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Studenti in laboratorioEsperimenti di biologia molecolare e bioinformatica

Cinzia Grazioli Cristina Gritti Paolo Plevani Giovanna Viale

SCIENZE


Cinzia Grazioli Cristina GrittiPaolo Plevani Giovanna Viale

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Prima edizione gennaio 2012

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SCIENZE

Grazioli Gritti Plevani Viale STUDENTI IN LABORATORIO copy Zanichelli 2012

Chi egrave il colpevole

Identificazione degli OGM

Sano o malato

Clonaggio del DNA bianco o blu

Mais blu dal fenotipo al genotipo

Analisi cromosomiche

Anche i geni possono diventare reporter

Separazione e colorazione di proteine

Surfing tra i genomi

Il codice a barre del DNA

Le forme invisibili

I nostri geni su un microchip

APPENDICE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1

9

19

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103

113

INDICE


In sette anni di lavoro allrsquoUniversitagrave degli Studi di Milano il CusMiBio (Centro Universitagrave ndash Scuolaper la diffusione delle Bioscienze e delle Biotecnologie) ha sviluppato un progetto di collegamento traricerca e scuola per rispondere alla sempre crescente esigenza di aggiornamento della cultura scienti-fica e tecnologica che emerge dal mondo della scuola italiana

Fare unrsquoesperienza di laboratorio durante il percorso scolastico egrave unrsquooccasione unica e indimenticabileche perograve si presenta raramente ed egrave per lo piugrave accessibile solo a pochi studentiEgrave indubbio infatti che indossando un camice bianco e guanti da laboratorio imparare la biologiaegrave molto piugrave interessante e stimolante I capitoli di questo libro offrono la possibilitagrave di conoscere edi provare direttamente la metodologia e le tecniche della ricerca scientifica in campi drsquoavanguardiacome la genetica la biologia molecolare e la bioinformatica

Partendo sempre da uno scenario reale e attuale gli studenti si trovano di volta in volta ad affrontareun problema diverso e sono stimolati a cercare una soluzione allestendo un esperimento a osservare ediscutere criticamente i risultati ottenuti ad applicare cioegrave il metodo scientifico proprio come si fa in unvero laboratorio di ricerca

Presentazione


I diversi capitoli riguardano

1 CHI Egrave IL COLPEVOLE Determinazione del ldquopro-filo del DNArdquo per stabilire lrsquoidentitagrave personalea livello molecolare e identificare lrsquoautore di unreato

2 IDENTIFICAZIONE DEGLI OGM Che cosrsquoegrave un or-ganismo geneticamente modificato (OGM) ecome si produce Come egrave possibile stabilire seuna pianta egrave stata geneticamente modificata me-diante lrsquoinserimento di un gene estraneo

3 SANO O MALATO I polimorfismi di restrizionedel DNA per la diagnosi di alcune malattie gene-tiche

4 CLONAGGIO DEL DNA BIANCO O BLU Come tra-sformare un batterio con un plasmide ldquoricombi-nanterdquo che contiene un tratto di DNA esogenolrsquoingegneria genetica come strumento della ricer-ca e le sue applicazioni biomediche

5 MAIS BLU Dallrsquoosservazione dei fenotipi dipiante di mais fatte germinare in classe allrsquoanalisidel loro genotipo a livello molecolare uno stru-mento nuovo per spiegare le leggi di Mendel

6 LE ANALISI CROMOSOMICHE Per conoscere lemetodologie usate in citogenetica umana per lostudio dei cromosomi e imparare a riconoscere einterpretare cariotipi normali e patologici

7 ANCHE I GENI POSSONO DIVENTARE ldquoREPORTERrdquoCome utilizzare i geni nei vari ambiti della biolo-gia per esempio nel monitoraggio ambientale

8 COLORAZIONE E SEPARAZIONE DI PROTEINECome si puograve eseguire unrsquoanalisi delle proteinepresenti in un tessuto o in una popolazione se-lezionata di cellule Come si possono studiare lemodificazioni e variazioni delle proteine in rispo-sta a modifiche ambientali

9 SURFING FRA I GENOMI Esplorare il genomaumano navigando fra le informazioni contenutenelle banche dati on line confrontare lrsquoorganizza-zione e le caratteristiche di genomi di organismidiversi scoprendo le corrispondenze esistenti frai cromosomi umani e quelli di altri esseri viventitrovare un gene allrsquointerno del genoma e scoprir-ne la struttura e la funzione

10 IL CODICE A BARRE DEL DNA Un nuovo mododi classificare gli organismi che permette di di-stinguere le varie specie animali a cavallo fra bio-diversitagrave e bioinformatica per scoprire lrsquoutilitagrave diquesto nuovo strumento e le sue applicazioni

11 LE FORME INVISIBILI Dalla cristallizzazione diuna proteina ai metodi per determinarne la strutturamolecolare allrsquoosservazione del cristallo con un sof-tware dedicato la medicina del futuro si fa in 3D

12 I NOSTRI GENI SU UN MICROCHIP La simula-zione di una tecnica di incredibile potenza perstudiare quando come e dove si esprimono i genie cercare di riuscire a capire le basi molecolari deiprocessi biologici normali e patologici

In un capitolo a parte per ogni esperimento egrave for-nito il protocollo e lrsquoelenco della strumentazionedei materiali e dei reagenti necessari

Presentazione



Esercitazione n 1

1

1 Chi egraveil colpevole

Lrsquoesperimento illustrato riguarda lrsquoidentificazione personale

attraverso il test del DNASi procederagrave allrsquoanalisi di brevi sequenze di nucleotidi dette microsatelliti presentinel DNA dei campioni in esame queste sequenze amplificate con la tecnologia della PCRsono separate mediante elettroforesi su di un particolare substrato di gel (agarosio)Il risultato finale consiste nella visualizzazione di una sorta di codice a barre univoco e diversoper ciascun individuo

Il problema dellrsquoidentificazione personaleI piccoli rilievi presenti sui polpastrelli delle no-stre dita sono unici per ciascuno di noi e permet-tono di distinguerci lrsquoun lrsquoaltro sin dalla nascitaSi chiamano impronte digitali e sono notefin dallrsquoantichitagrave infatti i babilonesi le usavanocome firma in fondo alle tavolette di argilla frescasu cui scrivevano le leggi dello stato Giagrave Quinti-liano nella Roma antica aveva usato le improntedigitali per trovare lrsquoassassino di una donna nel1902 per la prima volta esse furono presentatecome capo drsquoaccusa in unrsquoaula della corte ingleseper incastrare uno scassinatore che aveva lascia-to la propria impronta sulla vernice fresca dellafinestra vicino alla cassaforte Da allora ladri ecriminali consapevoli della possibilitagrave di esserericonosciuti dalle impronte sono soliti indossarei guanti per evitare di essere identificati Ma nonbasta piugraveDal 1986 anno in cui per la prima volta vieneusata lrsquoimpronta genetica scritta nel DNA percondannare un assassino anche i criminali piugraveaccorti hanno di che preoccuparsi mediantelrsquoanalisi genetica infatti si puograve effettuare un nuo-

vo tipo drsquoidentificazione detta ldquofingerprinting delDNArdquo o ldquotest del DNArdquoIl fingerprinting del DNA egrave una tecnica di Gene-tica molecolare utilizzata in tutti quei casi medicio forensi in cui egrave necessario effettuare lrsquoidentifi-cazione di un individuo Oltre che nei laboratoridi ricerca in Genetica molecolare questa tecnicaegrave usata nei laboratori di Medicina legale di tuttoil mondo Puograve essere applicata allrsquoidentificazionedi materiale per attribuirne lrsquoappartenenza a vitti-me o sospetti come succede nei casi di incidentiaerei delitti stupri o anche alla determinazionedi relazioni familiari come la paternitagrave Questatecnica consente di produrre il profilo genetico diun individuo partendo da quantitagrave molto piccoledi materiale biologico anche non perfettamenteconservato Egrave sufficiente una quantitagrave minima dicellule come un capello con il bulbo le tracce disaliva su un bicchiere o su una sigaretta per potereffettuare il testIl test del DNA si basa sullrsquoanalisi di particolarisequenze nucleotidiche denominate microsa-telliti presenti nel genoma di ogni individuodal campione in esame viene estratto il DNA e

Esercitazione n 1

Conoscenzepropedeutiche

Struttura del DNAConcetti digene locus alleleElettroforesiPCR


Manuale di laboratorio

2

mediante la tecnica della Polymerase Chain Re-action (PCR) vengono amplificate le regioni re-lative ad alcuni microsatelliti i prodotti della PCRsono poi analizzati tramite elettroforesi (fig 11)

Un porsquo di teoria - Tutti uguali tutti diversiIl sequenziamento completo del genoma dellrsquouo-mo e di molti altri organismi eucariotici ha per-messo di ottenere un quadro dettagliato della suastruttura e organizzazione (fig 12)Una delle osservazioni piugrave sorprendenti emersedal sequenziamento del genoma umano egrave che ilnumero dei geni (il cui ordine di grandezza tralrsquoaltro egrave sostanzialmente conservato anche tragenomi di diversa dimensione e complessitagrave) egravemolto minore di quanto ci si attendeva 20 000 -23 000 geni Altra osservazione sorprendente egraveche le sequenze codificanti occupano solo circa il2 di tutto il genoma umano mentre il restante 98contienesequenzenoncodificanti Il sequenziamen-to del genoma umano ha confermato che il DNAnon codificante extragenico egrave prevalentemente co-stituito da DNA ripetitivo cioegrave da sequenze di basipiugrave o meno brevi ripetute in tandem (testa-coda)molte volte e presenti in blocchi distribuiti in vari siti(loci) sui diversi cromosomi (fig 13) Queste ripeti-zioni sono presenti per lo piugrave a livello dei centromeri(DNA satellite costituito da sequenze di 5-50 paiadi basi ripetute fino a un milione di volte) e dei telo-meri (DNA minisatellite costituito da sequenze di6-100 paia di basi ripetute migliaia di volte)

Lungo i bracci dei cromosomi si localizza unafrazione particolare del DNA ripetitivo quelladei cosiddetti microsatelliti (monomeri di 1-5paia di basi ripetuti 10-30 volte) detti anche STR(Short Tandem Repeats) Gli STR presenta-no un elevato grado di polimorfismo allrsquointernodella popolazione umana in quanto il numerodi ripetizioni allrsquointerno di uno specifico sito (lo-cus) puograve essere diverso da individuo a individuoQuesto tipo di polimorfismo egrave un polimorfismodi lunghezza i diversi alleli cioegrave differiscono peril numero di ripetizioni e quindi hanno lunghez-ze diverse (fig 14)

DNA extragenico70

DNA genico30

DNA codificante2

Genoma nucleare aploide3300 Mb

DNA non codificante28

sequenze ripetute sequenze uniche

pseudogeniintroni sequenze di

regolazione eccsequenze ripetute

in tandemsequenze ripetute

sparse

DNAsatellite

DNAminisatellite

DNAmicrosatellite

Figura 11

Fotografia del risultatodi una elettroforesi su gel drsquoagarosiocon la distribuzione delle bande deimicrosatelliti di due individui diversi

Figura 12

Organizzazione del genoma umano

Figura 13

Distribuzione nel cromosomadelle diverse classi di DNA ripetitivo

Telomero (unitagrave ripetute in tandem

del minisatellite TTAGGG)

Lunghezza di diverse kb (migliaia di basi)

Centromero (vari componenti di DNA satellite)

Lunghezza di diverse Mb (milioni di basi)

Microsatelliti (ampiamente distribuiti

nei vari cromosomi)

DNA minisatellite ipervariabile

(particolarmente nelle regioni vicine ai telomeri)


Esercitazione n 1

3

Il polimorfismo del DNADue genomi umani differiscono in media traloro di circa 1 base ogni 500-1200 paia di basi(SNP Single Nucleotide Polymorphism)Ognuno di noi egrave quindi un ldquounicumrdquo Questa va-riabilitagrave egrave distribuita sia nella parte codificantedel genoma che nella parte non codificante (ge-nica ed extragenica)La variabilitagrave genetica egrave introdotta dalle mutazio-ni che generano nuovi alleli (forme alternative diuno stesso gene) nelle popolazioni Un gene conpiugrave alleli nella popolazione egrave detto polimorficoPer alcuni geni il numero di alleli identificati puograveraggiungere le centinaia Ricordiamo che tutte lecellule somatiche di un singolo individuo sonodiploidi portano cioegrave 2 alleli di uno stesso geneuno proveniente dal padre e uno dalla madre

lrsquoindividuo saragrave omozigote se porta due alleliidentici eterozigote se porta due alleli diversiSi definiscono alleli sia le forme alternative dello stes-so gene (ad esempio le varianti normali e patologichedel gene della β-globina umana) sia le 4 possibili for-me di un SNP (una per ogni base azotata del DNA)Nel primo caso la diversitagrave allelica puograve corrisponderea una diversitagrave fenotipica (nel nostro esempio un in-dividuo sano eterozigote o affetto da una globino-patia associata a una variante patologica della catenaβ dellrsquoemoglobina) nel secondo caso se il SNP egrave inuna sequenza non codificante quella differenza fradue individui saragrave riscontrabile solo a livello genoti-pico ossia analizzando la sequenza del DNA

Figura 16

Schema del cariogramma umanocon evidenziati i marcatori microsatellitiutilizzati dal sistema CODIS

Figura 14

In questo esempio la ripetizione CA (citosina adenina) presentein un particolare locus cromosomico ha tre forme alleliche di 1519 e 21 ripetizioni

Per saperne di piugraveLA DATTILOSCOPIA E IL PROTOCOLLO CODIS

su 1010) LrsquoInterpol e molte polizie nazionali tracui quella italiana hanno accesso alle banchedati in cui egrave raccolta unrsquoenorme e crescentequantitagrave di impronte e sono in grado di effettuarein tempo reale comparazioni veloci e probantiLrsquoAFIS (Automated Fingerprint Identification

System) egrave un sistema hardware e software chenasce dalla necessitagrave di ridurre i normali tempidi acquisizione catalogazione e confronto delleimpronte esso egrave consultabile da tutte le nazionicompresa lrsquoItalia (fig 15)Anche per lrsquoimpronta genetica si ricorreallrsquoindividuazione di piugrave sequenze dimicrosatelliti Secondo un protocollo (CODISCombined DNA Index System) stabilito dallrsquoFBIe universalmente riconosciuto valido vengonoprese in considerazione 13 sequenze microsatellitidi cromosomi autosomici e 1 sequenza allrsquointernodi un gene presente sui cromosomi sessuali perstabilire il sesso dellrsquoindividuo da cui proviene ilmateriale biologico (fig 16) Seguendo questaprocedura si ha la probabilitagrave di uno su unmilione di miliardi (1 su 1015) che lo stesso DNAappartenga a due individui contemporaneamenteLa distinzione fra gemelli monovulari che hannolo stesso DNA e sono quindi indistinguibili conil fingerprinting egrave possibile solo in base allediverse impronte digitali

La dattiloscopia egrave la scienza che studia le crestecutanee papillari principalmente dei polpastrellidelle dita per stabilire lrsquoidentificazione personaleI disegni papillari infatti non si alteranodurante la vita di un individuo ma rimangonoimmutati dal momento della loro formazioneche avviene intorno al terzo mese di vitaintrauterina solo in caso di eventi traumatici(ad esempio lrsquoasportazione in profonditagrave delderma) o a seguito di particolari malattieinfettive della pelle le impronte digitali possonoalterarsi Per il riconoscimento e lrsquoattribuzionedi una impronta a un determinato individuosono presi in considerazione punti particolarisulle creste papillari che nel confronto devonocoincidere perfettamente Secondo la Corte diCassazione due impronte appartengono allamedesima persona se hanno in comune 16-17punti egrave stato calcolato che in questa condizionela probabilitagrave di errore cioegrave che lrsquoimprontaappartenga a una persona diversa da quellache lrsquoha depositata egrave di uno su 10 miliardi (1

Figura 15

Impronta digitale inserita nella banca dati AFIS

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Allele 1

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Allele 2

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Allele 3

TPOX

D358358

D358358

D5S818

CSF1P0FGA

D75820

D851179TH01

VWA

D135317

D165539 D18531D21511

AMEL

AMEL

1 111098765432 12

14 X232221201918171615 Y



4

Nel caso dei polimorfismi di lunghezza del DNAmicro e minisatellite la diversitagrave fra due indivi-dui si puograve mettere in evidenza ldquomisurandordquo lalunghezza degli alleli in una determinata posizio-ne (locus) cromosomicaCome per tutti i loci genetici anche per i microsa-telliti i singoli individui possono essere omozigoti oeterozigoti se un individuo egrave omozigote per il locusanalizzato sui due cromosomi omologhi egrave presen-te lo stesso numero di ripetizioni Se invece un indi-viduo egrave eterozigote sui due cromosomi omologhiil numero di ripetizioni egrave diverso (fig 17)Lrsquoesistenza di questi loci genetici un porsquo peculiari sipuograve comprendere in base al meccanismo con cui leripetizioni vengono generate ossia per uno scivola-mento della ldquomacchinardquo enzimatica coinvolta nellareplicazione del DNA (fig 110)Come accennato precedentemente (vedi boxldquoPer saperne di piugraverdquo a p 3) lrsquoFBI ha stabilito unprotocollo basato sullrsquoanalisi di 17 microsatellitisu cromosomi autosomici e di 1 sequenza parzialenel gene dellrsquoamelogenina sui cromosomi sessuali(di lunghezza diversa sul cromosoma X e Y) perlrsquoidentificazione del sesso del campione biologicoUn esempio di calcolo della frequenza nella po-polazione di 4 loci microsatelliti egrave illustrato nellatabella seguente

Per eseguire un fingerprinting del DNA le se-quenze alleliche presenti in un dato locus vengo-no amplificate per mezzo della PCR utilizzandodue primer complementari a sequenze unichefiancheggianti il microsatelliteI frammenti ottenuti sono successivamente ana-lizzati per elettroforesi su gel di agarosio i fram-menti piugrave corti migreranno piugrave velocemente diquelli piugrave lunghi generando un profilo di bandesimile a un codice a barre caratteristico per cia-scun individuo (fig 18)La procedura standard per la costruzione di unprofilo genetico consiste in una ldquoPCR multiplardquo

Figura 17

Esempio di microsatelliti presenti sulla coppia del cromosoma 2degli individui A e B Lrsquoindividuo A egrave omozigote per il microsatelliteTPOX e eterozigote per il microsatellite D2S1338 lrsquoindividuo Begrave eterozigote per entrambi i microsatelliti considerati

LOCUS ALLELE

(Ndeg ripetizioni)

FREQUENZA

NELLA POPOLAZIONE

FREQUENZA

COMBINATA

CSF1PO

TPOX

vWA

D5S818

1(7)

2(7)

3(11)

4(9)

1 su 25 (0040)

1 su 100 (0010)

1 su 320 (00031)

1 su 75 (00133)

allele 1x2 = 1 su 2 500

allele 1x2x3 = 1 su 800 000

allele 1x2x3x4 = 1 su 60 000 000

TABELLA 11

Figura 18

Profilo geneticorelativo ai loci

analizzati in figura 17per gli individuiA e B

QUALI SONO LE

CARATTERISTICHE CHE

RENDONO I MICROSATELLITI

PARTICOLARMENTE UTILI

PER LrsquoIDENTIFICAZIONE

PERSONALE

certa sequenza presente in undato punto del genoma puograveessere costituito da numeridi ripetizioni diverse dandoorigine a numerosi alleli

in molti punti diversi delgenoma con una densitagravemedia stimata intorno a 1 ogni10 000 - 30 000 pb

loci genetici altamentepolimorfici e costituisconoquindi degli ottimi marcatorigenetici Studi di geneticadi popolazioni hannoconsentito di determinare ladistribuzione delle frequenzedei diversi alleli in variepopolazioni e quindi diidentificare i loci piugrave adattiin quanto piugrave informativiper essere utilizzati nel DNAfingerprinting

Domande e risposte

Individuo A

5 ripetizioni3 ripetizioni


Individuo B



Individuo A Individuo B

6

5

4

3

2

7

1

-

+


Esercitazione n 1

5

che utilizza contemporaneamente piugrave coppie diprimer specifiche per i loci microsatelliti che sivogliono analizzare La figura 19 illustra lo sche-ma di amplificazione di 3 loci microsatelliti Sinoti la posizione dei primerPer garantire la specificitagrave di una PCR i primerdevono essere disegnati a livello di sequenze uni-che nel genoma in modo che possano appaiarsi alDNA solo nella zona di interesse La lunghezza e ilcontenuto in basi (espresso come di GC guani-na e citosina) dei primer di una coppia devono es-sere comparabili per garantire la stessa efficienzadi amplificazione nei due sensi di sintesiSoftware dedicati identificano sequenze fian-cheggianti la regione di interesse che possiedonoqueste caratteristiche

Per saperne di piugraveLE MALATTIE DA ESPANSIONE DI TRIPLETTE

Le ripetizioni in tandem di trinucleotidipossono essere presenti anche allrsquointernodi sequenze codificanti e sono siti soggettia espansione patologica Lrsquoamplificazionedella sequenza egrave dovuta a uno scivolamentodel macchinario enzimatico durante lareplicazione del DNA (fig 110)Lrsquoalterazione patologica riguarda in genereuno solo dei due alleli di un determinato geneNella sindrome dellrsquoX fragile (la formaereditaria piugrave frequente di ritardo mentale)la mutazione riguarda il gene FMR1 (sulcromosoma X) che codifica per una proteinaimplicata nello sviluppo delle sinapsiLa Corea di Huntington egrave una patologianeurodegenerativa associata allrsquoespansionedella tripletta CAG nel gene della huntingtina(sul cromosoma 4) una proteina che egraveespressa in neuroni localizzati in specifichearee del cervelloNel caso della distrofia miotonica la proteinacoinvolta egrave espressa nel muscolo ed egravefondamentale per la sua funzionalitagraveIn queste patologie si osserva unacorrelazione tra il numero delle ripetizionilrsquoetagrave di insorgenza della malattia e la gravitagravedei sintomi

Figura 110

Scivolamentodel macchinarioenzimaticocon formazionedi una seriedi triplette ripetute

Figura 19

Esempio di amplificazione di 3 loci microsatelliti(pb = paia di basi) Le frecce indicano le posizionie la direzione di amplificazione dei primer ogni rettangolinorappresenta una unitagrave di ripetizione del microsatellite

Sindrome tripletta

ripetuta

ndeg di ripetizioni

normali

ndeg di ripetizioni

nella malattia

X Fragile

Corea di Huntington

Distrofia miotonica

CGG

CAG

CTG

da 5 a 52

da 6 a 37

da 5 a 37

da 35 a 121

da 50 a 72 000

Alcune mutazioni dovute ad espansione di trinucleotidi

Numero

OMIM

da 230 a 72 000

143100

160900

309550

localizzazione

del gene

Cr X

Cr 4

Cr 19

Locus TPOXunitagrave di ripetizione 4 pb

ndeg di alleli piugrave frequentemente osservati nella popolazione 8

TPOX

VWA

Locus vWAunitagrave di ripetizione 4 pb


Locus D5S818unitagrave di ripetizione 4 pb


D5S 818

110 pb

80 pb

65 pb

75 pb

55 pb

70 pb



6

Attribuzione di paternitagrave attraversoil fingerprinting del DNAI microsatelliti sono trasmessi come caratterimendeliani semplici codominanti Gli alleli ai di-versi loci segregano indipendentemente e si ritro-vano nei gameti in tutte le combinazioni possibi-li Consideriamo per semplicitagrave la trasmissionedegli alleli di un singolo locus microsatellite indue generazioni (fig 111)Ogni individuo eredita 50 degli alleli (bande)dal padre e 50 dalla madre Tutte le bande delprofilo genetico del figlio devono essere rintrac-ciabili o nellrsquoimpronta materna o in quella paternaUn esempio in cui il DNA fingerprinting permettedi risolvere facilmente un caso di paternitagrave dubbiaegrave illustrato in figura 112 Il padre 1 egrave il padre bio-logico

Elettroforesi capillareNei laboratori specializzati per potere distingue-re i prodotti di amplificazione dei singoli micro-satelliti si utilizzano per lrsquoamplificazione primerlegati a molecole fluorescenti (fluorocromi) cheemettono colori differenti Per ovvie ragioni auna stessa molecola fluorescente vengono legatiprimer che amplificano regioni di diversa dimen-

Storia della scienza

Alec Jeffrey e la sua scoperta

Alec Jeffrey nasce nel 1950 a Oxford e fin da piccolo ha la passione per le scienze si laureain Biochimica nel 1972 e prosegue gli studi con un dottorato in Genetica Con il collega RichardFlavell ad Amsterdam scopre lrsquoesistenza nel genoma nucleare degli introni studiando il genedella -globina di coniglio scoperta che sfata lrsquoopinione diffusa a quellrsquoepoca che il genomasia una serie ininterrotta di geni La sua ricerca tuttavia non continua sugli intronima si concentra sullrsquoindividuazione nel genoma di ldquopezzirdquo di DNA caratteristici e uniciin ogni organismo viventeLa scoperta avviene la mattina del 10 settembre 1984 quel giorno Jeffrey ottenne il suo primosuccesso con il fingerprinting del DNA confrontando il DNA di suoi colleghi e di alcuni familiarie riconoscendo attraverso il confronto tra le bande chi era imparentato e chi noIl DNA utilizzato era stato tagliato con gli enzimi di restrizione ottenendo quindi numerosiframmenti di diversa lunghezza Tra tutti questi solo alcuni potevano associarsi (ibridare)con una sonda radioattiva di DNA ripetitivo minisatellite Esponendo su una lastra per raggi Xi frammenti di DNA separati tramite elettroforesi e ibridati alla sonda radioattiva Jeffrey osservogravedei segnali che erano caratteristici di ogni individuo ottenendo il primo fingerprinting del DNA

Alec Jeffrey con la lastra fotograficarisultato del suo primo esperimento di fingerprinting del DNA

Figura 111

Trasmissione degli alleli di 1 microsatellite in un albero genealogicoche rappresenta tre generazioni il quadrato indica il maschio e il cerchiola femmina Allrsquointerno dei simboli sono indicati gli alleli del microsatelliteNella parte inferiore egrave riportato il profilo genetico di ciascun individuoper il locus analizzato determinato mediante elettroforesi

34 57

37

46 77

37 77 3736 77 67 36

67

allele 7

allele 6

allele 5

allele 4

allele 3

nonna madre nonno figli nonna padre nonno


Esercitazione n 1

7

sione e che quindi non si sovrappongono nelprofilo La ragione dellrsquouso di primer fluorescentiegrave legata al fatto che lrsquoanalisi degli amplificati vieneeseguita con un sistema di elettroforesi capillare(fig 113) che consente di distinguere i frammentidi DNA amplificati sulla base del coloreI frammenti vengono separati per elettroforesi inun capillare che contiene una soluzione polimeriz-zante Nella parte inferiore il capillare egrave dotato diuna finestra attraverso la quale il laser eccita a unaprecisa lunghezza drsquoonda i frammenti di DNAmarcati con i diversi fluorocromi e ne permettelrsquoidentificazione (fig 113a)Ogni frammento identificato da una lunghezza(che dipende dal numero di ripetizioni) e da uncolore (che dipende dal fluorocromo dei primerche lo hanno amplificato) viene rappresentatoda un picco e attribuito a un microsatellite (fig113b) elettroferogramma

I risultati dellrsquoelettroforesi capillare vanno elabo-rati eliminando eventuali sovrapposizioni tra glispettri di emissione e soprattutto convertendolrsquoinformazione contenuta nei vari picchi (lun-ghezza e numero dei frammenti di DNA) in unlinguaggio comune che permetta di confrontare idati di laboratori diversi La conversione dellrsquoelet-troferogramma in profilo genetico egrave oggi effettuatatramite software disponibili in commercio I profilidevono poi essere interpretati da operatori esper-ti in modo da individuare possibili errori causatiad esempio da fattori legati alla scarsa quantitagrave delDNA esaminato dalla sua degradazione o dallapresenza di profili misti (cioegrave dal fatto che egrave stataanalizzata una traccia in cui era presente materialebiologico appartenente a due o piugrave soggetti)Effettuati questi controlli il profilo ottenuto rap-presenta lrsquoimpronta genetica di un determinatoindividuo

Figura 113

Schema dellrsquoelettroforesi capillare

Figura 112

Risultato di unrsquoanalisi multiloci per ladeterminazione della paternitagrave Il padre1 egrave il padre biologico

Iniezione del campione

Separazione dei campioni su capillare Analisi dei campioni

Pannello rivelatore del colore

Separazionedei colori

spettrografoa prisma

Capillare

Fluorescenza

LASER(488 nm)

Miscela dei campioni di DNAmarcati con fluorocromi

e amplificati con PCR Multipla



8

Nel laboratorio di una grande casa farmaceuticatedesca la dottssa Christine Kritt viene trovatadalla donna delle pulizie la mattina presto anco-ra nel suo studio apparentemente addormentataInizialmente la donna non si preoccupa percheacutespesso capita che la dottoressa rimanga a lavoraretutta notte ma questa volta crsquoegrave qualcosa di stranoI cassetti della scrivania sono aperti ci sono foglisparsi sul pavimento la stampante accesa e colle-gata al computer continua a lampeggiare per indi-care lrsquoinceppamento della carta A questo puntola donna prova a chiamare la dottoressa che perogravenon si muove e sembra svenuta o peggioViene chiamata immediatamente la polizia e ilmedico che soccorre la dottoressa constata solouna contusione alla testa causata da un colpo in-ferto dallrsquoaggressore probabilmente utilizzandocome arma lrsquoestintore ritrovato a terra vicino allascrivania Christine Kritt si riprende e raccontadi aver subito unrsquoaggressione mentre stava per ar-chiviare sul computer la formula per un farmacorivoluzionario da lei inventato e sperimentatoefficace e senza effetti collaterali per lrsquoeliminazio-ne totale dellrsquoipertricosiDa un controllo veloce scopre che la formulascritta sui suoi quaderni di laboratorio egrave scom-parsa cosigrave come il file che stava archiviando mache non era ancora protetto da password Crsquoeraanche una busta sigillata con la formula dentroanche la busta egrave stata aperta ed egrave vuota ma in-collato al bordo richiudibile della busta la poliziaindividua un capello

I sospettati sono

anni lavorava su quella formula ma senza succes-so a causa della sua avversione per le colture bat-teriche di Escherichia coli che sono indispensabiliper ottenere il farmaco

a fare gli straordinari per mesi e mesi senza alcu-na retribuzione aggiuntiva

zelante ma disperatamente alla ricerca di un fi-nanziamento per andare negli Stati Uniti per undottorato di ricerca

LrsquoesperimentoPer eseguire lrsquoesperimento scaricate le schede delprotocollo di laboratorio che riguardano la prepara-zione del gel di agarosio e la corsa elettroforeticaOgni provetta contiene i prodotti di PCR multiplaper i tre microsatelliti della figura 19Le provette sono identificate nel seguente modoPM = marcatori di peso molecolareV = vittimaSC = scena del crimineS1 = sospettato 1S2 = sospettato 2S3 = sospettato 3C = bianco di PCR

Chi egrave il colpevole Analisi dei risultatiIl risultato dellrsquoesperimento viene riportato nelloschema sottostante (fig 114)

InterpretazioneLa foto del gel va osservata attentamente perstabilire quale indiziato ha lo stesso profilo delDNA di quello prelevato dalla scena del criminePer avere la certezza egrave necessario che le bandedellrsquoindiziato coincidano tutte perfettamentecon quelle del campione prelevato sulla scena delcrimine Nel nostro caso questo accade per lrsquoin-diziato S3Attenzione in Genetica una rondine non fa pri-mavera ma neanche due In altri termini perpoter fare il profilo di un individuo ed ottenererisultati attendibili bisogna analizzare almeno 17microsatelliti Nel nostro esperimento abbiamoanalizzato 3 microsatelliti e non 17 per motividi tempo di spazio e di costi

La scena del crimine

La polizia scientifica rileva

le impronte digitali sullrsquoestintore

e preleva i campioni biologici

per procedere allrsquoanalisi del DNA

Si ha a disposizione il DNA di

1 Dottssa Christine Kritt (V)2 scena del crimine cioegrave il DNA estratto

dal bulbo del capello (SC)3 Dottssa Isabell Gralitziu (S1)4 Robert Battle (S2)5 Lorentz Cats (S3)

Figura 114

Schemadel risultato del geldellrsquoesperimentole tre aree coloratecorrispondonoai tre microsatellitianalizzati

2=SCPM 1=V S1 CS3S2


Esercitazione n 2

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2 Identificazionedegli OGM

Lrsquoesperimento illustrato spiega come egrave possibile stabilire

se una pianta egrave stata geneticamente modificata mediante lrsquoinserimento

di un gene estraneo o transgeneLa presenza del transgene puograve essere rilevata analizzando il DNA estratto dalla piantaNellrsquoesperimento descritto si verificheragrave la presenza in campioni di maisdel gene Bt un gene proveniente dal batterio Bacillus thuringensis che conferisce alla piantala capacitagrave di produrre una proteina che la rende resistente ad alcuni insetti infestanti

Che cosrsquoegrave un organismo geneticamentemodificato (OGM)Osservando la pianta di mais rappresentata infigura 21 egrave possibile determinare se egrave stata ge-neticamente modificata Alla pura osservazioneuna pianta geneticamente modificata (GM) halo stesso aspetto di una pianta non GM Ciograve chele distingue egrave una modificazione introdotta nelDNA utilizzando alcune moderne tecniche bio-tecnologiche

La direttiva dellrsquoUnione Europea 200118CEdefinisce OGM ldquoun organismo il cui materialegenetico egrave stato modificato in modo diverso daquanto avviene in natura con lrsquoaccoppiamentoeo la ricombinazione genetica naturalerdquo La di-rettiva specifica le tecniche utilizzate per otteneretale modificazione del materiale genetico in pra-tica sono considerati geneticamente modificatigli esseri viventi il cui DNA egrave stato modificatoattraverso tecniche di ingegneria genetica chepermettono lrsquoisolamento la modifica e il trasfe-rimento da un organismo a un altro di sequenzedi DNA Non sono invece considerati OGM gliorganismi ottenuti mediante ldquofecondazione invitro processi naturali quali la coniugazione latrasduzione e la trasformazione lrsquoinduzione del-la poliploidiardquo e quelli ottenuti con programmi dimiglioramento genetico convenzionale inclusaldquola mutagenesi e la fusione cellulare di cellule ve-getali di organismi che possono scambiare mate-riale genetico anche con metodi di riproduzionetradizionalirdquoEgrave quindi grazie allrsquoingegneria genetica che ilmondo scientifico egrave approdato agli OGM OGM


La struttura del DNAe il codice geneticoIl genotipo e il fenotipoGli enzimi di restrizioneI vettori di clonaggioe la trasformazione

Figura 21

Particolare di una piantadi mais il cui nome botanicoegrave Zea mais



10

possono essere virus batteri funghi piante oanimali questo egrave possibile grazie allrsquouniversali-tagrave del codice genetico al fatto cioegrave che tutti gliesseri viventi dal punto di vista genetico parlanola stessa lingua Un gene umano introdotto in unacellula batterica o un gene batterico introdottoin una cellula vegetale faranno sintetizzare nellacellula ricevente la stessa proteina prodotta nellacellula donatricePer essere certi che un organismo sia genetica-mente modificato bisogna ricercare nel suo DNA

Per saperne di piugraveIL MAIS BT

la presenza di un gene estraneo (transgene) cherende lrsquoorganismo ospite in grado di esprimereun nuovo carattere non tipico della specie di ap-partenenza

La selezione di piante per lrsquoagricolturaIn figura 22 sono rappresentate una pianta di teo-sinte e una di mais Che cosa hanno in comuneNonostante le loro spighe abbiano dimensionimolto diverse queste piante sono tra loro stret-tamente imparentate Il teosinte egrave una piantaannuale simile al mais sia nellrsquoaspetto che nelgenotipo infatti ha anchrsquoesso 20 cromosomianalogamente alla specie coltivata Molto proba-bilmente il mais egrave stato ottenuto a partire dallapianta di teosinte che ne rappresenta pertantolrsquoantenato selvaticoCome puograve essere avvenuta una simile trasforma-zione La manipolazione delle piante non egrave sol-tanto quella dellrsquoingegneria genetica ma risalealla nascita dellrsquoagricoltura Giagrave nellrsquoantichitagrave siselezionavano attraverso incroci programmati lespecie piugrave adatte quelle piugrave resistenti eo quelleche davano i migliori raccolti A partire da 10 000

Il mais Bt egrave una varietagrave di mais resistente agli insetti La resistenza egraveottenuta facendo produrre alla pianta una proteina tossica per gli insettiprodotta da Bacillus thuringiensis un batterio del terreno utilizzato anche

Figura 23

La proteina Cry prodotta dal gene Bt proteggela pianta di mais nei confronti di insetti dannosi

nellrsquoagricoltura biologica come insetticida naturale Questo microrganismopossiede un gene (Bt) che codifica per la proteina Cry (cosigrave chiamata percheacutesi presenta in forma cristallina) che egrave in grado di legarsi selettivamentea specifici recettori localizzati nellrsquoepitelio intestinale delle larve di alcunespecie di insetti (tra cui la piralide un insetto dannosissimo per le colture)Il legame della proteina con i recettori provoca la distruzione dellrsquoepiteliointestinale Esistono diversi tipi di proteine Cry prodotte da differentisottospecie di Bacillus thuringiensis che hanno una elevata specificitagrave diazione nei confronti di vari tipi di insetti I mammiferi non hanno recettoriper le proteine CryPer conferire a una specie vegetale il carattere di resistenza nei confronti di unparticolare tipo di insetto egrave sufficiente introdurre nel suo genoma il gene checodifica per la proteina Cry attiva contro quellrsquoinsetto (fig 23) In tal modo lapianta saragrave in grado di produrre questa proteina che esplicheragrave la sua azioneinsetticida quando lrsquoinsetto si ciba dei suoi tessutiIl mais Bt sembra presentare vantaggi anche riguardo a un altro problemache preoccupa gli agronomi Nel mais sono spesso presenti tossine(aflatossine) dovute allrsquoinfezione da parte di muffe Le aflatossine hannotossicitagrave acuta e cronica e attivitagrave cancerogena su animali e uomo Utilizzaremais geneticamente modificato resistente alla piralide insetto le cui larvetrasportano spore fungine e scavano gallerie nello stocco e nella spiga delmais favorendo quindi le infezioni fungine potrebbe risolvere questo problemaLa coltivazione su larga scala di mais cotone e patate con geni Bt egrave iniziatanel 1997 in Australia Argentina e Canada La tossina prodotta dal gene Bt egravestata sperimentata anche su pioppo melanzana tabacco e soia

Figura 22

Confronto tra i frutti del teosinte (a destra) e del mais

Il gene Bt viene inseritonel DNA del mais

Bacillus

thuringiensis


Esercitazione n 2

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anni fa con incroci controllati cioegrave selezionandogli organismi parentali e cercando di ldquofissarerdquo deicaratteri desiderabili sono state ottenute diversevarietagrave di mais ma anche di riso orzo grano len-ticchie peperoni arachidi zuccaDal secolo scorso nuove varietagrave vegetali perlrsquoagricoltura sono state ottenute inducendo mu-tazioni tramite irraggiamento con radiazioni io-nizzanti o con agenti chimici e si sono incrociateanche specie diverse ottenendo ibridi fertili ne egraveun esempio il triticale incrocio tra il grano duroe la segale (fig 24)Tuttavia le normali tecniche di selezione dannoesiti casuali e la maggior parte delle varianti otte-nute sono piantine aberranti e inutilizzabili Solopoche piante dopo numerose e attente selezionirisultano essere utili non si ha perograve la possibili-tagrave di sapere con precisione cosa sia successo dalpunto di vista geneticoLa creazione di modificazioni genetiche mirateattraverso le biotecnologie moderne permette dioperare in maniera estremamente precisa Quel-lo che si fa egrave infatti di aggiungere al patrimoniogenetico di una pianta una precisa sequenza diDNA proveniente anche da specie non sessual-mente compatibili Dal punto di vista tecnologi-co questo rappresenta sicuramente un passaggiodi qualitagrave rispetto alle normali tecniche di sele-zione sia per la probabilitagrave di ottenere dei suc-cessi che per la possibilitagrave di conoscere con preci-sione ciograve che egrave stato introdotto ed eventualmentemodificato

Come si fa a modificare geneticamenteuna piantaLa tecnica del DNA ricombinante rappresen-ta il passaggio fondamentale per modificare unorganismo e quindi anche una pianta Vediamoora piugrave in dettaglio le tre tappe principali

isolamento del gene esogeno e preparazione1del vettoretrasferimento del gene esogeno alla pianta ospite2identificazione e sviluppo della pianta geneti-3camente modificata

1 Isolamento del gene esogenoe preparazione del vettoreInnanzitutto egrave necessario stabilire quale gene sivuole inserire nellrsquoorganismo ospite Una voltaindividuato il gene in questione puograve essere iso-lato in uno dei seguenti modi

estrazione da cellule o tessuti opportunidi mRNA (RNA messaggero) che codificaper la proteina di interesse in seguito grazieallrsquoazione della trascrittasi inversa si procedealla sintesi del DNA complementare (cDNA)risalendo cosigrave alla copia di DNA che contienelrsquoinformazione genetica che stiamo cercandoisolamento del gene direttamente da DNA ge-nomico dellrsquoorganismo in cui egrave presente e suasuccessiva purificazione Questa tecnica egrave piugravecomplessa ma resa possibile grazie allrsquoimpie-go degli enzimi di restrizionesintesi artificiale di un gene di cui sia nota lasequenza si utilizza una particolare ldquomacchi-na dei genirdquo (sintetizzatore di sequenze nucle-otidiche) in grado di produrre la sequenza dinucleotidi desiderata

Il gene esogeno deve essere preceduto da regionidi controllo specifiche come il promotore perconsentire lrsquoespressione nellrsquoorganismo ospiteIl gene cosigrave allestito deve essere introdotto inun vettore cioegrave una molecola di DNA in gradodi replicarsi nella cellula ospite prescelta Fre-quentemente si utilizzano plasmidi molecoledi DNA circolari extracromosomiche presentinaturalmente nei batteri e capaci di replicarsi au-tonomamente allrsquointerno della cellula battericaSi usano per lo piugrave plasmidi modificati genetica-mente in laboratorio (fig 25) in cui sono statieliminati praticamente tutti i geni originali e checontengono

unrsquoorigine di replicazione del DNA (ori daldquooriginerdquo) che permette ai plasmidi di repli-carsi in modo indipendente dal cromosomadella cellula ospite

GRANO DURO SEGALE

TRITICALE

Figura 24

Il triticale egrave un cereale ottenuto dallrsquoincrocio tra due specie distinte ilgrano duro e la segale

Figura 25

Esempio di plasmideori origine di replicazionedel DNA amp r gene per laresistenza allrsquoantibioticoampicillina (polylinker) sitodi clonaggio contenente sitidi taglio per diversi enzimi direstrizione

VETTOREDI CLONAGGIO PLASMIDICO

ampr

poly

linke

r

ori



12

un gene marcatore che permette di riconosce-re le cellule contenenti il plasmide da quelleche non lo contengono in genere si tratta diun gene per la resistenza a un antibiotico adesempio il gene ampr che conferisce resistenzaallrsquoantibiotico ampicillinauna regione il sito di clonaggio in cui possaessere inserito il segmento di DNA esogenoquesta zona chiamata polylinker o zona diclonaggio multiplo egrave costituita da un trattodi DNA che contiene delle sequenze unichericonosciute come siti di taglio da parte di en-zimi di restrizione (siti di restrizione)

Sia il plasmide che il DNA esogeno sono tagliaticon lo stesso enzima di restrizione per generareestremitagrave compatibili Il plasmide ricombinan-te (plasmide con inserito il frammento di DNAesogeno) egrave ottenuto mediante ligazione ad operadellrsquoenzima DNA ligasi che forma legami fosfo-diesterici per ripristinare la molecola circolare

2 Trasferimento del gene esogenoalla pianta ospiteCompletata la ldquocostruzionerdquo del vettore questrsquoul-timo deve essere introdotto nella cellula vegetalepresceltaPer le piante sono state realizzate alcune tecni-che che favoriscono il trasferimento di geni e laloro integrazione stabile nel DNA della cellula equindi la loro trasmissione alla progenie Le piugravecomuni sono quelle basate sullrsquoutilizzo di sistemifisico-chimici o di sistemi biologici come il tra-sferimento genico mediato da batteri

