina

MC-LF Leucina Fenilalanina

MC-LW Leucina Triptofano

\

Analiti selezionati

Nodularina

(STANDARD INTERNO)

H

HCH3

H

CH3

H

H

NH

CH3

HO

NH

COOHH

N

O

CH3

CH2

NH

O

CH3

H

R1

O

R2

O

NH

H CH3

COOHH

CH3

O

(5) Adda

(6) D-Glu (7) N-metildeidroalanina

(Mdha)

(1) D-Ala

(3) D-eritro--metilAsp

\

LC-MS

Conservazione e pretrattamento del campione -bottiglie di polietilene o vetro scuro -temperatura 1-10º -conservazione al buio

Tossine intracellulari

isolamento delle cellule (filtrazione)

estrazione previa lisi cellulare (congelamento-scongelamento, ultrasuoni)

in presenza di solvente organico

Tossine extracellulari o libere

isolamento degli analiti in soluzione acquosa: SPE

filtri 0.45 mm Tossine totali

intracellulari + libere Filtri a fascia nera

Congelamento

scongelamento

\

1) 0,5 L campione di acqua +1µg/L di Nodularina 2) PRECONCENTRAZIONE DEGLI ANALITI

3) RI-ESTRAZIONE

DEGLI ANALITI

Eluizione:

1 mL CH3OH + 6 mL

CH2Cl2/CH3OH (80:20

v/v) 10 mmol/L TFA

4)- evaporazione a 50°C

-ricostituzione del residuo

-iniezione 50/1000 estratto finale

Cartucce SPE (Carbograph 4)

0,5 L campione di acqua +1µg/L di Nodularina

Filtrazione del campione di acqua (filtri a fascia nera)

Iniezione diretta (100 µl di campione)

Metodo di conferma: fornisce informazioni

per l’identificazione e la quantificazione di

tossine in esame

sistema estremamente sensibile (limite

inferiore di rivelabilità intorno al picogrammo)

Tossine di origine algale e da cianobatteri

sviluppo di sistemi API alla fine degli

anni ’80

utilizzo nel settore analitico

ambientale nell’ultimo decennio:

Sistema di

separazione

cromatografica

Sorgente

di ioni

Analizzator

e di massa Rivelatore

Presentazione

del segnale

Elaboratore

di segnale

Campione

A B C

m/z

\

LC-MS

Informazioni

strutturali e

proprietà chimiche

della molecola

Filtro Q1

Cella di collisione

Q2

Filtro Q3

Spettrometro di massa: API 3000 triplo quadrupolo

(AB-Sciex)

Sorgente: Atmospheric Pressure Ionization (API)

Interfaccia: Turbo IonSpray® (TIS)

15 © 2009 Applied Biosystems

LC

High Voltage

Nebulizer

Gas

Atmospheric pressure Vacuum

Formation of

charged droplets

Evaporation

(TurboV heaters)

Coulomb-

Explosion Exhaust

Curtain Gas

Curtain Gas

Mass Analyzer

Orifice

TurboV

heaters

Turbo V™ Source: ESI

Curtain Gas Interface

DP SK CUR

N2


Q0


DP SK CUR

N2


Q0

+

+

+

+

+

+


DP SK CUR

N2


Q0

+

IONIZZAZIONE

\

Identificazione certa con MS_ Identification point (Ips)

Q1 scan: full scan (Start – Stop)

Soluzione standard di

MC-dem-RR 5 ng/µL

Ione molecolare protonato

Analisi LC-MS/MS di microcistine

Continuous Ion Flow

Q1= Resolving Q3 = Scanning

Production Ion Scan (MS/MS)- Frammentazione

Utilizzato per l’identificazione

di ioni prodotti

Dopo l’identificazione lo ione precursore

viene inviato nella cella di collisione e

viene frammentato.

Q1 è fisso, filtra lo ione prursore selezionato

Q3 seleziona in range di masse stabilito, gli

ioni prodotti

Continuous Ion Flow

Q1= Resolving Q3 = Scanning

Production Ion Scan (MS/MS)- Frammentazione

Ione frammento

CE=30

Ione frammento

CE=60

MRM ( Multiple Reaction Monitoring)

DP, volt

Precursor Ion Scan

O C H 3

+ + O C H 3

+ + N2

N2

N2

O C H 3

+ +

IDENTIFICAZIONE MCs IN FULL-SCAN

Collision cell Q1 Q3

\

LC-MS

Colonna

Alltima C18

(2.1x250 mm,

ID 5µm)

Temperatura

40°

Flusso

200 µL/min

Volume

iniettato

50 µL

Fase mobili

ACN 10 mM HCOOH

H2O 10 mM HCOOH

Cromatogramma LC-MS/MS in modalità MRM risultante da un’iniezione di 0,5 L di un campione di acqua deionizzata contaminato con 0,1 µg/L di una miscela degli analiti oggetto di studio e 1 µg/L dello standard di processo

Cromatogramma LC-MS/MS in modalità MRM risultante da un’iniezione di 0,5 L di un campione di acqua deionizzata contaminato con 0,1 µg/L di una miscela degli analiti oggetto di studio e 1 µg/L dello standard di processo

MC-dem-RR>213 (diagnostic TRANSITION)

MC-dem-RR>135 (quantifying TRANSITION)

O

NH2

OH

Composto Massa esatta,

(m/z)

Transizioni, (m/z) e abbondanze relative

166 91 166 107 166 131 166 149

Phe 165.191 2.2% 34.4% 50% 13.4%

Ana-a 165.234 9.7% 10.5% 27% 52.8%

CH3

O

NH

Anatoxin-a (neurotossina algale)

Fenilalanina

(amminoacido)

Conclusioni

Sviluppo e validazione di un metodo analitico di conferma per la valutazione del rischio da esposizione a microcistine in acque potabili

in distribuzione

Determinazione di 12 congeneri di Cianotossine

LOD :0.002-0.013 µg/L

Modello di approccio generale per la gestione delle emergenze correlate a proliferazione di

cianobatteri potenzialmente tossici nella filiera di produzione di acque destinate a consumo umano

Controllo Ricerca (studi ambientali, efficienza dei trattamenti,

prevenzione dei fenomeni)

Sviluppo e Ottimizzazione di un metodo LC-MS/MS applicato...

Documents

Transcript of Sviluppo e Ottimizzazione di un metodo LC-MS/MS applicato...