- Metodo biolistico (= biologia + balistica) Il tes-suto vegetale egrave ldquobombardatordquo con microproiettilidrsquooro o di tungsteno del diametro di qualche mricoperti con il DNA del vettore in cui egrave statointegrato il gene di interesse (fig 26) Una vol-ta allrsquointerno il DNA si stacca dal supporto e siintegra nel DNA della cellula stessa Le lesioniprodotte dai microproiettili sono temporaneee di lieve entitagrave Il metodo biolistico egrave risultatoparticolarmente efficace nei confronti di alcunespecie vegetali ad esempio legumi e diverse spe-cie arboree

(o elettroperfo-razione) di protoplasti Applicando un campoelettrico pulsante a tensione elevata si provoca laformazione di piccole aperture temporanee sullamembrana cellulare del protoplasto (cioegrave dellacellula vegetale privata enzimaticamente dellaparete vegetale in quanto questa rappresenta unostacolo al passaggio di molecole) per favorirelrsquoingresso del vettore ricombinante nella cellulaospite Successivamente il DNA esogeno si puograveintegrare nel DNA della cellula ospite diventan-do parte del suo patrimonio ereditario La cellularigenera quindi la parete cellulare e coltivata inpresenza di opportuni stimoli ormonali dagrave luogoad una pianta transgenica

tumefaciens (Quando la natura ci precedehellip)Lrsquoingegneria genetica delle piante esiste giagrave innatura Al di fuori dellrsquointervento umano esisteun organismo che forse da milioni di anni faesattamente quanto lrsquouomo cerca di ottenere conle sofisticate tecniche del DNA ricombinanteInfatti lrsquoAgrobacterium tumefaciens (fig 27) egrave uncomune batterio del suolo che riprogramma asuo uso e consumo lrsquoinformazione genetica dellecellule delle piante inserendo al loro interno geniestranei e inducendo lrsquoespressione delle proteinecorrispondenti Il batterio aderisce alla superficiedella pianta in genere dove trova una lesione so-prattutto in corrispondenza della giunzione traradice e fusto (colletto) o vicino a essa costrin-gendo le cellule vegetali circostanti a proliferaree a formare una galla o tumore (fig 28) I tumo-ri indotti da A tumefaciens producono sostanzeparticolari chiamate opine (derivati di comunicomposti intermedi del metabolismo per la mag-gior parte aminoacidi vari chetoacidi e zuccheri)utilizzate come cibo dallrsquoAgrobacterium

Figura 26

Nella figura egrave mostrato lo strumento con cui si ldquosparanordquoi microproiettili rivestiti da DNA per farli entrare nelle cellule vegetali

Figura 27

Agrobacterium tumefaciens


Esercitazione n 2

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Il batterio quindi egrave in grado di indurre la cellulavegetale a produrre una sostanza che la cellula ve-getale non egrave in grado normalmente di fabbricaree di cui esso solo egrave capace di nutrirsi Le cellulevegetali inoltre trasmettono questa capacitagrave allecellule figlie Questo comportamento particolareegrave dovuto al fatto che il microrganismo oltre al suounico cromosoma ospita normalmente un pla-smide detto Ti ( ) che egrave il veroresponsabile della trasformazione delle cellulesane in cellule tumorali Allrsquoatto dellrsquoinfezione ilbatterio aderisce alle cellule della pianta e un seg-

mento del plasmide Ti passa al loro interno Que-sto frammento che egrave stato denominato T-DNA siinserisce nel DNA delle cellule infettate e da quelmomento in poi diventa parte integrante del loropatrimonio genetico Agrobacterium essendo ilsolo in grado di nutrirsi delle opine si egrave cosigrave creatorispetto agli altri microrganismi del suolo una nic-chia ecologica un modo particolare per risolverela lotta per la sopravvivenza Allo stesso tempo rea-lizza un vero capolavoro di ingegneria genetica Inaltre parole il plasmide Ti egrave lrsquoelemento centrale diuna interazione ecologica estremamente evoluta

Figura 28

Infezione del batterio Agrobacterium tumefaciens e formazione di un tumore (galla) Il tumore egrave indotto dal plasmide Tipresente nel batterio che integra una parte del suo DNA (T-DNA) nei cromosomi della cellula vegetale

T-DNA

Plasmide TiCromosoma

Agrobacterium DNAcromosomico

cellulatrasformata

il T-DNAsi integranel DNAdellrsquoospite

Tumore(galla del colletto)

Per saperne di piugraveOGM A COLORI

Figura 29

A sinistra il Golden Rice dal colore giallo-dorato e a destrala rosa blu geneticamente modificata

La principale coltura alimentare del mondo si tingedi giallo Egrave stata messa a punto una qualitagrave di risotransgenico chiamata Golden Rice riso dorato (fig 29a sinistra) il giallo dei chicchi egrave dovuto alla capacitagravedella pianta di sintetizzare beta-carotene il precursoredella vitamina A a cui si deve la colorazione Talecaratteristica egrave stata ottenuta inserendo nel DNA delriso i geni di narciso responsabili della produzione dibeta-carotene In tal modo il riso che normalmente noncontiene vitamina A puograve fornire questa sostanza che egravecarente nellrsquoalimentazione di molti paesi poveriUn altro esempio riguarda le rose nessuna qualitagrave dirosa egrave infatti in grado di produrre un pigmento blu e lerose blu in commercio sono ottenute grazie a colorantiimmessi nel terreno di coltura o addirittura spruzzati suipetali Una ricerca durata anni ha portato invece allaprima rosa in grado di produrre da sola un pigmento blula delfinidina (fig 29 a destra) Il gene egrave stato ottenutodalla petunia e poi inserito mediante la tecnologia delDNA ricombinante nel DNA della rosa



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interesse nelle cellule vegetaliIl plasmide Ti egrave di per seacute un vettore ideale per in-trodurre DNA estraneo nelle cellule vegetali Inlaboratorio sono stati ottenuti plasmidi Ti modi-ficati in modo da introdurre il transgene deside-rato nelle cellule vegetali la tabella 21 riassumele caratteristiche del plasmide Ti naturale quelledel plasmide modificato in laboratorio per essereutilizzato come vettore e quelle di un vettore con-tenente il transgene (plasmide ricombinante)

In genere nel plasmide Ti vettore vengono inseritidue geni che conferiscono resistenza agli antibio-tici Un gene (ad esempio per la resistenza allrsquoam-picillina) egrave inserito nella regione del T-DNA e ilsecondo gene (ad es quello per la resistenza allatetraciclina) egrave inserito al di fuori della regione del

T-DNA Quando il gene per la resistenza allrsquoam-picillina viene tagliato da un enzima di restri-zione per inserire il transgene esso non saragrave piugravefunzionante I batteri che possiedono il plasmidericombinante possono quindi essere selezionatiin quanto crescono in presenza di tetraciclina emuoiono in presenza di ampicillina A questopunto gli Agrobatteri selezionati vengono mes-si a contatto con frammenti del tessuto vegetale(ad es foglie) che si intende trasformare la re-gione T-DNA del plasmide ricombinante si tra-sferisce nelle cellule (fig 210) I tratti terminaliinseriscono il gene esogeno nel DNA vegetaleed il promotore ne garantisce lrsquoespressione Daquesti frammenti di tessuto vegetale trasformatoegrave possibile ottenere lrsquointera pianta fertile in gradodi trasmettere alle generazioni successive il geneesogeno integrato nel genoma

3 Identificazione e sviluppo della piantageneticamente modificataLrsquoidentificazione della cellula vegetale contenen-te il DNA esogeno egrave resa possibile dalla presenzanel vettore di trasformazione (nella regione delT-DNA) di un ulteriore marcatore di selezione(per semplicitagrave non indicato nella tab 21 e nellafig 210) ad esempio la resistenza a un erbicidaInizialmente i geni di resistenza agli antibioticivenivano utilizzati come marcatori selettivi ancheper questa fase Tuttavia anche se la resistenza ri-guardava antibiotici ormai poco usati in medici-

Figura 210

Confronto tra lrsquoinfezione diAgrobacterium in natura e inlaboratorio Nella produzione dipiante GM il T-DNA non contienei geni che inducono il tumore ela produzione di opine bensigrave iltransgene drsquointeresse

in natura in laboratorio

T-DNA

Plasmide Ti

Agrobacterium cellula vegetale

Genidi ormoni

Genidelle opine

T-DNA

Plasmide Ti


Geninuovi

Marcatori diselezione

PLASMIDE TI NATURALE PLASMIDE TI VETTORE PLASMIDE TI RICOMBINANTE

Unrsquoorigine di replicazione (ori) Unrsquoorigine di replicazione (ori) Unrsquoorigine di replicazione (ori)

Geni che conferiscono la virulenza allrsquoAgrobacterium (vir) Geni che conferiscono la virulenza allrsquoAgrobacterium (vir) Geni che conferiscono la virulenza allrsquoAgrobacterium (vir)

La regione T-DNA che entra nelle cellule e contienegeni per la sintesi e il catabolismo delle opine perindurre il tumore e alle due estremitagrave sequenze per iltrasferimento e lrsquointegrazione (in nero in figura)

Le due estremitagrave della regione T per il trasferimento elrsquointegrazione (in nero in figura)


Geni di selezione ad es geni che conferiscono resistenzaallrsquoantibiotico ampicillina (Ampr) e tetraciclina (Tetr)


Il transgene preceduto dal promotore (P) inserito tra le sequenzeper il trasferimento e lrsquointegrazione (in nero in figura)

Geni virori

tet rAmpr

TransgeneP

regione T-DNA

Geni virori

Geni virori

tet r

Ampr

Tabella 21


Esercitazione n 2

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na lrsquoUnione Europea ha vietato la produzione diOGM con vettori ricombinanti contenenti genidi resistenza agli antibiotici nella regione del T-DNA per evitare unrsquoeventuale diffusione di geniper antibiotico-resistenze nellrsquoambienteLe cellule vengono fatte crescere in un terreno dicoltura selettivo (ossia contenente ad esempiolrsquoerbicida di cui egrave stata acquisita la resistenza) esaragrave cosigrave possibile selezionare le cellule ricom-binanti che hanno integrato il gene estraneo inmodo stabile nel loro genoma

Percheacute si fanno gli OGMNellrsquoelenco che segue sono indicati i settori pro-duttivi e di ricerca in cui gli OGM trovano o po-trebbero trovare varie applicazioni per la produ-zione di determinate sostanze

farmacologia e medicina (produzione di bio-farmaci molecole utili a fini terapeutici vacci-ni e antibiotici terapia genica ecc)industria alimentare (modificazione del con-tenuto di zuccheri aminoacidi grassi ecc)chimica e farmaceutica (enzimi additivi alcol

acidi solventi detergenti materie plastichereagenti diagnostici ecc)agricoltura zootecnia e veterinaria (migliora-mento genetico per rendere resistenti piante oanimali alle malattie ai pesticidi e agli stress am-bientali incremento della produzione ecc)protezione ambientale (bio-risanamento di am-bienti contaminati depurazione delle acque)energia (estrazione del petrolio presente nellerocce mediante produzione di sostanze tensio-attive che ne favoriscono la separazione ecc)biostrumentazione (chip biologici)

Nel settore agro-alimentare lrsquoimpiego degliOGM mira allrsquoottenimento di piante che espri-mano nuove caratteristiche agronomiche deside-rabili quali

resistenza ai patogeni e ai parassititolleranza agli erbicidimiglioramento delle caratteristiche nutrizio-naliaumento della conservabilitagrave

Per saperne di piugrave

Ogni anno lrsquoInternational Service for theAcquisition of Agri-biotech Applications(ISAAA Servizio internazionale per lrsquoacquisizionedi applicazioni agro-biotecnologiche) compilaun rapporto che fotografa lo stato delle colturetransgeniche nel mondoIl rapporto egrave disponibile sul sito wwwisaaaorge comprende grafici e carte sullrsquoestensionedei campi seminati con OGM i paesi coltivatoriil tipo di colture (fig 211)

Figura 211

Il grafico in alto mostra le aree coltivate dal 1996 al2010 con le quattro colture transgeniche piugrave diffusesoia mais cotone colza Nel grafico in basso dellestesse quattro colture sono messe a confronto le diaree coltivate con varietagrave convenzionali e con varietagravetransgeniche

LE COLTURE OGM NEL MONDO



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Lo scenarioIl laboratorio di cui siete responsabili deve verifi-care llsquoeventuale presenza del gene Bt in un caricodi mais destinato alla produzione di corn flakes inuna ditta che certifica ldquoprodotto senza OGMrdquoLrsquoanalisi comprende le seguenti fasi

campionamentoestrazione del DNA e amplificazione con PCRelettroforesianalisi dei risultati

CampionamentoIl campione predisposto allrsquoanalisi deve essereil piugrave possibile rappresentativo della matrice dipartenza ed essere omogeneo A causa del miscu-glio durante la raccolta lo stoccaggio e il traspor-to un prodotto OGM potrebbe non essere bendistribuito nella matrice di partenza ed essere adesempio piugrave concentrato in un punto piuttostoche in altri occorre perciograve eseguire piugrave prelievidalla matrice e in punti diversi

Estrazione del DNA e PCRDai campioni sottoposti a omogeneizzazioneviene estratto il DNA viene effettuata una PCRutilizzando una coppia di primer specifici per ilgene Bt successivamente si effettua lrsquoelettrofo-resi dei prodotti di PCR e si analizzano i risultatidella corsaEgrave opportuno sottoporre il DNA da analizzare a unldquocontrollo di qualitagraverdquo per stabilire se proviene daquel determinato organismo vegetale in questomodo si controlla che il campionamento e lrsquoestra-

zione del DNA siano avvenuti in modo correttoPer questo si deve individuare un gene esclusivodelle cellule vegetali (ad esempio un gene per unaproteina del cloroplasto) e un gene specie-speci-fico (ad esempio nel caso del mais il gene per lazeina una proteina di riserva presente nei semi)Si esegue mediante PCR la loro amplificazionecon i primer idonei e mediante elettroforesi siverifica la presenza dellrsquoamplificato Questi nonsono ldquotransgenirdquo ma geni ldquospiardquo i quali indicanoche siamo in presenza di materiale vegetale e inparticolare di mais Avendo verificato queste duecondizioni si valuta se il transgene egrave davvero pre-sente La coppia di primer che si utilizza di solitoin laboratorio per la ricerca del gene Bt mediantePCR amplifica un segmento di DNA lungo 189pb interno al gene Bt (fig 212)

LrsquoesperimentoPer eseguire lrsquoesperimento di riconoscimentodel mais OGM scaricate le schede del protocolloelettroforesiLe provette sono identificate da

PM marcatore di peso molecolare (per il con-fronto dei PM)1 gene per una proteina del cloroplasto (dal-la PCR egrave atteso un amplificato di DNA di 484pb paia di basi)2 gene per la zeina (dalla PCR egrave atteso un am-plificato di DNA di 220 pb)3 campione in cui si vuole analizzare la pre-senza del transgene (dalla PCR egrave atteso un

Figura 212

Con opportune coppie di primersi amplificano segmenti dildquogeni spiardquo (una proteina delcloroplasto e la zeina) noncheacuteparte del gene Bt (transgene)I simboli (+) e (-) indicanorispettivamente presenzae assenza del prodotto di PCR

(+)

egrave DNA vegetale(+)

egrave DNA di mais

(+)

egrave OGM(-)

non egrave OGM

PCR PCR

Genedel cloroplasto

primer

Geneper la zeina

primer

Gene Btdi resistenza agli insetti

primer

PCR


Esercitazione n 2

17

amplificato di 189 pb se il transgene BT egrave pre-sente)4 controllo positivo (un campione standardche contiene la sequenza di DNA in esameper dimostrare che la procedura di amplifica-zione funziona)5 controllo negativo (un campione di DNAche non contiene il transgene ricercato)6 ldquobiancordquo di PCR (costituito dalle stesse so-

luzioni e dagli stessi tamponi utilizzati ma chenon contiene DNA del campione Serve perdimostrare lrsquoassenza di DNA contaminantedurante tutte le fasi di lavoro)

Egrave OGM Analisi dei risultatiDal confronto con le bande nella corsia del mar-catore di peso molecolare (PM) si puograve dedurreche il campione 1 presenta una banda di circa


Quante volte sentiamo parlare di prodotti alimentari che sono stati o sono in venditae che sono stati ottenuti con tecniche di modificazione genetica (OGM)Esempi famosi sono il pomodoro e la fragola antigelo che sono stati modificatigeneticamente per resistere alle basse temperature benehellip questi prodotti non sonomai esistitiNel 1991 la DNA Plant Technology cercava di rendere il pomodoro piugrave resistentealle basse temperature introducendo nel suo genoma il gene di una delle proteineanticongelanti AFP (Antifreeze Proteins) presenti in pesci che vivono in acquecon temperatura molto freddaI ricercatori della DNA Plant Technology non hanno trasferito direttamente nel pomodoroil gene della proteina anticongelante isolato da un pesce artico ma hanno utilizzatola sequenza di DNA di quel gene per sintetizzare in provetta un tratto di DNAcon analoga sequenza ma piugrave adatto ad esprimersi in organismi vegetaliCome spesso accade nella ricerca sperimentale egrave risultato che il pomodoro ottenutonon era perograve resistente al freddo Nonostante questo la storia del pomodoro-pesce

ha iniziato ad essere diffusa tramite i mediaGli scienziati hanno provato dopo lrsquoiniziale fallimento ad inserire geni antigelo di variaprovenienza ma per lo piugrave con scarso successo Solo di recente qualche passo avantiegrave stato fatto utilizzando una proteina antigelo della carote

Le fragole antigelo

Veniamo ora allrsquoOGM piugrave citato della storia la Fragola-PesceIn questo caso siamo di fronte ad un vero gioco di fantasia la fragola-pesce non

esiste Non egrave mai esistita e non egrave stata oggetto di sperimentazione come accadutoper il pomodoro che perograve non egrave mai stato messo in commercio

Il caso della farfalla monarca

Nel 1999 la rivista Nature pubblica una breve corrispondenza di John Losey (unentomologo americano della Cornell University) in cui si afferma che sarebbe statodimostrato che il polline del mais Bt che si deposita nelle vicinanze dei campi di maisuccide le larve della farfalla monarca Questa notizia fa scatenare una battagliaecologista dato che le farfalle monarca sembra che siano a rischio estinzioneLa Commissione Europea blocca lrsquoautorizzazione alla sperimentazione del mais Btma dopo qualche settimana lrsquoesperimento di Losey viene analizzato con attenzionedalla comunitagrave scientifica ed emerge che contiene numerosi errori non egrave stato condottoseguendo criteri scientifici ed egrave giunto a conclusioni errate Ci si accorge tra lrsquoaltroche proprio nel momento della massima diffusione del mais Bt negli Stati Unitila popolazione delle farfalle monarca egrave cresciuta da 300 a 500 milioni di esemplariLo studio di Losey viene bocciato dalla comunitagrave scientifica e lui fa marcia indietroammettendo gli errori e la non validitagrave dei risultati un articolo del 2001 su PNASfornisce le prove scientifiche che lrsquoutilizzo del mais Bt non minaccia la farfallamonarca Purtroppo come spesso succede le smentite non hanno nei media lo stessorisalto delle notizie piugrave clamorose e lrsquoopinione pubblica rimane influenzata nel dibattitosulla pericolositagrave degli OGM

LrsquoOGM che non esiste



18

480 pb e cioegrave della lunghezza attesa per il gene del-la proteina del cloroplasto (fig 213) Il campione2 presenta una banda di circa 220 pb e cioegrave del-la lunghezza attesa per il gene della zeina Si puograveconcludere che si egrave in presenza di DNA vegetaledi mais Inoltre il DNA non egrave stato eccessivamenteframmentato durante lrsquoestrazione in quanto sonopresenti frammenti amplificabili di almeno 200 pbQuesta informazione egrave importante percheacute il fram-mento del gene Bt da amplificare egrave lungo 189 pb edegrave necessario quindi sapere che il DNA da analizza-re contiene frammenti di lunghezza paragonabile

Il campione 3 presenta una banda identica a quelladel controllo positivo (campione 4) Ciascuna diqueste bande egrave di 189 pb Poicheacute la banda egrave assentesia nel controllo negativo che nel ldquobiancordquo di PCRsi deduce che essa egrave la banda relativa al gene ricer-cato Quindi nel campione preso in esame egrave pre-sente mais geneticamente modificato

Data la elevata sensibilitagrave della PCR che riescead amplificare un singolo tratto di DNA presentein quantitagrave minime (10 pg) di DNA genomicosarebbe opportuno allestire oltre al controllo po-sitivo e negativo (vedi sopra) ulteriori reazioni dicontrollo per verificare che ogni fase del lavoro egravestata eseguita correttamente Nei laboratori specia-lizzati nelle analisi di OGM che rilasciano certifica-zione ufficiale sono obbligatori i seguenti ulterioricontrolli

un controllo ambientale che consiste in una pro-vetta contenente acqua lasciata aperta durantetutto il processo di analisi (dallrsquoomogeneizzazio-ne allrsquoamplificazione) per dimostrare che non cisia contaminazione nellrsquoaria del laboratoriocontrollo di assenza di inibizione della reazionedi PCR Il DNA estratto dal campione vieneamplificato con primer per una sequenza endo-gena sicuramente amplificabile In questo modosi verifica lrsquoassenza di sostanze di inibizione del-la PCR nel DNA estratto che potrebbero darefalsi risultati negativi

Figura 213

Schema del risultato della corsa elettroforetica

2PM 1 3 654

587

458434

298

267

236

174

10280


Esercitazione n 3

19

3 Sanoo malato

Cosa vuol dire essere in buona saluteEd essere malatoChi dei quattro bambini in figura 31 egrave malatoSicuramente rispondereste il bambino a lettocon la febbre e lrsquoinfluenza maPotremmo sospettare che anche gli altri sianomalati ma ancora senza sintomi oppure siano por-tatori di malattie genetiche o addirittura abbianomutazioni genetiche dominanti a insorgenza tar-diva cioegrave che si manifestano solo in etagrave adulta eallora proviamo a riflettere sulla definizione disano e malatoRisulta forse piugrave facile definire la condizione dimalattia soprattutto quando si pensa a situazio-ni acute o gravi infatti secondo lrsquoOMS lrsquoOrga-nizzazione Mondiale della Sanitagrave essere malatosignifica ldquoessere in una qualsiasi condizione delcorpo e della mente che diminuisce le capacitagravedi sopravvivenza dellrsquoindividuordquo Riassumendomalato significa non in salute mentre sano si-gnifica ldquostato di completo benessere fisico psi-chico sociale e culturale e non semplice assenzadi malattiardquoQui ci occuperemo delle malattie ereditarie e

di come in alcuni casi sia possibile determinarea livello molecolare lrsquoesistenza nella sequenza diDNA di mutazioni trasmissibili di generazione ingenerazione

Che cosrsquoegrave il pedigreeUno dei campi drsquoindagine della Genetica egrave lo stu-dio dei meccanismi con cui i geni sono trasmessidai genitori ai figli A tale scopo i genetisti effet-tuano accoppiamenti tra organismi della stessaspecie per analizzare la trasmissione dei caratteriNella Genetica umana gli accoppiamenti speri-mentali ovviamente non sono possibili Moltedelle nostre conoscenze sullrsquoereditarietagrave dei ca-ratteri umani derivano perciograve dalla analisi deglialberi genealogici o pedigreeIn pratica il pedigree egrave la rappresentazione siste-matica della storia familiare attraverso lrsquouso disimboli standardizzati (fig 32) Il pedigree vie-ne stilato partendo dallrsquointervista ai componen-ti di una famiglia al fine di ricostruirne la storia(anamnesi) in questo modo egrave possibile seguirela trasmissione di un carattere in una data fami-glia per alcune generazioni (fig 33)

Lrsquoesperimento che viene illustrato riguarda lrsquoanalisi del DNA

per individuare una mutazione genica recessiva a carico del gene

della szlig-globina che egrave causa dellrsquoanemia falciformeDallo studio del DNA di vari membri di una famiglia nella quale si egrave manifestata lrsquoanemia falciformesi potragrave riconoscere lrsquoesistenza della mutazione in forma omozigote o eterozigotee quindi fare una diagnosi di malattia o di portatore sano ai componenti dellrsquoalbero genealogico


Le leggi di MendelLe mutazioni genicheLe malattie monogenicheGli enzimi di restrizione

Figura 31

Chi dei quattro bambini in figuraegrave malato



20

Lrsquoanalisi del pedigree perla determinazione delle modalitagravedi trasmissione di malattieo di caratteri monogeniciDallrsquoanalisi di un pedigree si puograve determinare(talvolta non in modo univoco in quanto unpedigree puograve essere compatibile con piugrave di unamodalitagrave di trasmissione ereditaria) se un carat-tere ha una modalitagrave di trasmissione recessiva odominante e se il gene in questione egrave localizzatosu un autosoma o su un cromosoma sessuale Inultima analisi si possono informare i membri diuna famiglia sulla probabilitagrave di trasmettere undeterminato carattere ai propri figli Analizziamole caratteristiche dei pedigree relativi a caratteri

autosomici recessivi (AR)autosomici dominanti (AD)legati al cromosoma X recessivi (XR)legati al cromosoma X dominanti (XD)legati al cromosoma Y

Figura 32

I simboli usati nellrsquoanalisi del pedigreeadottati nel 1995 dalla SocietagraveAmericana di Genetica Umana

Figura 33

Un pedigree che mostra la trasmissione ereditaria di un carattere (i simboli scurirappresentano gli individui affetti) attraverso alcune generazioni di una famiglia Le diversegenerazioni vengono indicate con i numeri romani partendo da quelle piugrave lontane nel tempo

maschio

morte

sesso non determinato

femmina

portatrice di un gene recessivo legato al sesso

aborto o parto di nato morto(sesso non determinato)

matrimonio

gemelli dizigotici (due cellule uovo)

matrimonio consanguineo(matrimonio tra parenti)

numero di figli del sesso indicato

individui affetti

eterozigoti per un gene autosomico recessivo

genitorie 1 bambino1bambina(in ordine di nascita)

metodo per identificare le personein un albero genealogicoqui il probando egrave il bambino 2della generazione II II-2

gemelli omozigotici (una cellula uovo)

3 2

probando

1 2

1 2 3 54

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

I

II

III

IV

V


Esercitazione n 3

21

Per saperne di piugraveLE MALATTIE EREDITARIE

Allrsquoorigine di una malattia genetica viegrave la presenza di una o piugrave mutazioninel genoma di tutte o di una partedelle cellule di un individuo le malattiegenetiche sono ereditarie solo se lemutazioni sono presenti nelle cellulegerminali (ovociti o spermatozoi)i sintomi (piugrave o meno gravi) di unamutazione possono manifestarsiprecocemente anche in epoca prenataleo dopo un periodo di latenza anche moltolungo come nel caso della Cograverea diHuntington una patologia dovuta a unamutazione dominante che si manifestasolo nellrsquoetagrave adultaLe malattie ereditarie possono essere

malattie monogeniche o monofattorialideterminate da mutazioni in un singologene e che si trasmettono nelle famigliesecondo le leggi di Mendel oppurepossono essere malattie poligeniche

(es allergie diabete ipertensione ecc)causate da difetti genetici a caricodi piugrave di un gene e la cui ereditarietagraveegrave di tipo non mendeliano Le malattiee piugrave in genere i caratteri poligenicipossono essere piugrave o meno condizionatida fattori non genetici cioegrave dallrsquoambiente

e in questi casi vengono definitimultifattoriali (es arteriosclerosie malattie cardiovascolari in genereobesitagrave ecc)

Ereditagrave autosomica recessiva di un genelegato a una malattia (ldquogene-malattiardquo)

entrambi eterozigoti Ogni affetto (eterozigote)ha il 50 di probabilitagrave di avere figli malatiGenitori entrambi affetti (eterozigoti) posso-no avere figli sani (25)I genitori di un bambino malato possono es-sere sani in questo caso si puograve dedurre che lamalattia origina da una nuova mutazione ve-rificatasi durante la formazione di un gamete(mutazione de novo)

Ereditagrave recessiva di un ldquogene-malattiardquo loca-lizzato sul cromosoma X

Possono essere affetti sia i maschi sia le fem-mineIn genere gli individui affetti hanno genitorisani (portatori asintomatici)I genitori entrambi portatori sani hanno il25 di probabilitagrave di avere figli malati a ognigravidanzaLrsquoincidenza della malattia aumenta in caso diconsanguineitagraveTutti i figli di genitori entrambi affetti (omozi-goti) sono a loro volta affetti

Ereditagrave autosomica dominante di un ldquogene-malattiardquo

Possono essere affetti sia i maschi sia le fem-mineGli individui affetti possono essere presenti intutte le generazioniGli individui affetti hanno sempre un genitoreaffettoPoicheacute i geni responsabili di malattie autosomi-che dominanti sono rari in genere gli individuiaffetti sono eterozigoti Rarissimi sono gli omo-zigoti che possono nascere solo da genitori

1

I

II

III

IV

2

1 2 3 4

12 13 14 15

5 6

7 8 9 10 11

I

II

III

1 2

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2

1 2 3 4

1 2

1 2 3 4 5 6

3 4 5 8

6

7

5

6

I

II

III

IV

La frequenza della malattia egrave maggiore nei ma-schi che nelle femmineLe femmine possono essere portatrici saneLe donne portatrici hanno un rischio del 50di avere figli maschi malati



22

Ereditagrave legata al cromosoma YSono stati individuati pochi caratteri legati alcromosoma YI caratteri si manifestano solo nei maschiSono trasmessi direttamente da padre a figlio(ereditagrave olandrica)

La Bioinformatica al serviziodella Genetica la banca dati OMIMEsiste in internet una banca dati che contiene infor-mazioni sui geni umani e sulle malattie geneticherealizzata e mantenuta dallrsquoNCBI National Centerfor Biotechnology Information La banca contienela descrizione dei geni e delle malattie a essi associa-te i quadri clinici e i riferimenti bibliografici oltre alink ad altre risorse web Si tratta della versione onli-ne del testo Mendelian Inheritance in Man (OMIM)a cura del genetista medico Victor A McKusick edi un gruppo di colleghi della Johns Hopkins Uni-versity e di altre istituzioni La banca dati OMIMriporta solo malattie che sono state associate a unoo piugrave geni ed egrave aggiornata quotidianamenteLa pagina di accesso a OMIM si raggiunge tra-mite un link sulla homepage dellrsquoNCBI (httpwwwncbinlmnihgov) In tabella 31 sono ri-portate alcune malattie monogeniche con il co-dice identificativo OMIM

1 2

1 2 3 4 5

1 2

3

6

21

I

II

III

IV

1 2

1 2 3 4 5

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2 3 4 5 6 7 8

I

II

III

IV

I maschi affetti hanno figlie portatrici sane efigli maschi saniLa madre di un individuo affetto egrave portatricesana

Ereditagrave dominante di un ldquogene-malattiardquo loca-lizzato sul cromosoma X

Maschi affetti generano solo femmine affettementre i figli maschi sono sempre saniFemmine eterozigoti affette trasmettono ilcarattere al 50 dei figli siano essi maschi ofemmine


Esercitazione n 3

23

MALATTIE MONOGENICHE FREQUENZA IN POPOLAZIONE ADULTA TIPO DI TRASMISSIONE LOCALIZZAZIONE CROMOSOMICA REF OMIM

Ipercolesterolemiafamiliare

1 500 Autosomica dominante Cromosoma 19 143890

Corea di Huntington 1 20 000 Autosomica dominante Cromosoma 4 143100

Policistite renaledellrsquoadulto

1 1000 nati vivi Autosomica dominante Cromosoma 16 173900

Fibrosi cistica1 2000 ndash 4000popolazione caucasica

Autosomica recessiva Cromosoma 7 219700

Anemia falciforme (HbS)Molto rara in Europa molto diffusa nella popolazione nera inAfrica e in America


Talassemia Molto frequente nel bacino Mediterraneo (1 250) Autosomica recessivaCromosoma 11 catene betacromosoma 16 catene alfa

Alfa 141800Beta 141900

Fenilchetonuria 1 10 000 nati vivi Autosomica recessiva Cromosoma 12 261600

Ipofosfatemia familiare 1 20 000 X-linked dominante Cromosoma X 307800

Emofilia A 1 5000 ndash 10 000 nei maschi X-linked recessiva Cromosoma X 306700

Daltonismo(Cecitagrave al verde e alrosso)

8 nei maschi 064 nelle femmine X-linked recessiva Cromosoma X 303800

Miopatia di Duchenne 1 6000 nei maschi X-linked recessiva Cromosoma X 310200

Tabella 31

Alcune malattie monogeniche di cui egrave indicata la frequenzanella popolazione adulta il tipo di trasmissione la localizzazionecromosomica e il numero del catalogo OMIM

Per saperne di piugraveNOMENCLATURA DELLE MUTAZIONI

Un gene puograve mutare con modalitagrave diverse eogni alterazione della sequenza egrave classificatada una nomenclatura che descrive ilcambiamento avvenuto a livello nucleotidico odella sequenza aminoacidica

Sostituzione di nucleotidi

La nomenclatura 1162(G gt A) indica che inposizione 1162 della sequenza nucleotidica unaguanina egrave stata sostituita da unrsquoadenina

Delezioni e inserzioni di nucleotidi

La nomenclatura nt6232 (del5) indica chesono stati deleti 5 nucleotidi a partire dalla

posizione 6232 La nomenclatura nt409 (insC)indica che dopo il nucleotide in posizione 409 egraveinserita una citosina La nomenclatura F508indica la delezione della tripletta che codificaper lrsquoaminoacido fenilalanina che si trova inposizione 508 nella sequenza aminoacidica

Sostituzione di aminoacidi (vedi tab 32)La nomenclatura R117H indica che inposizione 117 della sequenza aminoacidicaunrsquoarginina egrave stata sostituita da una istidinaLa nomenclatura G542X indica che in posizione542 della sequenza aminoacidica un codoneglicina egrave stato convertito in un segnale di stop

A Ala ALANINA N Asn ASPARAGINA

C Cys CISTEINA P Pro PROLINA

D Asp ACIDO ASPARTICO Q Gln GLUTAMMINA

E Glu ACIDO GLUTAMMICO R Arg ARGININA

F Phe FENILALANINA S Ser SERINA

G Gly GLICINA T Thr TREONINA

H His ISTIDINA V Val VALINA

I Ile ISOLEUCINA W Trp TRIPTOFANO

K Lys LISINA Y Tyr TIROSINA

L Leu LEUCINA X CODONE DI STOP

M Met METIONINA

Tabella 32

Ogni aminoacidoviene indicatocon il codicea 1 e a 3 lettere

I polimorfismi di lunghezzadei frammenti di restrizione (RFLP)e il loro utilizzonella diagnosi di malattie geneticheGli enzimi di restrizione (ER tab 33) sono ldquoforbicimolecolarirdquo in grado di tagliare la doppia elica delDNA in siti specifici (lunghi 4-8 paia di basi) dettildquositi di restrizionerdquo generando numerosi frammentidi diversa lunghezza Ogni enzima genera una seriedi frammenti di DNA numerosi detta pattern di re-strizione specifica per una data specieUna mutazione nella sequenza di basi del DNApuograve creare o distruggere un sito di restrizione di-gerendo il DNA di individui diversi con uno stessoER si osserva quindi un polimorfismo di lunghez-za dei frammenti di restrizione (in inglese Restric-tion Fragment Length Polymorphism o RFLP)Come tutti i polimorfismi i RFLP sono eredi-tabili come caratteri mendeliani semplici (fig37) e sono trasmessi come caratteri codomi-nanti Il fenotipo di un RFLP egrave evidenziabile intermini di differenze di numero eo dimensione



24

Tabella 33

Alcuni ER con relativo organismo di provenienza sito di restrizione e posizione del taglio indicata con su ciascun filamento di DNA

Per saperne di piugraveETEROGENEITAgrave GENICA E PLEIOTROPIA

Eterogeneitagrave Genica

Per alcune malattie ereditariemonogeniche tutti gli individui affettiportano unrsquoidentica mutazionelrsquoanemia falciforme ne egrave un esempioPer molte altre malattie ci sono invecepiugrave mutazioni che possono produrre lostesso quadro patologico Quando lediverse mutazioni sono a carico dellostesso gene si parla di eterogeneitagrave

allelica Nel caso dellrsquoemofilia A adesempio il catalogo OMIM riporta 270varianti alleliche Un altro esempio egrave lafibrosi cistica causata da piugrave di 1000mutazioni diverse nel gene CFTR (Cystic

Fibrosis Transmembrane Receptor)Le diverse mutazioni possono produrrefenotipi di gravitagrave diversa (fig 34)Nel caso in cui le mutazioniavvengano in geni diversi che

collaborano alla determinazione diun fenotipo si parla di eterogeneitagrave

di locus Ad esempio in una stessavia metabolica mutazioni in genidiversi possono portare alla stessamodificazione del fenotipoEgrave il caso delle due forme diipercolesterolemia familiare A e Bdovute rispettivamente a mutazioninel gene del recettore che legale lipoproteine LDL (Low Density

Lipoprotein) localizzato sul cromosoma19 e del gene della apoproteinaB-100 (sul cromosoma 2) che media illegame della LDL al recettore (fig 35)

Pleiotropia

Questo concetto sta a indicare cheun solo gene puograve essere responsabiledi fenotipi diversi Un esempio

di pleiotropia nellrsquouomo egrave quellodellrsquoanemia falciforme una malattiacaratterizzata da diversi sintomia carico di organi e tessuti diversiQuesti possibili effetti fenotipiciderivano tutti dallrsquoazione di un soloallele mutato presente in omozigosiLrsquoeffetto diretto dellrsquoallele dellrsquoanemiafalciforme egrave quello di indurrei globuli rossi a produrre molecoleanomale di emoglobina che tendonoa unirsi fra loro e cristallizzareDi conseguenza i globuli rossiassumono una caratteristica formaa falce diventano fragili lisanoe tendono ad aggregarsi occludendoi capillari (fig 36) Tutto questoproduce molteplici danni a caricodi organi e tessuti diversi(Vedi per saperne di piugrave a pag9)

Figura 34

Descrizione dellrsquoeffetto di duetipi di mutazione a carico diesoni diversi nel gene CFTRsulla proteina di membrana

Figura 35

Apoproteina B-100che media il legametra una lipoproteinaLDL e il recettore sullamembrana cellulare

Figura 36

Ostruzione dei capillari sanguignida parte di globuli rossi falcemici

NOME DELLrsquoER PRONUNCIA ORGANISMO DI PREVENZIONESITO DI RESTRIZIONE

E POSIZIONE DEL TAGLIO

BamHI bam-acca-uno Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC CCTAGG

EcoRI eco-erre-uno Escherichia Coli RY13 GAATTC CTTAAG

HindIII ind-tre Haemophilus influenzae AAGCTT TTCGAA

DdeI di-di-e-uno Desulfovibria desulfuricans CTNAG GANTC

MstII emme-esse-ti-due Microcaleus species CCTNAGG GGANTCC

SmaI sma-uno Serratia marcescens CCCGGG GGGCCC


Esercitazione n 3

25

dei frammenti di DNA ottenuti dalla digestionecon un certo enzima di restrizione I frammentisono visibili dopo migrazione elettroforetica suun gel di agarosio (fig 37)

La tecnica della PCRper lrsquoanalisi degli RFLPLe applicazioni della PCR sono praticamente in-finite Uno degli ambiti di utilizzo egrave la diagnosi dimalattie genetiche mediante analisi dei RFLP LaPCR consente di analizzare uno specifico trattodi DNA invece di dover lavorare su tutto il DNAnucleare di una cellula ossia sul DNA genomicoPer fare diagnosi di una malattia genetica me-diante analisi di un RFLP si amplifica la regionedi DNA utilizzando una coppia di primer posi-zionati a monte e a valle del sito di restrizione(figg 37 e 38) Il segmento di DNA amplificatoviene sottoposto a digestione con lrsquoenzima direstrizione e i prodotti della digestione vengonoseparati mediante elettroforesi

Diagnosi molecolare di anemia falciformeutilizzo di un RFLP nella diagnosi direttaGli individui affetti da anemia falciforme sonoomozigoti per la mutazione HbS che consistenella sostituzione di un singolo aminoacido dei146 che formano la catena dellrsquoemoglobinaNellrsquoemoglobina HbS lrsquoacido glutammico (Glu)nella sesta posizione della catena egrave sostituitodalla valina (Val) La sostituzione aminoacidicaegrave dovuta alla mutazione A --gt T nella posizionemediana del codone 6 (fig 39 in alto)La sostituzione che converte il codone GAG(acido glutammico) nel codone GTG (valina)modifica la sequenza CCTGAGG (che interessai codoni 5 6 e 7) riconosciuta e tagliata dallrsquoenzi-ma di restrizione MstII

Figura 38

I primer della PCR vengono disegnati a monte e a valle del sito direstrizione La digestione con ER dei prodotti di PCR genera dueframmenti per lrsquoallele 1 e lascia il frammento intero per lrsquoallele 2

Figura 37

Sono mostrati i frammenti di restrizione ottenuti con digestione conlrsquoenzima EcoRI di due alleli (1 e 2) di un geneNella parte bassa della figura i prodotti della digestione del DNA deigenitori e dei figli vengono separati mediante corsa elettroforesiI genitori (corsia 1 e 2) il cui DNA mostra 3 bande corrispondentia frammenti da 500 350 e 150 pb (paia di basi) sono eterozigoti(12) il figlio (corsia 3) il cui DNA mostra 2 bande corrispondenti aframmenti da 350 e 150 pb egrave omozigote per lrsquoallele 1 (11) la figlia(corsia 4) il cui DNA mostra una sola banda da 500 pb egrave omozigoteper lrsquoallele 2 (22)

Figura 39

La figura mostra lrsquoenzima di restrizione MstII che riconosce e taglia la sequenza CCTGAGG Il DNA dellrsquoallele A vienetagliato dallrsquoenzima di restrizione Una mutazione di una singola base fa perdere il sito di taglio dellrsquoenzima MstII

e il DNA dellrsquoallele S non viene tagliato dallrsquoenzima Nella parte bassa della figura si vede il risultato della corsaelettroforetica del DNA di un individuo normale di un portatore sano e di un individuo affetto da anemia falciformeamplificati con PCR (utilizzando i primer indicati dalle frecce blu) e successivamente digeriti con lrsquoenzima MstIILrsquoindividuo normale ( A A) mostra 2 bande il portatore sano ( A S) mostra 3 bande e lrsquoindividuo affetto ( S S)mostra una sola banda di lunghezza corrispondente al DNA non tagliato

EcoRI

5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo Allele 1

150 bp350 bp

5rsquo3rsquo


500 bp

12 12

11 22

1 42 3

primer

primersito di restrizioneprimer

primer

C C T G A G G A GG G A C T C C T C

MstII

5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo

6 75Codoni

C C T G T G G A GG G A C A C C T C

5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo

1 2 3

szligSszligS

malatoszligAszligA

sanoszligAszligS

sano

mutazione

dellrsquoanemia falciforme

376 bp

201 bp

175 bp

szligA

szligS



26

In questo caso la stessa mutazione che causa lamalattia altera anche un sito di restrizione Lasemplice digestione con lrsquoenzima di restrizioneconsente di fare diagnosi diretta di malattia e diriconoscere i portatoriGli individui omozigoti ed eterozigoti sono di-stinguibili in base al tipo di bande ottenute dopodigestione del loro DNA con lrsquoenzima MstII (fig38 in basso) Amplificando con la PCR un seg-mento di DNA di 376 pb che comprende lrsquoesone1 e il sito MstII (posizionato 175 pb dallrsquoestremi-

Figura 310

Frammenti attesi dopo amplificazione con PCRe digestione con MstII degli alleli BetaS e BetaA


A differenza di quello che avviene nel casodellrsquoanemia falciforme la maggior parte dellemalattie genetiche sono dovute a numerosemutazioni diverse dello stesso gene In questocaso le diverse mutazioni responsabili dellamalattia non generano necessariamente unRFLP che possa essere usato per la diagnosidiretta Egrave invece possibile trovare uno o piugraveRFLP associati al gene-malattia (in quantolocalizzati allrsquointerno o nelle vicinanze del gene)che possono essere utilizzati per la diagnosi sitratta in questo caso di diagnosi indiretta perassociazione e non di diagnosi direttaPer poter utilizzare un RFLP come marcatoreoccorre che il gene responsabile dellamalattia sia collocato cosigrave vicino al RFLP chequestrsquoultimo possa rivelare la presenza stessadellrsquoallele malato

Un particolare RFLP puograve essere associato inalcuni individui con lrsquoallele-malattia e in altricon lrsquoallele sano Pertanto per poter utilizzareun RFLP nella diagnosi indiretta egrave necessarioesaminare non soltanto il DNA del malato mail maggior numero possibile di membri dellafamiglia per identificare il tipo di associazionepresente in quel pedigree (fig 311)A differenza della diagnosi diretta lrsquoaccuratezzadella diagnosi per associazione egrave del 100solo quando il locus malattia e il RFLP sonostrettamente associati (vicini sul cromosoma)In questo caso infatti la frequenza di crossing-

over che puograve modificare lrsquoassociazione egravetrascurabile Tanto maggiore egrave la distanza trail RFLP e il locus genico di interesse tanto piugravebassa egrave la probabilitagrave di una diagnosi accurataLrsquoimportanza dei RFLP come marcatori genetici

di associazione sta nel fatto che consentono ladiagnosi della malattia anche in casi in cui nonegrave noto il gene responsabile I marcatori RFLP (nelgenoma umano sono stati identificati migliaiadi RFLP e diverse centinaia sono stati assegnatia ciascun cromosoma) hanno consentito lamappatura di alcuni importanti geni-malattia(ad esempio egrave stato possibile localizzare ilgene della fibrosi cistica in posizione distale delbraccio lungo del cromosoma 7)Un secondo aspetto da prendere inconsiderazione egrave che non sempre un dato RFLPpuograve essere utilizzato ai fini della diagnosiindiretta Egrave necessario che nella famiglia sianopresenti i due alleli (se tutti gli individui dellafamiglia sono portatori dello stesso allele delRFLP studiare quel RFLP in quella famiglia nonegrave significativo)

UTILIZZO DI UN RFLP NELLA DIAGNOSI INDIRETTA

RICERCA DI UN RFLP ASSOCIATO A UN ALLELE-MALATTIA

Figura 311

Il pedigree mostra lrsquoereditarietagrave di un marcatore RFLPattraverso tre generazioni di una famiglia in cui egravepresente una malattia recessiva legata al cromosomaX Nella famiglia sono presenti gli alleli (+) presenza disito di restrizione e (-) assenza del sito di restrizioneTutti gli individui malati sono maschi e presentanolrsquoallele (+) Tutti gli individui portatori dellrsquoallele (-)sono sani si puograve dedurre che lrsquoallele malattia siastrettamente associato allrsquoallele (+) di questo RFLP Siala madre (II 1) che la nonna I 1 sono eterozigoti portatricisane in cui lrsquoallele (+) egrave associato allrsquoallele malattiaLrsquoallele (-) del RFLP egrave associato allrsquoallele sano del genemalattia come dimostrato da I 2 III 5 III 6 e III 7Nella figura a destra una corsa elettroforetica del DNA diindividui con alleli ++ -- e +- dopo digestione con ER

376 pb szligS

175+201 pb szligA

+- -Y

+-

-Y

-Y

--I

II

III -Y-Y-Y-- --+-+Y+Y

31 2 4

--Ref ++ +-

10 kb

7 kb

3 kb

2 kb

07 kb

1

1

1 2 3 4 5 6 7 8

2 3 4

tagrave 5rsquo) e digerendo poi il prodotto della PCR conlrsquoenzima direstrizione MstII (fig 39) qual egrave il numero e lalunghezza (in pb) delle bande che vi aspettate ditrovare nel caso di individui omozigoti normalieterozigoti o omozigoti affettiAnche se sarebbe sufficiente analizzare solo ilDNA del feto analizzeremo anche il DNA deigenitori e quello dei fratelli sani per confermarela condizione di eterozigositagrave dei genitori e poteridentificare tra i fratelli un eventuale portatore


Esercitazione n 3

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LrsquoesperimentoSimuliamo una consulenza geneticaSiete un genetista medico e lavorate in un consul-torio geneticoSi presenta una giovane donna (etagrave 35 anni) chevive a Milano ma egrave di origine sarda Ha avuto 3 fi-gli I primi due un maschio e una femmina sonosani Al terzo figlio maschio che aveva manife-stato un ittero dovuto a una crisi emolitica egrave sta-ta diagnosticata lrsquoanemia falciforme Egrave in attesa diun quarto figlio (egrave alla fine della sesta settimana digravidanza) e vorrebbe informazioni sul rischiodi avere un altro figlio malato Aggiunge che unsuo zio materno scapolo ha la stessa patologia Auna indagine piugrave approfondita la donna riferisceche suo marito il padre dei suoi figli egrave anchrsquoessosardo di origine ed egrave suo cugino primoViene suggerito alla donna di sottoporsi ad am-niocentesi per effettuare lrsquoanalisi del DNA e de-terminare il genotipo del nascituroSapendo che lrsquoanemia falciforme egrave una malattiaautosomica recessiva costruite in base ai dati

raccolti dallrsquoanamnesi familiare il pedigree dellafamigliaChe probabilitagrave ha il nascituro di essere sanoDi avere lrsquoanemia falciforme Di essere portatoredellrsquoallele mutatoLrsquoanalisi del DNA consente di identificare il ge-notipo del nascituro e quindi di trasformare unaprobabilitagrave in un dato certoAnche se sarebbe sufficiente analizzare solo ilDNA del feto analizzeremo anche il DNA deigenitori e quello dei fratelli sani per confermarela condizione di eterozigositagrave dei genitori e poteridentificare tra i fratelli un eventuale portatoreVengono fornite delle provette contenenti i pro-dotti di PCR ottenuti amplificando il DNA deidiversi famigliari analizzati (fig 312) Le provet-te sono identificate nel seguente modo (tra pa-rentesi egrave indicata la loro posizione nel pedigree)

il padre (III1)la madre (III2)il primo figlio (IV1)

Per saperne di piugraveANEMIA FALCIFORME (SCD)

Lrsquoanemia falciforme chiamata anchedrepanocitosi e sickle cell disease SCD (dalnome greco e inglese usato rispettivamente perindicare la parola italiana ldquofalcerdquo) egrave una malattiaereditaria autosomica recessiva caratterizzatadalla classica forma a falce che hanno i globulirossi degli individui affetti

Manifestazioni patologiche

La malattia si manifesta nei primi due anni di vitacon un ampio spettro di sintomi a carico di organie sistemi diversi legati allrsquoaumentata distruzionedei globuli rossi (emolisi) che contengonoemoglobina S (la vita media di un globulo rossofalcemico egrave di soli 20 giorni anzicheacute di 120come invece avviene per i globuli rossi normali)alle crisi da occlusione dei vasi sanguigni eallrsquoaccumulo di cellule falciformi nella milzalrsquoorgano deputato alla distruzione dei globuli rossiLa lisi dei globuli rossi causa anemia cronica conconseguente ittero scarso sviluppo fisico ritardomentale insufficienza cardiaca Lrsquoinsufficienteapporto di sangue a vari distretti causa danni adiversi tessuti e organi infarti cerebrali (ictus)necrosi ossee sindrome polmonare acuta chepuograve risultare letale crisi dolorose improvvise di

durata variabile tumefazioni dolorose al dorsodelle mani e dei piedi (dactilite) Lrsquoaccumulo di

globuli rossi falcemici nella milza la costringea un iperlavoro e ne provoca ingrossamentoe fibrosi con riduzione della funzionalitagrave econseguente aumento della suscettibilitagrave alleinfezioni Negli omozigoti la malattia egrave gravee di solito conduce a morte in etagrave infantileNegli eterozigoti invece egrave benigna rendendosievidente solo in occasione di particolari sforziche richiedono notevole consumo e trasportoefficiente di ossigeno

Terapia

Attualmente non esiste una terapia in grado dirisolvere tutte le patologie legate allrsquoanemiafalciforme Si possono perograve utilizzare varifarmaci che possono attenuare i sintomi erendere piugrave sopportabile la vita per i malatiPer esempio si usano antidolorifici per sedarele crisi dolorose antibiotici e vaccini per curaree prevenire le infezioni trasfusioni di sangueche diluiscono i globuli rossi anomali e riduconole complicanze legate al sovraccarico di lavorodella milza Si puograve inoltre ricorrere al trapianto

di midollo osseo

Frequenza dellrsquoallele


Questa malattia egrave rara in Europa ma moltofrequente in Africa tra i neri drsquoAmerica ein genere nelle zone malariche del pianetaQuesta diversa distribuzione egrave dovuta al fattoche i globuli rossi degli individui portatori(eterozigoti) hanno maggiore resistenza verso ilPlasmodium falciparum lrsquoagente della malariarispetto ai globuli rossi dei soggetti sani Questovantaggio genetico degli eterozigoti ha favorito ilmantenimento dellrsquoallele dellrsquoanemia falciformenelle zone malariche Dopo la bonifica di talizone la frequenza dellrsquoallele szligS diminuisce peresempio nella popolazione di neri americanidopo piugrave di 6 generazioni la frequenza dellrsquoalleleszligS egrave 5 (frequenza di malati alla nascita 1500e circa 1 individuo su 12 egrave eterozigote) mentrenella regione dellrsquoAfrica da cui provengono lafrequenza supera il 20 (125 egrave malato) (veditab 31) Lo stesso vale per i cittadini americanicon origini nelle regioni paludose dellrsquoItaliadella Grecia di Cipro e del Medio Oriente

Figura 312

Albero genealogico della famigliaesaminata il probando egrave il figlioche deve ancora nascere della 4deggenerazione (indicato con un rombo e unpunto di domanda poicheacute ancora non sene conosce il sesso)

Scenario anemia falciforme

1 2

1 2 3 4

1

1 3 42

2

6

I

II

III

IV



28

la figlia (IV2)il figlio malato (IV3)il probando cioegrave lrsquoindividuo da cui egrave nata la richie-sta di analisi genetica in questo caso il feto (IV4)

Aggiungete a ogni provetta eppendorf contenen-te 8 μl di DNA 2 μl di enzima di restrizione MstIIcon lrsquoopportuno tampone di digestionePosizionate le provette in un termoblocco allatemperatura di 37 degC per 1 ora

Per saperne di piugraveMETODI DI PRELIEVO DI MATERIALE FETALE PER POTER ESEGUIRE LA DIAGNOSI PRENATALE

Per diagnosi prenatale (DP) si intende lrsquoinsieme diindagini finalizzate a individuare nel feto la presenza dipatologie di diversa origine (genetica infettiva ecc)Tali tecniche comprendono

le ecografie e le ecotomografiele indagini citogenetiche cioegrave lo studio del cariotipole analisi sul DNA mediante tecniche di Geneticamolecolare

Le analisi sul DNA mediante le tecniche della Geneticamolecolare possono essere effettuate su cellule fetaliprelevate

dal liquido amniotico (AMNIOCENTESI)dai villi coriali (VILLOCENTESI)dal cordone ombelicale (FUNICOLOCENTESI)da altri tessuti del fetodal sangue materno che puograve contenere DNA fetale(tecnica ancora da perfezionare)

Amniocentesi

Lrsquoamniocentesi (fig 314) consiste nel prelievo di liquidoamniotico mediante un ago sottile lungo fino a 15 cmpenetrando attraverso la parete addominale della madrecon lrsquoaiuto e la guida simultanea delle immagini ottenuteper mezzo di unrsquoecografia Il liquido contiene cellule chesi sono sfaldate dallrsquoembrioneQuesto prelievo non puograve essere effettuato prima della15a settimana ed egrave attualmente raccomandato a tutte lemadri che abbiano superato i 35 anni

Villocentesi

La villocentesi (fig 315) consiste nel prelievo di un campionedi tessuto appartenente ai villi coriali I villi coriali sonoestensioni digitiformi del corion che si sviluppano a partiredalla placenta verso lo spazio sanguigno materno che egrave postonella parete dellrsquoutero In passato il prelievo era effettuato pervia transcervicale ossia mediante un sottile tubicino (catetere)o una pinza introdotta attraverso la vagina Attualmente sipreferisce la via transaddominale cioegrave utilizzando un agoattraverso la parete addominale della madre La villocentesipuograve essere effettuata giagrave a partire dalla 9a settimana

Funicolocentesi

La funicolocentesi consiste nel prelievo di sangue fetale purodal cordone (= funicolo) ombelicale per mezzo di un ago pervia transaddominale e puograve essere effettuata solo a partiredalla 18 a settimana

Tutte queste tecniche diagnostiche sono attualmente in rapidoe notevole sviluppo tuttavia comportano ancora alcuni rischiper la madre e per il feto la cui incidenza egrave molto variabile indipendenza delle metodologie utilizzateRischi minori sono infezioni o emorragie ma si possonoverificare anche lesioni del fetoLa complicanza fetale piugrave rilevante (aborto) si puograve averein seguito al prelievo di villi coriali ma poicheacute egrave moltodifficile distinguere i casi di aborto spontaneo (che nelledonne con piugrave di 35 anni puograve variare comunque dal 2al 109) non egrave possibile determinare con precisione ilreale rischio legato a questa tecnica

Figura 313

Schema del gel dopo corsaelettroforetica si evidenziano i genotipidei soggetti eterozigoti (tre bandecorsie 1 2 6) omozigoti normali (duebande corsie 3 e 4) omozigoti affetti(una banda corsia 5)

Figura 314

Tecnica di prelievo del liquidoamniotico

Figura 315

Tecnica di prelievo dei villi corialiUn ago egrave inserito attraversola parete addominale della madreper prelevare un campionedi tessuto fetale dal corion

La digestione con enzimi di restrizione va con-dotta a 37 degC in una soluzione tampone (fornitainsieme allrsquoenzima dal produttore) che garanti-sce le condizioni ottimali (di salinitagrave e pH) perla digestione Il tempo di incubazione varia aseconda se si digerisce DNA genomico o fram-menti di DNA corti (ad esempio un prodotto diPCR come nel nostro caso) Nel primo caso ladigestione richiede almeno 8 ore (o tutta la not-te) Nel secondo caso sono sufficienti da 1-2 oreGli enzimi di restrizione sono reagenti costosi edelicati Temono le contaminazioni (usare pre-cauzioni nel prelevare lrsquoenzima dalla soluzionestock) e lrsquoinattivazione (si devono conservare a-20degC e al momento dellrsquouso mantenere semprein un bagno di ghiaccio)

Risultato della consulenza geneticaLa lettura del gel (fig 313) conferma il genotipoeterozigote dei genitori e il genotipo omozigoterecessivo di IV 3 (malato) IV 1 e IV 2 sono saniIV 4 (il feto) egrave portatore di anemia falciforme

2PM 1 3 654 7

III 2III 1 IV 1 IV 4IV 3IV 2 C

587

458434

298267236

174

10280


Esercitazione n 4

29

Cosa vuol dire clonareLa parola ldquoclonerdquo indica la ldquocopia identicardquo diqualcosa e deriva dal greco klon che significagermoglio o ramoscello infatti nei vegetali a par-tire da un ramoscello egrave possibile ottenere lrsquointerapianta In Biologia si parla di clonaggio moleco-lare e di clonazione nel primo caso si indica lapossibilitagrave di ottenere copie di un frammento diDNA di qualsiasi essere vivente con il termineclonazione invece si intende la ldquoduplicazionerdquo diun intero organismo possibilitagrave che evoca spessopaure e fantasmi abbondantemente sfruttati dacinema e letteratura In realtagrave clonare un anima-le superiore egrave un procedimento complesso e disuccesso limitatissimo e la clonazione funzionameglio con gli organismi unicellulari (come nelcaso di batteri adibiti a produzioni utili ad esem-pio i batteri ingegnerizzati per produrre insulinaumana)Lrsquoindustria biotecnologica si basa spesso su mi-crorganismi a cui si ldquoinsegnardquo a produrre sostan-ze utili microrganismi che vengono modificatigeneticamente e che duplicandosi ldquoclonanordquo ilgene estraneo in essi inserito

Spesso per i ricercatori egrave molto utile avere nume-rose copie di singoli geni percheacute in questo modoegrave possibile sequenziarli o utilizzarli come ldquosonderdquoper studiarne lrsquoespressione in tessuti o in interiorganismi Alternativamente egrave anche possibi-le rompere il genoma di un organismo clonarei singoli frammenti e ottenere cosigrave le cosiddettelibrerie (library) nelle quali vengono conservatiquesti frammenti di DNA Queste librerie (chia-mate anche ldquogenotecherdquo) possono essere conser-vate in azoto liquido indefinitivamente e succes-sivamente utilizzate per finalitagrave specifichePer clonare un gene si sfrutta la potenza e lrsquoeffi-cienza della capacitagrave replicativa dei microrgani-smi Se si riesce a inserire il gene di interesse inun batterio o in un lievito e lo si lascia replicareotterremo molte copie del gene di partenza Ilproblema egrave come introduciamo questo geneAlcuni microrganismi (come i batteri) hanno lacapacitagrave di assumere DNA dallrsquoambiente esternoma questo processo egrave raro e poco efficiente senzacontare che se il DNA esogeno non si inseriscenel cromosoma batterico non verragrave tramandatoalla progenie rendendo il clonaggio impossibile

4 Clonaggio del DNAbianco o blu

Attraverso questo esperimento egrave possibile trasformare cellule di Escherichia colicon un plasmide ldquoricombinanterdquo che contiene un inserto di DNA esogenoLe cellule batteriche trasformate con il plasmide ricombinante sono riconoscibilipercheacute generano colonie bianche invece che colonie blu Nella seconda parte dellrsquoesperimentoattraverso lrsquoestrazione del DNA plasmidico da colonie bianche e blu la sua digestione con enzimidi restrizione e la separazione dei frammenti di DNA tramite elettroforesi su gel di agarosiosi potragrave evidenziare e valutare la grandezza del segmento di DNA esogeno inserito nel plasmide


Il dogma centraledella BiologiaCellule procarioticheed eucarioticheI batteriIl genoma battericoe la sua organizzazioneGli operoniLa riproduzione nei batteriLa scoperta dellatrasformazione battericaGli enzimi di restrizione



30


Vengono cosigrave utilizzati dei vettori di clonaggiocome i plasmidi in cui si inserisce il gene di inte-resse generando cosigrave vettori ricombinanti chesuccessivamente vengono introdotti allrsquointernodel microrganismo

Clonaggio molecolareIl clonaggio di un gene egrave costituito da diversetappe qui di seguito riportate

Costruzione del vettore ricombinante(vedi Esercitazione n2)

1) Taglio con enzima di restrizione dalle cellu-le che contengono il DNA da clonare ad esempiocellule umane viene estratto il DNA genomicoe amplificato il gene (o frammento) di interesse(detto anche gene esogeno) I DNA esogeno eplasmidico vengono tagliati con lo stesso enzimadi restrizione per generare estremitagrave compatibili

2) Ligazione egrave un processo di saldatura traframmenti di DNA che possono derivare ancheda organismi molto distanti tra loro da un punto

DNAsuperavvolte

a) b)

ori = Sequenza di origine di replicazioneampR = Gene per la resistenza alla ampicillina

lacZ+ = Gene per la -galattosidasi

ori

ampR

lacZ+

pUC19(2686 kb)

EcoRI KpnI

Sacl Xmal

Smal

Xbal

Sito di clonaggio multiplo (Polynker)

BspMI SphI

BamHl

Sal I

Hinc II

Accll PstI Hind III

Plasmide pUC19tagliato conlrsquoenzima Ecor RI

DNA genomicotagliatocon lrsquoenzima EcoRI

Il plasmide e il DNAgenomico si legano

Il DNA genomicosi richiude se stesso

Due plasmidisi leganoassieme Il plasmide si

richiude suse stesso

cresce su terrenocon ampicillina


non cresce su terrenocon ampicillina

Cellula di Ecoli trasformatasolo dal plasmide

Cellula di Ecoli trasformatadal plasmide ricombinante

Figura 41

Il vettore di clonaggio pUC19 Questo plasmidepossiede unrsquoorigine di replicazione (ori) un marcatoreselettivo (ampR) e un polylinker localizzato allrsquointernodel gene lacZ+ che codifica per la -galattosidasi

In questo esperimento utilizzeremo il plasmide

pUC19 (fig 41) della cosiddetta serie pUC(p indica plasmide UC sono le iniziali dellaUniversity of California che ha messo a puntoquesto vettore di clonaggio il numero chesegue la sigla pUC indica il numero di seriedel plasmide ingegnerizzato) I plasmidi pUChanno dimensioni molto piccole e sono presentinellrsquoospite batterico E coli in un alto numero dicopie cosigrave da rendere agevole e facile la loropurificazioneI plasmidi pUC contengono come marcatoredi selezione il gene ampR una seconda formadi selezione permette di distinguere in modofacile e visivo (con un test colorimetrico dettoldquobianco o blurdquo) le cellule di E coli che sonostate trasformate dal solo vettore (vettore nonricombinante) o dal vettore ricombinante checontiene il DNA esogenoNormalmente i plasmidi hanno DNA circolare adoppio filamento anche se esistono dei plasmidicon DNA lineare Come riportato in figura42a allrsquointerno delle cellule di E coli il DNAplasmidico si trova in una forma caratteristicacircolare a doppio filamento superavvolto intornoallrsquoasse della doppia elica Tale struttura viene

chiamata ldquostruttura superavvoltardquo e essendola struttura piugrave stabile dal punto di vistatermodinamico egrave quella presente in naturaIn figura 42b si puograve osservare unrsquoimmagineal microscopio elettronico di molecole di DNAplasmidico superavvolte

Figura 42

I plasmidi sono molecole di DNA circolarisuperavvolte (a) Rappresentazione schematicadi una molecola di DNA a doppio filamento(a sinistra) con struttura circolare (al centro)e superavvolta (a destra) (b) Fotografie almicroscopio elettronico di DNA plasmidicosuperavvolto

Figura 43

Formazione di diversi prodotti di ligazione e lorointroduzione allrsquointerno di cellule di E coli

I PLASMIDI COME VETTORI DI CLONAGGIO


Esercitazione n 4

31

di vista evolutivo come batteri e uomo La liga-zione egrave una tappa indispensabile per effettuareil clonaggio molecolare e consente di formaremolecole di DNA ricombinante In presenzadi un opportuno tampone lrsquoenzima DNA ligasicatalizza il legame covalente (legame fosfodieste-rico) tra le due molecole di DNA La molecola diDNA introdotta nel vettore viene spesso chiama-ta insertoI prodotti della reazione di ligazione possono es-sere molecole di diverso tipo (fig 43)

molecole ricombinanti vere e proprie (vettore+ inserto)molecole di vettore che si egrave richiuso su se stes-so senza aver incorporato lrsquoinsertomolecole di solo inserto richiuse su se stessemolecole di vettore che sono rimaste lineari emolecole ricombinanti contenenti piugrave di uninserto (non illustrate nella figura)

Pertanto quando si effettua un esperimento ditrasformazione batterica con una miscela di liga-zione possono penetrare molecole diverse allrsquoin-terno delle cellule batteriche Tra queste solo lemolecole di vettore con struttura circolare sianoesse ricombinanti (cioegrave con inserto) oppure nonricombinanti (cioegrave senza inserto) danno luogoalla formazione di ceppi trasformati capaci dicrescere in terreno selettivo con antibiotico

Trasformazione battericacon plasmidi ricombinantiAlcuni batteri sono capaci naturalmente di as-sumere DNA dallrsquoesterno e questa loro capacitagraveegrave stata individuata perfezionata e utilizzata dairicercatori come il mezzo ideale per clonare mo-lecole di DNA Tuttavia sono pochi i generi bat-terici che sono naturalmente trasformabili qualiStreptococcus Bacillus e Haemophilus Inoltre inuna popolazione di batteri solo una frazione dicellule egrave trasformabile tale proprietagrave prende ilnome di competenzaPer poter utilizzare E coli in esperimenti di clo-naggio molecolare si devono rendere ldquocompe-tentirdquo le sue cellule per consentire al DNA delvettore di attraversare la parete e la membranaplasmatica e penetrare allrsquointerno dove puograve es-sere replicato e espressoPer rendere competenti le cellule di E coli unodei metodi piugrave semplici consiste nel coltivare ibatteri in terreno liquido raccogliere le cellulemediante centrifugazione risospenderle in unasoluzione di CaCl2 fredda e mantenere la sospen-

Per saperne di piugraveESCHERICHIA COLI

Il batterio Escherichia coli (abbreviatoin E coli il nome deriva da TheodorEscherich medico e batteriologo tedescoche lo scoprigrave nel 1885) egrave un bacilloGram-negativo e vive generalmentenellrsquoapparato digerente degli organismia sangue caldo La maggior parte dellevarietagrave di E coli sono innocue fannoparte della normale flora battericaintestinale e sono utili al loro ospitepoicheacute producono la vitamina K2 eprevengono le infezioni di altri batteripatogeni Alcune varietagrave come quelledella serie O157H7 possono contaminarei cibi e causare gravi avvelenamentiE coli egrave stato il primo organismo modelloper studi di Biologia molecolare e diVirologia batterica specialmente per lostudio del batteriofago lambdaI diversi tipi di batteri della specie coli

e tutti gli altri simili che vivono sulterreno (nel suolo o in piante in via diappassimento) vengono raggruppatiinsieme sotto il nome di coliformi Illdquogruppo coliformerdquo comprende batteriGram-negativi a forma di bastoncino(bacilli) aerobi e allrsquooccorrenza anaerobiche non formano spore e che fermentanoil lattosio I ceppi di E coli sono spessospecie-specifici rispetto allrsquoospiterendendo possibile determinare lrsquooriginedella contaminazione nellrsquoambiente Peresempio riconoscendo il tipo di E coli che

contamina le acque possiamo capire selrsquoinquinamento egrave causato dallrsquouomo daaltri mammiferi o da uccelliGrazie alla versatilitagrave e facilitagrave dimanipolazione E coli gioca un ruolomolto importante nella Biologiamolecolare e nellrsquoindustria microbiologicaSi puograve affermare che le Biotecnologienacquero negli anni settanta del secoloscorso grazie al lavoro di Stanley NormanCohen e Herbert Boyer i quali usandocellule di E coli plasmidi enzimi direstrizione e ligasi crearono le primemolecole di DNA ricombinante Unadelle prime utili applicazioni dellatecnologia del DNA ricombinante egrave statala produzione di insulina umana da partedi cellule di E coli trasformate Esistecomunque una limitazione non si puogravefar produrre a E coli proteine complessee con modificazioni post-traduzionalitipiche delle proteine eucariotiche

sione cellulare in ghiaccio per un certo tempoDopo questo trattamento le cellule di E coli sonoin grado di acquisire DNA a doppio filamento(come il DNA plasmidico fig 44) Non sonocomprese del tutto le ragioni che rendono com-petenti le cellule di E coli si ipotizza che lrsquoingres-so del DNA nelle cellule sia favorito dalla presen-za degli ioni bivalenti positivi di Ca++ che vannoa mascherare le cariche negative del DNA e adestabilizzare la membrana Con tale procedurasi ottengono efficienze di trasformazione dellrsquoor-dine di 105-106 trasformanti per microgrammodi DNA plasmidico un valore piugrave che sufficien-te per molti scopi scientifici Tuttavia quando sieffettua un esperimento di clonaggio molecolaretramite trasformazione solo una piccola percen-tuale dei batteri viene trasformata per cui egrave indi-spensabile poter distinguere le cellule batteriche



32

trasformate da quelle non trasformate Ciograve egrave resopossibile ricorrendo allrsquouso dei cosiddetti ldquomar-catori selettivirdquo come la resistenza ad alcuni anti-biotici una caratteristica che le cellule battericheacquisiscono solo se hanno introdotto al lorointerno il plasmide Come verifica della compe-tenza (il controllo positivo dellrsquoesperimento)viene effettuata una trasformazione batterica conquantitagrave note di pUC19 Tale controllo permetteanche di calcolare lrsquoefficienza di trasformazio-ne nellrsquoesperimentoBisogna inoltre verificare che la crescita delle cel-lule su terreno con antibiotico dopo la trasfor-

mazione sia dovuta allrsquoacquisizione del vettoredi clonaggio e non a una precedente caratteristicadella popolazione batterica Per fare ciograve si effettuaanche un controllo negativo in cui la miscela diligazione egrave sostituita da acquaTuttavia come egrave possibile determinare se le cel-lule batteriche che crescono su un terreno con-tenente lrsquoantibiotico contengono il plasmidericombinante oppure quello non ricombinanteEsistono diversi modi uno dei quali egrave illustratonel paragrafo successivo e costituisce lrsquoobiettivodella prima parte del nostro esperimento di labo-ratorio

_ _

__

_

_ _

_ _

_

_

_ _ _ _ _

__

_

_ _ _ _ _

_ _ _

membrana plasmaticainterno

DNA

fosfolipidi

esterno

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++ Ca++

Ca++ Ca++

Ca++

Ca++

Figura 44

Membrana plasmatica di cellula batterica resa competentedal trattamento con CaCl2 che permette il passaggio del DNAdallrsquoesterno verso lrsquointernoLe dimensioni del DNA e della membrana non sono in scala


Esercitazione n 4

33

Per saperne di piugraveCOLTIVAZIONE DI BATTERI IN LABORATORIO

come lrsquoagar un polisaccaride complesso che adalta temperatura egrave liquido ma che a temperaturaambiente determina la solidificazione del terrenoSia in terreno liquido che in terreno solido la

crescita ottimale dei batteri avviene in condizionidefinite di temperatura aerazione e pHIn un terreno liquido egrave possibile seguire lacrescita dei batteri sia contando direttamente ilnumero dei batteri al microscopio sia misurandocon lrsquoutilizzo di uno spettrofotometro lrsquoaumentodella torbiditagrave della coltura che egrave funzione delnumero di batteri presenti nel terreno (fig 45)Durante la fase esponenziale della crescita lecellule di E coli si dividono ogni 20 minuti circaAliquote di colture liquide di batteri possonoessere distribuite (piastrate) su capsule di Petri

contenenti terreno solido Ogni batterio vitale sidivideragrave sul terreno fino a generare una coloniavisibile a occhio nudo In circa 12 ore (ossiaincubando la piastra in un termostato a 37 degCover night dalla sera alla mattina) ogni cellula diE coli genera una colonia che contiene circa 107

cellule (figg 46 47 e 48)Se si piastrano troppe cellule le colonie finirannoper confluire una nellrsquoaltra e non saranno piugravedistinguibili e contabili (figg 46 e 48)

OD

60

0

tempo (ore)

001

0 81 2 3 4 5 6 7

01

1

10

I batteri possono essere coltivati in laboratoriofacendoli crescere in opportuni terreni di colturache contengono tutti quei materiali biologici osintetici in grado di fornire un ambiente ottimaleper la crescita di un particolare ceppo battericoA tale scopo sono stati sviluppati centinaia diterreni di coltura diversi I componenti dei terrenipiugrave comuni possono comprendere estratti ditessuti di lieviti peptone (derivato dallrsquoidrolisiparziale di proteine) ecc Questi composti sonochimicamente poco definiti per cui i terreni cheli contengono sono solitamente chiamati terreni

complessi o massimi Spesso vengono perograveutilizzati terreni a composizione chimica bendefinita chiamati terreni sintetici o definiti Aquesti terreni si aggiungono spesso zucchericome ulteriore fonte drsquoenergiaUna tipica curva di crescita di una popolazionebatterica egrave riportata in figura 45 Essa egravecaratterizzata da diverse fasi

una fase iniziale di adattamento (fase ldquolagrdquo)in cui il numero di cellule aumenta moltolentamenteuna fase di crescita esponenziale ologaritmica (fase ldquologrdquo) in cui vi egrave attivacrescitauna fase stazionaria in cui il numero dicellule rimane costanteuna fase di morte per esaurimentodei nutrienti o per accumulo di prodottimetabolici tossici

I batteri possono crescere sia in terreni solidi chein terreni liquidi (fig 46) Nel primo caso vieneaggiunto al terreno liquido un agente gelificante

Un terreno solido nutritivoviene inoculato con un

piccolo numero di batteri

Crescita di unrsquoora

Dopo poche oredi

raddoppiamentidella popolazione

in colturasaranno presentimilioni di cellule

Dove si deposita un batteriosi forma una colonia

Si forma un tappetosolido di batteri

Il terreno diviene semprepiugrave torbido man mano

che i batteri si moltiplicano

Un terreno solido nutritivoviene inoculato

con 108-109 batteri

crescitacrescita crescita

Un terreno liquidonutritivo viene inoculato

con batteri

Cellule di Ecoliin sospensioneliquida

Dopo 12 ore di incubazione a 37 degC sullapiastra Petri si notano piccole colonie

Dopo 2436 ore di incubazione le coloniesono ben visibili a occhio nudo

La sospensione vienepiastrata su agar

Figura 45

Curva di crescita di una popolazione batterica Inquesta curva non egrave indicata la fase di morte Lacrescita dei batteri viene determinata misurandoallo spettrofotometro la densitagrave ottica (OD) cioegravelrsquoassorbanza di una sospensione contenente i batteria una lunghezza drsquoonda di 600 nm Lrsquoasse delleordinate egrave rappresentato in scala logaritmica

Figura 46

Coltura dei batteri in terreno solido e in terreno liquido

Figura 47

Fasi di piastramento e crescita delle colonie

Figura 48

Crescita di batteri su unterreno solido (capsula diPetri) in funzione della densitagravedi piastramento Le coloniebatteriche sono facilmentedistinguibili e contabili solopiastrando quantitagrave limitatedi batteri (a destra) in casocontrario si ha una crescitaconfluente che non permette ilconteggio (a sinistra)



34

Per distinguere le cellule batteriche che hanno ac-quisito il vettore con inserto (vettore ricombinante)da quelle che hanno acquisito il solo vettore (vetto-re non ricombinante) si allestisce un test colorime-trico (bianco o blu) per comprendere il quale egrave ne-cessario conoscere il funzionamento dellrsquooperonelattosio (operone lac) (fig 49)I batteri utilizzano per il loro metabolismo sostan-ze organiche ad esempio tra i carboidrati il gluco-sio quando nellrsquoambiente di crescita crsquoegrave a disposi-zione il lattosio invece del glucosio si attivano inmodo coordinato i 3 geni strutturali dellrsquoopero-ne lac che codificano i seguenti enzimi

la β-galattosidasi (prodotta dal gene lacZ) enzi-ma che idrolizza il legame β-glicosidico del latto-sio convertendolo nei due monomeri (glucosioe galattosio) che verranno utilizzati dal batteriola β-galattoside permeasi (prodotta dal genelacY) una proteina di membrana che favori-sce lrsquointroduzione del lattosio allrsquointerno dellacellula mediante trasporto attivola tiogalattoside transacetilasi (prodotta dalgene lacA) che libera la cellula dai tiogalatto-sidi tossici importati insieme al lattosio

Questi tre geni sono trascritti solo se nel ter-reno di crescita egrave presente lattosio infattilrsquoespressione dellrsquooperone lac egrave controllata dauna proteina regolatrice nota come represso-re lac codificata dal gene regolatore lacI (fig410) situato a monte dei geni strutturali Ilrepressore blocca la trascrizione dei tre genistrutturali quando non crsquoegrave lattosio disponibilein quanto si lega a una sequenza lrsquooperatoresituata a monte dei geni strutturali e bloccalrsquoaccesso alla RNA polimerasi

Come semplificato in figura 41 il vettore pUCcontiene il gene selvatico (o wild type) lacZ checodifica la β-galattosidasi Nel vettore il polylin-ker cioegrave il sito di clonaggio in corrispondenza delquale avviene lrsquoinserimento del DNA esogeno egraveposizionato allrsquointerno del gene lacZNei vettori ricombinanti in cui il frammento diDNA egrave inserito a livello del polylinker (fig 411) ilcodice di lettura del gene della β-galattosidasi vieneinterrotto e quindi nelle cellule trasformate nonpuograve essere prodotta β-galattosidasi funzionaleSe una cellula batterica viene trasformata dal soloplasmide pUC (cioegrave dal vettore di clonaggio nonricombinante) in presenza di IPTG (isopropil-tiogalattoside un analogo del lattosio che fa da in-duttore artificiale dellrsquooperone lac) e di un substra-to cromogeno della β-galattosidasi come lrsquoX-gal(5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-galattoside) laβ-galattosidasi scinde lrsquoX-gal in un prodotto pre-cursore dellrsquoindaco Le colonie batteriche quindi

DNA

mRNAmRNA 5rsquo

lattosio proteinarepressore inattivata

5rsquo

3rsquo

lac I lacZ lacY lacA

RNA polimerasi

gene regolatore

galattosidasi Permeasi Transacetilasi

operone lac

RNApolimerasi

non si forma mRNA

proteina repressore attiva

mRNA5rsquo

3rsquo

DNAlaci lacZ

gene regolatore operatorepromotore

Bianco o bluScopriamo se il clonaggiodel gene ha avuto successo

Figura 49

Lrsquooperone lac egrave regolato dallaproteina repressore codificata dalgene lacI In presenza di lattosioil repressore perde lrsquoaffinitagrave per lasequenza operatore (in giallo) e laRNA polimerasi puograve trascrivere igeni strutturali dellrsquooperone

Figura 410

In assenza di lattosio ilrepressore si lega allasequenza operatore (in giallo)e la RNA polimerasi non puogravetrascrivere i geni strutturalidellrsquooperone


Esercitazione n 4

35

assumeranno un colore blu Se nel gene lacZ delplasmide egrave stato inserito del DNA estraneo le cel-lule batteriche trasformate non producono piugrave laβ-galattosidasi Pertanto in presenza di IPTG edi X-gal nel terreno di coltura lrsquoX-gal non vienetrasformato nel precursore dellrsquoindaco Di con-seguenza le colonie batteriche trasformate con ilvettore ricombinante saranno bianche (fig 411)

LrsquoesperimentoPer eseguire la prima parte dellrsquoesperimento sca-ricate le schede del protocollo di laboratorio cheriguardano lrsquoattivitagrave 1 ldquoBianco o blurdquo

Risultati ed interpretazioneIl ceppo di E coli utilizzato (XL1 Blue) egrave costituitoda cellule batteriche mutanti (lacZ-) cioegrave che nonproducono β-galattosidasi endogena e ampicilli-na-sensibili (amps) cioegrave non in grado di formarecolonie in un terreno contenente lrsquoantibiotico am-picillina Esso acquisisce la capacitagrave di crescere inpresenza di ampicillina solo se trasformato con ilvettore che porta come marcatore di selezione ilgene per la resistenza allrsquoampicillina Pertanto il ri-sultato atteso dopo trasformazione egrave il seguente

Le cellule che crescono su ampicillina hanno per-tanto acquisito il vettore Quanto al colore dellecolonie esse saranno solo blu se i batteri sonostati trasformati con pUC19 alcune bianche ealcune blu se la trasformazione egrave stata effettuatacon la miscela di ligazione

RICOMBINANTE O NON RICOMBINANTELA PROVA MOLECOLARE DELLA PRESENZADELLrsquoINSERTO DI DNA NEL PLASMIDEIn base a quanto detto precedentemente egrave ragione-vole supporre che le cellule batteriche bianche sianostate trasformate dal vettore ricombinante Non viegrave ancora tuttavia la dimostrazione formale che ciogravesia vero Per ottenere tale dimostrazione bisognaestrarre il DNA plasmidico dalle cellule trasformatee mediante lrsquoutilizzo dello stesso enzima di restri-zione usato per la creazione del plasmide ricombi-

nante verificare la presenza del frammento di DNAesogeno che si voleva clonare Ad esempio se lrsquoobiet-tivo era clonare un segmento di DNA umano genera-to dopo taglio con lrsquoenzima di restrizione EcoRI unavolta recuperato il DNA plasmidico dalle cellule diuna colonia bianca il taglio con EcoRI di tale DNAdovrebbe generare due frammenti uno delle dimen-sioni del vettore pUC19 e lrsquoaltro corrispondente alsegmento di DNA umano in esso inseritoLa seconda parte dellrsquoesperimento consiste pro-prio in questo

estrazione del DNA plasmidicoanalisi di tale DNA mediante taglio con enzi-ma di restrizione e separazione elettroforeticadei frammenti di DNA ottenuti

LrsquoesperimentoScaricate le schede del protocollo dellrsquoattivitagrave 2ldquoricombinante o non ricombinanterdquo

ldquoMinipreprdquo di DNA plasmidicoda cellule di E coliNei laboratori di ricerca per purificare il DNA pla-smidico da cellule di E coli trasformate si utilizzanodelle procedure rapide di estrazione (genericamentechiamate mini-preparazioni o miniprep di DNAplasmidico) che permettono di valutare il risultatodi un esperimento di clonaggio in tempi molto bre-vi (poche ore) Quando si estrae il DNA plasmidi-co con una miniprep si ottiene un DNA che nonegrave puro cioegrave in soluzione non egrave presente solo DNAplasmidico ma sono presenti anche altri tipi di mo-lecole Oltre a proteine lipidi e zuccheri vi sono

Plasmide pUC19

Il plasmide conferisce resistenzaallrsquoampicillina e produce

galattosidasi funzionale

Taglio di restrizionenel polynker

Il plasmide conferisce resistenzaallrsquoampicillina ma non puograve produrre


la galattosidasi viene prodotta eX-gal libera il precursore dellrsquoindaco

che colora le colonie di blu

la galattosidasi non vieneprodotta e le colonie sono bianche

Frammenti di DNA

Agar + ampicillina + X-gal + IPTG

Inserimento del DNAestraneo nel gene lacZ interrotto

3rsquo

3rsquo 3rsquo

3rsquo

5rsquo5rsquo

3rsquo

ampRampR

lacZ

ampR

5rsquo

5rsquo 5rsquo

Figura 411

Nella piastra in basso nellafigura egrave indicata a sinistrauna colonia blu che deriva dauna cellula trasformata dalplasmide senza lrsquoinsertoIn presenza dellrsquoinduttore IPTGe del substrato cromogenoX-gal le cellule produconolrsquoenzima e formano una coloniadi colore blu A destra crescitadi una colonia trasformatadal plasmide con il geneesogeno inserito allrsquointernodel gene lacZ non producendoszlig-galattosidasi le celluluesono bianche Sia le colonie bluche le bianche sono resistentiallrsquoampicillina

+ = presenza di colonie - = assenza di colonie

Ceppo batterico XL1 Blue trasformato con

miscela diligazione

pUC19(controllo pos)

acqua(controllo neg)

crescitacolonie

+ + -

colore colonie Bianche blu Solo blu -



36

molecole di RNA Le molecole di RNA essendospesso piugrave piccole hanno una mobilitagrave elettrofore-tica maggiore del DNA plasmidico (cioegrave in un gel diagarosio ldquocorronordquo di piugrave) Esse sono quindi visibilinella parte bassa del gel per evitare queste impuritagravea una miniprep di DNA plasmidico prima della cor-sa elettroforetica viene normalmente aggiunto lrsquoen-zima RNasi che degrada specificamente le molecoledi RNA che quindi non risultano piugrave visibili su gel

Digestione con un enzima di restrizioneDopo aver isolato il DNA plasmidico tramite mi-niprep lo digeriamo con un opportuno enzimadi restrizione (vedi capitolo 3 ldquoSano o malatordquo)per verificare la presenza dellrsquoinserto di DNAIl vettore plasmidico pUC19 contiene un unicosito di restrizione EcoRI nella zona del polylinkerIl taglio del vettore non ricombinante con lrsquoen-zima di restrizione EcoRI trasformeragrave quindi lemolecole di DNA circolari del vettore in molecolelineari Se invece il vettore pUC19 contiene uninserto di DNA esogeno clonato nel sito EcoRIil taglio del vettore ricombinante con lrsquoenzima direstrizione genereragrave due molecole di DNA linea-ri una che corrisponde al vettore pUC19 linea-rizzato e lrsquoaltra che corrisponde al frammento diDNA inserito Dopo elettroforesi si osserverannoquindi due bande una corrispondente al vettorelrsquoaltra corrispondente allrsquoinserto Mediante elet-troforesi egrave possibile pertanto determinare sia lapresenza che la dimensione del DNA clonato

Marcatori di peso molecolare utilizzatiIn questo esperimento si utilizzano due diversitipi di marcatori di peso molecolare (fig 413)uno per il DNA con struttura circolare (che serveper controllare il peso molecolare del DNA pla-smidico estratto da una singola colonia battericatrasformata) e uno per il DNA con struttura li-neare (che serve per determinare la dimensionedellrsquoinserto) Come marcatore di peso molecola-re di DNA con struttura circolare egrave stato utilizza-to il plasmide pUC19 che egrave costituito da 2686pb (paia di basi)Come marcatore di peso molecolare di DNAcon struttura lineare viene utilizzata una mi-scela di frammenti di DNA ottenuti digerendoil DNA di diversi plasmidi con enzimi di restri-zione adatti al fine di generare 13 frammenticon un intervallo di dimensioni che va da 025a 100 Kb I frammenti di 30 e di 10 Kb sonoun porsquo piugrave abbondanti per servire da bande diriferimento (fig 412)

Risultati e interpretazioneIl gel viene caricato secondo questo schema

nel pozzetto 1 viene caricato pUC19 comemarcatore di DNA con forma circolarenei pozzetti 2 e 3 vengono caricati rispettiva-mente i DNA plasmidici estratti da una colo-nia blu e da una colonia bianca non digeriticon EcoRI e forniti dal laboratorio questi ser-vono da controllonei pozzetti 4 5 6 7 quattro studenti caricanoi DNA plasmidici purificati da a partire da co-lonie bianche o blunel pozzetto 8 viene caricato il DNA estrattoda colonia blu e digerito con EcoRInel pozzetto 9 viene caricato il DNA estrattoda colonia bianca e digerito con EcoRInellrsquoultimo pozzetto viene caricato il PM Lad-der di DNA lineare a peso molecolare noto

Il risultato del gel di agarosio egrave riportato nella fi-gura 413

Nella prima corsia crsquoegrave una banda di DNA del pla-smide pUC19 nella sua struttura di DNA supe-ravvoltoNella seconda corsia crsquoegrave il DNA estratto da unacolonia blu Poicheacute le colonie blu contengono ilplasmide pUC19 (non ricombinante) si osservauna banda della stessa dimensione di quella delpUC19 di riferimentoNella terza corsia crsquoegrave il DNA estratto da una colo-nia bianca Il DNA ricombinante ha una dimen-sione maggiore rispetto al DNA della colonia blupercheacute contiene il DNA esogenoDalla corsia 4 alla 7 troviamo i campioni caricatidagli studenti in questo gel ad esempio gli stu-denti hanno estratto e digerito DNA plasmidicida due colonie blu (4 e 5) e due da colonie bian-che (6 e 7)Nella corsia 8 crsquoegrave il DNA di controllo del vettoreplasmidico pUC19 linearizzato mediante tagliocon enzima di restrizione EcoRINella corsia 9 crsquoegrave il DNA del vettore ricombi-nante tagliato con EcoRI Si osservano 2 bandela piugrave alta egrave il vettore plasmidico la piugrave bassa egravelrsquoinserto di DNA esogenoLe bande indicate in figura per i pozzetti 1 2 e 3corrispondono alla posizione del DNA plasmidi-co superavvolto e nei pozzetti 8 e 9 al plasmidein forma linearizzata Notare che il plasmide informa superavvolta migra piugrave velocemente dellostesso plasmide linearizzato

10 0008 0006 0005 000

4 000

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

750

500

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 PMLa

dder

10 000 pb8 000 pb6 000 pb5 000 pb4 000 pb

3 000 pb

2 000 pb

1 500 pb

1 000 pb

500 pb

Figura 412

Immagine sperimentale della misceladi frammenti (PM Ladder) utilizzatacome marcatore di peso molecolarenell esperimento schematizzato infigura 413

Fig 413

Schema del risultato del geldellrsquoesperimento Vedi il testo per ladescrizione dei campioni analizzatinelle corsie 1-9 e PM Ladder


Esercitazione n 5

37

Geni indipendenti e geni associatiI geni localizzati su cromosomi non omologhisono chiamati geni indipendenti in quanto se-gregano indipendentemente durante la meiosi(seconda legge di Mendel fig 51a)Mendel lavorograve con caratteri (geni) che mostra-vano segregazione indipendenteI geni situati sulla stessa coppia di cromosomiomologhi sono detti geni associati e non mo-strano un assortimento indipendente cioegrave iloro alleli tendono a essere ereditati insiemeVengono separati solo se tra loro interviene unevento di ricombinazione (crossing-over) la cuifrequenza egrave proporzionale alla distanza dei lociconsideratiDue geni associati si definiscono associati in cisquando su un cromosoma si trovano gli alleli do-minanti dei due geni e sul cromosoma omologoi due alleli recessivi si definiscono associati intrans quando sullo stesso cromosoma si trovanolrsquoallele recessivo di un gene e lrsquoallele dominantedellrsquoaltro gene (fig 51b)

I marcatoriUn allele che determina un fenotipo riconoscibi-le (ad esempio i caratteri analizzati da Mendel) egraveconsiderato un marcatore genetico classico inquanto consente di seguire la trasmissione nellegenerazioni di un determinato gene e del cromo-soma su cui egrave localizzato I marcatori genetici ser-vono per costruire le mappe genetiche che sonorappresentazioni figurate della posizione dei genisu un cromosomaNegli anni ottanta e novanta del secolo scorso egraveavvenuta una rivoluzione tecnologica nel campodella Genetica Sono stati infatti identificati altritipi di marcatori riconoscibili tramite tecniche

5 Mais blu dalfenotipo al genotipo

Lrsquoesperimento che viene illustrato riguarda lrsquoosservazione dei fenotipi

di plantule di mais e lrsquoanalisi a livello molecolare del loro genotipo per verificare

la segregazione degli alleli di un gene responsabile della sintesi di antociani potenti antiossidanti

naturali che conferiscono un colore blu-violetto a diversi tessuti della piantaIn una prima parte insegnanti e studenti si occupano della semina e germinazione di semi di mais per verificarenelle plantule (le giovani piantine nei primi stadi di sviluppo) i rapporti fenotipici attesi secondo le leggi di MendelIn laboratorio gli studenti procedono allrsquoestrazione del DNA dalle foglie e dalle radici e alla amplificazionetramite PCR di una sequenza marcatore associata al gene responsabile della sintesi di antocianie verificano i genotipi a livello molecolare


La struttura del DNALa replicazione del DNADal DNA al cromosomaLa genetica mendelianaLe definizioni di genotipoe fenotipo allele locusgeneticoLrsquoelettroforesiLa PCR

Figura 51

Geni indipendenti e associatia) I due geni A e B localizzati sucromosomi diversi (a sinistra)segregano in modo indipendenteb) Due geni A e B quando si trovanosullo stesso cromosoma(a destra) sono associati

a) geni indipendenti b) geni associati

A a A a A a

B b B bB b

cis trans



38

di analisi del DNA che hanno dato un forte im-pulso alla costruzione di mappe genetiche piugravedettagliate e precise i marcatori molecolari delDNA sequenze nucleotidiche presenti nel geno-ma che mostrano elevato polimorfismo cioegrave dif-ferenze evidenziabili tra gli individui Il sequen-ziamento del genoma umano ha consentito lalocalizzazione di molti siti polimorfici distribuitiin tutti i cromosomi per lo piugrave nelle sequenzenon codificanti Questa variabilitagrave puograve riguarda-re anche una singola base in questo caso si parladi SNP (Single Nucleotide Polymorphism) I mar-catori microsatelliti chiamati anche STR (ShortTandem Repeat) sono costituiti da corte sequen-ze (1-5 paia di basi) ripetute n volte localizzatein 102-104 posizioni diverse (e fisse) nel genomaGli STR presentano un elevato grado di polimor-fismo allrsquointerno della popolazione in quanto ilnumero di ripetizioni puograve essere diverso da indi-viduo a individuo Questo tipo di polimorfismoegrave un polimorfismo di lunghezza i diversi allelicioegrave differiscono per il numero di ripetizioni equindi hanno lunghezze diverse (per una descri-zione piugrave dettagliata dei polimorfismi del DNAvedi Esercitazione 1)I marcatori molecolari seguono le stesse regole diereditabilitagrave dei geniI marcatori molecolari sono numerosissimi econsentono quindi di costruire mappe moltodettagliate dei cromosomi (fig 52)I genetisti hanno sviluppato metodi efficaci e ra-pidi per identificare i marcatori molecolariIl numero di ripetizioni di un STR puograve essereevidenziato con la PCR (Polymerase Chain Reac-tion) utilizzando una coppia di primer (forward ereverse) per innescare la reazione di amplificazio-ne ldquodisegnatirdquo su regioni fiancheggianti il trattodi interesse (fig 53)I prodotti dellrsquoamplificazione analizzati tramiteelettroforesi su gel evidenziano il polimorfismosotto forma di segmenti di DNA di diverso pesomolecolare che permettono di rilevare le diffe-renze alleliche tra gli individuiSe un gene drsquointeresse difficile da identificarefenotipicamente egrave posizionato vicino a un mar-catore molecolare (cioegrave se i due loci sono stretta-mente associati) il marcatore molecolare salvoricombinazione egrave ereditato insieme allrsquoallele diinteresse (fig 54) Invece di analizzare la trasmis-sione di questo allele si puograve piugrave facilmente ana-lizzare la trasmissione del marcatore molecolaread esso associato

Figura 52

Cromosoma 1 dellrsquouomoa) distribuzione dei geni e dei marcatoridel DNA lungo il cromosomab) distanze in cMc) alcuni dei marcatori con le relative sigled) mappa citogenetica del cromosoma

STRaltri polimorfismigenigeni che contengonopolimorfismi del DNA

marcatoridel DNA

Figura 53

Esempio di analisi di un microsatellite tramite amplificazione con PCR ed elettroforesisu gel A sinistra un individuo omozigote che mostra unrsquounica banda elettroforeticacorrispondente a un frammento con 4 ripetizioni a destra un individuo eterozigoteche mostra due bande elettroforetiche corrispondenti a frammenti di 3 e 4 ripetizioni

AG AG AG AG

(AG)4

AG AG AG AG

(AG)4

forward primer reverse primer

AG AG AG

(AG)3

AG AG AG AG

(AG)4


PRC

corsa elettroforetica


Esercitazione n 5

39

Il maisI cereali rappresentano per lrsquouomo la piugrave impor-tante fonte rinnovabile di cibo foraggio e materieprime per lrsquoindustria Egrave per questo motivo che laricerca sui cereali egrave oggetto di una rinnovata at-tenzione da parte del settore biotecnologico Inparticolare la comprensione dei fenomeni checaratterizzano lo sviluppo e i processi che porta-no allrsquoaccumulo dei nutrienti di riserva nel frutto(o cariosside) possono fornire le basi per il mi-glioramento della resa e della qualitagrave dei cerealiTra i cereali il mais (fig 55) riveste particolareimportanza sia nellrsquoalimentazione animale sianellrsquoutilizzo dei suoi derivati nellrsquoindustria in-fatti come prodotto alimentare zootecnico puograveessere considerato lrsquoalimento base e in molti casiindispensabile per la preparazione delle razionianimaliIl mais per la sua particolare fisiologia egrave unadelle piante piugrave efficienti nel trasformare lrsquoener-gia solare ed egrave anche una delle piugrave plastiche perquanto riguarda la possibilitagrave di cambiare le ca-ratteristiche produttive in funzione delle condi-zioni ambientali e delle esigenze umane I primia coltivare il mais furono le popolazioni mesoAmericane A partire dal 1500 la sua coltivazio-ne si egrave diffusa anche negli altri continenti dove ilmais si egrave adattato alle piugrave svariate condizioni cli-matiche ed egrave oggi nel mondo la terza coltura perimportanza dopo il frumento e il riso A livellomondiale occupa piugrave di 150 milioni di ettari disuolo e fornisce una produzione di circa 800 mi-lioni di tonnellate di granella (lrsquoinsieme delle ca-riossidi ottenute dalla sgranatura delle spighe)Le rese medie per ettaro variano notevolmentedalle 15-18 tonnellate nei paesi in via di svilup-po alle 7-8 tonnellate nei paesi sviluppati La resaunitaria media italiana egrave prossima a 10 tonnellate

Inoltre il mais egrave una delle specie modello piugrave uti-lizzate per studiare il ruolo dei geni nelle vie bio-sintetiche e nella morfogenesi delle piante Infattiper le sue dimensioni e per lrsquoabbondanza di tessutinellrsquoembrione nelle foglie e nelle spighe le proce-dure di dissezione sono piugrave semplici e consentonodi ottenere grandi quantitagrave di materiale per le ana-lisi biochimiche e molecolariLe due caratteristiche della pianta di mais che han-no piugrave aiutato gli studi genetici sono la dimensio-ne della spiga detta comunemente e impropria-mente pannocchia e lo sviluppo di infiorescenzemaschili e femminili distinte (fig 56)Una normale pianta di mais produce spighe concirca 400-700 semi Le piante da loro derivate pos-sono essere facilmente incrociate o autofecondateproducendo una progenie numerosa particolar-mente utile negli studi geneticiLa localizzazione dei fiori maschili nel pennacchioe dei fiori femminili nella spiga consente inoltredi evitare contaminazioni con polline indesidera-to semplicemente incappucciando lrsquoinfiorescenzafemminile senza dover procedere allrsquoemasculazio-ne che consiste nella rimozione dellrsquoinfiorescenzamaschileI frutti che si formano dopo la fecondazione sono

Figura 54

Per studiare la trasmissione del geneldquoardquo si puograve utilizzare il marcatoremolecolare Mm1 per il gene ldquodrdquosi puograve usare Mm4 Invece non ci sonomarcatori sufficientemente associatiai geni ldquocrdquo e ldquobrdquo per essere utilizzati

Figura 55

Un campo di mais

Mm1 Mm2 Mm3 Mm4

a b c d

Marcatori molecolari (Mm)

polimorfismi di sequenza nucleotica

Geni di interesse



40

chiamati cariossidi e sono avvolti da un sottile ri-vestimento (pericarpo) molto aderente al semeche proteggono egrave quindi improprio considerareil chicco di mais come un seme egrave in realtagrave un in-tero frutto (fig 57)La cariosside egrave costituita dallrsquoembrione che de-riva dalle divisioni dello zigote (2n) dallrsquoendo-sperma un tessuto di riserva ricco di numerosesostanze tra cui amido e proteine e dallrsquoaleuro-ne uno strato esterno ricco in proteineLa percentuale di acqua in un seme egrave bassissimae grazie a ciograve il seme si trova in uno stato di quie-scenza che gli permette di resistere alle condi-zioni piugrave avverse e gli dagrave la capacitagrave di germinareanche a distanza di anniNellrsquoembrione si possono giagrave riconoscere una ra-dichetta avvolta da una membrana (coleoriza)e un fusticino (ipocotile) che porta nel casodelle monocotiledoni (come il mais) una fogliao cotiledone e termina con una gemma apicaleplumula o piumetta protetta da unrsquoaltra mem-brana (il coleottile) Il cotiledone egrave detto scu-tello contiene sostanze di riserva (soprattuttograssi e proteine) e ha funzione di assorbimentodelle sostanze di riserva dellrsquoendospermaLa germinazione del seme (fig 58) cominciacon la re-idratazione successivamente lrsquoembrio-ne comincia a crescere nutrito dalle sostanze diriserva La radichetta cresce piugrave rapidamente egrave laprima a emergere dal tegumento del chicco for-mando la radice primaria altre radici avventiziesi svilupperanno piugrave tardi Quindi si forma unastruttura tubulare chiusa che cresce fino alla su-perficie del suolo la plumula protetta dal coleot-tile Appena emerge smette di allungarsi si apreed espone le foglie arrotolate che ha allrsquointerno Ilfusto inizieragrave ad allungarsi solo dopo che la pian-ta avragrave raggiunto unrsquoaltezza di parecchi centime-tri Lrsquounico cotiledone resta interrato

La biosintesi dei flavonoidiTra i pigmenti che determinano la varietagrave di co-lori nelle piante i flavonoidi rappresentano unaclasse di molecole che vengono sintetizzate eesclusivamente nelle piante vascolariSi tratta generalmente di sostanze idrosolubiliche la cellula conserva nel vacuolo la loro co-mune struttura egrave data da un anello a 15 atomi dicarbonio (fig 59) Sulla base della loro strutturachimica i flavonoidi sono classificati in diversigruppi tra cui le antocianidine dette anche an-tocianiAi flavonoidi sono attribuite diverse funzioni come

pericarpio scutello

coleottile

plumula

ipocotile

radichetta

coleoriza

aleurone

endosperma

embr

ione

Figura 56

Morfologia della pianta di maisa) infiorescenza maschile(pennacchio)b) infiorescenza femminile (spiga)

Figura 58

Fasi di germinazione del mais

Figura 57

Struttura della cariosside di mais

coleottile

prima foglia

radice primaria radici secondarie

a)

b)


Esercitazione n 5

41

ad esempiole colorazioni rosso e viola dovute alle anto-cianidine (fig 510)un ruolo fondamentale nei processi di impolli-nazione affidata agli insetti e nella dispersionedei semiuna grande capacitagrave antiossidante egrave noto checibi ricchi di queste sostanze come ad esem-pio fragola spinaci mirtillo vino rosso posso-no migliorare il decorso dellrsquoinvecchiamentoneuronale noncheacute opporsi allrsquoazione dannosadei radicali liberi sul DNA e avere un effettoprotettivo sul sistema cardiovascolare

I pigmenti antociani sono caratteri facilmente eprontamente distinguibili inoltre non essendolegati al metabolismo primario della pianta egravepossibile ottenere dei mutanti vitali con altera-zioni della sintesi e conseguente fenotipo rico-noscibile Dato il loro benefico effetto egrave evidentelrsquointeresse nella selezione di varianti ricche diantocianiLa biochimica e la genetica della sintesi degliantociani sono state ampiamente studiate negliultimi decenni Ad oggi sono stati isolati unaventina di geni strutturali coinvolti in questa viabiosintetica Nel mais sono stati studiati i fatto-ri di trascrizione che attivano la via biosinteticadegli antociani nei diversi tessuti e in momentiappropriati dello sviluppo Tra questi il gene R1(colored 1) presenta un elevato numero di alleliche determinano una diversa distribuzione delpigmento nelle varie parti della pianta e della ca-riosside In particolare in questa attivitagrave di labo-ratorio sono analizzati gli alleli codominanti

Rchedeterminalrsquoaccumulodipigmentonellrsquoaleu-rone (fig 511) e quindi la cariosside coloratar che determina la colorazione di alcuni tessu-ti della pianta (in particolare le radici)

I marcatori molecolari in agricolturaCome abbiamo detto i marcatori molecolaripermettono di seguire la trasmissione di allelispecifici e possono essere utilizzati per mapparecaratteri di interesse (figg 52 e 54) Lrsquoidentifi-cazione di marcatori associati a un locus genicoresponsabile di un carattere drsquointeresse consentedi selezionare le piante per quel carattere in baseallrsquoanalisi degli alleli polimorfici del marcatoreritrovabili nella popolazione senza ricorrere aprove in campoIn generale nelle piante di interesse agrario e nelmais in particolare molti caratteri importanti dal

Figura 59

Struttura di un flavonoide

Figura 510

Frutti freschi il cui colore egrave dovutoalla presenza di flavonoidi

Figura 511

Tessuto specificitagrave degli alleli R e rGenotipo RR cariosside colorata e radice incoloregenotipo Rr cariosside colorata e radice coloratagenotipo rr cariosside gialla e radice colorata

HO O

OHO

OH

RR

Rr

rr



42

punto di vista economico presentano una varia-bilitagrave di tipo continuo che dipende dalla segrega-zione mendeliana di molti geni Si tratta di caratte-ri quantitativi (QTLQuantitative Trait Locus)Egrave pertanto difficile separare lrsquoeffetto di un singololocus influenzante un QTL da quello di altri cheinfluenzano lo stesso carattere I marcatori mole-colari permettono di trattare i QTL come singolifattori mendeliani semplici e di selezionare ognu-no di questi fattori separatamenteI marcatori molecolari possono essere utili anchenel caso in cui si desideri combinare in unrsquounicaprogenie due geni differenti che concorrono alladeterminazione di un dato fenotipo per ottenereun fenotipo potenzialmente migliorato Anche inquesto caso invece di analizzare la trasmissionedei geni di interesse il genetista puograve piugrave facil-mente analizzare la trasmissione di marcatorimolecolari ad essi associati

I marcatori molecolari associati al gene R1Il marcatore molecolare STR utilizzato in questaattivitagrave di laboratorio egrave stato scelto dalla mappaldquoSSR consensus maprdquo del Maize Genetics andGenomics Database (Maize-GDB httpwwwmaizegdborg) Esso egrave localizzato vicino al geneR1 (circa 1 cM = centiMorgan) sul braccio lun-go del cromosoma 10 (fig 513) Il marcatorebnlg1028 ha due forme alleliche bnlg1028aassociato allrsquoallele r egrave costituito da un numerodi ripetizioni di nucleotidi superiore rispetto abnlg1028b associato alllsquoallele R

Storia della scienzaI TRASPOSONI

Figura 512

Spighe di mais di diverse varietagrave Alcune presentanocolorazione non omogenea della cariosside

lo studio della trasmissione dei caratteri siavvalse di differenze nella pigmentazione delfiore e dei cotiledoni del seme in piante dipiselli da giardino Negli anni cinquanta delsecolo scorso Barbara McClintock lavorando suigeni degli antociani nel mais notograve inserzionidelezioni e traslocazioni di sequenze specificheassociate a variazioni di colore delle cariossidinelle pannocchie che attribuigrave allo spostamentodi elementi genetici definiti trasposoni da unpunto allrsquoaltro del genoma In unrsquoepoca in cuisi riteneva che il genoma fosse assolutamentestabile la scoperta di Barbara McClintockche le meritograve il premio Nobel nel 1983 fudirompente Oggi il sequenziamento completodel genoma di diversi organismi animali evegetali ha messo in evidenza la massiccia

presenza di milioni di copie di elementigenetici mobili nella quota di DNA extragenicoEgrave impressionante sapere che quasi metagrave delgenoma umano egrave costituito da vari tipi dielementi trasponibili che hanno in comune lacapacitagrave di spostarsi anche se con modalitagravediverse allrsquointerno del genoma Lrsquoelementotrasponibile piugrave frequente nel genoma umano egravela sequenza Alu lunga circa 300 basi e presentein 300 000-1 000 000 di copie Gli elementigenetici mobili rappresentano una enorme fontedi variazione genetica i cui effetti sono ancoralargamente sconosciutiI trasposoni si ritrovano in tutti gli organismiviventi a partire dai batteri la loro storiaevolutiva e i loro effetti sulla evoluzionesono oggetto di ricerca e studio

Lo studio dei pigmenti nelle piante e della lorodeterminazione genetica ha attirato lrsquoattenzionedei genetisti da lungo tempo Mendel per

Figura 513

In alto il cromosoma 10 di mais e la posizione dei loci

concatenati r1 e bnlg1028 sul braccio lungoIn basso schema dei microsatelliti bnlg1028ae bnlg1028b associati rispettivamente agli allei r e R(il numero di ripetizioni egrave indicativo)

Cr10

AG AG AG AG AG AG AG allele r bnlg1028a

AG AG AG allele R bnlg1028b

mmg 71l1T1-10c (10)bnlg 1028r1sn1ccl2lsr1acs7umc44acdck4ocb355abnl1702lc1


Esercitazione n 5

43

Il nostro esperimento

Impostazione del problemaIn questa esercitazione si confronteranno i risul-tati ottenuti con la Genetica classica con quellidella Genetica molecolare utilizzando come or-ganismo sperimentale il mais Partendo da semidi mais ottenuti autofecondando piante etero-zigoti Rr si andragrave a verificare a livello fenotipi-co e molecolare il rapporto 121 atteso in unapopolazione F2 dalla segregazione di due allelicodominantiSecondo la Genetica classica si potragrave verifica-re la segregazione degli alleli R e r direttamentecontando le plantule con i tre diversi fenotipi ot-tenute dalla germinazione dei semi (fig 514) eapplicando un test statistico noto come test del χ2

si valuteragrave la affidabilitagrave dei risultati osservatiLa segregazione di questi due alleli potragrave essereseguita anche utilizzando il marcatore molecola-re bnlg1028 nei suoi due alleli a e b (fig 515)Amplificando con la PCR il locus bnlg1028 e ana-lizzando su gel i prodotti dellrsquoamplificazione saragravepossibile individuare e discriminare in manieraunivoca (a meno dei rari ricombinanti Rbnl-g1028a e rbnlg1028b) i tre fenotipi genotipipresenti

RR seme colorato radice incolore una solabanda bassaRr seme colorato e radice colorata due ban-de una alta e una bassarr seme incolore radice colorata una solabanda alta (fig 516)

Operativamente bisogna far germinare i semidalla foglia e dalla radichetta delle plantule verragraveestratto il DNA genomico che saragrave amplificatocon la PCR utilizzando una coppia di primer spe-cifica per il marcatore bnlg1028Per eseguire lrsquoesperimento scaricate i protocolliche comprendono anche le istruzioni per semi-nare le cariossidi di mais

Estrazione del DNAPer estrarre il DNA dai nuclei delle cellule ve-getali si devono prima rompere (lisare) le pa-reti cellulari (ricordate che le cellule vegetali adifferenza delle cellule animali possiedono unaparete) le membrane plasmatiche e le membra-ne nucleari ciograve viene effettuato ponendo il cam-

Figura 514

Genotipi e relativi fenotipi di unapopolazione F2 segregante peril gene R1 in mais Il simboloindica autofecondazione

Popolazione F2

Figura 516

Profili elettroforetici attesi daitre genotipi della popolazionesegregante analizzando ilmarcatore molecolare bnlg1028associato al gene R1

Figura 515

Autofecondazione di un ibrido e segregazione del gene R1 associato al marcatore molecolare bnlg1028

RR

genotipo fenotipo

Rr

rr

Rr

R r

RRR Rr

Rrr rr

R

bnlg1028b

r

bnlg1028a

R

bnlg1028b

r

bnlg1028a

r

bnlg1028a

r

bnlg1028a

R

bnlg1028b

R

bnlg1028b

estrazione del DNAe amplificazione (PCR) del marcatore bnlg1028

RR Rr rr

RR Rr rr



44

pione in una soluzione omogeneizzante-lisantecontenente un detergente che facilita la rotturadella parete e delle membrane utilizzando unomogeneizzatore il DNA si libera nella frazionesolubileIn alcuni casi per esempio se il campione egrave rap-presentato da semi secchi egrave richiesta unrsquoazionemeccanica preliminare come la triturazione perridurre la matrice di partenza in piccole partiPoicheacute il DNA egrave associato alle proteine isto-niche lrsquoaggiunta di un sale come il cloruro disodio (NaCl) facilita la separazione del DNAdalle proteine Dopo centrifugazione nel super-natante saranno presenti DNA RNA proteinepolisaccaridi e lipidi Lrsquoaggiunta di enzimi qualiproteinasi e ribonucleasi facilita la digestionerispettivamente delle proteine (istoniche e nonistoniche) e dellrsquoRNABisogna ora eseguire la precipitazione del DNAche avviene con lrsquoaggiunta di isopropanolo IlDNA egrave insolubile in isopropanolo il DNA preci-pita sotto forma di filamenti gelatinosi bianchiLa soluzione verragrave poi centrifugata e il precipita-to di DNA risospeso in acqua distillata sterile oin una opportuna soluzione tampone saragrave pron-to per le successive analisi

Analisi dei risultatiVerifica della segregazione del gene R1Il test del χ2 (Chi quadrato) egrave un test di signifi-cativitagrave statistica uno strumento indispensabilenel confrontare due gruppi o popolazioni riguar-do ad un parametro Si tratta di confrontare unaserie di valori osservati e di valori attesi per sta-bilire se concordano fra loroNel nostro esempio su 180 plantule nate dallrsquoin-crocio Rr x Rr si sono osservate 41 RR (cariossi-de scura radice bianca) 97 Rr (cariosside e radi-ce scure) e 42 rr (cariosside chiara e radice scura)come viene riportato in tabella 51Ci dobbiamo chiedere se la differenza tra i valo-

121 (valori teorici attesi 459045) egrave statistica-mente significativa oppure no Egrave un porsquo come lan-ciare una moneta su 100 lanci egrave difficile ottenereil rapporto teorico atteso di 50 volte testa e 50volte croce Su 100 lanci si possono ad esempioottenere 48 testa e 52 croce ossia i valori osser-vati sono diversi da quelli attesi Se la differenzanon egrave significativa vuol dire che egrave dovuta soloal caso Se la differenza risultasse significativacome ad esempio nel caso di 10 testa e 90 cro-ce vorrebbe dire che ci sono stati dei fattori didisturbo ad esempio le due facce della monetanon solo uguali e ciograve impedisce la casualitagrave deirisultati Ci sono tuttavia una serie di valori inter-medi ad esempio 30 testa e 70 croce per i quali egravedifficile stabilire senza lrsquoimpiego di test statisticise la differenza tra valori osservati ed attesi egrave si-gnificativa o noIn questi casi si rende indispensabile lrsquoutilizzo diun test statistico come il test del χ2Dallrsquoapplicazione della formula

dove o sta per fenotipi osservati e a sta per fenotipiattesi si ottiene che il valore del χ2 egrave un misura del-la differenza complessiva fra le due serie di valori

Nel nostro casoχ2 = 1645 + 4990 + 945=035 + 054 +020 = 109

Il valore ottenuto va confrontato con quelli in ta-bella 52 nella riga corrispondente a df = 2 dovedf = degrees of freedom (gradi di libertagrave) pari a(numero di fenotipi mdash1) e quindi a (3mdash1)Con 2 gradi di libertagrave si possono accettare valorifino a 460 per cui il valore 109 egrave piugrave che accetta-bile infatti egrave collocato tra i valori di probabilitagrave p070 e 050 cioegrave vi egrave una probabilitagrave superiore al50 e inferiore al 70 che la differenza osservatasia dovuta al caso Di norma sono accettati valoridi p gt 005NB Come regola generale percheacute un test delχ2 sia svolto correttamente egrave necessario che ilcampionamento sia assolutamente casuale (nelnostro caso la scelta dei semi o cariossidi F2) elrsquoanalisi sia fatta su una popolazione di almeno 50individui

ri di segregazione osservati e quelli teorici-attesiin base al rapporto di segregazione genotipica di

Tabella 51

Esempio di segregazione F2 su un campione di 180 plantule

GENOTIPO VALORI OSSERVATI VALORI ATTESI

RR 41 45

Rr 97 90

rr 42 45

Totale 180 180

χ2 = Σ(o-a)2

a


Esercitazione n 5

45

Interpretazione dei risultatidella corsa elettroforeticaLa figura 517 mostra una schema dei risultatidella corsa elettroforetica lrsquoordine di caricamen-to dei campioni egrave indicativo dato che egrave possibileldquocaricarerdquo il gel con un ordine diverso da quelloindicato nellrsquoesempio (pb= paia di basi)

PM marcatore di peso molecolare che si se-para in bande di peso molecolare (lunghezzain pb) notocorsia 1 banda bassa associata allrsquoallele Rcampione di DNA genomico estratto da plan-tula a seme colorato e radice incolore e quindiomozigote RRcorsia 2 banda alta associata allrsquoallele r cam-pione di DNA genomico estratto da plantula aseme incolore e radice colorata e quindi omo-zigote rrcorsia 3 presenza di entrambe le bande cam-pione di DNA genomico estratto da plantulaa seme colorato e radice colorata e quindi ete-rozigote Rrcorsia 4 bianco di PCR (campione contenen-te le stesse soluzioni e gli stessi tamponi uti-lizzati ma che non contiene DNA) Serve perdimostrare lrsquoassenza di DNA contaminantedurante tutte le fasi di lavoro

Lrsquoassenza di bande nel bianco di PCR (corsia 4)dimostra che gli amplificati sono specifici e chenon crsquoegrave stato ldquoinquinamentordquo da parte di altroDNA Le bande di diverso peso molecolare per-mettono di ldquoseguirerdquo gli alleli R e r e quindi i fe-notipi genotipi nella popolazione segregante

Tabella 52

Analisi statistica dei risultati genetici Il test del 2 Il valore p indica la probabilitagrave che la differenza tra valori osservati e valori attesi sia dovuta al caso

Figura 517

Schema del gel ottenuto dopo la corsa elettroforetica

df 095 090 070 050 030 020 010 005 001 0001

1 0004 0016 015 046 107 164 271 384 664 1083

2 010 021 071 139 241 322 461 599 921 1382

3 035 058 142 237 367 464 625 782 1135 1627

4 071 106 220 336 488 599 778 949 1328 1847

5 115 161 300 435 606 729 924 1107 1509 2052

6 164 220 383 535 723 856 1065 1259 1681 2246

7 217 283 467 635 838 980 1202 1407 1848 2432

8 273 349 553 734 952 1103 1336 1551 2009 2613

9 333 417 639 834 1066 1224 1468 1692 2167 2788

10 394 487 727 934 1178 1344 1599 1831 2321 2959

accettare

a livello di 005

rifiutare

Probabilitagrave= p

df= gradi di libertagrave cioegrave ndeg di fenotipi -1

2PM 1 3 4



46


Esercitazione n 6

47

6 Analisicromosomiche

Il cariotipo umanoLrsquoinsieme completo di tutti i cromosomi metafasi-ci di una cellula egrave definito cariotipo il cariotipo egravespecie-specifico e quello umano normale diploideegrave costituito da 46 cromosomi (22 paia di autoso-mi e un paio di cromosomi del sesso o eterocro-mosomi XX nella femmina XY nel maschio)

Classificazione e nomenclaturadei cromosomiLa ricostruzione del cariotipo o mappa cromo-somica viene effettuata attraverso la costruzionedel cariogramma ottenuto appaiando i cromoso-mi metafasici omologhi e ordinandoli secondo unsistema di classificazione internazionale

la posizione del centromero che egrave una carat-teristica costante nella morfologia dei cromo-somi egrave utile per la loro classificazione se ilcentromero ha una posizione centrale il cro-mosoma egrave definito metacentrico (fig 61a)se egrave localizzato non esattamente in posizionemediana il cromosoma egrave definito submeta-centrico (fig 61b)se infine il centromero egrave localizzato allrsquoestre-mitagrave del cromosoma questo egrave definito acro-centrico (fig 61c)

Secondo la classificazione di Denver propostanel 1960 al Congresso di Genetica Umana tenu-tosi in Colorado i cromosomi umani esaminatiin mitosi sono classificati e ordinati in base allaloro lunghezza e alla posizione del centromeroI cromosomi sono stati suddivisi in 7 gruppi (fig

a) b)

p

c c

q

c)

Lo scopo di questo laboratorio egrave di rendere familiari le metodologie usate in Citogenetica

umana per lo studio dei cromosomi guidando gli studenti nellrsquoosservazione e nellrsquointerpretazione

di situazioni normali o patologicheLa Citogenetica egrave lrsquoarea della Genetica che studia i cromosomi Ogni specieegrave caratterizzata da un determinato assetto vale a dire da un insieme specifico di cromosomiil cui numero e struttura vengono mantenuti costanti attraverso le generazioni


La struttura della doppiaelica del DNALa modalitagrave direplicazione del DNALrsquoorganizzazionestrutturale dellacromatinaLrsquoeucromatina elrsquoeterocromatinaI processi di divisionecellulare (mitosi e meiosi)con particolare attenzioneal comportamentodei cromosomi durantetali eventi

Figura 61

Diversi tipi morfologici di cromosomaa) metacentricob) submetacentricoc) telocentrico(p braccio corto q braccio lungo c

centromero)



48

62) in ordine decrescente di lunghezzagruppo A (coppie 1 2 e 3)gruppo B (coppie 4 e 5)gruppo C (coppie da 6 a 12 e cromosoma X)gruppo D (coppie 13 14 e 15)gruppo E (coppie 16 17 e 18)gruppo F (coppie 19 e 20)gruppo G (coppie 21 e 22)cromosoma Y

Nellrsquouomo i cromosomi 1 3 16 19 e 20 sono me-tacentrici i cromosomi 13 14 15 21 22 e Y sonoacrocentrici e gli altri sono submetacentriciSoltanto alla fine degli anni sessanta del secolo scor-so con lrsquointroduzione delle tecniche di bandeggioegrave diventato possibile classificare e identificare sin-golarmente tutte le 23 coppie di cromosomiSuccessivamente al 1960 si sono accumulate in-formazioni su diverse aberrazioni numeriche estrutturali dei cromosomi Nella Conferenza In-ternazionale di Genetica Umana di Chicago del1966 e in seguito nella Conferenza di Parigi del1971 egrave stata definita una nomenclatura standardper le varie aberrazioni cromosomiche venne

proposto di aggiungere alla nomenclatura origi-nale di Denver una serie di simboli per indicaresia alcune caratteristiche del cariotipo normaleche le aberrazioni cromosomichePer convenzione i cariotipi normali si rappresen-tano in modo sintetico come segue

46 XX (individuo di sesso femminile)46 XY (individuo di sesso maschile)

Alcuni dei simboli comunemente usati sono una linea diagonale indica la presenza di unmosaicismo (Vedi Per saperne di piugrave ldquoMosai-cirdquo) per esempio 4647 indica che lrsquoindivi-duo in esame presenta due linee cellulari unacon 46 cromosomi lrsquoaltra con 47+ e ndash questi segni indicano la presenza di uncromosoma soprannumerario (+) o la man-canza di un cromosoma (ndash) o di una parte dicromosoma (es 47 XX +21 indica un indivi-duo di sesso femminile con un cromosoma 21soprannumerario)

La ricostruzione del cariotipo ovvero il passag-gio dal cariotipo al cariogramma egrave rappresentatain figura 63 A sinistra egrave presentata una metafasecome appare al microscopio (cariotipo) al centroe a destra la ricostruzione (cariogramma) di uncariotipo maschile e femminile rispettivamentecon i diversi cromosomi appaiati

I bandeggiUnrsquoidentificazione inequivocabile di ogni cro-mosoma del cariotipo umano egrave stata possibilegrazie a tecniche di trattamento e colorazione deicromosomi denominate bandeggiIntorno al 1970 infatti sono state introdotte me-todiche di colorazione dei cromosomi che uti-lizzano sostanze in grado di colorare specificheregioni (bande) in modo piugrave evidente di altreIl bandeggio che ne deriva egrave specifico e costanteper ogni coppia di cromosomi omologhi e per-mette di ricostruire il cariogramma evidenzian-

1

6

13

19 20 21 22F G

X Y

14D

15 16 17E

18

7 8 9C

10 11 12

2A B

3 4 5

Figura 62

Cariogramma di cromosomimetafasici umani ordinatisecondo la classificazione diDenver Nella presentazionegrafica del cariotipoil cromosoma X vienenormalmente affiancatoal cromosoma Y o allrsquoaltrocromosoma X separatamentedagli altri cromosomi delgruppo C

Figura 63

Dal cariotipo al cariogramma


Esercitazione n 6

49

do anche eventuali anomalie cromosomiche siadi numero che di strutturaEsistono diversi tipi di bandeggi Il bandeggio Qottenuto mediante lrsquoimpiego di un colorante fluo-rescente la Quinacrina consiste in unrsquoalternanzadi regioni intensamente fluorescenti e di regionibuie Le bande piugrave luminose corrispondono azone ricche in Adenina e Timina (fig 64a)Il bandeggio G ottenuto col colorante Giemsa econ tripsina egrave caratterizzato da unrsquoalternanza dibande chiare e scure (fig 64b) Le bande chiarecorrispondono a regioni caratterizzate da attivitagravetrascrizionale replicazione precoce e basso con-tenuto di DNA ripetuto Le bande piugrave scure cor-rispondono a zone ricche in Adenina e Timinarelativamente povere di geni e risultano quindicorrispondenti e sovrapponibili alle bande lumi-nose Q Il potere di risoluzione di questo tipo dicolorazione egrave alquanto grossolano infatti unabanda citogenetica ha una dimensione media dicirca 5 Mb (5 milioni di basi) e puograve contenerecentinaia di geniIl bandeggio R (reverse) egrave ottenuto mediantedenaturazione al calore e opportuna colorazio-ne le bande scure corrispondono a zone ricchein Citosina e Guanina

Patologia cromosomicaNel corso degli anni le tecniche citogenetiche perlo studio del cariotipo si sono sempre piugrave raffina-te e oggi egrave possibile individuare alterazioni strut-turali anche di piccole dimensioni Si egrave sviluppatacosigrave una area della Patologia umana denominataPatologia cromosomica

Alcune applicazioni dellrsquoanalisi citogenetica nel-la Patologia cromosomica sono

diagnosi prenatale di sindromi associate adanomalie cromosomichediagnosi postnatale di anomalie cromosomi-che in individui portatori di sindromi o di ma-lattie genetichestudio citogenetico delle cellule tumoraliidentificazione di cromosomi ldquomarcatorirdquo emappaggio di regioni subcromosomiche checontengono geni associati allo sviluppo o allaprogressione tumorale

Variabilitagrave cromosomica normaleIl genoma umano presenta una grande variabi-litagrave genetica a livello molecolare tale variabilitagraveha riscontri anche a livello citogenetico quandocoinvolge tratti di DNA dellrsquoordine di milioni dibasi Molta di questa variabilitagrave riguarda lrsquoetero-cromatina inerte dal punto di vista genetico epertanto perlopiugrave senza effetti fenotipiciSi tratta quindi di una variabilitagrave normale che alivello di eterocromatina puograve manifestarsi sottoforma di varianti morfologiche e precisamente

variazioni di lunghezza di zone pericentrome-riche soprattutto dei cromosomi 1 9 16 e Yvariazioni di lunghezza dei bracci corti dei cro-mosomi acrocentrici con presenza di satellitio assenza totale del braccio corto

Variabilitagrave cromosomica patologicaUna qualsiasi anomalia del cariotipo umano nor-male (46 XX o 46 XY) ha spesso come conse-guenza una patologia di gravitagrave variabile

Figura 64

Bandeggio di cromosomi umania) le bande Q si ottengono con latecnica di bandeggio con Quinacrinab) le bande G si ottengono con latecnica di bandeggio con Giemsa

a) b)



50

prime fasi dello sviluppo embrionale Le rottu-re dei cromosomi si verificano in modo casualepertanto a livello teorico sono possibili numero-sissime anomalie di fatto solo una minima partesono compatibili con la vitaLe anomalie cromosomiche si possono distin-guere in due gruppi anomalie numeriche e distruttura

Anomalie numericheOgni assetto cromosomico corrispondente esat-tamente a un multiplo dellrsquoassetto aploide n diuna specie egrave definito euploide in particolarequelli superiori a 2n sono detti poliploidi (tri-ploidi 3n tetraploidi 4n ecc) (fig 65)Nellrsquouomo la presenza di una triploidia (fig 66)egrave di fatto incompatibile con la vita in quanto de-termina nel 99 dei casi un aborto spontaneoe nellrsquo1 dei casi la morte precoce dei neonatientro il primo mese di vita (lrsquoincidenza della tri-ploidia egrave 110 000 nati)Le triploidie (3n) si originano in seguito alla fe-condazione di un singolo ovulo da parte di duespermatozoi (fig 67a) o a errori della meiosisia femminile (fig 67b) sia maschile (fig 67c)con formazione di gameti in cui non egrave avvenutala riduzione del numero o ancora meno frequen-temente per la mancata espulsione del globulopolare durante la gametogenesi femminileSi definisce invece aneuploide qualunque nume-ro di cromosomi che non sia un multiplo esatto din i casi piugrave comuni sono rappresentati dalle tri-somie con presenza di un cromosoma sopran-numerario vale a dire un corredo cromosomico2n + 1 (es trisomie del cromosoma 13 18 21)e dalle monosomie con assenza di un cromoso-ma vale a dire un assetto cromosomico 2n ndash 1(es sindrome di Turner 45 X0) (tab 61)Durante ciascuna delle due divisioni cellulari checaratterizzano la meiosi puograve verificarsi un erro-re nella segregazione (non-disgiunzione) di unacoppia di cromosomi omologhi (nella prima di-visione) o dei cromatidi fratelli di un cromosoma(nella seconda)Ne consegue la formazione di gameti con un cro-mosoma in piugrave (n + 1) o un cromosoma in meno(n ndash 1) (fig 68)Generalmente il rischio aumenta con lrsquoaumenta-re dellrsquoetagrave maternaLa non-disgiunzione puograve interessare tutte le cop-pie di cromosomi cosigrave come evidenziato dagli stu-di di Citogenetica condotti sugli aborti spontanei

Assetto cromosomico normale

a) Monoploidia(un solo assetto cromosomico)

b) Poliploidia(piugrave del numero normale di assetti cromosomici)

Monoploide(n)

Triploide(3n)

Tetraploide(4n)

Diploide(2n)

1 2 3

n nn

n n2n

a) c)b)

2n

Le anomalie sono generalmente il risultato di er-rori durante la gametogenesi (non-disgiunzionedei cromosomi omologhi o rotture cromosomi-che seguite da una riorganizzazione degli stessi incombinazioni anomale) ma possono verificarsianche al momento della fecondazione o nelle

Figura 65

Anomalie numeriche monoploidiee poliploidie

Figura 66

Cariotipo triploide

Figura 67

Formazione di zigoti triploidi

1

6

13

19 20 21 22 23

1314 15 16 17 18

67 8 9 10 11 12

2 3 4 5


Esercitazione n 6

51

Considerazioni sulle aneuploidieSi sa che una percentuale delle gravidanze (circail 20) si arresta spontaneamente prima del ter-mine naturale Lo studio degli aborti spontanei siegrave rivelato interessante dal punto di vista citogene-tico poicheacute in circa metagrave degli aborti vi egrave unrsquoano-malia cromosomica In essi si ritrovano tutte leanomalie dei cromosomi anche se alcune comele monosomie degli autosomi hanno incidenzamolto bassa poicheacute comportano unrsquoalterazionetanto grave da arrestare lo sviluppo dello zigote astadi precocissimiSi verificano trisomie per tutti i cromosomi an-che se con frequenze diverse Pertanto i nati vivicon trisomia rappresentano solo ldquola punta di unicebergrdquo Ad esempio i trisomici 21 nati vivi sonosolo il 20 dei concepiti con questa anomaliapoicheacute la maggior parte abortisce spontaneamen-te prima della 28esima settimana Il cromosoma21 non egrave piugrave soggetto di altri a errori meiotici mapoicheacute la sua presenza in triplice copia non sem-pre provoca lrsquoarresto dello sviluppo embrionaleegrave quello percentualmente piugrave rappresentato neinati vivi trisomiciAnche la monosomia dellrsquoX presenta questo an-damento solo un quarto delle femmine con ca-riotipo 45 X0 concepite arriva alla nascita men-tre gli altri embrioni sono abortiti a stadi moltoprecoci Relativamente ai cromosomi sessualicon lrsquoaumentare del numero di cromosomi so-prannumerari aumenta la gravitagrave della sintoma-tologia questo dimostra che il dosaggio genicodi questi cromosomi deve essere perfettamenteequilibrato per il normale sviluppo sia nel ma-schio che nella femmina

Per saperne di piugraveMOSAICI

Un individuo viene definito mosaico

cromosomico quando presenta almenodue linee cellulari diverse derivateda uno stesso zigote a seguito diunrsquoanomalia in una delle celluleformatasi in un qualunque momentodello sviluppo embrionale tutte le celluleche derivano da questa presenteranno lastessa anomalia Lrsquoanomalia nei mosaicipuograve essere sia strutturale che numericaNel caso in cui lrsquoanomalia sia originatada una non-disgiunzione mitotica sioriginano due linee cellulari una a 47cromosomi e una a 45 (oltre alla lineanormale a 46) La linea a 45 cromosomiegrave perograve letale per cui lrsquoindividuo saragravecostituito da due linee cellulari unatrisomica e una normale (fig 69) In unmosaico la gravitagrave dello sbilanciamentodipende dal numero di cellule che

compongono ciascuna linea cellularevale a dire dal momento in cui egrave avvenutolrsquoevento anomalo (la gravitagrave dellrsquoanomaliaegrave maggiore quanto piugrave precocemente si egraveverificato lrsquoevento)

Figura 69

Origine di un mosaico cromosomico 4647

NON DISGIUNZIONE

NON DISGIUNZIONE

GAMETI

NUMERO DI CROMOSOMI

n+1 n+1 n-1 n+1 n nn-1n-1

MEIOSI I

MEIOSI II

Tabella 61

Schema riassuntivo delle piugrave comuni aneuploidie dei cromosomi sessuali e degli autosomi

Figura 68

Non-disgiunzione in I divisione meiotica(a sinistra) e in II divisione meiotica (adestra) e conseguente formazione deigameti

cariotipo sindrome cariotipo sindrome cariotipo sindrome

45 X0 Turner 47 XXX48 XXXX49 XXXXX

Polisomie delcromosoma Xldquosuperfemminerdquo

47 XX o XY +21 DownTrisomia 21

47 XXY48 XXXY49 XXXXY

Klinefelter 47 XX o XY +18 EdwardsTrisomia 18

47 XYY48 XXYY

Doppio Y 47 XX o XY +13 PatauTrisomia 13

47 XX o XY +8 Trisomia 8

MONOSOMIE POLISOMIE

degli eterocromosomi degli eterocromosomi degli autosomi



52

Anomalie di strutturaI cambiamenti di struttura possono coinvolgereuno due o piugrave cromosomi e sono il risultato dirotture ed eventuali ricongiungimenti errati diporzioni cromosomiche In alcuni casi le rottu-re sono ricomposte in modo da ripristinare lastruttura originaria ma nella maggior parte deicasi sono alla base di un riarrangiamento cro-mosomico anomalo Le modificazioni strutturalidei cromosomi possono essere sia stabili vale adire passano inalterate da una divisione cellulare

allrsquoaltra sia instabili in quanto non consentonouna regolare divisioneLe piugrave importanti modificazioni stabili sono(fig 610)

delezione perdita di un frammento di cro-mosoma La delezione puograve essere terminalecausata da una singola rottura cromosomicaallrsquoestremitagrave (fig 610a) o piugrave frequentemen-te interstiziale come conseguenza di due rot-ture allrsquointerno del cromosomainversione rottura del cromosoma in duepunti con formazione di un segmento cromo-somico che si reinserisce dopo rotazione di180deg (fig 610b)duplicazione raddoppiamento di un tratto diun cromosoma (fig 610c) Le duplicazioni sonopiugrave frequenti e meno dannose delle delezionitraslocazione spostamento di un tratto o diun intero cromosoma su di un altro cromo-soma non omologo (fig 610d) quando inseguito al riarrangiamento la quantitagrave tota-le del materiale genetico non risulta alteratasi parla di traslocazione bilanciata e non sihanno effetti sul fenotipo Le traslocazionipossono perograve causare la produzione di gameticon corredo genico sbilanciato e quindi essereresponsabili di gravi sindromi nella prole

TranslocazioneDuplicazioniin tandem

EDCBA

EDCBA

ONML

ONMA

EDCBL

E

D

D

C

B

A

FEDCBA

F

EDCBA

Frammentoacrocentricoperso

Delezione

EDCBA

ED

BCA

Inversione

Per saperne di piugraveLrsquoIBRIDAZIONE IN SITU SUI CROMOSOMI

Figura 610

Alcune delle anomalie cromosomichestrutturali stabili piugrave frequenti

a 4 Mb) permettendo di visualizzare anomalie checoinvolgono poche migliaia di paia di basiLa FISH egrave una tecnica di ibridazione molecolarein situ inizialmente sviluppata per la mappatura(localizzazione) dei geni sui cromosomi chepermette di visualizzare a livello cromosomicola localizzazione di un gene o di una qualsiasisequenza genomica drsquointeresse e le loro anomalie(traslocazioni delezioni o duplicazioni) usandosonde di DNA marcate con composti fluorescenti

(fig 611) In breve il DNA dei cromosomimetafasici viene denaturato a 100degC e fattorinaturare abbassando la temperatura a 65degC inpresenza di un eccesso di una sonda nucleotidicaa singolo filamento complementare alla sequenzadi interesse La reazione di ibridazione viene fattaavvenire su un vetrino sul quale egrave stato allestitoun preparato cromosomico e quindi permette divisualizzare lrsquoacido nucleico drsquointeresse in situ

cioegrave nella sua sede naturale il cromosoma

Una nuova tecnica di Genetica molecolarela FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)consente di individuare anomaliesubmicroscopiche di struttura dei cromosomianche molto piccole non rilevabili quindicon la citogenetica convenzionale Talemetodica applicata ai cromosomi metafasiciha incrementato il livello di risoluzione dellacitogenetica convenzionale (che arriva aidentificare le anomalie cromosomiche superiori

Figura 611

La sindrome di Williams egrave una malattia genetica rara checausa anomalie della crescita dello sviluppo cognitivoe difetti del cuore I soggetti con questa sindromesono portatori di una delezione nel braccio lungo delcromosoma 7 (46 -7q) che include il gene dellrsquoelastinaNella figura a sinistra una FISH in un soggetto consindrome di Williams che mostra la perdita di unacopia del gene dellrsquoelastina su uno dei cromosomi 7 adestra una FISH su un soggetto normale in cui il genedellrsquoelastina egrave presente in duplice copia Sono stateutilizzate due sonde fluorescenti diverse una per il genedellrsquoelastina e una per un gene di controllo localizzatosullo stesso cromosoma

a)

c)

b)

d)


Esercitazione n 6

53

Analisi del cariotipo umanoin laboratorioColture cellulari e terreni di colturaPer poter effettuare unrsquoanalisi cromosomica egrave ne-cessario utilizzare cellule in mitosi che possonoessere ottenute da campioni prelevati espressa-mente per questa analisi (sangue periferico liqui-do amniotico villi coriali) o da colture cellulariI tessuti che piugrave si prestano a essere coltivati invitro sono quelli che giagrave in vivo mostrano attivitagraveproliferativa Essi comprendono tessuti embriona-li adulti e tumorali In linea teorica egrave possibile al-lestire preparati cromosomici a partire da qualsiasitessuto purcheacute si usino i metodi adatti per ciascuntipo di cellule da esaminare Nellrsquouomo la maggiorparte delle procedure diagnostiche citogeneticheutilizza colture di linfociti cellule del midollo os-seo cellule embrionali sospese nel liquido amnio-tico villi coriali e fibroblasti cutaneiI primi terreni di coltura studiati per le colture invitro di tessuti animali e ancora oggi utilizzati perparticolari tipi di colture erano costituiti esclusi-vamente da componenti naturali come il plasmao il siero il liquido amniotico gli estratti di tessutie di organiNellrsquointento di rendere piugrave controllabili e quindi ri-producibili le condizioni di coltura in vitro i terreni

nutritivi naturali sono stati progressivamente sosti-tuiti con soluzioni a composizione chimica notaEsistono terreni di coltura con formulazioni adattea coprire le necessitagrave dei diversi tipi di colture cellu-lari Il terreno di coltura deve fornire i nutrienti es-senziali per le cellule ossia aminoacidi carboidratiacidi grassi vitamine e cofattori Esso inoltre man-tiene costanti le condizioni dellrsquoambiente chimicodi crescita cellulare come pH ed osmolaritagrave graziealla presenza di ioni di sali inorganici La stabilitagrave delpH del terreno egrave ottenuta grazie alla presenza di unsistema tamponePer quanto esistano in commercio terreni di col-tura definiti in tutti i loro componenti nella mag-gior parte delle colture non puograve essere evitatalrsquoaggiunta di siero animale costituito da numerosecomponenti proteiche e non per la maggior partesconosciute

Coltura di linfociti per ottenerecromosomi metafasiciPer le analisi cromosomiche le colture cellula-ri sono in genere ottenute da linfociti cellule delsangue della serie bianca utilizzate a questo scopodata la facilitagrave con cui questo tessuto egrave prelevabile

Seminarele cellule(linfociti)

Aggiungere una sostanzache stimoli la mitosi fitoemoagglutinina (PHA)

Incubareper 2-3 giorni

Aggiungere una sostanzache blocchi le mitosiin metafase (colchicina)

Trasferire le cellule in provettae centrifugare per concentrarele cellule sul fondo

Coltura in unterreno di crescita

Ritagliare i cromosomie ordinarli ricostruendoil cariotipo

Identificare e fotografarei cromosomi

Aggiungere il colorante(Giemsa)

Strisciare le cellulesul vetrino portaoggetto

Trasferire nella provettache contiene il fissativo

Aggiungeresoluzione ipotonica

Figura 612

Procedura di allestimento di un preparato cromosomico



54

dallrsquoorganismo I globuli rossi non si prestano perlrsquoanalisi cromosomica essendo privi di nucleoLe cellule vengono messe in coltura in una pro-vetta a 37 degC in presenza di fitoemoagglutinina(PHA dallrsquoinglese phytohaemoagglutinin una so-stanza che induce i linfociti a entrare in mitosi)raggiunta una fase di crescita esponenziale vieneaggiunta per unrsquoora la colchicina una sostanza cheinibisce la formazione del fuso mitotico bloccan-do le mitosi in metafaseLe cellule vengono raccolte mediante centrifuga-zione (e scarto del surnatante) e trattate con unasoluzione ipotonica per determinarne il rigonfia-mento e la rottura della membrana cellulare Se-gue un trattamento con fissativo che stabilizza lastruttura dei cromosomi altrimenti fragili e ren-de piugrave duraturo il preparato ritardando lrsquoazionedegli agenti ossidantiIl sedimento cromosomico egrave mantenuto in una

soluzione di fissativo (costituita da metanolo eacido acetico in rapporto 31) Il citoplasma incui sono immersi i cromosomi risulta disidratatodallrsquoalcool e ridotto dallrsquoacido acetico i cromo-somi mantengono la medesima posizione chepresentavano prima della fissazione nel citopla-sma Il passaggio in fissativo viene ripetuto alme-no una seconda volta dopo di che la sospensionecromosomica puograve essere conservata in provettaalla temperatura di 20degC anche per qualcheanno prima di venire strisciata su vetrino (fig612)Per ottenere vetrini con cromosomi metafasicifissati da osservare al microscopio scaricate leschede del protocollo di laboratorio sulle analisicromosomiche Potete anche esercitarvi a rico-noscere assetti cromosomici umani normali epatologici scaricando una serie di immagini dicariotipi con bandeggio Q


Esercitazione n 7

55

I geni reporterIl termine ldquoreporterrdquo proviene dallrsquoinglese e si-gnifica ldquocolui che riporta fa una relazionerdquo I genireporter sono geni utilizzati dai ricercatori perldquoriportarerdquo informazioni relative allrsquoespressionedi un altro gene di interesse eo allrsquoattivitagrave del suopromotore Una caratteristica importante di ungene reporter egrave quella di produrre una proteinarilevabile e quantificabile con un saggio semplicerapido sensibile e riproducibile ad esempio unaproteina che determina la colorazione del tessuto

in cui si esprime o emissione di fluorescenza op-pure unrsquoattivitagrave enzimatica facilmente misurabileSupponiamo di voler studiare quando si esprimeun certo gene X si dovragrave costruire un vettore incui un gene reporter (ad esempio il gene GFPGreen Fluorescent Protein che codifica una protei-na che emette fluorescenza verde vedi piugrave avan-ti) egrave inserito a valle del promotore del gene X inmodo da mantenere la corretta cornice di lettura(fig 71) Nelle cellule in cui egrave stato inserito sta-bilmente il vettore quando il promotore del gene

Colorazione FluorescenzaAttivitagrave enzimatica misurabile

Promotore di X Gene reporter

Trascrizione

Gene X

7 Anche i geni possonodiventare reporter

Attraverso questa attivitagrave imparerai come i geni possono fare i ldquoreporterrdquo

ed essere utilizzati in diversi ambiti della BiologiaLrsquoesperimento propone uno scenario in cui lrsquoutilizzo di un gene reporter inserito in piantedi Arabidopsis thaliana consente di verificare la presenza di inquinanti (come il cadmio) nel terreno


La struttura di DNA e RNALa struttura di un geneLa duplicazione del DNALa sintesi proteicaI vettori plasmidiciLa retro-trascrizionee il cDNA

Figura 71

Il gene reporter egrave inserito a valle delpromotore del gene drsquointeresse (gene X)e ne segnala lrsquoespressione



56

X egrave attivo egrave prodotto un mRNA unico da cui vie-ne sintetizzata una proteina di fusione (proteinaX + GFP) La localizzazione della proteina di in-teresse puograve essere rilevata osservando le cellulein coltura con un microscopio a fluorescenzaLa proteina codificata dal gene reporter deve es-sere assente nella specie in esame e la sua attivitagraveenzimatica deve essere facilmente distinguibileda ogni altra attivitagrave enzimatica simile presentenella cellula inoltre la sua attivitagrave non deve pre-sentare competizione neacute interferenza con altreattivitagrave enzimatiche cellulariUnrsquoulteriore e molto diffusa applicazione dei genireporter egrave quella dello studio del promotore di undato gene in un determinato tipo di cellula o du-rante lo sviluppo di un organismo In questo casobisogna costruire un vettore in cui la sequenza delpromotore o parti di essa vengono poste a montedel gene reporter (in questo caso nel vettore il geneldquodi interesserdquo non crsquoegrave) Lrsquoattivitagrave del promotore egraveanalizzata misurando il prodotto del gene reporterdirettamente nelle cellule trasformate

Come si inserisce un gene reporterin una cellulaPer introdurre un gene reporter in una cellulaviene costruito un vettore (in genere un plasmi-de) in cui il gene reporter egrave posizionato a valle delpromotore del gene che si vuole studiare (segui-to o meno dal gene ldquodi interesserdquo)Il vettore deve contenere oltre allrsquoorigine direplicazione un gene marcatore selezionabile(marker) ad esempio un gene che conferisce re-sistenza a un antibiotico che consente di selezio-nare le cellule in cui egrave avvenuto lrsquoinserimento delgene reporter (fig 72)

Nella tabella 71 sono riportati alcuni esempi digeni reporter la proteina da loro prodotta e la suaattivitagrave il prodotto puograve essere un enzima che inpresenza di un substrato specifico fornisce unldquosegnalerdquo visibile oppure una proteina che emet-te fluorescenza quando eccitata da luce di unadeterminata lunghezza drsquoonda

Descrizione dellrsquoattivitagrave dei prodottidei geni reporter piugrave utilizzatiTra i prodotti dei geni reporter indicati in tabella71 descriviamo brevemente quelli piugrave largamen-te utilizzati

GFP (Green Fluorescent Protein)La GFP egrave in grado di emettere luce di colore ver-de acceso se colpita da radiazione a specifica lun-ghezza drsquoonda la sua scoperta la sua modifica eil suo utilizzo hanno valso il premio Nobel per lachimica nel 2008 a Osamu Shimomura MartinChalfie e Roger Y TsienLa GFP egrave stata scoperta nel 1962 in una medusala Aequorea victoria (fig 73) che vive in NordAmerica lungo le coste del Pacifico alla qualeconferisce la caratteristica bioluminescenza dicolore verde Nella proteina egrave presente una por-zione di 3 aminoacidi detta fluoroforo ben pro-tetta allrsquointerno di una struttura a ldquobarilerdquo (fig74) quando la radiazione blu (475 nm) o ultra-violetta (395 nm) colpisce il fluoroforo alcunisuoi elettroni assorbono energia per passare a unlivello energetico superiore (stato eccitato) perpoi ricadere nello stato fondamentale emetten-do radiazione a energia inferiore di colore verde(505 nm) La scoperta di questa proteina che siaccende ldquoautomaticamenterdquo in presenza di ossi-

PLASMIDE

ori= origine di replicazioneP= promotore di XR= gene reportermarker= gene che conferisceresistenza a un antibiotico

ori

P

marker

R

Figura 72

Esempio di un plasmide perlrsquoinserimento di un gene reporterin una cellula

Tabella 71

GENE REPORTER PRODOTTO ATTIVITAgrave

GFP Green Fluorescent Protein Proteina in grado di emettere fluorescenza verde quando eccitatada radiazione a specifica lunghezza drsquoonda

Luc luciferasi della lucciola(Photinus pyralis)

Enzima che agisce sul suo substrato (luciferina) in presenza di ATPossigeno e Mg++ determinando lrsquoemissione di luce verdegialla

GUS szlig-glucuronidasi batterica Enzima che agisce su alcuni composti szlig-glucuronididando una colorazione blu

szlig-gal szlig-galattosidasi Enzima che agisce su alcuni composti come X-galdando una colorazione blu

Lux A e Lux B luciferasi batterica Enzima che agisce sul suo substrato (luciferina) in presenzadi aldeide alifatica a catena lunga e ossigeno determinandolrsquoemissione di luce bluverde

Ruc luciferasi da Renilla reniformis Enzima che agisce sul suo substrato (una luciferinadetta Celenterazina) in presenza di ioni Ca++ e ossigenodeterminando lrsquoemissione di luce blu

Figura 73

La medusa Aequorea victoria


Esercitazione n 7

57

Luciferasi

HO S

S

N

N

COOH

Luce gialla

LuciferinaATP Mg++

OssiluciferinaAMP CO

2

HO S

S

N

N

OH

geno e senza necessitagrave di attivazione da parte dienzimi o altri fattori ha rivoluzionato le tecnichedi studio della Biologia cellulare consentendonuovi approcci per lrsquoanalisi dellrsquoespressione ge-nica la localizzazione dinamica di proteine ladivisione cellulare e molti altri processi in cellulevive

LuciferasiLa luciferasi della lucciola egrave un enzima in grado dicatalizzare la produzione di luce a partire dallrsquoos-sidazione della proteina luciferina in presenza diATP ossigeno e ioni Mg++ (fig 75)Il metodo che utilizza il gene della luciferasi ha ivantaggi di essere molto sensibile di non averenessuna interferenza (percheacute la maggior parte del-le cellule non ha attivitagrave di luciferasi) di utilizzareun saggio rapido e a bassi costi Il gene miglioreegrave quello della lucciola nordamericana Photinus

pyralis la cui proteina non egrave tossica non richiedemodificazioni post-traduzionali e quindi funzio-na sia in cellule procariotiche che eucariotiche laluminescenza prodotta egrave gialla (560 nm)In generale il vettore contenente il gene reporterviene inserito nelle cellule Dopo un certo tempole cellule sono lisate attraverso lrsquoaggiunta di unopportuno tampone di lisi cosigrave da ottenere unestratto cellulare in cui si introducono luciferina(il substrato della luciferasi) Mg++ e un eccesso diATP Lrsquoenzima luciferasi eventualmente espres-so catalizza lrsquoossidazione della luciferina causan-do luminescenza gialla Questo effetto puograve esserequantificato con un luminometro uno strumen-to che misura lrsquointensitagrave luminosa la quantitagrave diluce emessa egrave correlabile direttamente con lrsquoatti-vitagrave del promotoreUnrsquoaltra luciferasi egrave quella di Renilla reniformisun celenterato questo enzima in presenza di

Figura 74

La struttura della GFP e il meccanismo di eccitazione degli elettroni (eˉ)

Figura 75

A sinistra schema della reazione catalizzata dalla luciferasi della lucciola e a destra Photinus pyralis

Luce blu o UV

Livello fondamentale e-

e-Livello eccitato

Luce verde



58

ioni Ca++ e ATP eccita unrsquoaltra luciferina la ce-lenterazina che produce luce blu (fig 76)Le attivitagrave della luciferasi della lucciola e di quelladi Renilla possono essere combinate in un unicosaggio che utilizza entrambi i geni reporterIl limite di questo saggio sta nel fatto che vieneeffettuato su estratti cellulari (non su cellule) erichiede lrsquoaggiunta di un substrato Non egrave adattoper seguire processi dinamici e variabili nel tem-po in cellule vive

-galattosidasiLa β-galattosidasi egrave un enzima di Escherichia coliin grado di scindere il disaccaride lattosio nei duecomponenti (galattosio + glucosio) lrsquoenzima egravein grado di scindere un substrato chiamato X-gal(composto da galattosio e da una molecola precur-sore dellrsquoindaco il 5-bromo-4-cloro-3-idrossindo-lo) e le cellule che lo esprimono si colorano di blu

-glucuronidasi (GUS)La β-glucuronidasi egrave un enzima di Escherichiacoli utilizzato nel saggio GUS la tecnica ideatada RA Jefferson che egrave in assoluto la piugrave diffu-sa nello studio della Biologia vegetale Lrsquoenzimaβ-glucuronidasi egrave in grado di scindere deriva-ti dellrsquoacido glucuronico se lrsquoenzima agisce suspecifici substrati incolori e non fluorescenti egrave ingrado di renderli colorati o fluorescenti dunquevisibili allrsquooperatore Come substrati di reazionesi possono usare diverse sostanze Per la colora-zione istochimica viene utilizzato prevalente-mente il 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronide(X-Gluc) che per idrolisi forma un precipitatoindaco insolubile (fig 78) Per i saggi quantitati-vi (saggi spettrofotometrici) si usa il p-nitrofenilβ-D-glucuronide da cui deriva una sostanza co-lorata e solubile per i saggi fluorimetrici si uti-lizza il 4-metilumbelliferil-β-D-glucuronide dacui viene prodotta una sostanza fluorescente esolubileUn organismo egrave adatto per il saggio GUS se nonha una propria attivitagrave β-glucuronidasica (o se

Figura 76

Schema della reazione catalizzatadalla luciferasi di R reniformis e adestra la medusa

Figura 78

Schema della reazione catalizzatadalla szlig-glucurunidasi su X-Gluc

Per saperne di piugraveNON SOLO VERDE

Lrsquoidea di utilizzare la GFP come genereporter di espressione per studiare lalocalizzazione e le funzioni di specificheproteine nelle cellule viventi risale allafine degli anni ottanta del secolo scorsoNel 1994 sono stati trasformati batteri diEscherichia coli facendogli esprimere laGFP in seguito il gene GFP egrave stato inseritocon successo in sei specifici neuroni diCaenorhabditis elegans (un nematode)Tuttavia la GFP naturale ha dei limiti egravescarsamente foto-stabile presenta undoppio picco di eccitazione (luce blu a475nm e UV a 395nm) e ha difficoltagravenellrsquoassumere una corretta conformazionea 37 degC Per ovviare a questi limiti laproteina egrave stata modificata in laboratorioottenendo una GFP con maggiorefoto-stabilitagrave e con una fluorescenzapiugrave brillante sono state prodotte ancheproteine con spettri di eccitazione edemissione diversi di colore giallo (YFPYellow Fluorescent Protein) azzurro-grigio

(CFP Cyan Fluorescent Protein) blu(BFP Blue Fluorescent Protein) (fig 77)Il grande vantaggio di queste proteinesta nella mancanza di tossicitagrave e nellaestrema facilitagrave di rilevamento il loroimpiego simultaneo consente lo studioa livello molecolare di diversi processibiologici contemporaneamente (e anchedi processi dinamici) in una singolacellula in coltura e in organismi semplicianche in vivo

Figura 77

Da sinistra a destra BFP CFP GFP e YFP

HO

CelenterazinaATP Ca++

Celenteramide

O O

OH

CO2

NN

N HON

NNH

H

OH

O2

Luce blu

Luciferasi di Renilla+

+

acidoglucuronico

dimerizzazioneossidativa

55rsquo dibromo-44rsquo dicloro indaco(insolubile colorato)

-glucurunidasiX-Gluc

Br BrCl Cl OH

BrCl

Br

ClONH

0

NH

acidoglucuronico

O-

+

NH

NH


Esercitazione n 7

59

questa attivitagrave egrave sufficientemente bassa per cuiil ldquorumore di fondordquo egrave accettabile) Per questaragione il saggio non puograve essere utilizzato nellamaggior parte dei vertebrati e in molti molluschiNelle piante superiori nei muschi nelle alghenei funghi e in quasi tutti i batteri non crsquoegrave attivitagraveGUS endogena per cui la tecnica puograve essere usa-ta proficuamente

I geni reporter per lrsquoambienteIl monitoraggio ambientale prevede spesso lrsquouti-lizzo di organismi viventi come indicatori dellaqualitagrave ambientale tali organismi sono detti bio-indicatori (o indicatori biologici) e fornisconoinformazioni sulla qualitagrave ambientale e sui livellidi inquinamento percheacute rispondono a determi-nate condizioni con variazioni che possono esse-re identificate e talvolta quantificate Queste va-riazioni spesso riguardano il tasso di mortalitagrave dicrescita o di riproduzione della specie bioindica-trice ad esempio la qualitagrave delle acque dolci puograveessere monitorata studiando la composizione dicomunitagrave di invertebrati cosigrave come la diminuzio-ne della fertilitagrave e del numero di specie di licheniegrave indice di inquinamento atmosferico Altre va-riazioni sono di tipo morfologico e funzionalead esempio sempre nei licheni lrsquoinquinamentoatmosferico ne causa lo scolorimento e la ridu-zione del ldquocorpordquo (fig 79)Oltre a utilizzare organismi naturali per lo studiodella qualitagrave ambientale sono stati messi a puntobioindicatori transgenici ossia organismi in cuisono stati inseriti geni reporter sotto il controllo diun promotore sensibile alle variazioni del parame-tro ambientale che si vuole studiare come la pre-senza di un particolare contaminante Ad esem-pio per lrsquoindividuazione di arsenico nellrsquoacqua deipozzi si utilizzano batteri resistenti allrsquoarsenico emodificati geneticamente in modo da esprimere laGFP in presenza dellrsquoelemento tossicoIn particolare lrsquoutilizzo di piante transgenichecome bioindicatori presenta alcuni vantaggi le-gati principalmente alla loro natura di organismicomplessi sedentari naturalmente adatti allacrescita sul suolo la cui coltura egrave relativamentefacile e poco costosa Inoltre le piante rappresen-tano il principale punto di ingresso nella catenaalimentare umana e animale per numerosi inqui-nanti eo composti tossiciPer costruire bioindicatori vegetali si utilizzanodei vettori contenenti geni reporter A differenzadi quanto visto precedentemente in questo casoil gene reporter viene posto sotto il controllo di

Per saperne di piugraveLA PIANTA CHE UTILIZZIAMO

ARABIDOPSIS THALIANA

Arabidopsis thaliana (o Thale Cress

oppure arabide comune) egrave una piantaannuale che cresce nei sentieri o suimuri dei giardini e fa parte della stessafamiglia del cavolo e della senapeCresce in diversi habitat dal Polo ArticoallrsquoEquatore con notevoli capacitagrave diadattamento Si tratta di una speciecosmopolita in grado di sopravviverein una vasta gamma di ambienti e diadattarsi alle diverse condizioni esternepresentando numerose varietagrave localiArabidopsis thaliana egrave diventata negliultimi anni un organismo modello perlo studio della Genetica e della Biologiamolecolare e cellulare delle piante poicheacutepossiede una serie di vantaggi piccoledimensioni (che la rendono ideale neglispazi ristretti dei laboratori e delle serrenegli istituti di ricerca) ciclo vitale breve(circa sei settimane) elevata produttivitagravedi semi (fino a 10 000 semi per pianta)ridotte dimensioni del suo genoma(circa 125 milioni di paia di nucleotidiin soli cinque cromosomi) Arabidopsis

egrave la prima pianta da fiore di cui siastato sequenziato il genoma graziea una ricerca avviata nel 1991 dallaCommissione europea e basata sullacollaborazione di laboratori di 15 paesi

tra cui Stati Uniti e Giappone (Nature 408791 14 December 2000)Un ulteriore vantaggio di Arabidopsis

egrave la semplicitagrave con la quale si possonoprodurre piante transgeniche tramiteil processo di trasformazione geneticasfruttando il batterio Agrobacterium

tumefaciens per incorporare nuovoDNA nel genoma della pianta (vediEsercitazione n˚2)

un promotore di cui sia giagrave nota la sensibilitagrave allemodificazioni di un dato parametro ambientaleUn particolare esempio di bioindicatore vegetaleegrave rappresentato da piante di Arabidopsis thalianatransgeniche in grado di evidenziare la presenzadi mine di terra in esse egrave stato inserito un geneper la sintesi degli antociani (una classe di com-posti che conferisce colorazioni rosa-blu-violet-

Figura 79

Licheni danneggiati lrsquoinquinamentone ha causato lo scolorimento e ildistacco del ldquocorpordquo dal substrato



60

to) la cui espressione egrave controllata da un promo-tore sensibile al tritolo (fig 710)In modo analogo sono state sviluppate piante diArabidopsis transgeniche per il monitoraggio del-la concentrazione di specifici metalli nel suoloTali bioindicatori sono stati costruiti integrandostabilmente nel genoma della pianta un vettorein cui lrsquoespressione del gene reporter GUS (ri-levabile grazie a una colorazione blu dei tessutivegetali in presenza del substrato opportuno) egraveposta sotto il controllo del promotore di un genespecificamente indotto dalla presenza di metallonel mezzo di crescita Queste piante non solosono in grado di indicare la presenza del metallonel mezzo di crescita ma forniscono un segnalela cui intensitagrave egrave dipendente dal livello di conta-minazione I risultati ottenuti a livello sperimen-tale con questo approccio sono incoraggianti masono necessarie ulteriori prove in condizioni piugravesimili a quelle di campo per valutare la reale ap-plicabilitagrave di queste piante come bioindicatoriIl nostro esperimento si basa sullrsquoutilizzo di pian-te di Arabidopsis sensibili alla presenza di cadmionel terreno

Per saperne di piugraveI METALLI PESANTI NELLrsquoAMBIENTE IL CASO DEL CADMIO

nella catena alimentare umana egrave infatti unelemento biopersistente poicheacute una voltaassorbito da un organismo rimane in esso permolti anni (dellrsquoordine di decine per gli uomini)prima di venire espulsoIl cadmio egrave assorbito dalle piante attraversogli stessi sistemi di trasporto utilizzati daicationi essenziali come Zn++ Ca++ e Fe++ Leproprietagrave tossicologiche del cadmio derivanodalla sua somiglianza chimica con lo zinco unmicronutriente essenziale per piante animali edesseri umaniNegli organismi vegetali lrsquoesposizione a elevateconcentrazioni di Cd++ comporta lrsquoinibizionedella crescita sia delle radici che della parteaerea della pianta la comparsa di clorosifogliare lrsquoalterazione del bilancio idricolrsquoinibizione dellrsquoapertura stomatica e unadiminuzione della sintesi della clorofilla Latossicitagrave del cadmio potrebbe essere legataa interferenze con numerosi processi come ilmetabolismo dei carboidrati e la fotosintesiprobabilmente percheacute porta a unrsquoinattivazioneenzimatica Inoltre lrsquoaccumulo di cadmio

produce specie reattive dellrsquoossigeno qualilrsquoanione superossido e il perossido drsquoidrogenoche danneggiano acidi nucleici e proteineAlcune piante evidenziano capacitagrave ditolleranza sopportando una elevataconcentrazione del metallo senza evidenziareeffetti sul loro metabolismoLrsquoassorbimento di cadmio da parte degli esseriumani avviene principalmente attraverso il ciboDerrate alimentari ricche in cadmio possononotevolmente aumentare la sua concentrazionenel corpo umano Alcuni degli alimenti in cui sipossono accumulare elevate concentrazioni dicadmio sono fegato funghi crostacei mitilipolvere di cacao e alghe secche Il cadmioingerito egrave trasportato al fegato principalmentetramite il sangue Nel fegato si lega a proteineformando complessi che arrivano poi ai renidove il cadmio si accumula danneggiando imeccanismi di filtrazione Ciograve causa lrsquoescrezionedi proteine essenziali e di zuccheri con ulterioredanno renale Occorre molto tempo prima cheil cadmio accumulato nei reni sia espulso dalcorpo umano

Il cadmio (Cd) (fig 711) egrave un metallo pesanteossia un metallo la cui densitagrave superai 5 gcm3 in particolare egrave un metallo pesantenon essenziale in quanto non egrave richiesto perla crescita delle piante e in molti casi puograveesercitare effetti tossici La sua rilevanza comecontaminante ambientale e la sua mobilitagrave nelsistema suolo-pianta hanno reso questo metallotossico il piugrave studiato nelle piante Inoltre ilcadmio ha un notevole impatto rispetto siaallrsquoesposizione delle piante sia allrsquoaccumulo

Figura 711

Unrsquoinsolitaldquocarta drsquoidentitagraverdquodel cadmio

Figura 710

La colorazione blu dovuta agliantociani delle piante transgenichedi Arabidopsis indica presenza di tritolo


Esercitazione n 7

61


ScenarioUn campo deve essere seminato con erbe offi-cinali ma le analisi di una falda acquifera vicinarivelano la presenza di cadmio Si vuole verificarese anche il terreno da coltivare egrave contaminato dalcadmio a tal fine si egrave deciso di utilizzare piante diArabidopsis thaliana geneticamente modificate ingrado di rivelare la presenza di cadmio nel suoloIl vostro laboratorio sta quindi predisponendo isemi per le piantine transgeniche sono necessaridei saggi sperimentali per verificare che essi sianoidonei allrsquouso prima di procedere al loro utilizzoin campo

Il costrutto genetico utilizzatoper trasformare ArabidopsisGli esperimenti utilizzeranno piante di Arabidop-sis thaliana geneticamente modificate che espri-mono il gene reporter GUS di Escherichia coli(GUS = β-glucuronidasi enzima poco espressonelle piante) Lrsquoenzima β-glucuronidasi egrave in gra-do di scindere X-Gluc liberando una molecola diacido glucuronico e una molecola di 5-bromo-4-cloro indaco che in seguito a una reazione didimerizzazione ossidativa forma un precipitatoinsolubile e colorato il 55rsquo-dibromo-44rsquo-dicloroindaco (figg 78 e 713)

Nel costrutto genetico lrsquoespressione del geneGUS egrave regolata dal promotore di un gene coin-volto nelle risposte delle piante alla presenza dicadmio (fig 712) Arabidopsis diventa quindi un

bioindicatore in grado di mettere in evidenza lapresenza del metallo nel suolo

Allevamento delle pianteLe piante di Arabidopsis utilizzate sono ottenute inlaboratorio previa sterilizzazione dei semi questisono quindi seminati in condizioni di sterilitagrave suterreni di crescita contenenti agar con e senza cad-mio (sotto forma di cloruro di cadmio CdCl2)I semi sono lasciati crescere per 10 giorni in unacamera di crescita mantenuta a 23 degC con un fo-toperiodo di 16 oreSu queste piante egrave possibile svolgere lrsquoesperienzadescritta dai protocolli scaricabili

Analisi dei risultatiIl saggio istochimico effettuato su piante transge-niche che esprimono il gene GUS rivela la colora-zione indaco solo nelle piante cresciute in terrenicontenenti cadmio (fig 714)Nella figura si osserva la colorazione nellrsquoappara-to radicale nellrsquoapice di crescita e nelle nervaturedelle foglie

Analisi dellrsquoespressione del gene reporterattraverso RT-PCRPartendo dal RNA estratto dalle foglie di Arabi-dopsis di fenotipo selvatico e di piante transge-niche cresciute in terreni completi con e senzacadmio mediante retro-trascrizione e amplifica-zione (PCR) con opportuni primer si ottengonocopie parziali di cDNA codificanti per il gene

PLASMIDE

ori = origine di replicazioneP = promotore di Xgus = gene reportermarker = gene che conferisceresistenza a un antibiotico

ori

P

marker

gus

Figura 713

Effetto fenotipico della reazionecatalizzata dalla szlig-glucuronidasisu X-gluc in piantine diArabidopsis transgeniche

Figura 712

Il plasmide utilizzato perlrsquoinserimento del gene reporterGUS in Arabidopsis



62

GUS e per il gene di controllo 16S per che codi-fica per RNA della subunitagrave minore dei ribosomidi plastidi e mitocondriI campioni ottenuti sono analizzati medianteelettroforesi su gel di agarosioSe retro-trascrizione e PCR hanno funzionatobene egrave logico aspettarsi in tutte le corsie caricatela presenza della banda relativa al gene di control-

lo S16 come riportato nello schema (fig 715)In quali dei campioni caricati saragrave presente anchela banda relativa al gene GUS

La foto del gel (fig 716) evidenzia il profilo diespressione del gene GUS e del gene di riferi-mento il gene GUS egrave espresso solo in piante tra-sformate e in presenza di cadmio nel terreno

cDNA da Arabidopsiscon fenotipo selvatico

GUS

C

+Cd C +Cd

16S

cDNA da Arabidopsistrasformata con GUS

Figura 716

Schema dei risultati ottenuti Nella pianta con fenotipo selvatico non crsquoegrave espressione del gene GUSnella pianta trasformata il gene GUS si esprime solo in presenza di cadmio nel terreno Il gene dicontrollo 16S egrave espresso in misura paragonabile in tutte le condizioni esaminate

Figura 714

Espressione del gene GUS in piante di Arabidopsis transgenichecresciute in presenza di cadmio (b) il gene non si esprime inpiante cresciute in terreno di controllo (a)

Figura 715

Schema dellrsquoespressione del gene di controllo S16 in piante cresciute in terrenicompleti in assenza (C) e in presenza (+Cd) di cadmio


C +Cd C +Cd


GUS

16S

a) b)


Esercitazione n 8

63

Dal DNA alle proteineIl genoma (DNA) di un organismo multicellulare(ad es lrsquouomo) egrave sempre lo stesso in tutte le suecellule mentre il proteoma (il numero e il tipo diproteine) varia nelle cellule dello stesso individuoIl proteoma inoltre cambia nel tempo rispon-dendo a una molteplicitagrave di fattori di natura me-tabolica fisiologica farmacologica nutrizionaleambientale e nellrsquouomo anche in funzione dellostato di salute o malattiaIl proteoma egrave piugrave plastico e dinamico del genomaVa perograve sottolineato per evitare equivoci che an-che il genoma non va considerato come unrsquoentitagravestatica Infatti ciograve che rimane pressocheacute stabile egrave lasequenza dei nucleotidi nel DNA mentre la strut-tura tridimensionale del DNA varia nei diversi tes-suti e nel tempo in relazione alla loro espressioneEgrave proprio in virtugrave della variazione dellrsquoespressionegenica che si determina gran parte della plasticitagravedel proteoma (fig 81) I geni funzionalmente piugraveimportanti sono quelli che vengono ldquotrascrittirdquo inRNA messaggeri (mRNA) e poi ldquotradottirdquo in pro-teine secondo le regole del ldquocodice geneticordquo Assu-mendo che nel genoma umano possano esserci piugrave

8 Separazione ecolorazione di proteine

Lo scopo dellrsquoesperimento egrave analizzare il contenuto di proteine

in un tessuto o in una popolazione selezionata di celluleEsistono diverse procedure ma quella che utilizzeremo in questa attivitagrave egrave basata sulla separazionedi proteine mediante elettroforesi su gel di acrilammide sulla loro colorazione e sul ricoscimentodi una specifica proteina avendo a disposizione degli anticorpi prodotti contro la proteina in esame


Il DNAIl codice geneticoLa sintesi proteicaLa struttura e lecaratteristiche delleproteine (polipeptidi)La funzione delle proteine

Figura 81

a) Il genoma contiene lrsquoinformazionegenetica della specie b) Il trascrittomaanalizzabile con la tecnica deimicroarrays rappresenta lrsquoinsiemedei mRNA espressi in un dato tipocellulare in un determinato momentoc) il proteoma definibile attraversolrsquoelettroforesi bidimensionale egravelrsquoinsieme di proteine trovate in unparticolare tipo di cellule in determinatecondizioni

a)

b)

c)



64

o meno 20 000-23 000 geni trascrivibili in mRNAsi ritiene che il proteoma dellrsquouomo possa esserecirca 100-1000 volte piugrave ampio raggiungendo lacomplessitagrave di 23 times 106-107 proteine Tale diversitagravesi raggiunge attraverso due meccanismi principaliil primo riguarda il meccanismo di ldquomaturazionerdquodegli mRNA il secondo riguarda le modificazionipost-traduzionali delle proteine La trascrizione diun gene codificante per una proteina dagrave origine aun trascritto primario che attraverso un mecca-nismo complesso denominato splicing puograve gene-rare diversi mRNA ldquomaturirdquo che sono tradotti inisoforme della stessa proteina che possono averefunzioni diverse Le proteine infine possono subi-re modificazioni dopo essere state ldquotradotterdquo sui ri-bosomi tale processo chiamato ldquoregolazione post-traduzionalerdquo influenza enormemente lrsquoattivitagrave e lastabilitagrave delle proteine

Trascrittoma maturazionedellrsquoRNA messaggero splicinge splicing alternativoLa molecola trascritta dalla RNA polimerasi egrave unpre-RNA (chiamato anche hn-RNA o RNA etero-geneo nucleare) cioegrave una molecola di RNA che vaincontro a maturazione prima di passare nel cito-plasma ed essere tradotta sui ribosomi Nel nucleole sequenze introniche (non codificanti) vengonoeliminate attraverso il processo di splicing in cuile estremitagrave degli introni (siti di splicing) vengonoriconosciute tagliate e gli esoni vengono ricucitiinsieme dando luogo alla sequenza codificantecompleta A maturazione completata lrsquomRNAesce dal nucleo e puograve essere tradotto sui ribosomiEgrave evidente che i tagli degli introni devono avvenire

in modo molto accurato per garantire che lrsquomRNAfinale abbia una cornice di lettura correttaAllo stesso tempo il meccanismo di splicing egrave statoselezionato anche per la sua flessibilitagrave nella scel-ta dei siti di splicing Questo permette alla celluladi ldquosperimentarerdquo nuove proteine modificandolo schema di splicing (includendo o escludendoun determinato esoneintrone mantenendonecomunque lrsquoordine) Queste forme alternative displicing sono molto comuni il 70 dei geni umaniha splicing alternativi e in molti casi gli schemi displicing di uno stesso pre-RNA sono molteplici Intessuti o in stadi di differenziamento diversi di unastessa cellula o in vari momenti dello sviluppo lostesso pre-RNA subisce splicing diversificati ge-nerando proteine con funzioni differenti Questaplasticitagrave egrave dovuta alla presenza di fattori specificiche regolano lrsquoaccessibilitagrave al taglio dei diversi sitidi splicing e quindi lo schema dei tagli che ven-gono effettuati sulla molecola di pre-RNA Il van-taggio egrave evidente piugrave proteine sono codificate dauna stessa sequenza genica e di conseguenza piugraveinformazione egrave immagazzinata nel genoma

Un gene una proteinaLrsquoesistenza dello splicing alternativo ha cancellatoil dogma originario un gene una proteina e haportato a definire il gene come una collezionelineare di esoni che vengono assemblati in mol-teplici combinazioni dallo splicingLa fibronectina ad esempio egrave una proteina dellamatrice extracellulare con vari schemi di splicingtessuto-specifici (fig 82) Egrave presente nel tessutoconnettivo e nel plasma Contribuisce a orga-nizzare la matrice extracellulare e regola lrsquointe-

Fibroblasti

Fegato

5rsquo 3rsquo

Legamedella fibroneticaai linfociti+

+

-

-

-

Figura 82

Il gene della fibronectina contiene 50esoni Lo splicing alternativo del pre-RNA in tre diversi siti dagrave origine a piugravedi 20 diverse isoforme di fibronectinacon diverse proprietagrave Le celluleche maggiormente sintetizzano lafibronectina sono i fibroblasti e il fegatoLo splicing alternativo nella parteterminale determina la capacitagrave deillafibronectina di essere legata dai linfocitie di conseguenza lrsquoadesione ai tessutidi questi ultimi


Esercitazione n 8

65

Splicing alternativo del trascritto primario della tropomiosina

Muscolo striato 1

Muscolo striato 2

Muscolo liscio

Mioblasto

Fibroblasto

Epatocito

Neuroblasto

Figura 83

Il gene della tropomiosina contiene 12 esoni Lo splicing alternativodel pre-RNA in diversi siti dagrave origine a 7 diverse forme di tropomiosinacon diverse proprietagrave e in diversi tessuti

razione con altre molecole della matrice e altrecellule svolge un ruolo chiave nella regolazionedellrsquoadesione e della migrazione cellulare in pro-cessi fondamentali come lrsquoembriogenesi la meta-statizzazione la cicatrizzazione il mantenimentodellrsquointegritagrave dei tessutiLa tropomiosina una proteina implicata nel con-trollo della contrazione muscolare egrave codificatada un gene contenente 12 esoni Diverse modali-tagrave di splicing generano 7 isoforme diverse di tro-pomiosina nel muscolo scheletrico nel muscololiscio nei fibroblasti del tessuto connettivo nelfegato e nel cervello (fig 83)

Modificazioni post-traduzionaliLe modificazioni delle proteine (fig 84) aumen-

tano la diversitagrave dei gruppi funzionali ben al dilagrave dei 20 tipi di aminoacidi esistenti Tali modi-ficazioni variano le proprietagrave funzionali delleproteine rappresentano nuovi segnali di ricono-scimento molecolare ldquoaccendonordquo o ldquospengonordquoattivitagrave enzimatiche e controllano la stabilitagrave e lalocalizzazione di proteine allrsquointerno della cellu-la Le modificazioni di proteine possono esserereversibili o irreversibili fisiologiche o patolo-giche Alcune modificazioni sono irreversibililrsquoesempio piugrave classico consiste nel processamen-to di proteine tramite rottura del legame peptidi-co catalizzata da proteasi enzimi che degradanoaltre proteine La modificazione di proenzimitramite proteolisi specifica egrave comune nella pro-duzione delle forme attive di enzimi digestivi di

Figura 84

Alcune delle principali modificazioni post-traduzionali delle proteineAc acetilazione Ub ubiquitinazione P fosforilazione Me metilazione



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Proteasoma

PeptidiUbiquitinazionedella proteina

Proteine construttura alterata

ormoni di proteine coinvolte nella coaugulazio-ne del sangue e in numerosi altri processi

Alcuni esempi di modificazionipost-traduzionaliUbiquitinazione (fig 85)Lrsquoubiquitina egrave una piccola proteina di 76 ami-noacidi molto conservata tra tutti gli eucariotiil ruolo piugrave noto dellrsquoubiquitinazione consiste

nellrsquo ldquoetichettarerdquo le proteine da avviare alla de-gradazione nei proteasomi Negli ultimi anni si egraveperograve scoperto che lrsquoubiquitinazione di proteineegrave coinvolta in una miriade di processi tra cui laproliferazione cellulare la progressione del ciclocellulare lrsquoapoptosi la riparazione del DNA ildifferenziamento il trasporto di proteine Il nu-mero dei residui di ubiquitina legati alla proteinane regola la funzione e il destino se alla stessaproteina si legano molti residui di ubiquitinaquesta viene per lo piugrave spinta alla degradazionetramite i proteasomi al contrario il legame dipochi residui di ubiquitina (1-4) influenza la fun-zionalitagrave della proteina e non la sua stabilitagrave

Fosforilazione e defosforilazioneLa fosforilazione di proteine egrave la modificazionepost-traduzionale piugrave frequente nel proteomadegli eucarioti Egrave stato valutato che circa un terzodelle proteine del proteoma umano sono fosfori-late e che esistono circa 500 enzimi in grado difosforilare in modo specifico altre proteine e 150capaci di de-fosforilarle Come anticipato gli en-zimi fosforilanti sono chiamati proteine-chinasi(PK) mentre quelli che defosforilano sono de-nominati fosfatasi La fosforilazione di proteineavviene anche nei procarioti ma egrave estremamentepiugrave abbondante negli eucariotiLe proteine-chinasi catalizzano il trasferimentodi un fosfato dellrsquoATP su residui di serina treo-nina o tirosina con liberazione di ADP Poicheacutela fosforilazione ha unrsquoimportante funzione re-golativa possiamo prevedere che esistano diver-se strategie anche per eliminare i gruppi fosfatodalle proteine fosforilate o per spegnere lrsquoattivitagravedelle chinasi Il modo piugrave diretto per eliminare glieffetti della fosforilazione di una proteina consi-ste nellrsquoidrolizzare direttamente il gruppo fosfatodai residui degli aminoacidi fosforilati

Acetilazione e metilazioneNelle cellule eucariotiche molti processi possonoessere regolati attraverso lrsquoacetilazione e la meti-lazione di proteine In particolare lrsquoacetilazionee la metilazione degli istoni sono molto rilevan-ti per modulare la struttura e la funzione dellacromatina Il nucleosoma (fig 86) costituiscelrsquounitagrave strutturale di base della cromatina egrave unastruttura nucleo-proteica costituita da 9 moleco-le istoniche 1 copia dellrsquoistone H1 e due copieciascuna degli istoni H2A H2B H3 e H4 cheformano il ldquocorerdquo del nucleosoma che ha il ruo-lo di compattare il DNA nel nucleo delle cellule

Figura 85

Aggiunta di ubiquitine a una proteinanon correttamente formata e suadegradazione nel proteasoma

Figura 86

Struttura del nucleosoma due giridi DNA avvolti intorno a un ottamerodi istoni (H2A H2B H3 H4) Lemodificazioni istoniche avvengono sulleestremitagrave delle proteine che sporgonodal nucleosoma


Esercitazione n 8

67

Per saperne di piugraveIL CODICE DEGLI ISTONI

Figura 87

Alcuni esempi di modificazioniistoniche K lisina Rarginina S serina

Nellrsquoottamero istonico lrsquoistone H3 egrave quello piugravefortemente modificato a livello post-traduzionaleConsiderando tutte le possibili modificazioni ilnumero di isoforme proteiche diverse per unamolecola di istone H3 egrave enorme 110 592 possibilicombinazioni di modificazioni post-traduzionaliCome giagrave detto inoltre gli amminoacidi possonoessere mono- di- o tri-metilati e va consideratoche tutte queste modificazioni possono essere

teoricamente diverse nei circa 107 nucleosomipresenti sul genoma umano ciascuno contenentedue copie dellrsquoistone H3 Esistono poi gli altriistoni e le loro modificazioni Il numero di possibilicombinazioni di modificazioni nel genoma diventaquindi astronomico Questo spiega come lecellule possono adattare con estrema dinamicitagravegli schemi di espressione genica a diversecondizioni

Acetilazione e metilazione riguardano molteproteine ma in particolare gli istoni che sono leproteine piugrave modificate a livello post-traduzionale(si parla di codice degli istoni)Lrsquoacetilazione di proteine riguarda essenzialmenteresidui di lisina e arginina mentre la metilazionepuograve avvenire anche su altri aminoacidi (fig 87)Non solo le metilazioni possono prevederelrsquoaggiunta di 1 2 o 3 gruppi metilici

Tutti e quattro gli istoni H2A H2B H3 e H4 cheformano il ldquocorerdquo possono essere acetilati eometilati su specifici tipi di aminoacidi Egrave impor-tante aggiungere che le modificazioni istonichesono tra loro inter-connesse ad esempio unacerta modificazione su uno specifico aminoacidopuograve avvenire solo se un altro residuo sulla stessamolecola egrave stato precedentemente modificatoIl complesso delle modificazioni istoniche hauna grande rilevanza nei meccanismi di epige-netica cioegrave i meccanismi che influenzano le fun-zioni del genoma ma non comportano alcunamodificazione nella sequenza del DNA Il codicedelle modificazioni istoniche consente alla cellu-la di ldquointerpretarerdquo in piugrave modi il codice geneticosul DNA attuando schemi di espressione genicaspecifici (ad es attivazione o silenziamento di unparticolare gene o gruppo di geni) in risposta aun dato stimolo o una data condizione ambien-

tale Queste modificazioni degli istoni possonoessere trasmesse di generazione in generazionee consentono quindi il trasferimento dello statofunzionale della cromatina alle cellule figlie

GlicosilazioneLa glicosilazione consiste nellrsquoaggiunta di unacatena laterale di carboidrati a un aminoacidoe le proteine cosigrave modificate sono definite glico-proteine tra queste rientrano molte proteine chesvolgono la loro funzione in ambiente extracellu-lare e che quindi vengono secrete dalle celluleo sono esposte sulle membrane cellulari La gli-cosilazione inizia nel reticolo endoplasmatico(RE) e viene completata nellrsquoapparato di GolgiQuesto tipo di proteine durante la sintesi vienetrasferito nelle membrane o nelle cisterne delRE da qui passa nellrsquoapparato di Golgi da cui egraveindirizzato alla destinazione definitiva



68

PremessaIn tutti gli eucarioti le cellule attivano in rispo-sta a danni al DNA uno specifico meccanismocellulare chiamato checkpoint la cui funzione egraveessenzialmente quella di rallentare il ciclo cellu-lare per offrire alle cellule piugrave tempo per ripararele lesioni sul DNA Il DNA egrave danneggiato da sva-riati agenti chimico-fisici presenti nellrsquoambientetra cui le radiazioni ultraviolette nella luce delsole e sostanze chimiche presenti in diverse lavo-razioni industriali nella nostra dieta o nel fumodi sigaretta Oltre a questi danni causati da agenticosigrave detti ldquoesogenirdquo il DNA egrave danneggiato ancheda radicali liberi dellrsquoossigeno che si generanonelle cellule durante il normale metabolismo cel-lulare (si parla di ldquoagenti endogenirdquo) Per nostrafortuna nelle cellule si sono evoluti insieme aicheckpoint sopra citati tutta una serie di meccani-smi di riparazione dei danni molto efficienti chesi prendono cura di specifiche lesioni prodottesul DNA Per avere unrsquoidea del fenomeno bastipensare che il DNA di ogni cellula umana su-bisce giornalmente alcune decine di migliaia dilesioni che se non riparate portano a mutazio-ni riarrangiamenti e perdita di cromosomi tuttifenomeni connessi allrsquoinsorgenza di tumori e al-tre patologie nellrsquouomo La stabilitagrave e lrsquointegritagravedel genoma sono cosigrave vitali per la cellula che ilDNA egrave lrsquounica molecola per cui si sono evolutimeccanismi di riparazione le altre molecole sedanneggiate vengono buttate viaIn risposta a danni al DNA le cellule aumentanolrsquoefficienza dellrsquoattivitagrave di riparazione trascriven-do geni che codificano per proteine riparative orichieste per il checkpoint incrementando di con-seguenza la loro quantitagrave allrsquointerno delle cellule

Lrsquoattivitagrave delle proteine riparative e di checkpoint egravemodulata anche a livello post-traduzionale cioegravequeste proteine sono modificate chimicamentedopo essere state sintetizzate (vedere piugrave avanti)

Lo scenarioNellrsquoesperimento analizzeremo il livello di unaparticolare proteina di lievito il prodotto del geneRAD53 una proteina-chinasi che gioca un ruolocruciale nella risposta cellulare a tutti i tipi di dannosul DNA In risposta a danni al DNA la proteinaRad53 viene specificamente fosforilata e tale mo-dificazione egrave visibile sperimentalmente in quantoaumentando il peso molecolare della proteina nerallenta la mobilitagrave elettroforetica Questi meccani-smi di riparazione sono cosigrave utili e importanti chesi sono conservati nel corso dellrsquoevoluzione dal lie-vito allrsquouomo Come potete osservare nella tabel-la 81 ci sono diverse proteine che hanno la stessafunzione nellrsquouomo e nel lievito anche se hannonomi diversiUn tipico checkpoint comprende tre componenti

i sensori proteine che rilevano i segnali causa-ti sul DNA dalle varie lesionii trasduttori per lo piugrave delle proteine-chinasi(tra cui Rad53) che amplificano e trasmetto-no il segnale nellrsquoambito di una cascata di tra-sduzione del segnalegli effettori per lo piugrave proteine che agisconosul controllo del ciclo cellulare

Elettroforesi la tecnica usataper separare le molecole proteicheLa purificazione di una proteina consiste nel suo

La cellula corre ai ripariMeccanismi di riparazione del DNA

PROTEINE UOMO LIEVITO

Sensori complesso 9-1-1ATM e ATR (chinasi)

complesso 9-1-1Tel1 e Mec1 (chinasi)

Trasduttori Chk1 e Chk2 (chinasi) Chk1 e Rad53 (chinasi)

Effettori numerose proteine che controllano per lo piugrave la progressione del ciclo cellulare (tra le qualiin uomo la famosa p53 nota come ldquoguardianordquo del genoma

Tabella 81

Proteine coinvolte nel chekpoint dadanni sul DNA in uomo e in lievito


Esercitazione n 8

69

isolamento da una miscela eterogenea contenen-te altre proteine o anche acidi nucleici polisac-caridi lipidi e molecole piugrave piccole (zuccheripeptidi aminoacidi ormoni etc) La purificazio-ne sfrutta le differenze nelle proprietagrave chimico-fisiche tra la molecola che si vuole purificare e lealtre presenti nella miscela Alcuni parametri utilizzabili sono

la dimensione della proteina e la sua caricasolubilitagrave densitagrave idrofobicitagravecapacitagrave di legare metalli o altre molecolepresenza di modifiche post-traduzionalialtre proprietagrave (per es la termolabilitagrave o ter-mostabilitagrave)

Lrsquoelettroforesi in un campo elettrico egrave perograve latecnica piugrave utilizzata per separare tra loro misce-le di proteine di diverse dimensioni e peso mo-lecolare La separazione delle varie componentiproteiche avviene solitamente su gel verticali dipoliacrilammide con la porositagrave piugrave idonea alledimensioni delle proteine da separareLa velocitagrave di migrazione su gel di una proteinadipende dallrsquointensitagrave del campo elettrico appli-cato dal peso molecolare (dimensione) e dallacarica della proteina stessa La carica netta di unaproteina dipende a sua volta dal pH del tampo-ne utilizzato per la corsa elettroforeticaLe tecniche di separazione elettroforetiche pos-sono essere divise in due categorie principalielettroforesi di proteine in condizioni native oin condizioni denaturate In condizioni native leproteine conservano la loro conformazione e laseparazione avviene sulla base del rapporto cari-camassa La conservazione della conformazio-ne egrave importante per il mantenimento dellrsquoattivi-

tagrave biologica proteine estratte da gel nativi sonosolitamente attive e possono essere utilizzate perulteriori esperimenti

Allestimento di un gelper elettroforesi in SDSUna tecnica molto utilizzata in laboratorio egrave laseparazione di proteine in condizioni denatu-ranti in presenza di sodio-dodecil-solfato (SDS)e agenti riducenti si parla di tecnica SDS-PAGE(Sodio Dodecil Solfato - PoliAcrilammide GelElettroforesi) In presenza di SDS detergentefortemente ionico e altre condizioni sperimen-tali specifiche la struttura secondaria e terziariadelle proteine viene di fatto distrutta I polipep-tidi sono ricoperti da cariche negative (il deter-gente SDS conferisce una carica elettrica negati-va in media ogni 2 aminoacidi) permettendo lamigrazione delle proteine verso lrsquoanodo (polopositivo) con una velocitagrave che dipende dal loropeso molecolare (dimensioni) Ne consegue chedisponendo di proteine di peso molecolare notoegrave possibile costruire una curva standard chepermette di calcolare il peso molecolare di unaproteina ignota in funzione della sua distanza dimigrazioneUn tipico allestimento di un gel per elettroforesiin SDS prevede (fig 88)

uno ldquostackingrdquo gel (o gel di impaccamento) diacrilammide al 4 egrave la parte superiore del gella sua funzione egrave quella di concentrare il cam-pione proteico caricato negli appositi pozzettiin modo che tutte le proteine presenti nellamiscela inizino la loro migrazione dallo stessopunto di partenzaun ldquorunningrdquo gel (o gel di separazione) di acri-

pozzetti

running gel

stacking gel

Figura 88

Allestimento di un gel di acrilammidee apparecchiatura per elettroforesi inSDS



70

lammide al 10 egrave la parte inferiore e la suafunzione egrave quella di separare le proteine deivari campioni in base al loro peso molecola-re Egrave composto dagli stessi ingredienti dellostacking gel ma in quantitagrave diverse e con unpH diverso In particolare la concentrazionedi acrilammide varia tra stacking gel e runninggel Infatti lo stacking gel serve solo a impac-care le proteine alla ldquogriglia di partenzardquo e perottenere ciograve basta una concentrazione bassa diacrilammide nel running gel invece si voglio-no separare le proteine e quindi la scelta dellaconcentrazione di acrilammide egrave in funzionedellrsquoambito di peso molecolare che si vuoleanalizzare La concentrazione di acrilammidedetermina la dimensione dei pori nel gel con-centrazioni maggiori portano a pori di dimen-sioni minori

Tutta la procedura di allestimento del gel puograveessere evitata in quanto sono disponibili in com-mercio gel ldquoprecastrdquo giagrave polimerizzati e con i poz-zetti preformati pronti allrsquousoScaricate le schede del protocollo per lrsquoelettrofo-resi delle proteine e per il western blotting

Come si allestisce una corsaelettroforetica per proteineLrsquoapparato di base per lrsquoelettroforesi verticale egravecostituito da due lastre di vetro rettangolari di 8 x10 cm inserite verticalmente nel supporto per lagelificazione le lastre sono separate da due spa-ziatori di plastica e chiuse da pinze Nello spazioche si genera (circa 1 mm di spessore) si versa-no e si lasciano gelificare prima la soluzione diacrilammide per il gel di separazione (inferiore)e poi quella per il gel di impaccamento (superio-

re) Quando questo non egrave ancora gelificato si in-troduce un pettine di teflon dello stesso spessoredegli spaziatori allo scopo di formare i pozzettiin cui verranno caricati i campioni (fig 88) Ilsupporto contenente il gel di poliacrilammidecosigrave preparato viene poi immerso nella cameraper la corsa elettroforetica contenente il tamponeper la separazione delle proteine I campioni diproteine piugrave densi percheacute contengono glicerolosono depositati nei pozzetti contenenti il tampo-ne di corsa

Dopo lrsquoelettroforesi le proteine (se presenti inquantitagrave sufficienti) possono essere visualizzatemediante la colorazione con Blu di Coomassie(fig 89) La miscela di proteine contenuta in unestratto cellulare non purificato contiene tantipolipeptidi che dopo separazione e colorazio-ne danno origine a un numero molto elevato dibande non facilmente distinguibili una dallrsquoaltraInoltre alcune proteine sono presenti in bassequantitagrave e non sono rilevabili con una semplicecolorazione

Western blottingPer individuare ed evidenziare nella miscela diproteine presente in un estratto cellulare la pro-teina a cui si egrave interessati si ricorre molto spesso atecniche di ldquoblottingrdquo con tale termine si intendeil trasferimento di materiale biologico su suppor-ti tipo nylon o nitrocellulosa che possono esserefacilmente maneggiati e incubati con opportunesonde che possono ibridare (formare legami)con le molecole drsquointeresse Nel caso di unamiscela di proteine egrave possibile evidenziare ine-quivocabilmente la proteina drsquointeresse (doposeparazione elettroforetica) se si dispone di unanticorpo contro tale proteina (vedi box Persaperne di piugrave Interazione antigene-anticorpo)A tale scopo le proteine separate mediante SDS-PAGE sono trasferite elettricamente su un fo-glio di nitrocellulosa Il foglio egrave poi incubato inpresenza di un anticorpo specifico (anticorpoprimario) contro la proteina drsquointeresse e il com-plesso proteina-anticorpo formatosi sul foglio egraveevidenziato utilizzando un anticorpo secondario(cioegrave che riconosce il primo anticorpo) marca-to o in grado di conferire una colorazione spe-cifica o una chemioluminescenza che possonoessere monitorate su una lastra fotosensibileLrsquointera procedura prende il nome di ldquowesternblottingrdquo(fig 812)Le tecniche di marcatura degli anticorpi sono

Figura 89

Colorazione di proteine con Bludi Comassie dopo separazioneelettroforetica nelle corsie 1 e 8 sonocaricati i marcatori di peso molecolare

1 2 3 4 5 6 7 8


Esercitazione n 8

71

Per saperne di piugraveINTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

con anticorpi il sito di interazione con lrsquoanticorpoviene indicato con il termine di ldquoepitopordquo odeterminante antigenico Gli immunogeni (oantigeni) piugrave comuni e potenti sono le proteineLe singole proteine hanno piugrave di un epitopo epossono quindi essere riconosciute da anticorpicon specificitagrave diverse

Legame antigene-anticorpo

Lrsquoanticorpo lega con affinitagrave piugrave o meno elevatalrsquoepitopo mediante formazione di legami ionici

legami idrogeno interazioni idrofobiche (fig811) Se lrsquoantigene egrave rappresentato da unaproteina lrsquoepitopo che stabilisce legami con ilsito variabile dellrsquoanticorpo egrave formato da circa6-10 aminoacidi Il legame AbAg egrave stabilea condizioni di pH e forza ionica fisiologiciA pH estremi il legame si rompe Lo stessoaccade aumentando la concentrazione salina oaggiungendo detergenti in grado di indebolirei legami idrofobici Tali condizioni variano aseconda sia dellrsquoantigene che dellrsquoanticorpo

La tecnica qui utilizzata per evidenziare unaparticolare proteina ldquosfruttardquo la reazioneantigene-anticorpo che avviene normalmentein un organismo Vale la pena ripassare alcuniconcetti fondamentali In seguito allrsquoingressonellrsquoorganismo di microrganismi estranei nelsistema immunitario dei vertebrati i linfociti Bsi attivano producendo molecole gli anticorpio immunoglobuline in grado di riconoscere elegare selettivamente i determinanti antigenici(Ag) presenti sulle molecole estranee Le funzioniprincipali degli anticorpi sonolegarsi agli antigeni e neutralizzarlicontribuire a eliminare gli agenti patogeni conlrsquoaiuto di macrofagiformare complessi con gli agenti patogeni cheattivano direttamente una forma di rispostaimmunitaria (i fattori del complemento) che portaalla lisi del microrganismo legato

Gli anticorpi hanno la caratteristica fondamentaledi riconoscere gli antigeni in modo molto specificoQuesta caratteristica egrave ampiamente sfruttatasperimentalmente e gli anticorpi vengono utilizzatiquali sonde ottimali per studiare la localizzazionee la biochimica di proteine e altri antigenicomplessi cosigrave come per effettuarne il dosaggio ela purificazione

Struttura degli anticorpi

Una molecola di anticorpo (Ab dallrsquoingleseantibody) ha una struttura quaternaria (fig810a) costituita da due catene pesanti di circa440 aminoacidi e due catene leggere di 220aminoacidi uguali a due a due Catene pesanti(H dallrsquoinglese heavy) e leggere (L dallrsquoingleselight) sono tenute insieme da ponti disolfuro(S-S)Ciascuna catena comprende una regionevariabile -NH2 terminale in cui sono localizzatele sequenze aminoacidiche che concorrono allaformazione del sito di legame e una regionecostante -COOH terminale Le estremitagrave -NH2terminali di catene H e L accoppiate formano duesiti di legame per lrsquoantigene Le catene leggeree pesanti sono costitute da domini ciascuno deiquali egrave lungo 110 aminoacidi e caratterizzatodalla presenza di due cisteine che formano unponte disolfuro che stabilizza la struttura deldominio La catena L (fig 810b) ha due domini(un dominio variabile VL e un dominio costanteCL) mentre la catena H ha un dominio variabile(VH) e tre domini nella regione costante (CH1CH2 CH3)

Antigeni

Gli antigeni sono sostanze in grado di interagire

Figura 810

a) Un tipico anticorpo ha forma di Y e ha dueidentici siti di legame per lrsquoantigene su ciascunbraccio della Y La proteina egrave formata da 4catene polipeptidiche (2 catene pesanti H e2 catene leggere L) tenute insieme da pontidisolfuro Ciascuna catena egrave composta da

a)

b)

sito di legame per lrsquoantigene

antigene

ansa che lega lrsquoantigene

dominiovariabiledella catenaleggera (V L)

dominiocostantedella catenaleggera (C L)

catena pesante

dominio VH

dominio VL

5 nm

legame disolfuro

catenaleggera

Sito di legameper lrsquoantigene

Dominio VL Dominio VH

Figura 811

Nella molecola di anticorpo il sito di legame perlrsquoantigene egrave formato dai domini VH e VL In verdee in arancio i residui amminoacidici coinvoltinella formazione del sito di legame

domini immunoglobulinici un dominio variabilealla estremitagrave ndashNH2 terminale (ombreggiato inazzurro) uno (nella catena L) e tre (nella catenaH) domini costanti (ombreggiati in grigio)b) Modello a nastro di una catena L che mostra(in rosso) le parti del dominio VL maggiormentecoinvolte nel legame con lrsquoantigene



72

a) elettrotrasferimento

correnteelettrica

SDS - gel dopo corsaelettroforetica

aggiunta del substrato

SVILUPPO

b) incubazione con anticorpoprimario e lavaggi

c) incubazione con anticorposecondario successivi lavaggie sviluppo

Figura 812

In alto Apparecchiatura perwestern blotting In bassoI passaggi di un western blottinga) Elettrotrasferimento delle proteinedal gel di poliacrilammide a un fogliodi nitrocellulosa b) Incubazione con anticorpo primario c) Incubazionecon anticorpo secondario marcatoe rilevamento

moltepliciradioattivitagravelegame con un enzima (il cui substrato sia ingrado di dare una colorazione specifica)biotinilazione (e rilevamento con avidinamarcata)chemioluminescenza in grado di dare un se-gnale su una lastra fotosensibile

Gli anticorpi primari si ottengono dal siero dianimali (in genere toporattoconigliocapra)iniettati con la proteina di interesse Gli anticor-pi del siero animale sono policlonali (ossia sonodiretti contro diversi epitopi della proteina usatacome immunogeno) e possono quindi avere del-le reazioni crociate con altre proteine (che con-dividono epitopi con la proteina di interesse)Per una specificitagrave maggiore si usano anticorpimonoclonali prodotti in vitro immortalizzando

singole cellule della milza di animali immunizza-ti Come anticorpo secondario si usa un siero dianimale (di specie diversa da quella in cui egrave statoprodotto lrsquoanticorpo primario) immunizzato conanticorpi della specie dellrsquoanticorpo primarioLrsquoanticorpo secondario egrave quindi un anticorpodiretto contro la parte costante di un anticorpodi specie diversa

Dopo il trasferimento (blotting) su filtro di nitro-cellulosa si effettuano i seguenti passaggi

Saturazione nel processo di trasferimento ri-1mangono dei siti liberi sulla membrana chevengono bloccati rivestendo la membrana conuna miscela di proteine non specifiche Que-sto evita il legame non specifico dellrsquoanticorposu tali siti Si utilizza latte o albumina bovina(BSA)Incubazione con anticorpo primario la mem-2


Esercitazione n 8

73

brana viene immersa in una soluzione checontiene lrsquoanticorpo contro la proteina di in-teresse Poicheacute tutti i siti della membrana chelegano proteine sono bloccati lrsquoanticorpoaderisce alla membrana solo se si lega con ilsuo antigene specificoLavaggi permettono di eliminare dalla mem-3brana lrsquoanticorpo in eccesso che non ha legato ilproprio antigene La membrana viene lavata conuna soluzione contenente un detergente (tween20) mantenendola in agitazione su una piastrabasculante Egrave importante effettuare piugrave lavaggicambiando diverse volte la soluzione di lavaggioIncubazione con anticorpo secondario la4membrana viene immersa in una soluzioneche contiene un anticorpo in grado di reagi-re con qualunque anticorpo della stessa fontebiologica del primarioEsempi

Ab primario di coniglio (rabbit)Ab secondario capra anti-coniglio (goatanti-rabbit)Ab primario di topo (mouse)Ab secondario capra anti-topo (goat anti-mouse)

Lavaggi permettono di eliminare dalla mem-5brana lrsquoanticorpo in eccesso che non ha legatolrsquoanticorpo primario Si utilizza la stessa solu-zione con detergente utilizzata nello step 3lrsquoultimo lavaggio avviene invece in TBS per-chegrave il tween 20 puograve inibire la reazione utilizza-ta per la rivelazione della proteina

Rilevazione della proteina lrsquoanticorpo secon-6dario egrave accoppiato covalentemente a un enzimache catalizza una reazione cromogena quandola membrana viene incubata con il substratodellrsquoenzima accoppiato

Analisi dei risultatiGli stessi campioni 1 e 2 vengono caricati su duegel (gel 1 e gel 2) I risultati sono illustrati in fi-gura 813PM marcatore di peso molecolare di proteineCampione 1 estratto proteico proveniente dalceppo di lievito normaleCampione 2 estratto proteico proveniente dalceppo di lievito irraggiato con raggi UV

Dopo la corsa elettroforetica il gel 1 viene coloratocon il Blu di Coomassie e si ottengono una serie dibande corrispondenti alle maggiori componentiproteiche dei due estratti non sono evidenziabilidifferenze tra il campione 1 e il campione 2Dopo western blotting del gel 2 lrsquoimmunodecora-zione della membrana con lrsquoanticorpo anti-Rad53mostra che la proteina egrave presente in entrambi gliestratti ma nel campione 2 ha un peso maggiore(eacute piugrave in alto) dovuto alla sua fosforilazioneColorando la membrana dopo western blottingcon Rosso Ponceau si osserva una distribuzionedi bande del tutto sovrapponibile a quella ottenu-ta con il Blu di Coomassie nel gel 1 dimostrandoche crsquoegrave stato un completo trasferimento delleproteine durante il western blotting

Figura 813

a) Gel di proteine colorato con Blu diCoomassieb) Risultato del western blotting inevidenza solo la proteina di interessenon modificata (1) e modificata (2)c) Colorazione del gel con RossoPonceau dopo il trasferimento

P M 1 2

a)Coomassie

245 KDa180 KDa

135 KDa

100 KDa

75 KDa

b)western blotting

c)Ponceau

P M 1 2 P M 1 2



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Esercitazione n 9

75

Anche i genomi vanno in bancaIl sito da cui partiremo per lrsquoesplorazione delgenoma umano egrave wwwensemblorg (fig 91)Ensembl (un gioco di parole fra ensemble cioegraveinsieme e EMBL la sigla del European Molecu-lar Biology Laboratory) egrave un progetto nato dallacollaborazione tra Sanger Center (uno dei piugraveimportanti centri di ricerca sul genoma a Cam-bridge) e EMBL-EBI (European BioinformaticsInstitute) per sviluppare un sistema software diannotazione automatica dei genomi animaliCon il termine ldquoannotazionerdquo si intende lrsquoinse-rimento di tutte le informazioni riguardanti lafunzione di una determinata sequenza di DNAEnsembl aggiorna i dati almeno dieci volte in unanno ma nel sito si possono ritrovare comunquele versioni precedenti (Ensembl Pre) nel riqua-dro Browse a Genome che si trova a sinistra del-la home page Le immagini contenute in questa

attivitagrave si riferiscono alla versione (release) 64aggiornata a settembre 2011Passiamo subito a esplorare il genoma umanoutilizzando lrsquointerfaccia fornita da Ensemblesattamente come fanno quotidianamente mol-tissimi ricercatori impegnati in studi di Biologiae Genetica molecolare Per iniziare fate ora clicksu Human nel riquadro Browse a Genome

9 Surfingtra i genomi

In questa attivitagrave impareremo a esplorare il genoma umano utilizzando le informazioni

contenute in alcune delle banche dati biomediche disponibili online

Metteremo a confronto lrsquoorganizzazione e le caratteristiche di genomi di organismi diversi

scopriremo le corrispondenze esistenti fra i cromosomi umani e quelli di altri esseri viventi

impareremo a trovare un gene allrsquointerno del genoma e a scoprirne struttura e funzionePer poter svolgere questa attivitagrave egrave indispensabile avere a disposizione un computer collegatoa internet e un percorso guida con indicati i siti dove trovare le informazioni


DNA e cromosomiCariotipoGeni e strutturaEsoni-introni

Figura 91

Home page del sito Ensembl in basso a destra in evidenza il numerodella versione disponibile e la data dellrsquoultimo aggiornamento dei datiin questo caso settembre 2011



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Si apre la pagina relativa al genoma umano (fig92) poche righe fanno riferimento alla prove-nienza dei dati presenti nella corrente versione diEnsemblFate click suKaryotype nella colonna di sinistra siapre una nuova pagina che permette di raccoglierevarie informazioni sui cromosomi umani In alto siha una rappresentazione grafica del cariogrammaumano (fig 93) con gli ideogrammi dei 22 cromo-somi autosomici e di quelli sessuali con MT vieneindicato il genoma mitocondriale Le linee nere ogrigie sui cromosomi rappresentano le ldquobanderdquoregioni cromosomiche che avendo differenti pro-prietagrave fisico-chimiche si colorano in modo diversodopo il trattamento con coloranti specificiLe bande sui cromosomi possono essere consi-derate come punti di riferimento dato che sonospecifiche per ogni cromosoma gli scienziati lehanno usate in passato per definire le diverse re-gioni cromosomiche e ancora oggi i citogeneti-sti utilizzano diverse tecniche di bandeggio perstudiare i cromosomi (vedi Esercitazione Analisi

1

WHOLE GENOME

14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y MT

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Figura 92

Schermata dedicata al genoma umanoa sinistra in blu i link utili per avereulteriori notizie sul genoma umano

Figura 93

Rappresentazione del cariotipo umanocon bandeggi

cromosomiche)In basso sono evidenziati i dati che riguardanoil genoma umano La sua sequenza egrave conside-rata oggi sufficientemente stabile cosigrave che i tremaggiori browsers genomici (NCBI Ensemble UCSC Genome Browser) si sono accordati alfine di identificare e annotare ciascun gene conun codice unico valido per tutti (gene ID)Si contano 3 283 481 986 paia di basi (Base Pairs)20 469 Known protein-coding genes (geni noti checodificano proteine) e 431 ldquoNovel protein-codinggenesrdquo cioegrave geni previsti dallrsquoanalisi al computerma che non sono ancora stati verificati sperimen-talmente A volte le previsioni bioinformatichepossono non essere corrette e lrsquounico modo perprovare lrsquoesistenza di un nuovo gene egrave la dimo-strazione sperimentale in laboratorio (nota idati si riferiscono alla versione 64 di Ensemblsettembre 2011 e potrebbero variare in versionipiugrave recenti)Gli pseudogeni mantengono alcune delle carat-teristiche proprie dei geni (ad esempio esserepreceduti da sequenze promotrici o avere siti displicing) ma non sono piugrave funzionanti percheacutehanno perso la capacitagrave di essere espressi a causadi eventi genetici (mutazioni) che hanno creatocodoni di stop o slittamenti di lettura del codiceTornate sulla home page di Ensembl e cliccatesu Mouse e poi su Karyotype si apriragrave la pagi-na relativa al cariotipo del topo con il suo tipicobandeggio Vedrete che il topo ha un numero in-feriore di cromosomi (19 cromosomi autosomici+ X Y)Inoltre tutti i cromosomi sono acrocentrici conil centromero a unrsquoestremitagraveTornando alla pagina iniziale e cliccando su Viewfull list of all Ensembl species si possono controlla-re anche altre specie (cane pollo ecc) notereteche non sempre sono presenti i cariotipi con icromosomi o alcuni di questi non sono rappre-


Esercitazione n 9

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sentati nel cariotipo della specie oppure ancorasebbene presenti non sono bandeggiati Questosignifica che un cromosoma egrave stato poco anno-tato o che non ci sono informazioni sui geni inesso contenuti o infine che il bandeggio non egravesignificativo per rintracciare zone specificheTornate ora alla home page di Ensembl e allrsquoHomosapiens e provate a osservare un cromosoma piugraveda vicino per esempio il cromosoma 1 cliccan-do sopra di esso si apre una tendina e scegliendoChromosome summary si accede a una visionepiugrave dettagliata del cromosoma e di alcune sue ca-ratteristiche (fig 94) Lrsquoideogramma del cromo-soma riporta annotazioni di tipo citogenetico Sipossono vedere le sigle che sono state assegnatead alcune delle bande con numeri crescenti dalcentromero verso le estremitagrave telomeriche rispet-tivamente sul braccio corto p (petit) e sul bracciolungo q La colonna immediatamente a destra mo-stra la densitagrave genica cioegrave quanti geni sono pre-senti in una regione specifica del cromosoma e inparticolare la parte rossa dellrsquoistogramma mostrala percentuale di geni noti sul totale dei geni pre-visti Nota che ci sono regioni con un numero digeni molto alto altre con un numero molto bassoe altre ancora senza geni (chiamate ldquodesertirdquo) tracui la zona del centromero (Ricordiamo che soloil 2 circa dellrsquointera sequenza del genoma umano

contiene sequenze codificanti I geni sono per lopiugrave ldquoimmersirdquo in lunghe sequenze non codificantiil cui significato non egrave ancora del tutto compresotalora chiamate junk DNA o DNA spazzatura)La seconda colonna mostra la percentuale di se-quenze ripetute mentre la linea rossa quella di basiazotate GC La colonna in blu indica la distribu-zione delle variazioni o polimorfismi del DNANella parte in basso della schermata trovi altreinformazioni sul cromosoma 1 Ci sono 2002Known Protein-coding Genes e 26 Novel Protein-Coding genes cioegrave geni predetti con le analisi alcomputer ma che non sono ancora stati validati

Figura 94

Cromosoma 1 umano osservato nel dettaglio

Figura 95

Informazioni sul cromosoma 1 lunghezza in paia di basi numero di geni conosciuti numero di geni predettipseudogeni geni per micro RNA (miRNA) per RNA ribosomiali (rRNA) per piccoli RNA nucleari (small nuclear RNAsnRNA) per piccoli RNA nucleolari (small nucleolar RNA snoRNA) per miscellanea di RNA (MiscRNA) numero dipolimorfismi di singolo nucleotide (SNPs)

sperimentalmente (fig 95)Egrave possibile visualizzare altri cromosomi aprendola tendina posta sotto la rappresentazione graficae scegliendo il numero del cromosoma

La Genomica comparativaper seguire lrsquoevoluzioneAttraverso i nuovi strumenti bioinformatici dellagenomica comparativa egrave possibile seguire le trac-ce dellrsquoevoluzione sulla struttura e la funzionedei genomi Cliccando nel riquadro di sinistra suSynteny possiamo anche seguire la chromosomesynteny cioegrave lrsquoassociazione di gruppi di geni met-tendo a confronto cromosomi di specie differen-ti Troveremo che intere regioni cromosomicherisultano conservate in specie diverse

Cromosomi di topo e di uomoPer confrontare ad esempio il cromosoma 1 uma-no con i cromosomi di topo cliccate a sinistra suSynteny Egrave evidente come interi gruppi di sinteniacioegrave regioni cromosomiche sono rintracciabili in



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La storia del cromosoma XSelezionate adesso il cromosoma X Egrave interes-sante notare che il cromosoma X umano a dif-ferenza degli autosomi presenta sintenia solocol cromosoma X del topo (fig 97) Questo egravespiegabile in base al fatto che i geni localizzati suquesto cromosoma sono espressi in singola copiasia nei maschi (che hanno un solo cromosomaX e quindi un solo allele per ogni suo gene) sianelle femmine dove in seguito allrsquoinattivazionecasuale di uno dei due cromosomi X durante losviluppo embrionale allo stadio di blastocistiuna sola copia di ogni gene presente sul cromo-soma X (con alcune eccezioni) egrave funzionantePer questo motivo nellrsquoevoluzione i geni postisul cromosoma X tendono a rimanere localizzatiinsieme su questo cromosoma se si spostasserosu un autosoma sarebbe complicato garantire laloro espressione a partire da uno solo dei duealleli (esclusione allelica) Questa sintenia com-pleta (o quasi) si osserva in tutte le specie in cui ilsesso egrave determinato dal maschio eterogameticocioegrave nei mammiferi

Un progenitore comune allrsquouomoe allo scimpanzeacuteLo scimpanzeacute ha un cromosoma in piugrave rispettoallrsquoHomo sapiens Lrsquoesistenza di un cromosomaumano che sia equivalente ai 2 cromosomi delloscimpanzeacute spiegherebbe questa discrepanza nelnumero dei cromosomi delle due specieOsserviamo il cromosoma 2 umano e la sua sin-

Figura 98

Sintenia tra il cromosoma 2 umano e i cromosomi dello scimpanzeacute

Figura 97

Gruppi di sintenia del cromosoma Xumano a confronto con il genoma ditopo anche se in posizione diversa ivari gruppi di geni si trovano tutti sulcromosoma X di topo

Figura 96

Il cromosoma 1 umano in posizionecentrale e ai lati grafica delladistribuzione sui cromosomi di topo deivari gruppi di sintenia

diversi cromosomi di topo In particolare i geni delcromosoma 1 umano sono distribuiti nei cromoso-mi 1 3 4 5 6 8 11 e 13 del topo (fig 96) Esten-dendo questa analisi agli altri cromosomi puoi os-servare che tutti i cromosomi del topo sono costituitida un mosaico di segmenti esattamente omologhi asegmenti presenti anche sui cromosomi umaniIl fatto che interi gruppi di geni mantengano in spe-cie diverse la loro posizione relativa (e contenganosequenze altamente conservate) porta a concludereche derivano da un progenitore comuneSotto la rappresentazione grafica della sintenia siaprono due tendine che consentono di cambiare ri-spettivamente il cromosoma umano e la specie concui fare il confronto


Esercitazione n 9

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tenia con lo scimpanzeacute (fig 98)La sintenia praticamente completa del cromoso-ma 2 umano con i cromosomi 2a e 2b dello scim-panzeacute egrave una forte evidenza del fatto che questocromosoma deriva dalla fusione di due cromo-somi ancestrali rimasti separati nello scimpanzeacute(e anche in altre grandi scimmie come gorillae orango) Ulteriore evidenza di questa fusionesta nella posizione delle sequenze telomeriche(specie-specifiche) allrsquointerno del cromosoma 2umano che rispetta le attese di un simile eventoinoltre il centromero del cromosoma 2 umanoegrave allineato al centromero del cromosoma 2a discimpanzeacute mentre resti delle sequenze centro-meriche del cromosoma 2b si ritrovano doveattese nel cromosoma 2 umanoOsservando la sintenia tra altri cromosomi uma-ni e di scimpanzeacute si nota che un gran numero digruppi sintenici sono localizzati sugli stessi cro-mosomi si puograve concludere quindi che piugrave lespecie risultano vicine evolutivamente piugrave sonoconservati i gruppi di sintenia e questi ultimisono localizzati sugli stessi cromosomi

Adesso osserviamo da vicino un cromosoma evediamo quali informazioni sono disponibili aquesto nuovo livello di ingrandimentoRitornate alla pagina con il cariogramma umanoquindi selezionate il cromosoma 13 Notereteche il cromosoma 13 contiene un numero di genirelativamente basso Provate ora a cliccare su unaregione del cromosoma e a selezionare Jump tolocation View magari scegliendo una zona ricca digeni (le aree senza geni sono decisamente menointeressanti)Per seguire un percorso comune dopo aver fat-to qualche prova autonomamente inserite il se-guente link httpwwwensemblorgHomo_sapiensLocationViewdb=coreg=ENSG00000139618r=1332889611-32973347Si apriragrave una pagina suddivisa in diverse sezioni(fig 99) Nel riquadro 1 ldquoChromosome 13rdquo egrave inevidenza il punto in cui vi trovate sul cromoso-ma Nel riquadro 2 viene mostrata la regione delgenoma che avete selezionato (rettangolo rosso)nella parte destra del riquadro 2 sono indicati

Figura 99

Riquadro 2

Riquadro 3

Riquadro 1



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Figura 910

Figura 911

gli elementi principali che si trovano nel trattodi DNA visualizzato cloni di DNA utilizzati pereffettuare il sequenziamento della regione mar-catori polimorfici geni eccIl riquadro 3 mostra la struttura del gene presentein questa regione BRCA2 Si notano dei rettan-goli e delle barre collegate da una linea spezzataPer capire questa rappresentazione grafica egrave ne-cessaria qualche informazione sullrsquoarchitetturadei geni La struttura dei geni eucariotici egrave pe-culiare la sequenza codificante non egrave continua

ma egrave frammentata Nei geni le parti utilizzateper dirigere la sintesi di proteine o di molecole diRNA sono dette esoni (nella figura rappresentatida rettangoli) e sono alternate ad altre sequenzedi DNA gli introni (linee spezzate) A causa diquesta alternanza esoni-introni i geni eucarioti-ci sono definiti ldquogeni interrottirdquo Esistono alcunerare eccezioni i geni degli istoni ad esempionon sono interrottiCliccando nel riquadro in alto a sinistra suAlignment (text) si arriva a visualizzare la sequen-


Esercitazione n 9

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za delle basi del gene (fig 910 in rosso le sequen-ze degli esoni e in nero quelle degli introni)La sequenza puograve essere confrontata con quel-la di altre specie aprite la tendina nel campoAlignment situato sopra alla sequenza di basi delgene BRCA2 selezionate lo scimpanzeacute e clicca-te su Go Compaiono le due sequenze del trattodi DNA di uomo e di scimpanzeacute allineate (fig911) Notiamo che le due sequenze sono pres-socheacute identiche anche nella scansione esoni-in-troni I trattini presenti in alcuni punti sono statiintrodotti dal software per ottimizzare lrsquoallinea-mento delle sequenzeTornate a Region in detail cliccando sul menu inazzurro a sinistra della pagina si possono contarei rettangoli per scoprire quanti esoni contiene ilgene BRCA2 Fate click su uno dei rettangoli delgene e scegliete la sigla alla voce Gene si apriragraveun nuovo collegamento in cui potrete trovare ul-teriori informazioni su questo geneNel riquadro Gene summary cliccando su BRCA2si apriragrave una nuova pagina con molte altre infor-mazioni sul gene in esame in questa tabella clicca-te sulla sigla OMIM (Online Mendelian Inheritancein Man) si apriragrave un link alle malattie associate adalterazioni in questo gene (fig 912)Il gene BRCA2 insieme al gene BRCA1 rap-presenta uno dei principali geni di suscettibilitagrave

al cancro della mammella e dellrsquoovaio BRCA2 egravestato scoperto studiando famiglie islandesi concarcinoma familiare della mammella Questi duegeni sono coinvolti nei meccanismi di riparazionedei danni al DNA anche se tutte le loro comples-se funzioni non sono state ancora completamen-te chiarite Solo il 5-10 dei tumori della mam-mella ha unrsquoorigine ereditaria e in questi casinel 90 dei pazienti sono presenti mutazioni inBRCA1 o BRCA2 BRCA1 egrave coinvolto nel 50-85 dei casi di tumore ereditario della mammel-la e conferisce un aumento del rischio di tumoreallrsquoovaio del 15-45 BRCA2 egrave responsabile del35 dei casi di tumore ereditario della mammel-la Le mutazioni nel gene BRCA2 conferisconoun rischio minore di tumore allrsquoovaio (10-20) esono associate con lo sviluppo di carcinoma dellamammella maschile (6) In entrambi i casi esi-ste un piccolo aumento del rischio di sviluppa-re altri tipi di tumore come ad esempio colonpancreas e prostata (6-14) Nei carcinomi nonereditari le mutazioni di BRCA1 e BRCA2 sonoinvece molto rare Si stima che nella popolazio-ne globale la frequenza di soggetti portatori dimutazioni in uno di questi due geni sia fra 1500e 11000 a causa dellrsquordquoeffetto fondatorerdquo neidiversi gruppi etnici singole o poche mutazionipossono diventare predominanti (vedi Per saper-

Figura 912



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Per saperne di piugraveLA DERIVA GENETICA

nuova popolazione in cui le nuove frequenzealleliche possono ridurre drasticamente lavariabilitagrave genetica e fenotipicaIn queste condizioni egrave facile che aumentinogli incroci non casuali e quindi aumenta laprobabilitagrave che i caratteri recessivi vadano inomozigosi con il conseguente aumento dellafrequenza di malattie rareEsempi di effetto fondatore nellrsquouomo sono

lrsquoalta frequenza di alcuni alleli-malattianella popolazione di ebrei Askenaziti e negliAmish della Pennsylvanialrsquoassenza quasi totale del gruppo sanguignoB tra gli Indiani drsquoAmerica (migrati in unpiccolissimo numero attraverso lo stretto diBehring circa 20 000 anni fa)lrsquoalta frequnza di albinismo negli IndianiHopi e Navajos rispetto agli altri

Uno dei fattori fondamentali dellrsquoevoluzioneoltre alla mutazione e alla selezione naturaleegrave la deriva genetica ovvero la tendenzafondamentale di ogni allele a variarecasualmente in frequenza nel tempo allrsquointernodi una popolazione Un esempio di derivagenetica egrave quello del cosiddetto ldquocollo dibottigliardquo o ldquoeffetto fondatorerdquo (fig 913)in cui una popolazione si ricostituisce apartire da un piccolo numero di individui peresempio in seguito a un naufragio o un eventogeologico socio-economico o culturale che haprovocato lrsquoisolamento di una piccola partedella popolazione originaria I pochi individuisopravvissuti non possono rappresentaretutta la variabilitagrave genetica della popolazioneoriginale i caratteri dei fondatori (siavantaggiosi che svantaggiosi) si fissano nella

ne di piugrave La deriva genetica)Nella tabella precedente si aprono altre pagine checi portano a scoprire tutte le informazioni note re-lative al gene in esame noncheacute link a banche datidi secondo livello Prova a cliccare alla voce ldquoEn-trez Generdquo ldquoEntrez Generdquo egrave un database di secondolivello da cui si possono trarre molte informazio-ni Nel ldquosummaryrdquo sono descritti la funzione dellaproteina codificata da BRCA2 (e da BRCA1) nellariparazione dei danni al DNA e il rapporto tra mu-tazioni in questi geni e la probabilitagrave di sviluppo dicancro alla mammella e allrsquoovaio

popolazioneoriginale

popolazionefinale

collo di bottiglia

Adesso che hai imparato a navigare fra i geno-mi puoi utilizzare questa modalitagrave partendo dalnome di un gene specifico di tuo interesse Puoitrovare una lista dei geni umani di interesse bio-medico al sito httpwwwgenecardsorg e cliccan-do su ldquodisease genesrdquo in fondo alla pagina web allavoce ldquostatisticsrdquoDa quanto sin qui detto egrave evidente che per faresurfing tra i genomi bisogna conoscere un porsquo dilingua inglese e questo egrave vero essenzialmente pertutti gli approfondimenti nellrsquoambito delle Bio-scienze

Figura 913

Deriva genetica dovuta allrsquoeffetto fondatoreo del collo di bottiglia in seguito a unadiminuzione drastica degli individui diuna popolazione diminuisce anche lavariabilitagrave genetica La nuova popolazionesaragrave genticamente molto diversa da quellaoriginaria

Tabella 91

Alcune delle malattie genetiche che mostrano prevalenza nella popolazione Amish della Pennsylvania

Tabella 92

Alcune delle malattie genetiche che mostrano prevalenza nella popolazione degli Ebrei

MALATTIA SINTOMI

Atassia teleangectasia Sensibilitagrave alle radiazioniperdita di equilibrio e di coordinazionealto rischio di cancro

Sindrome bipolare Mania-depressione sbalzi drsquoumore

Sindrome Ellis van Creveld Nanismo polidattilia anomalie dei denti

Omocistinuria Alterazioni dei vasi infarto ictus

MALATTIA SINTOMI

Sindrome di Bloom Sensibilitagrave alle radiazioniimmunodeficenzaaumentato rischio di cancro

Tumore al seno familiare Carcinoma mammario dovutoa mutazioni del gene BRCA1

Malattia di Gaucher Ingrossamento della milza e del fegatodanni neurologici

Malattia di Tay Sachs Degenarione del cervelloritardo dello sviluppo paralisi cecitagrave


Esercitazione n 9

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Per saperne di piugraveLE BANCHE DATI

descrizione di geni e malattie ad essiassociate i quadri clinici e i riferimentibibliografici oltre a link a sequenze e adaltre risorse web Si tratta della versioneonline del testo ldquoMendelian Inheritance inManrdquo ora alla sua dodicesima edizione acura di Victor A McKusick e di un gruppodi colleghi della Johns Hopkins Universitye di altre istituzioni La banca dati egraveaggiornata quotidianamente e riporta solomalattie che sono state associate ad unoo piugrave geni La pagina di accesso a OMIM siraggiunge tramite un link sulla homepagedellrsquoNCBI (httpwwwncbinlmnihgov)PubMed egrave una banca dati che permette diottenere informazioni di tipo bibliograficonel campo della medicina e di altrediscipline di tipo biologico e naturalisticoIl database contiene i riferimentibibliografici a partire dagli anni rsquo50 eviene aggiornato giornalmente Gli articoliprovengono da riviste scientifiche di tuttoil mondo La maggior parte delle voci egrave inlingua inglese o ha almeno il riassunto ininglese Per ogni articolo sono disponibiligli abstract le referenze bibliografiche ein alcuni casi anche il link per accedere altesto completo (gratuito o a pagamento)Come OMIM PubMed egrave a cura del NCBI Siaccede dal sito NCBI (httpwwwncbinlmnihgov)

Le banche dati di primo livello (banche dati disequenze nucleotidiche proteiche di mutazioniecc) catalogano le informazioni provenientidirettamente dalla ricerca in laboratorio Ogniricercatore puograve depositare una sequenza chedopo essere stata controllata sperimentalmenteviene inserita in banca datiLe principali banche dati di sequenzenucleotidiche sono

in Europa Ensembl (httpwwwensemblorg)gestita da EMBL-EBInegli Stati Uniti quella gestita dalNCBI (National Center for BiotechnologyInformation httpwwwncbinlmnihgov)in Asia il DDBJ (DNA Data Bank of Japanhttpwwwddbjnigacjp)

I gestori delle tre banche dati hanno stipulatoun accordo per aggiornare quotidianamente leinformazioni e quindi il contenuto dei dati disequenza presenti egrave quasi del tutto coincidenteLe banche dati di secondo livello raccolgonoinformazioni dalle banche dati di primolivello per organizzarle in maniera organicae integrata Se ne ricordano qui due inparticolare

OMIM Online Mendelian Inheritancein Man egrave una banca dati che contieneinformazioni sui geni umani e sullemalattie genetiche realizzata emantenuta dallrsquoNCBI Contiene la



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Esercitazione n 10

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Nuovi metodi di classificazioneConoscere e classificare la varietagrave delle forme vi-venti presenti sul nostro pianeta egrave un campo diindagine importante nelle scienze della vita Dal1730 con Carl von Linneacute egrave iniziata la classifica-zione tassonomica sistematica degli organismiviventi e in oltre due secoli e mezzo gli scienziatisono riusciti a descrivere circa 15 milioni di spe-cie si stima tuttavia che questo numero possaraggiungere i 10 milioni Il ldquodeficit tassonomicordquototale (rapporto fra taxa attesi e taxa identificati)egrave quindi di circa 6 Per quanto riguarda i verte-brati il numero di specie attualmente descritte egravemolto vicino al numero ldquototalerdquo atteso la maggiorparte di questi organismi relativamente grandi egraveormai stata descritta Lo stesso si puograve dire ancheper gruppi di organismi piugrave piccoli con dimen-sioni fino a 10 mm La grande maggioranza degliorganismi terrestri tuttavia ha dimensioni infe-riori a 1 mm e per questi gruppi il deficit tasso-nomico egrave sicuramente molto superiore a quellodei vertebrati terrestri e delle piante La medio-micro-fauna e la medio-micro-flora sono la chia-ve del funzionamento degli ecosistemi e costitu-

iscono la base produttiva per i macro-organismiLe piccole dimensioni ne rendono difficile lrsquoos-servazione visiva e molti degli aspetti morfologi-ci importanti sono addirittura fuori scala rispettoal potere risolutivo di un microscopio otticoDunque il codice a barre del DNA consente diavere accesso a questi animali ldquoinvisibilirdquo

Il codice a barre del DNALa tecnologia necessaria per isolare un gene diinteresse e determinarne la sequenza egrave ormaiampiamente diffusa relativamente poco costo-sa e facile da utilizzare (vedi Per saperne di piugraveIl sequenziamento del DNA fig 101 e 102 ) Seriuscissimo a trovare un gene la cui sequenza egravesignificativamente diversa tra le varie specie talesequenza costituirebbe un marcatore affidabileper permetterci drsquoidentificare rapidamente le va-rie specie partendo da un campione di DNAEgrave proprio questa lrsquoidea che sta alla base del co-dice a barre del DNA (cosigrave chiamato percheacute egravesimile a quello utilizzato per distinguere i prodot-ti di un catalogo o i prodotti commerciali in unsupermercato) Lrsquoobiettivo egrave quello di fornire una

10 Il codicea barre del DNA

Questa attivitagrave vi introduce a un nuovo modo di classificare

gli organismi denominato ldquocodice a barre geneticordquo (DNA barcode)

esso si basa sullrsquoanalisi di una piccola porzione di DNA mitocondriale

che permette di distinguere le varie specie animali tra di loroAttraverso un percorso in internet vi potrete addentrare in modo divertentein un campo di ricerca drsquoavanguardia a cavallo fra biodiversitagrave Bioinformatica e Biologiamolecolare nellrsquoambito della classificazione degli esseri viventi


Cosrsquoegrave il DNAIl DNA nucleare e il DNAmitocondrialeLa tassonomia linneanaIl concetto di specieLrsquoevoluzioneLa biodiversitagrave



86

Per saperne di piugraveIL SEQUENZIAMENTO DEL DNA

Il metodo attualmente utilizzato egrave derivatoda quello messo a punto da Frederick Sangeralla fine degli anni settanta del secolo scorsoIl frammento da sequenziare viene duplicatoa partire da un oligonucleotide primer Nellareazione oltre ai quattro deossiribonucleosiditrifosfato (dNTP necessari per sintetizzare nuovi

filamenti di DNA) una DNA polimerasi(lrsquoenzima che catalizza il legame tra i dNTP)e lrsquooligonucleotide primer si utilizzano anchedei dideossiribonucleosidi trifosfato (ddNTP)come ldquoterminatorirdquo della reazione Infattii ddNTP non possiedono il gruppo ossidrile (OH)in posizione 3rsquo (fig 101) necessario performare il legame fosfodiesterico con ilnucleotide successivo e far procedere la sintesidella catena di DNA ciascun tipo di ddNTP(ddATP ddGTP ddCTP ddTTP) egrave marcatocon un colorante fluorescente diversoDurante la fase di allungamento un ddNTPpuograve essere incorporato nella catena di DNAin formazione alla quale mancando ora ungruppo OH allrsquoestremitagrave 3rsquo non possono essereaggiunti ulteriori nucleotidi Ne deriva chela sintesi del DNA si arresta nel punto in cuiegrave stato introdotto un ddNTP I 4 ddNTP sonoincorporati solo occasionalmente e a caso nelfilamento di DNA in formazione in quanto leloro concentrazioni sono piugrave basse di quelledei dNTP Alla fine questa miscela di reazioneprodurragrave una serie di molecole di DNA didifferenti lunghezze (tante quante i nucleotididel frammento da sequenziare) e tutte conunrsquoestremitagrave terminale marcata con il colorantefluorescente corrispondente al ddNTP terminaleincorporato nella catena di DNA I frammentisono separati in base alle loro dimensionitramite elettroforesi in speciali capillari dotatiin uscita di una finestra attraverso la qualepassa un raggio laser un sensore leggee registra il colore del marcatore fluorescente inciascun frammento producendo una sequenzadi picchi colorati (elettroferogramma) chemostra la sequenza nucleotidica del DNAin esame (fig 102)

Fino ad oggi egrave stato sequenziato il genomadi molti organismi (incluso lrsquouomo) Questaimportante conquista non sarebbe statapossibile senza lo sviluppo di efficienti metodidi sequenziamento del DNA potenziati su largascala dalla possibilitagrave di automatizzareil processo

dNTP ddNTP

Mancagruppo OH

P

PP

CH2 0

5rsquo

3rsquo

Base

OH

P

PP

CH2 0

5rsquo

3rsquo

Base

H

Primer3rsquo

Sequenza sconosciuta

Molecole di DNAcon marcatore fluorescenteal terminale 3rsquo sottopostea elettroforesi capillare

Migrazionedel DNA

Rivelatore Laser

Risultato generato dal computer (elettoferogramma)i picchi colorati sono prodotti al passaggio

di un frammento di DNA marcato

Raggio laser

DNA polimerasi4 tipi di dNTPS4 tipi di ddNTPS

Denaturazione

Segmenti di DNAcon marcatorefluorescente copiatida uno ldquostampordquodi DNA sconosciuto

T

T

A

C

C

G

G

G

G

A

T

T

C C T G T T T G A T G G T G G T T T C C G A A T C G G

2 0 3 0 4 0

Figura 101

A sinistra struttura di undeossiribonucleoside trifosfato(dNTP) e a destra di undeossiribonucleoside trifosfato(senza gruppo ossidrile -OHin posizione 3rsquo)

Figura 102

Schema riassuntivo delle tappe principalidel sequenziamento del DNA

mappa generale della diversitagrave di facile accessoper chiunque voglia rapidamente ma accurata-mente identificare un organismo Un tale cata-logo consentirebbe anche di distinguere nuovespecie non ancora descritte da quelle giagrave notee potrebbe costituire un valido strumento nellavoro di conservazione della biodiversitagrave nelladiagnosi di patogeni nel monitoraggio di specieinvasive (quelle in grado di colonizzare nuovi

ambienti a scapito delle specie native) e in moltialtri campi

Una sfida tecnologicaAnche se lrsquoidea di base egrave semplice lo sviluppo diun metodo affidabile per la determinazione delcodice a barre del DNA presenta alcune difficoltagraveche richiedono di essere affrontate da ricercatoricon differenti competenze


Esercitazione n 10

87

Innanzitutto egrave necessario identificare un genespecifico che sia adatto come marcatore per ilcodice a barre La sequenza di questo gene deveessere sufficientemente diversa tra specie e spe-cie in modo che ogni sequenza possa essere uni-vocamente attribuita a unrsquounica specie di origineInoltre dato che in alcuni casi si osservano varia-zioni di sequenza anche allrsquointerno di una specie(intra-specie) queste devono essere minori ri-spetto a quelle tra le specie (inter-specie)Secondariamente il metodo attualmente utiliz-zato per isolare un gene (la PCR Reazione a Ca-tena della Polimerasi) e quindi per poterne poideterminare la sequenza richiede che siano notea priori le sequenze fiancheggianti il gene stessoIn pratica questo gene deve contenere due regio-ni molto conservate in tutte le specie mentre ilresto della sequenza deve essere molto variabiletra specie e specieTenendo conto di questi due aspetti i biologi mo-lecolari hanno identificato un gene che sembrapossedere le caratteristiche richieste Si tratta delgene della citocromo ossidasi 1 CoxI (fig 103)che codifica per la subunitagrave 1 di un complesso en-zimatico coinvolto nella catena di trasporto deglielettroni nella membrana mitocondriale internaCoxI si trova nel DNA mitocondriale di animalipiante e funghi

Unrsquoulteriore difficoltagrave egrave rappresentata dalla rac-colta dei campioni per il catalogo di riferimento edal metodo per attribuire correttamente una datasequenza a quella della specie corrispondentepresente nel catalogo I musei scientifici stannocontribuendo a questo scopo mettendo a dispo-sizione le loro collezioni e le loro competenze ditassonomia classica Sono anche stati stanziatidei fondi per lrsquoisolamento e il sequenziamentodel DNA di specie non presenti nelle collezionimuseali e per la loro classificazione Il codice abarre dunque ha riacceso lrsquointeresse per gli studitassonomiciEgrave evidente che per fornire una banca dati pubbli-ca contenente i dati di sequenza (potenzialmen-te) di milioni di specie (e gli strumenti necessariper accedere alle informazioni in modo rapido eaccurato) egrave richiesta la stretta collaborazione frabiologi ed informatici

Lo stato dellrsquoarteIl Consorzio per il Codice a Barre della Vita(CBOL Consortium for the Barcoding Of Life) egraveun movimento internazionale che comprendemusei di storia naturale erbari giardini zoologiciistituti di ricerca agenzie governative e intergo-vernative associazioni non governative compa-gnie private e altre organizzazioni coinvolte nella

Origine della replicazione

12S rRNA Citocromo b

16S rRNA

Subunitagravedella NADHdeidrogenasi

Subunitagravedella citocromo ossidasi(CoxII e CoxIII)

SubunitagravedellrsquoATP sintasi

Regioni che codificano proteine (13 in totale)

Subunitagravedella citocromo ossidasi(CoxI)



Geni del tRNA (22 in totale)

Figura 103

Genoma mitocondriale umano Sonoindicati in arancione i 2 geni per rRNAin verde i 13 geni codificanti proteinein giallo i 22 geni per tRNA In evidenzail gene CoxI



88

Per saperne di piugraveIL DNA MITOCONDRIALE

I mitocondri contengono un DNA proprio e unloro apparato biosintetico per produrre alcunidegli RNA e delle proteine dellrsquoorganello Questomacchinario di sintesi proteica ricorda quellopresente nei batteri ad esempio i ribosomimitocondriali sono sensibili ad antibioticiantibatterici e la sintesi di una proteina inizia conuna forma modificata di metionina (la N-formil-metionina) Queste somiglianze sono interpretatecome un relitto evolutivo della loro origine infattiegrave ampiamente accettato che i mitocondri come iplastidi derivino da cellule batteriche inglobatein cellule ancestrali con nucleo (fig 104)Tuttavia va sottolineato che la maggior partedelle proteine mitocondriali egrave codificata dageni presenti nel DNA nucleare i cui trascrittisono tradotti nel citoplasma e poi importatinellrsquoorganelloIl DNA mitocondriale egrave generalmente unamolecola circolare presente in piugrave copienella matrice del mitocondrio e puograve averedimensioni variabili a seconda dellrsquoorganismo(indicativamente da 6 000 pb (paia di basi)nel plasmodio della malaria a 300 000 pb inalcune piante terrestri) Nei mammiferi il DNAmitocondriale egrave di circa 16 500 pb nellrsquouomo

la sequenza di 16 569 pb egrave stata pubblicatanel 1981 e i suoi geni sono stati mappati (fig103) Dallrsquoanalisi del contenuto di geni nelDNA mitocondriale di diversi organismi sembrache nel corso dellrsquoevoluzione ci sia stato untrasferimento di geni dal DNA mitocondriale alDNA nucleare per cui i genomi mitocondrialipiugrave evoluti contengono pochi geni I geni checodificano i 2 rRNA mitocondriali e quelli che

cellula eucariotica ancestrale

nucleo membraneinterne

mitocondri condoppia membrana

cellula eucariotica primitiva

batterio

codificano per il citocromo b e per le subunitagrave 1e 3 della citocromo ossidasi sono comuni a tutti igenomi mitocondrialiDallrsquoanalisi di sequenze di DNA mitocondrialeprovenienti da diversi organismi risulta chela frequenza di mutazioni egrave 10 volte maggiorerispetto al genoma nucleare probabilmente acausa di un sistema replicativo eo di riparazionedella molecola meno fedele

ricerca tassonomica e nei temi della biodiversitagravecoinvolge piugrave di 200 enti in piugrave di 50 paesi nei 6continenti (fig 105)La banca dati del CBOL conta oltre un milionedi ldquorecordrdquo che coprono piugrave di 100 000 specie

(dati relativi a giugno 2011) rappresenta solouna piccola parte della biodiversitagrave totale del-la terra ma va crescendo di anno in anno (fig106) Egrave stato costruito anche un sito web (wwwbarcodinglifeorg) e sono stati ideati diversi stru-

Figura 104

Origine endosimbiotica dimitocondri e plastidi Unsistema a doppia membranacome quello che delimitamitocondri e plastidi puograveessersi originato in seguitoa fagocitosi di una cellulaprocariotica da parte di unacellula eucariotica

Figura 105

Il CBOL nel mondo


Esercitazione n 10

89

Figura 107

Pagine del sito webwwwbarcodinglifeorg

menti molto sofisticati per interrogare la bancadati In essa per ogni specie sono catalogatetutte le sequenze di codice a barre disponibili illuogo e il modo in cui sono stati raccolti i cam-pioni le connessioni Web ad altri utili link e lerelative immagini (fig 107)

Figura 106

Come si costruisce una pagina dellabanca dati del CBOL

Per ora lo sforzo maggiore si egrave concentrato su al-cuni gruppi tassonomici particolari pesci insettie uccelli Il marcatore CoxI sembra funzionaremolto bene per tutti i gruppi animali ma nonsono ancora stati identificati marcatori altrettan-to specifici per piante e funghi



90

Gli scenariAbbiamo ricostruito tre scenari per esemplificarealcuni degli ambiti in cui il codice a barre mostrauna applicazione pratica al di fuori della ricercatassonomica1 IN RIVA AL FIUME identificazione di specieinvasive in un determinato ambiente2 UN PINO AMMALATO identificazione

di agenti patogeni3 Egrave VERO CAVIALE riconoscimento di frodialimentari4 WOLPERTINGER un mistero da svelare

Per fare gli esercizi andate alla pagina webhttpwwwcusmibiounimiitdocumentiwebsite_new

ithomeindexhtml

Identificare le specie

Figura 108

EserciziIl primo esercizio ldquoIn riva al fiumerdquo vi consentedi identificare le specie che abitano sulle rive diun comune fiume europeo Leggete attentamentele istruzioni per svolgere lrsquoesercizio fino alla terzavideata usando il mouse cercate nella figura 108gli animali nascostiUno degli organismi che troverete appartiene auna ldquospecie invasivardquo cioegrave non autoctona di que-sto ambiente e potenzialmente dannosa

Quando scoprite un animale cliccate e arrivere-te a una pagina simile a quella riportata in figura109 che contiene lrsquoimmagine dellrsquoanimale pertrovare il codice a barre dellrsquoorganismo selezio-nare ldquoClicca qui per vedere il mio barcode DNArdquo

Figura 109


Esercitazione n 10

91

Nella nuova schermata (fig 1010) selezionatee copiate tutta la sequenza che appare nella fine-stra accedendo al link httpbarcodinglifecom

viewsidrequestphp potrete incollarla e scoprirea che organismo appartiene (fig 1011) Assi-curatevi che sia selezionata la voce ldquoAll BarcodeRecords on BOLDrdquo Oltre alla sequenza del DNAbarcode dalla schermata precedente egrave possibileaccedere a un link che fornisce maggiori informa-zioni sullrsquoorganismo

Nella tabella dei risultati (fig 1012) sono elen-cati i nomi delle specie che hanno codici a barresimili a quello da noi inserito e nellrsquoultima colon-na si trovano le percentuali di somiglianza con lasequenza in oggetto In generale valori superiorial 99 indicano che lrsquoidentificazione egrave correttamentre quando sono uguali o inferiori al 95 laclassificazione non egrave attendibile

Adesso potete ritornare alla pagina iniziale e cer-care altri animali Provate ad identificare la specieinvasiva e ricercando in rete scoprite quale dan-no puograve arrecare allrsquoambiente

Gli altri esercizi funzionano in modo analogoIn ldquoEgrave vero cavialerdquo userete le sequenze di codicea barre per discriminare fra il caviale di storione equello di un economico surrogatoIn ldquoUn pino ammalatordquo cercherete di identificarela patologia da cui egrave affetto un pinoIn ldquoWolpertingerrdquo hellip Beh vedete un porsquo voi

Figura 1010

Figura 1011

Figura 1012



92


Esercitazione n 11

93

La medicina del futuro si fa in 3DConoscere nei dettagli atomici come egrave fatta unamacromolecola biologica rappresenta un puntochiave per capirne la funzione le strutture ma-cromolecolari vengono poi raccolte in banchedati specializzate e sono osservabili utilizzandoprogrammi di visualizzazione specifici che con-sentono di estrarre informazioni funzionali dal-la struttura e di confrontare fra loro strutture dimacromolecole normali con quelle coinvolte inprocessi patologici Questi programmi sono inol-tre largamente utilizzati per il disegno razionaledei farmaci e dei vaccini del futuro

Le due principali tecnicheper la determinazione della struttura 3Ddelle proteineLa diffrazione ai raggi XEgrave una tecnica non distruttiva utilizzata per lrsquoana-lisi qualitativa e quantitativa dei materiali cristal-lini in polvere o allo stato solido Basandosi sulfatto che qualunque radiazione elettromagneticaegrave in grado di interagire con la materia la biocri-stallografia a raggi X consente di determinare la

posizione degli atomi delle molecole che com-pongono un cristallo in relazione al modo concui i raggi vengono deviati dal cristallo stessoQuesta tecnica quindi egrave ottimale per determina-re la struttura 3D di macromolecole biologiche arisoluzione atomica (fig 111)La disponibilitagrave di un cristallo ordinato conte-nente la proteina egrave il presupposto indispensabile

11 Le formeinvisibili

In questo laboratorio si sperimenteragrave la tecnica di cristallizzazione delle proteine e

attraverso un percorso in banche dati online si cercheragrave di risolvere un misterioso caso

di intossicazione alimentare individuando la proteina che lrsquoha causata

Il modello strutturale 3D di questa proteina saragrave visualizzato al computer con opportuni softwareOperativamente nella prima parte dellrsquoattivitagrave si allestiscono prove di cristallizzazione in diverse condizioni sperimentalie si controlla al microscopio la presenza di cristalli identificando le condizioni ottimali per la loro formazioneNella seconda parte si acquisiscono le basi teoriche e tecnologiche delle procedure che partendo dallrsquoanalisidei cristalli consentono di determinare la struttura tridimensionale delle proteine utilizzando poiun software dedicato si osserveragrave la struttura 3D di una proteina cristallizzata


Strutturadelle proteineFunzionamentodegli enzimi

Figura 111

Schema dei vari passaggi per ottenere una rappresentazione in 3D di una proteina



94

per procedere alla determinazione della struttura3D Non egrave facile identificare le condizioni ottimaliper ottenere cristalli di una determinata proteinache tra lrsquoaltro deve essere disponibile in formapura e in quantitagrave adeguate Le proteine inoltresono molecole irregolari che difficilmente si di-spongono ordinatamente Di conseguenza spes-so i cristalli e le strutture che noi conosciamocontengono anche molecole del solvente con ilquale la molecola egrave stata cristallizzata Una voltaottenuto il cristallo lo si posiziona tra la sorgentedi raggi X e il rivelatore Gli atomi del cristallo diproteina deviano i raggi X dal loro percorso e fan-

no sigrave che questi colpendo una lastra fotograficavi producano una caratteristica figura di diffra-zione (diffrattogramma fig 112) costituita datante macchie separate da cui egrave possibile ricavareuna mappa di densitagrave elettronica Si costruiscequindi un modello della struttura della molecolacompatibile con le mappe di densitagrave elettronicagiagrave note (fig 113) Egrave necessario utilizzare nume-rosissime immagini per riuscire a ricostruire inmodo ottimale una struttura tridimensionale

La risonanza magnetica nucleare (NMR)Questa tecnica egrave utilizzabile per determinare la

Fonte di raggi x

10000 - 40000volts

Schermodi piombo che

concentra i raggi x

Cristallo

Lastra fotografica

Spot derivanti da diffrazione di raggi X

Figura 112

Diffrazione ai raggi X Nei cristallile molecole sono ordinate in unreticolo Un fascio di raggi X direttosu un cristallo incontrando i diversiatomi viene deviato con angolazionidiverse e suddiviso in fasci lasciail cristallo andando a impressionareuna lastra fotografica su cui si crea ildiffrattogramma

HC

HC CH

HC CH

CH2

CH2

C

O O-

CH2

CH2

C

O O-

C

Acido glutammico Acido aspartico

Fenilalanina

Figura 113

La distribuzione della densitagraveelettronica nel cristallo puograve essereinterpretata dal cristallografo chericostruisce la catena aminoacidicaad essa corrispondente


Esercitazione n 11

95

Figura 114

Apparecchiatura per NMR e struttura 3D di una proteina

struttura 3D di proteine relativamente piccolecontenenti fino a 250-300 aminoacidi Una solu-zione concentrata di proteina viene posta in uncampo magnetico i nuclei di determinati ele-menti tendono ad allinearsi col campo magneti-co esterno proprio come lrsquoago di una bussola Simisurano a questo punto gli effetti sui nuclei sol-lecitati da diverse radio-frequenze i vari nucleinella proteina assorbono lrsquoenergia elettromagne-tica (risonanza) a frequenze differenti in base alloro ambiente elettromagnetico locale connessoalla struttura 3D della proteina Quando cessa lasollecitazione degli impulsi a radiofrequenza cheperturbano i nuclei questi ultimi tornano al lorostato energetico originale emettendo radiazioniAi nuclei sono associati valori di risonanza e inbase a come rispondono alle perturbazioni si de-ducono le distanze internucleari Queste distanzesono poi utilizzate per generare un modello del-la struttura 3D della proteina(fig 114) Poicheacute

tali distanze internucleari sono imprecise moltimodelli simili possono risultare compatibili con leosservazioni sperimentali misurate cosigrave le struttu-re NMR sono rappresentate come un insieme didiverse strutture 3D simili sovrapposte fra loroQuesta tecnica ha il vantaggio di non richiederela cristallizzazione della proteina Inoltre la NMRpuograve misurare alcune proprietagrave dinamiche delleproteine su una scala di tempi piuttosto estesa

Le due tecniche sono complementari Quando egravepossibile preparare cristalli sufficientemente ordi-nati la diffrazione ai raggi X egrave la tecnica miglioreper ottenere informazioni sulla struttura tridimen-sionale delle macromolecole e dei loro complessicon leganti eo con altre macromolecoleLa NMR egrave la tecnica drsquoelezione per lo studio del-le strutture biologiche in soluzione ma le dimen-sioni delle macromolecole che possono essereanalizzate sono attualmente limitate

PERCHEacute I RAGGI X

La lunghezza drsquoonda deiraggi X egrave di circa 1 Aring che egravedellrsquoordine di grandezza delle

distanze interatomiche epermette quindi di identificarela posizione dei singoli atomi

PERCHEacute I CRISTALLI

Per amplificare il segnale

di diffrazione (un cristallo egraveformato da 1015-1016 molecoleidentiche)

Domande e risposte



96

Figura 115

Struttura della parete batterica I quadratini indicano glizuccheri del peptidoglicano in blu la N-acetilglucosamina(NAG) e in arancione lrsquoacido N-acetilmuramico (NAM) I duetipi di monomeri sono connessi da legami glucosidici mentrecorti peptidi di pentaglicina uniscono due monomeri NAM dicatene adiacenti formando cosigrave una complessa struttura a reteLa parete egrave ancorata alla membrana plasmatica attraversomolecole di acido teicoico

La cristallizzazionedi una proteinaIn questa esperienza di laboratorio si osserveran-no le diverse condizioni per la cristallizzazione diuna proteina e successivamente si analizzeragrave alcomputer la struttura della proteina in esameLa proteina che viene cristallizzata egrave il lisozimaun enzima con azione battericida in grado di di-struggere il peptidoglicano delle pareti cellulari deibatteri Il peptidoglicano egrave una catena polisaccari-dica complessa composta da due tipi di zuccheri(N-acetilglucosamina (NAG) e acido N-acetilmu-ramico (NAM) questrsquoultimo contenente ancheun corto peptide di pentaglicina) che si alternanoformando una catena La struttura a lamina rigidadella parete batterica egrave conferita da legami che siinstaurano fra le parti polipeptidiche di due cateneadiacenti (fig 115) Il lisozima svolge la sua azio-ne battericida scindendo il legame glicosidico fradue zuccheri adiacenti Nellrsquouomo questa protei-na egrave prodotta dai macrofagi e dai granulociti ed egraveparticolarmente abbondante nelle secrezioni qua-li lacrime muco e salivaScaricate le schede del protocollo per lrsquoallestimen-to della prova di cristallizzazione del lisozima delpollo (proteina di 129 aminoacidi estratta da al-bume di uovo di gallina) secondo il metodo delladiffusione di vapore Sono utilizzate due diversecondizioni sperimentali per identificare le condi-zioni ottimali di cristallizzazione

Dallrsquoanalisi dei cristalli alla costruzionedella struttura 3D della proteinaIl periodo intercorrente fra la preparazione delle pro-

ve di cristallizzazione e lrsquoanalisi al microscopio deicristalli (almeno due ore) puograve essere utilizzato peresaminare la serie dei passaggi operativi necessariper ottenere un modello in 3D di una proteina a par-tire da un cristallo come illustrato nella figura 11La procedura si articola in 3 fasiFase 1Raccolta dei dati di diffrazione derivanti dallrsquointe-razione dei raggi X con le molecole proteiche con-tenute nel cristalloFase 2Questi dati sono una misura della ldquodensitagrave elettro-nicardquo di come gli elettroni e cioegrave gli atomi sonodistribuiti nello spazio del cristallo Le proteinepiugrave piccole hanno anche piugrave di 1 000 atomi le piugravegrandi possono avere 10 000-100 000 atomiFase 3Dalla visualizzazione della densitagrave elettronica dellaproteina si puograve ricostruire il modello molecolare

Quali sono le applicazioni maggioridella biocristallografiaConoscere la struttura 3D di una macromolecolabiologica consente di capire come avvengono iprocessi biologici a livello atomico e quindi comela macromolecola svolge la sua funzioneInoltre egrave possibile

studiare lrsquointerazione fra macromolecolestudiare le interazioni fra macromolecole epiccole molecole (acqua ligandi ioni cofatto-ri inibitori hellip)comprendere la relazione fra struttura e fun-

peptidoglicano

membranaplasmatica

acidoteicoico

pentaglicina

proteine dimembrana

fosfolipidi

citoplasma


Esercitazione n 11

97

zione di una data proteinaprogettare razionalmente nuovi farmaci

Detective degli alimentiuna pista bianco shockingNello scenario proposto lrsquoindagine molecola-re si rivela fondamentale nellrsquoindividuazione enellrsquoanalisi di sostanze tossiche che possono avercausato danni alla saluteUna giovane donna viene ricoverata drsquourgenzaal pronto soccorso con i sintomi di uno shockanafilattico probabilmente dovuto ad allergia ali-mentare Egrave accompagnata da un amico avvocatocon cui era a cena in un ristorante quando ha ac-cusato i primi sintomi Sapendo di essere allergi-ca alle proteine dellrsquouovo e alla soia ha scelto unmenu (fig 116) che escludesse queste sostanzeLrsquoamico avvocato egrave pronto a intentare causa al ri-storante per frode alimentare

Seguendo le istruzioni scaricate da internet le tresequenze aminoacidiche appartenenti a proteineisolate dai cibi consumati dalla donna Dovreterisalire alle proteine a cui appartengono e iden-tificare quale puograve essere responsabile della vio-lenta reazione allergica accusata dalla donna Le

sequenze sono indicate utilizzando il codice diaminoacidi a una lettera (Tab 111)

Figura 117

Figura 116

gtProteina 1CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL GSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS

gtProteina 2DQAMEDIKQM EAESISSSEE IVPNSVEQKH IQKEDVPSER YLGYLEQLLR LKKYKVPQLE IVPNSAEERLHSMKEGIHAQ QKEPMIGVNQ ELAYFYPELF RQFYQLDAYP SGAWYYVPLG TQYTDAPSFS DIPNPIGSEN SEKTTMPLW

gtProteina 3KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSS

Tabella 111

Schema del codice degli aminoacidi a 3e a 1 lettera

U C A G

U

UUUPheF

UUC

UUALeuL

UUG

UCU

UCCSerS

UCA

UCG

UAUTyrY

UAC

UAA STOP

UAG STOP

UGUCysC

UGC

UGA STOP

UGG TrpW

U

C

A

G

C

CUU

CUCLeuL

CUA

CUG

CCU

CCCProP

CCA

CCG

CAUHisH

CAC

CAAGlnQ

CAG

CGU

CGCArgR

CGA

CGG

U

C

A

G

A

CUU

CUC IleI

AUA

AUG MetM

ACU

ACCThrT

ACA

ACG

AAUAsnN

AAC

AAALysK

AAG

AGUSerS

AGC

AGAArgR

AGG

U

C

A

G

G

GUU

GUCValV

GUA

GUG

GCU

GCCAlaA

GCA

GCG

GAUAspD

GAC

GAAGluE

GAG

GGU

GGCGylG

GGA

GGG

U

C

A

G

first

posi

tion

second position

thirdposition

MENU DEL GIORNOProsciutto

San Daniele e fichiRisotto allo zafferanoCarpaccio con scaglie

di parmigiano reggianoe rucola

Panna cottaai frutti di bosco



98

Per ricercare a quale proteina appartengono le tresequenze andate su httpmrscmbirunlmrs-5 laldquohome pagerdquo di MRS un motore per effettuare ri-cerche nelle principali banche dati biologiche online(fig 117)

Cliccate sul link Blast posto sulla barra azzurrain cima alla paginaNel riquadro bianco che compare al centrodella nuova pagina incollate la sequenza ammi-noacidica della proteina 1 La prima riga dellasequenza cercata deve sempre cominciare conil simbolo gt seguito dal nome della proteinaper essere conforme con ldquoFASTArdquo il formatodi testo standard per la ricerca nelle banche datibiologiche on-line (fig 118)Verificate che sia selezionata lrsquoopzione UniprotKB nel campo Databank to searchCliccateaquestopuntosuRunBlastNellatabel-la ldquoBlast resultsrdquo selezionate la riga con i risultatiper la proteina cercata

Compare una tabella articolata in diversi campi(fig 119)Blast ha individuato molte proteine con una se-quenza aminoacidica simile a quella da voi ricerca-ta La sequenza che ci interessa deve avere il pun-teggio (BitScore) piugrave alto e un valore di E-valuemolto basso (questo significa che il risultato della

ricerca egrave molto attendibile)In prima posizione il software riporta sempre laproteina che mostra il piugrave alto grado di somiglian-za con la sequenza query appartenente alla pro-teina in esame Nel nostro caso il primo risultatoconsiste nella albu_bovin cioegrave lrsquoalbumina presen-te nel siero del bueOsservate la lista Per ciascuna proteina ricono-sciuta da Blast come simile a quella di partenzavengono riportati

nella colonna ID il codice che identifica nel-la banca dati la sequenza della proteina essoegrave costituito dal nome della proteina seguitodal nome abbreviato dellrsquoorganismo di pro-venienza che nel nostro caso per il primorisutato egrave quello del buenella colonna Coverage indicazioni relativeal livello di corrispondenza tra la sequenzadella proteina da voi cercata e quella omo-loga trovata dal software In particolare unalinea colorata rossa indica che la sequenzeproteina1 egrave completamente sovrapponibilealla albu_bovin Le linee blu e azzurre deglialtri hits della lista indicano sovrapposizioniparzialinella colonna Description una breve descri-zione della sequenza rintracciata da Blast

Figura 118

Figura 119


Esercitazione n 11

99

nelle colonne Hsps Bitscore e E-value deivalori calcolati da Blast che indicano il graddi affidabilitagrave dei risultati della ricerca

Cliccate sulla sigla della proteina albu_bovin Siapriragrave una pagina (fig 1110) con diverse infor-mazioni utili a identificare la proteina a scoprirela sua funzione e i suoi effetti sulla salute umana

Servitevi delle informazioni contenute nelle se-zioni ldquoEntry informationrdquo e in particolare allrsquoin-terno dei campi Name and origin CommentsFeatures key and Sequence information perrispondere alle domande relative alla proteinaalbu_bovin

Ritornate alla lista delle proteine trovate daBlast Cliccate sulla linea rossa corrispondentealla albu_bovin Troverete che i 150 aa della vo-stra query corrispondono perfettamente (100Identity) ad altrettanti aa della albumina bovinacliccando nuovamente sulla linea rossa compareuna sezione in cui viene mostrato lrsquoallineamentotra la proteina1 e albu_bovin (fig 1111)

La sequenza della prima proteina da voi inseritaegrave identificata dalla lettera Q che sta per queryQuella della proteina albu_bovin egrave contrasse-gnata invece dalla lettera SLe lettere che identificano gli aminoacidi identicitra Q e S vengono riportate nella riga posta tra ledue sequenzeNotate che i 150 aa della sequenza query corri-spondono agli aa 301-450 della albumina bovi-na

1 Di quale proteina si tratta2 Da quale organismo proviene3 Qual egrave la sua funzione4 Qual egrave la sua lunghezza in aminoacidi5 Egrave presente nel cibo ingerito dalla donna6 Puograve essere la responsabile della reazione aller-gica della donna Argomentate la vostra rispo-sta

A questo punto per identificare le proteine a cuiappartengono le altre due sequenze ripetete tuttii passaggi della ricerca con Blast allrsquoindirizzo webhttpmrscmbirunlmrs-5blast Analizzate le

BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool)

Egrave un software per ilconfronto multiplo trasequenze nucleotidichee amminoacidicheConsente di identificareuna determinata sequenzaappartenente a un geneo a una proteina ignoticonfrontandola con altresequenze archiviatenei principali databasebiologici e calcolandoneil grado di similaritagrave conciascuna di queste Egraveuno strumento utile perricostruire le relazionifunzionali ed evolutivetra sequenze diverse eidentificare membri di unastessa famiglie genica oproteica

Figura 1110

Figura 1111



100

informazioni ottenute e rispondete per ciascunamolecola alle sei domande precedentiTraete infine le vostre conclusioni sul caso delladonna allergica

Tra le tre proteine lrsquounica a cui la donna hadichiarato di essere allergica egrave il lisozima delpollo contenuto in grande quantitagrave nellrsquoalbumedellrsquouovo Ma in quale dei cibi ingeriti puograve esserecontenuto il lisozima di pollo

Il mistero si risolveIl lisozima ottenuto dallrsquoalbume dellrsquouovo vieneutilizzato nella produzione dei formaggi per lasua azione litica sulla parete dei batteri in parti-colare quelli responsabili del gonfiore tardivo deiformaggi a lunga stagionatura come grana pro-volone asiagoDa quando il lisozima di pollo egrave stato autorizzatonella tecnologia casearia la determinazione dellapresenza di queste proteine egrave diventata obbliga-toria per controllare la conformitagrave dei formaggialle leggi che ne disciplinano la produzione elrsquoetichettatura e per verificare lrsquoautenticitagrave di pro-dotti per i quali lrsquouso del lisozima non egrave consenti-to come il Parmigiano-Reggiano

Evidentemente il Parmigiano utilizzato dal Ri-storante contrariamente a quanto dichiarato sulMenu non egrave Reggiano (il grana Padano puograve con-tenere lisozima in quantitagrave non superiore a 300

YASARAEgrave un programma di grafica molecolare dimodeling e di simulazione per WindowsMacintosh e Unix utile per visualizzaree manipolare i modelli delle proteine Egravestato sviluppato da Elmar Krieger al CMBI(Centre for Molecular and BiomolecularInformatics) in Olanda Consente tra lealtre cose di creare immagini da inserirenei lavori scientifici Ha unrsquointerfacciaintuitiva e una grafica fotorealistica Di facileutilizzo garantisce una buona interazionecon la realtagrave virtuale Per utilizzare questoprogramma bisogna installarlo scaricandolodal sito wwwyasaraorg Il download egravegratuito previa registrazione

mgkg) La donna quindi ha buone probabilitagravedi vincere la causa per frode alimentare

Una proteina in 3DIn questa parte dellrsquoattivitagrave analizzerete la struttu-ra tridimensionale della sostanza che ha causatola reazione allergica imparerete ad interpretare laricostruzione grafica al computer di questa mole-cola e a rintracciarne gli elementi funzionali piugraveimportanti

Primi passi con il software YASARAInstallate il software YASARA e avviateloCliccate sul pulsante File posto nella barra de-gli strumenti e poi selezionate Load YASARASceneSelezionate il file introductionsce e conferma-te con OK Vi appare la struttura del peptidecon la sequenza Asp-His-Arg-Gly-Gly-Met-Lys-Tyr (codice a tre lettere degli aa) nellarappresentazione detta a ldquoball and stickrdquo (fig1112) In questa modalitagrave di visualizzazionei singoli atomi sono rappresentati da palliniconnessi fra loro da bastoncini che raffiguranoi legami chimici Non sono rappresentati gliatomi di idrogenoOsservate il modello noterete che il peptideegrave avvolto in una nuvola che rappresenta la su-perficie di Van der Waals Questa superficiemostra lo spazio effettivamente occupato da-gli atomiMuovete il mouse lungo la parte inferiore del-lo schermo di YASARA compariragrave la barracon la sequenza Per mantenerla visibile clic-cate sul pulsante blu posto allrsquoestremitagrave sini-stra della barra

Figura 1112

Visualizzazione di un corto peptide conla rappresentazione a ldquoball and stickrdquoossia sfere e bastoncini


Esercitazione n 11

101

Cliccate ora sui singoli amminoacidi il pro-gramma metteragrave in evidenza il carbonio alfaPremendo il tasto Ctrl mentre cliccate su unamminoacido la proteina ruota e si ingrandi-sce in modo da mostrare distintamente lrsquoato-mo Tenendo premuto il tasto del mouse emuovendolo sullrsquoimmagine potete spostare laproteinaCliccate ora il pulsante sinistro del mouseCosigrave farete ruotare la proteina il pulsante cen-trale del mouse la sposta il pulsante destroattiva lo zoomCliccate a questo punto sui diversi atomi chesono contrassegnati da YASARA mediantelrsquouso di uno specifico codice colore nella par-te sinistra della finestra compariranno infor-mazioni su ciascuno di questi

Quali sono gli atomi presenti nel peptide Qual egrave il codice colore utilizzato nel program-ma YASARA per i diversi atomiRosso = Blu = Verde = Azzurro =

Soffermatevi ora sui bastoncini corti gialli e bian-chi che collegano gli atomi rappresentano i lega-mi covalenti in giallo i doppi legami e in biancoi legami singoli

Ora spostate la vostra attenzione sui bastoncinicolorati in verde blu e arancione che compaiononella rappresentazione essi raffigurano tre tipi dilegami deboli tra atomi che sono importanti perlrsquoassunzione della struttura terziaria della proteinae rispettivamente legami idrogeno interazioni io-niche ( ponti salini) interazioni idrofobiche

La struttura 3D del lisozimaOra analizzerete la struttura 3D del lisozima

Cliccate sempre sul comando File posto nellabarra dei menu e poi su New si apriragrave una sche-da in cui vi si chiede conferma della scelta diabbandonare la precedente sessioneConfermate con YesCliccate come in precedenza su File Load PDBfile e a questo punto selezionate 3IJVpdb (perscaricare il file con lrsquoestensione pdb andate sullink httpwwwrcsborgpdbhomehomedo e scri-vete nel campo vuoto davanti a search la sigla3IJV e cliccate Search Si apriragrave una pagina dedi-

cata al lisozima di pollo e potete fare il downlo-ad del file pdf visualizzabile con YASARA)

Appariragrave la molecola del lisozima nella rappresen-tazione a pallini qui vengono mostrati solo gli ato-mi della proteina identificati da piccole sfere Perosservare altri elementi presenti nella molecolapotete visualizzare ricostruzioni grafiche alternati-ve della proteina premendo sulla tastiera i pulsantida F1 a F8 (fig 1113) In particolare cliccando sultasto

F2 visualizzerete la rappresentazione a pallinie bastoncini Qui oltre ai singoli atomi sempreraffigurati mediante pallini appaiono anche ilegami sotto forma di bastonciniF3 visualizzerete la rappresentazione a baston-cini In questo caso gli atomi sono mostraticome dei segmentiF4 visualizzerete traccia degli atomi di Carbo-nio alfa collegati attraverso dei bastonciniF5 visualizzerete la traccia dellrsquoossatura dellaproteina senza le catene lateraliF6 visualizzerete gli elementi della struttura se-condaria in una rappresentazione a cartoonF7 visualizzerete sempre la struttura secondariain una rappresentazione a cartoon alternativaF8 aggiungerete o rimuoverete le catene late-rali degli aminoacidi (gruppi ldquoRrdquo) nelle rappre-sentazioni a bastoncini e a pallini e bastonciniF1 visualizzerete nuovamente la rappresenta-zione a pallini

Navigate nelle rappresentazioni che mettono inevidenza gli elementi della struttura secondariacliccando sui pulsanti F5 F6 e F7 e rispondete alledomande successiveQual egrave la struttura secondaria delle regioni rossedella proteina E di quelle bluTrovate poi i seguenti cinque elementi o strutture

Figura 1113

Varie rappresentazioni grafiche dellaproteina ottenuta premendo i tastida F1 a F8



102

utilizzando per ciascun elemento la rappresenta-zione appropriata un atomo di Ossigeno con undoppio legame un legame peptidico la catenalaterale di unrsquoistidina unrsquoalfa elica un ponte di-solfuro

Adesso provate a trovare il sito attivo della protei-na e cioegrave il sito in cui avviene effettivamente la re-azione catalizzata dallrsquoenzima Tipicamente esso sitrova nella tasca o nella cavitagrave piugrave ampia presentesulla superficie della proteinaCercate il sito attivo del lisozima facendo ruotareil modello 3D della proteina e avvicinandolo con

lo zoom Scegliete la rappresentazione che ritenetepiugrave appropriata (da F1 a F8) e avviate la ricercaNel sito attivo del lisozima sono stati individuatidue residui critici nellrsquoattivitagrave catalitica dellrsquoenzi-ma sono due aminoacidi bicarbossilici in posi-zione 35 (Glu acido glutammico) e in posizione52 (Asp acido aspartico) i cui gruppi ndashCOOHsono essenziali per lrsquoidrolisi del legame glicosidicoche unisce i residui NAM e NAG adiacenti nellacatena del peptidoglicano Per individuarli cliccateil pulsante blu nella parte inferiore della rappre-sentazione e scorrete con la barra fino a trovare gliaminoacidi nelle posizioni indicate

Storia della scienzaIL PRIMO CRISTALLO DI UNA PROTEINA

La cristallizzazione del primo complessomultimolecolare il ribosoma ha richiesto circatrentrsquoanni e ha valso nel 2009 il premio Nobelper la Chimica a Venkatraman Ramakrishnan(UK) del Laboratorio di Biologia molecolaredi Cambridge (UK) a Thomas A Steitzdellrsquouniversitagrave di Yale (USA) e a Ada E Yonathdel Weizmann Institute of Science di Rehovot(Israele)Le prime osservazioni effettuate lasciavanopensare che cristallizzare i ribosomi o almenocristallizzare indipendentemente le due subunitagravedi cui sono composti non fosse fantascienzaNel 2000 Steitz pubblicograve la struttura dellasubunitagrave maggiore del ribosoma mentre Yonathe Ramakrishnan indipendentemente hannodefinito la struttura della subunitagrave minore (fig1115)

per la definizione del modello della doppia elicadel DNACrick e Watson si erano incontrati nel laboratoriodi cristallografia di Max Perutz a Cambridgenel 1951 e avevano iniziato a collaborare in unprogetto per determinare la struttura del DNABasandosi sui dati sperimentali a disposizioneallrsquoepoca avevano tentato di costruirne i primimodelli strutturali Watson appena vide la foto51 intuigrave immediatamente che quella immagineconteneva la soluzione del problema Laridisegnograve tornando a casa e la mostrograve subito aCrick il modello della doppia elica del DNA fupubblicato su Nature il 25 aprile del 1953

Struttura cristallografica di un organello

Il problema della definizione della strutturadettagliata a livello atomico di un organellomediante diffrazione dei raggi X su cristalloera senzrsquoaltro una sfida molto difficile

Solamente alla fine degli anni cinquanta delsecolo scorso egrave stato possibile cristallizzare estudiare mediante diffrazione ai raggi X lastruttura a livello atomico della prima proteinala mioglobina Questa struttura venne risolta daMax Perutz e Sir John Kendrew che ottennero nel1962 il Premio Nobel per la chimica

La foto 51 si puograve fare la cristallografia

anche degli acidi nucleici

Il contributo sostanziale di Rosalind Franklinalla determinazione della struttura del DNAsta nellrsquoaver prodotto diffrattogrammi di fibredi DNA purificate Nel laboratorio di MauriceWilkins al Kingrsquos College di Londra riuscigraveper prima a ottenere immagini riproducibilie analizzabili del DNA nella forma B la piugravefisiologica La famosa foto 51 (fig 1114) cheWilkins allrsquoinizio del 1953 mostrograve a Watsonallrsquoinsaputa della Franklin fu fondamentale

Figura 1114

Foto 51 a sinistra e Rosalind Franklin a destra

Fig 1115

Struttura cristallografica di un ribosomabatterico le molecole di rRNA sono visualizzatein arancione le proteine della subunitagrave minore inblu e della subunitagrave maggiore in verde


Esercitazione n 12

103

I microarray a DNAuna nuova tecnologia per studiarelrsquoespressione dei geniSalvo pochissime eccezioni le cellule dellrsquoorga-nismo contengono tutte un corredo cromosomi-co completo e gli stessi geni Nelle diverse cellu-le perograve egrave espressa solo una sottopopolazione ditutti i possibili geni e questo conferisce a ciascuntipo cellulare le sue caratteristiche di unicitagraveLrsquoespressione genica egrave un processo sottoposto auna regolazione molto sofisticata al fine di garan-tire una risposta dinamica al variare degli stimo-li extra e intracellulari Questo meccanismo diregolazione egrave dotato di interruttori ONOFFche consentono lrsquoaccensione o lo spegnimentodi specifici geni ma anche il controllo del loroldquovolumerdquo cioegrave del livello della loro espressionePer capire come una cellula risponde alle conti-nue modificazioni ambientali egrave molto importan-te studiare quali e quanti mRNA vengono pro-dotti cioegrave quali geni sono espressi (e quanto) inuna determinata condizioneSi noti che lrsquoespressione genica non si limita allasintesi di mRNA dai geni che codificano per

proteine ma comprende anche la trascrizionedi geni che codificano per RNA funzionalicome gli RNA ribosomali RNA transfer o altripiccoli RNA come i miRNA (micro RNA)recentemente identificati la cui funzione staassumendo una crescente importanzaLa tecnologia dei microarray facilita lrsquoidentifi-cazione la classificazione e lrsquoattribuzione dellafunzione dei geni Utilizzando particolari sup-porti solidi (nel caso piugrave semplice un vetrino) acui sono legate secondo uno schema predefinito(array) sequenze di DNA derivate da moltissi-mi geni diversi di un dato organismo (poten-zialmente tutti) egrave possibile determinare conun singolo esperimento la loro espressione inmodo estremamente rapido ed efficaceCon questo potentissimo strumento di indaginei ricercatori sono in grado per esempio di

comprendere alcuni aspetti fondamentali deiprocessi della crescita e dello sviluppoesplorare le cause genetiche di molte malat-tieidentificare nuovi potenziali bersagli per laterapia

12 I nostri genisu un microchip

Questa attivitagrave prevede la simulazione di un esperimento di microarray una delle

recenti applicazioni delle nanotecnologie alla Biomedicina che consente di analizzare

contemporaneamente lrsquoespressione di tutti i nostri geni ad esempio in un determinato tessuto

o in un particolare tipo cellulare in maniera rapida ed efficaceMicroscopici biochip e analisi informatiche di stupefacente potenza impossibili da realizzare in un laboratoriodidattico saranno sostituiti da strumenti di uso quotidiano per simulare lo studio dellrsquoespressione di alcuni geniin particolari condizioni (per esempio nello stesso tessuto in condizioni normali e patologiche)


Il DNA e la sintesi proteicaLa PCRLa trascrizione inversae il cDNA



104

Che cosrsquoegrave un microarrayI microarray di DNA sono dei piccoli supportisolidi (generalmente un vetrino da microscopiadi dimensioni 75 x 25 x 1 mm ma anche dei chipdi silicone o delle sottili membrane di nylon) suiquali vengono immobilizzate in posizioni fissee note migliaia di sequenze di DNA derivateda geni diversi (fig 121) Le sequenze di DNAsono depositate sul vetrino in piccolissime quan-titagrave (spot) o alternativamente sono sintetizzatedirettamente in situIl termine ldquoto arrayrdquo significa ldquodisporre secondoun ordinerdquo in un microarray le sequenze vengo-no attaccate al supporto secondo uno schemaordinato prefissato in modo che sia possibileindividuare quale sequenza genica egrave posiziona-ta in ciascun punto Le sequenze possono essereDNA cDNA o oligonucleotidi sintetici (cortesequenze di DNA a singolo filamento in genereformate da 10-50 nucleotidi)La tecnica del microarray si basa sullrsquoibridazionemolecolare fra sequenze nucleotidiche comple-mentari Quando due sequenze complementarisi ldquoriconosconordquo si formano legami idrogeno trabasi complementari Lrsquoibridazione avviene trauna sequenza bersaglio (target) immobilizzatasul supporto e una sequenza mobile detta son-da di mRNA o cDNA marcata con un fluoro-cromo Un computer egrave in grado di misurare con

precisione la quantitagrave di sonda legata in ciascunaposizione del vetrino e generare un profilo diespressione genica per ogni tipo cellulare

Programmiamo un esperimentodi microarray per confrontarelrsquoespressione genicain due tipi cellulari diversiConsideriamo due ipotetiche cellule dello stes-so tessuto ma diverse una dallrsquoaltra ad esempio(fig 122)

cellula normale (gialla)cellula tumorale (azzurra)

Entrambe contengono gli stessi geni ma egrave impor-tante conoscere il profilo di espressione genicanei due tipi cellulari percheacute una diversa espres-sione puograve aiutarci a comprendere il meccanismodella trasformazione di una cellulla normale inuna cellula tumoraleLa tecnica richiede alcuni passaggi successivi(fig 122)

isolamento dellrsquomRNA da ciascun tipo cellu-laresintesi del corrispondente cDNA median-te retrotrascizione con lrsquoenzima trascrittasiinversa in presenza di opportuni marcatorifluorescenti (es verde per la cellula normalee rosso per la cellula tumorale)incubazione in contemporanea delle due po-polazioni di cDNA marcati sul microarrayLe molecole marcate si legano sul microarraynelle posizioni in cui sono presenti le sequen-ze corrispondenti ai geni espressi in ciascuntipo cellularedopo lrsquoibridazione e una serie di lavaggi il mi-croarray viene posto in un apposito ldquolettorerdquolaser dotato di un microscopio speciale e diuna ldquomacchina fotograficardquo in grado di misu-rare il colore e lrsquointensitagrave dei diversi ldquospotrdquo

I fluorocromi infatti vengono eccitati dal lasere lrsquoimmagine che ne deriva viene catturata dalmicroscopio e dalla ldquomacchina fotograficardquo cheinsieme generano una immagine digitale dellrsquoar-ray Questi dati vengono immagazzinati nel com-puter ed elaborati da programmi dedicati che inbase allrsquoimmagine digitale calcolano il rappor-to della fluorescenza rossoverde sottraendoil background (rumore di fondo) per ciascunospot del microarray Una volta calcolati i rappor-ti la gradazione del colore (dal verde al rosso)dei singoli spot fornisce una stima del livello diespressione dei singoli geni nel campione e nelcontrollo normale (fig 123)

Figura 121

Vetrino da microscopiausato come supporto perimmobilizzare migliaia disequenze nucleotidiche

Figura 122

Schema dei passaggiper la preparazione di unmicroarray e per il suoutilizzo con sonde di cDNAmarcate in verde o in rossocon fluorocromi opportuni


Esercitazione n 12

105

Storia della scienzaDIVERSE APPLICAZIONI DI MICROARRAY NELLO STUDIO DELLrsquoESPRESSIONE GENICA

Sviluppo di nuovi farmaci

Se un determinato gene (o gruppo di geni)egrave sovra-espresso in una particolare formadi tumore con i microarray si puograve determinarese un dato farmaco egrave in grado di ridurrelrsquoespressione di quel gene (o geni) e se questariduzione egrave associata a remissione del tumoreLrsquoanalisi con i microarray puograve anche essereutilizzata per ottimizzare le diagnosidifferenziali e per definire a livello molecolarela progressione di un tumore questa analisiegrave applicata anche allrsquoidentificazione di geniassociati a patologie non neoplastiche come lemalattie del sistema immunitario del sistemanervoso e del sistema respiratorio

Studio dellrsquoespressione genica nei primi

stadi di sviluppo embrionale

I microarray stanno dando un contributoessenziale alla comprensione degli eventimolecolari legati a questo processoRecentemente sono stati condotti anche diversistudi sul profilo dellrsquoespressione genica cheporta alla maturazione delle cellule uovo

Studio delle modifiche dellrsquoespressione

genica in un dato periodo della vita cellulare

ad esempio durante il ciclo cellulare

Il ciclo cellulare egrave regolato da una retedi interazioni molecolari che essenzialmenteservono a decidere se e quando una cellulanormale entra in divisione Molti sono i geniche regolano il ciclo cellulareIn questo sistema di regolazione sono previstianche dei meccanismi di blocco del ciclo cheentrano in azione quando uno dei sistemi dicontrollo non funziona a causa di mutazioniin uno dei geni critici o quando la cellula sitrova in condizioni non-ottimali per dividersiI microarray possono contribuire a identificare iprofili di espressione genica nei vari ldquomomentirdquodel ciclo cellulare a fare luce sui dettaglidel passaggio da una fase allrsquoaltra del ciclopermettendo lrsquoidentificazione dei geni checontrollano questo orologio cellulare I risultatidi questo tipo di analisi possono fornire infineinformazioni preziose sui geni le cui mutazioniportano alla crescita tumorale e suggerire nuovestrategie di intervento terapeutico

Lrsquouso di microarray per lo studio del profilodrsquoespressione genica egrave stato pubblicato perla prima volta sulla rivista Science nel 1995Da allora le applicazioni della tecnologiadei microarray sono state molto numerosema la principale egrave lrsquoanalisi su larga scaladellrsquoespressione genica

Studio di stati patologici

Se un gene egrave sovra-espresso in un determinatostato patologico lo spot corrispondenterisulteragrave rossoarancio (poco verde)Identificando i geni la cui espressione(o non espressione) egrave associata a unadeterminata malattia si puograve costruire unldquoidentikitrdquo per ogni condizione patologicaIl cDNA derivato da un tessuto malato di unpaziente puograve essere ibridato su un microarrayper identificare a quale malattia corrispondeil pattern di espressione genica del tessutopatologico in esame Il risultato dellrsquoanalisipuograve essere utile per confermare (o fare)una diagnosi e per stabilire una terapiaappropriata

Utilizzando accurate tecnologie di spotting robo-tizzate su un singolo microarray si puograve arrivarea caricare 20 000 spot con sequenze diverse Lamole di dati generata da un singolo microarray egravequindi molto molto grande hellip e la sua interpre-tazione molto molto molto complessa

Sulla tecnica dei microarrayvisitate i sitihttplearngeneticsutaheducontentlabsmicroar-

ray

Entrate in un laboratorio virtuale eseguite unesperimento di microarray e analizzate i risulta-ti

httpwwwbiodavidsoneducoursesgenomicschip

chiphtml

Simulate al computer un esperimento di micro-array in cui sono confrontati i geni espressi dacellule di lievito che crescono in condizioni ae-robiche e anaerobiche

Figura 123

Spot rosso solo cDNA relativi allecellule tumorali dopo ibridazioneal DNA targetSpot verde solo cDNA relativi allecellule normali dopo ibridazione alDNA targetSpot giallo (rosso + verde =giallo) significa che entrambii cDNA hanno ibridato in modoequivalente al DNA targetSpot nero il gene non egrave espressoneacute nelle cellule normali neacute in quelletumorali



106

Esercizio 1Dallrsquoanalisi dellrsquoespressione genica di tessuti tu-morali di 6 pazienti affetti tutti dallo stesso tipodi tumore sono emersi i risultati illustrati in fi-gura 124 (NB in questo esercizio la tecnica delmicroarray egrave utilizzata per definire il profilo diespressione genica in un tipo di tumore non perconfrontare cellule tumorali e cellule normali)

1) Quali geni sono espressi in tutti i pazienti2) Quali geni invece non si esprimono in nessunpaziente3) Quali geni potrebbero avere un ruolo direttonello sviluppo di questo tipo di tumore

Dallrsquoanalisi della figura 124 si osserva che il geneC egrave sempre espresso mentre il gene I egrave ldquospentordquosono quindi due indicatori comuni a tutti i pa-zienti Questo potrebbe suggerire che lrsquoattivazio-

ne di C e lo spegnimento di I siano direttamenteimplicati nello sviluppo del tumoreTuttavia vi siete probabilmente resi conto che egraveindispensabile fare un confronto tra i microarrayottenuti dallrsquoanalisi dei tessuti tumorali e il mi-croarray con gli stessi geni espressi perograve nel tes-suto normale Infatti C potrebbe essere un genesempre espresso cosigrave come I potrebbe essere ungene normalmente spentoLa figura 125 rappresenta il microarray conlrsquoespressione di questi geni nel tessuto normaleda cui deriva il tumore in analisi

Dal confronto provate a prevedere come appari-ranno i diversi spot in un microarray con lrsquoespres-sione di entrambi i tessuti (normale e tumorale)dei 6 pazienti riempiendo la griglia vuota dellafigura 126 con i colori indicati nel ldquosemaforordquo infigura 123

Risultati di alcuni microarrayA voi analizzarli e interpretarli

Figura 124

Microarray di diversi pazienti (indicati con i numeri) affetti dauno stesso tipo di tumore ciascun microarray egrave rappresentatoda una riga contenente 10 geni (indicati con le lettere) Glispot rossi indicano che il gene egrave espresso mentre gli spot neriindicano che il gene non egrave espresso

Figura 125

Microarray con lrsquoespressione di 10 geni (A-L) nel tessutonormale Gli spot verdi indicano che il gene egrave espressomentre gli spot neri indicano che il gene non egrave espresso

A B C D E F G H I L

1

2

3

4

5

6

A B C D E F G H I L


Esercitazione n 12

107

4) Cosa potete dire ora dei geni che si comporta-no allo stesso modo nei 6 pazienti5) Quale potrebbe essere la loro funzione

Il gene C egrave normalmente spento nei tessuti sanie si esprime solo nei tessuti malati quindi puograveeffettivamente avere un ruolo nello sviluppo diquesto tipo di tumore potrebbe essere un on-cogene ad esempio un gene coinvolto nellacrescita di vasi sanguigni (fattore angiogenetico

Figura 126

I colori dei singoli spot si ottengono dalla sovrapposizionedei microarray dei 6 pazienti della figura 124 sul microarraydel tessuto normale della figura 125(ricordare che dalla

sovrapposizione di uno spot rosso su uno verde si ottiene uno

spot giallo)

Figura 127

Pattern di espressione dei geni A-L nei 6 pazienti dellrsquoesercizio 1

tumorale) oppure un gene che produce telo-merasi un enzima che ricostruisce le estremitagravetelomeriche dei cromosomi cosigrave che la cellula sipossa dividere infinite volte Invece il gene I nonsi esprime neacute nel tessuto normale neacute in quellotumorale e quindi non dagrave informazioni sullo svi-luppo del tumore in questi microarray puograve es-sere usato come gene di controllo per verificareche la procedura del microarray sia stata svoltacorrettamente

A B C D E F G H I L

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

A B C D E F G H I L

6

Confrontate poi i vostri risultati con quelli infigura 127



108

Esercizio 2Nella figura 128 egrave riportato un microarray conlrsquoespressione di 10 geni in tessuto epatico tumo-rale e normale prelevati con una biopsia su unpaziente affetto da tumore al fegato (il cDNA datessuto tumorale egrave marcato in rosso il cDNA datessuto sano egrave marcato in verde)

Il paziente risponde molto bene a un farmaco invia di sperimentazione la nemorubicina desti-nato alla cura del tumore al fegato in pazienti nonsensibili alla chemioterapia convenzionaleCon lrsquoutilizzo di microarray si puograve cercare di stu-diare se anche altri tipi di tumore dimostratisi

resistenti ai chemioterapici possono essere sen-sibili alla nemorubicinaOsservate i pattern di espressione degli stessi geni(A-L) in 6 pazienti con altri tipi di tumore chemio-resistenti (fig 129) qualei tra essi potrebberorispondere bene alla terapia con nemorubicinaTra i pazienti testati il paziente numero4 egrave lrsquounico che presenta un profilo di espres-sione dei geni A-L identico al paziente 1 equindi potrebbe rispondere alla terapia connemorubicina Il paziente 7 ha un profilomolto simile lrsquounica differenza egrave il gene CAnche questo paziente potrebbe essere sensibilealla nuova terapia

Figura 129

Pattern di espressione dei geni A-Lin 6 pazienti (da 2 a 7) affetti dadiversi tipi di tumore tutti resistentiai chemioterapici tradizionali

Figura 128

Pattern di espressione dei geni A-L inun paziente affetto da tumore al fegato(indicato come paziente 1) che rispondealla terapia con nemorubicina

2

1

3

4

5

6

A B C D E F G H I L

7

A B C D E F G H I L


Esercitazione n 12

109

Esercizio 3In tabella 121 viene fornito un elenco di genicon funzioni diverse che possono essere coin-volti nella formazione di tumori Leggete atten-tamente la funzione del gene decidete se saragravepiugrave espresso nelle cellule tumorali rispetto allecellule normali o viceversa e cercate di spiegare ilpercheacute (controllate le vostre risposte con quellenella tabella scaricabile dal sito)

Ora tocca a voi provate a fare la diagnosi inquesti 3 casi cliniciAvete le biopsie di tre pazienti che dovete analizzareper scoprire se sono presenti cellule tumorali Im-maginate di prelevare le cellule dal tessuto dei vostripazienti di coltivarle di purificare mRNA dal cito-plasma trasformarlo in cDNA e utilizzarlo comesonda per il microarray contenente i geni elencatinella tabella 121 (NB in questo esercizio la tecni-ca del microarray egrave utilizzata per definire il profilodi espressione genica in un tipo di tumore non perconfrontare cellule tumorali e cellule normali)Il risultato dellrsquoanalisi dellrsquoespressione dei geni inte-ressati egrave visibile nelle tabelle seguenti relativi ai trepazienti X Y e Z (lrsquoespressione del gene egrave indicatada un pallino nero) Qual egrave la vostra diagnosi per itre pazienti

NOME

DEL GENE

FUNZIONE DEL GENE PREVISIONE

LrsquoESPRESSIONE

DEL GENE Egrave AUMENTATA

O RIDOTTA NELLE

CELLULE TUMORALI

SPIEGAZIONE

DELLA

PREVISIONE

A1Un oncogene che produce una proteina che funzionada acceleratore in una via di trasmissione delsegnale di crescita cellulare

A2Un gene soppressore di tumore che produce unaproteina che funziona da freno in una via ditrasmissione del segnale di crescita cellulare

A3Il gene ldquoguardianordquo che produce la proteina p53 cheidentifica i danni del DNA e innesca lrsquoapoptosi se ildanno al DNA non puograve essere riparato

A4

Il gene della telomerasi un enzima indispensabileper la completa replicazione delle estremitagrave deicromosomi (telomeri) Le cellule senza attivitagravetelomerasica diventano senescenti e muoiono

B1Un gene che produce un enzima coinvolto nellariparazione dei danni al DNA

B2

Un gene che produce un fattore angiogeneticocioegrave una proteina che induce la formazione di vasisanguigni questi geni sono spenti nei tessuti adultinormali

B3

Un gene di una proteina di membrana che fa aderirele cellule una allrsquoaltra allrsquointerno di un tessutoe previene ldquolrsquoevasionerdquo del tumore dal suo sitoprimario (metastasi)

B4Un oncogene che produce un recettore di membranache trasmette in modo incontrollato un segnale dicrescita

C1Un gene che produce un recettore di membrana perun segnale di rallentamento della crescita

C2Un gene di un fattore trascrizionale che attiva latrascrizione di geni critici per la replicazione del DNA

C3Un gene che produce una proteina che trasformalrsquoADP in ATP (ATPsintasi)

C4 Un gene che produce una proteina del citoscheletro

paziente X

paziente Y

A B C

1

2

3

4

A B C

1

2

3

4

A B C

1

2

3

4

paziente Z

Il paziente X esprime 7 geni (A2 A3 B1 B3 C1C3 C4) 2 geni di controllo (sempre attivi) e 5geni che non sono coinvolti nella formazione di

tumore e possono essere espressi nelle cellulenormali Si puograve concludere che la biopsia del pa-ziente X non contiene cellule tumorali

Il paziente Y esprime 7 geni (A1 A4 B2 B4 C2C3 C4) 5 dei quali sono geni coinvolti nella for-mazione eo nel processo di metastatizzazione deltumore e 2 sono geni di controllo Pertanto per ilpaziente Y si puograve fare una diagnosi di tumore

Il paziente Z esprime 8 geni A1 A4 e B2 sono 3geni che si esprimono in caso di tumore mentre A2A3 e B1 sono geni che si esprimono nei tessuti sani Igeni C3 e C4 sono geni di controllo Non egrave possibilequindi fare una diagnosi certa avendo una situazio-ne di perfetta paritagrave di espressione tra geni coinvoltie non coinvolti nel processo di trasformazione

Tabella 121



110

Esercizio 4Immaginate di avere a disposizione due replichedi uno stesso microarray su cui sono state depo-sitati 20 spot relativi a 20 geni la cui funzione egraverilevante nel tessuto mammario I geni sono de-nominati con le lettere A B C D E F G H I J K L MN O P Q R S T Ciascun chip egrave stato messo a con-tatto con cDNA ottenuto da mRNA estratto dacellule normali (controllo) marcato con un trac-ciante verde e contemporaneamente con cDNAottenuto da mRNA estratto da cellule tumoralimarcato con un tracciante rosso

Anche in queste analisi uno spot verde indicache il gene egrave attivo nel tessuto normale Uno spotrosso indica che il gene egrave attivo nel tumore I co-lori intermedi indicano che il gene in questione egraveattivo in entrambi i tipi cellulari con diversi gradidi espressione che producono le diverse sfumatu-re Il colore giallo indica che il gene egrave ugualmen-te espresso nel tumore e nelle cellule normali Ilcolore nero indica che il gene non egrave espresso neacutenelle cellule normali neacute nelle cellule tumorali

Scopo dellrsquoesercizio egrave quello di identificare unprofilo di espressione tumore-specifico e possi-bilmente correlare il profilo di espressione conla malignitagrave Vengono messi a confronto i profilidi espressione di due tipi di tumore mammario(figura 1210) il carcinoma papillare in situ e ilcarcinoma infiltrante (ricordate che il carcinomainfiltrante ha un grado di malignitagrave superiore al car-cinoma in situ) Facendo riferimento alla figura1210 assegnate ad ogni spot un punteggio e in-

seritelo nelle celle della tabella 122

Per visualizzare in modo piugrave immediato le dif-

Tabella 122

La parte (a) della tabella si riferisce al carcinoma mammario in situla parte (b) si riferisce al carcinoma mammario infiltrante

a) b)

ferenze di espressione nei due tipi di tumorecostruite un grafico a colonne con i punteggi davoi assegnati ai singoli spot (A-T) utilizzando lagriglia della figura 1211 Per distinguere i profilidi espressione dei due tumori usate colori diver-si (carcinoma in situ colore blu carcinoma infil-trante colore viola)Confrontate i punteggi da voi assegnati e il graficorisultante con la tabella 123 e con la figura 1212

+4 +3 +2 +1 0 0 -1 -2 -3 -4

Figura 1210

Nei due chip gli estratti tumoralirispettivamente di carcinomamammario in situ (a) e di carcinomamammario infiltrante (b) vengonoconfrontati con cellule normalidel dotto mammario

A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

a) b)


Esercitazione n 12

111

(+1) ( 0) (-2) (-1) (+2) ( 0) (-2) (-2)

(+3) (-2) (-1) (-3) (+3) (-2) (+2) (-3)

(+4) (-1) (-2) (-3) (+4) (-1) (-2) (+3)

(+3) (-3) (-4) (+1) (+3) (-3) (-4) (+1)

( 0) (+2) (+4) ( 0) (+4) (+2) (+4) ( 0)

0A B C D E F G H I LJ K M N O P Q R S T

-1

-2

-3

-4

-5

1

2

3

4

5

Carcinoma duttale in situ Carcinoma duttale infiltrante

- i geni con punteggio negativo sono poco espressinelle cellule tumorali rispetto alle cellule normali- i geni con un punteggio positivo sono geni espres-si maggiormente nelle cellule tumorali rispetto allecellule normali- i geni con un punteggio uguale a zero sono geniespressi egualmente nelle cellule tumorali e nellecellule normali

Per fare una diagnosi differenziale fra i due tipi ditumori eo per correlare uno schema di espressionecon la malignitagrave egrave interessante identificare quei geniche hanno comportamento diverso nei due tipi di

tumoreIl gene G e ancora di piugrave il gene L sono sovra-espressi nelle cellule del carcinoma infiltrante esotto-espressi nelle cellule del carcinoma papillarein situIl gene Q egrave attivo solo nelle cellule del carcinomainfiltrante mentre egrave inattivo nel carcinoma in situIn conclusione se questo quadro fosse confermatosu un numero significativo di casi i geni G L e Qpotrebbero diventare dei marcatori diagnostici perdistinguere questi due tipi di tumore

Figura 1211

Figura 1212

Grafico a colonne dei profili di espressione dei due tipi di carcinomamammario (carcinoma in situ colonne blu carcinoma infiltrantecolonne viola)

Tabella 123

A

A A

B

B B

C

C C

D

D D

E

E E

F

F F

G

G G

H

H H

I

I I

J

J J

K

K K

L

L L

M

M M

N

N N

O

O O

P

P P

Q

Q Q

R

R R

S

S S

T

T T

4

3

2

1

0

-1

-2

-3

-4

Quali osservazioni potete fare sullrsquoespressione diffe-renziale dei geni analizzati nei due tipi di tumore



112


APPENDICE


114


115

Norme generali

Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezzache devono essere tassativamente rispettate

Norme generali di sicurezza in laboratorioEntrando in laboratorio individuare le vie di fuga indicate dalla segnaletica verdeIn laboratorio indossare sempre il camice Il camice deve essere chiuso sul davanti con manichelunghe Al termine delle attivitagrave prima di lasciare il laboratorio togliersi il camiceIn ogni caso non uscire dal laboratorio per recarsi in altre aree (biblioteca uffici bar ecc)senza aver prima tolto il camiceNon introdurre in laboratorio borse zaini o altro materiale non necessarioGli studenti che presentano dermatiti o altre lesioni sulle mani devono indossare guanti protettiviin tutte le fasi di lavoroI guanti vanno tolti quando si usino strumenti di qualsiasi natura (telefono tastiera strumentiscientifici maniglie ecc) I guanti usati non vanno riutilizzatiLavare le mani dopo la fine delle attivitagrave anche quando sono stati indossati i guantiLavare sempre le mani prima di lasciare il laboratorioIn laboratorio egrave vietato mangiare bere portare oggetti alla bocca e applicare cosmeticiNon appoggiare recipienti contenenti liquidi biologici vicino al bordo del banco di lavoroSegnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento di materiale biologicosul piano di lavoro affincheacute si provveda alla decontaminazione con un germicida chimicoappropriato (candeggina ecc)Decontaminare e pulire sempre al termine del loro utilizzo le apparecchiature scientifiche eal termine dellrsquoattivitagrave i piani di lavoroRaccogliere tutti i liquidi biologici (terreni di coltura venuti a contatto con le cellule cellule ecc)in speciali contenitori per rifiutiSegnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di materiale diprotezione

Nota di sicurezza Comportamento dellrsquooperatorePer chi ha i capelli lunghi legarsi i capelli con un elasticoPrima di cominciare a lavorare lavarsi le maniPulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturatoPrima di cominciare lrsquoesperimento accertarsi di conoscere il funzionamentodella strumentazione che dovragrave essere utilizzata

Nota di sicurezza Utilizzazione del forno a microondeNon accendere il forno se egrave vuotoNon utilizzare il forno con materiali infiammabiliNon utilizzare il forno con recipienti sigillati (potrebbero esplodere) svitare i tappi dellebottiglie rimuovere i coperchiNon utilizzare il forno con oggetti metallici o metallizzati (ad es bottiglie coperte di stagnola) econ carta drsquoargentoNon riempire eccessivamente i recipienti il liquido bollendo potrebbe traboccareProporzionare la potenza e il tempo di riscaldamento al contenuto in acqua di quanto vieneriscaldato In particolare nel caso di soluzioni acquose il liquido potrebbe surriscaldarsi oltreil punto di ebollizione senza che appaiano bollicine Ciograve puograve portare alla fuoriuscita di liquido

NORME GENERALI DI SICUREZZAIN LABORATORIO



116

bollente Per prevenire questo pericolo mescolare il liquido primadi scaldarlo e lasciarlo riposare per qualche minuto prima di togliere il recipiente dal fornoUtilizzare i guanti imbottiti per togliere i recipienti dal fornoDopo lrsquouso pulire il forno con carta imbevuta con detersivo per vetriIn caso di incendio del contenuto del forno tenere chiusa la porta spegnere il forno staccarela spina dalla presa di corrente lasciando che il fuoco si estingua per soffocamento

Nota di sicurezza Utilizzazione dellrsquoapparecchiatura per elettroforesiAssicurarsi che lrsquoalimentatore sia spento prima di collegare i morsettiAssicurarsi che il coperchio della vaschetta sia correttamente posizionato prima di collegarei morsettiPrima di rimuovere il coperchio della cella elettroforetica spegnere lrsquoalimentatore e staccarei morsetti

Nota di sicurezza Utilizzazione della centrifugaChiudere accuratamente il tappo delle provette per evitare la fuoriuscita di liquidoe la formazione di aerosolAssicurarsi che il rotore sia bilanciato provette di ugual peso devono essere inseritenegli alloggiamenti diametralmente oppostiChiudere il coperchio della centrifuga prima di avviarlaNon cercare di aprire il coperchio prima del completo arresto del rotore In caso di fuoriuscitadei liquidi dalle provette avvertire il personale docente

Nota di sicurezza Smaltimento dei rifiutiTutto il materiale monouso utilizzato (puntali provette pipette ecc) va messo in appositicontenitori per rifiuti che devono essere smaltiti da personale autorizzato secondo le normevigenti


Protocolli 1 2 3

117

1 Chi egrave il colpevole2 Identificazione di un OGM3 Sano o malato

Preparazione del gel di agarosioNota di laboratorio la concentrazione di agarosio nel gel viene scelta dal ricercatore in base alledimensioni dei frammenti di DNA da separare mediante elettroforesi Nel nostro caso dovendoseparare frammenti lineari di DNA compresi tra 100 e 2000 pb (paia di basi) si utilizza un geldi agarosio al 2 (wv)

Preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di nastro adesivo di cartaVerificare che il piano su cui si appoggia la vaschetta per elettroforesi sia correttamente ldquoin bollardquoMisurare 30 ml di tampone TBE 1times in un cilindro e versarli nella beuta di vetro pirex checontiene giagrave 060 gr di agarosioPesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e prendere nota del pesoLeggere attentemente la ldquoNota di sicurezza sulla utilizzazione del forno a microonderdquoSciogliere lrsquoagarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza di circa 500 V per 1 minutoAprire i il forno agitare delicatamente la soluzione con una protezione facendo attenzione a nonscottarsi Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per un ulteriore minuto allastessa potenza

ELETTROFORESI DEL DNASU GEL DI AGAROSIOApparecchiature e strumentazioni

micropipette 220 μlpuntalibeuta da 100 mlcilindro graduato da 50 mlbilanciaforno a microondeapparato per elettroforesinastro adesivo di cartaalimentatorecentrifugatransilluminatoreocchiali in plexiglass

Reagenti e materiali biologici1

TBE 1χ1

DNA prodotti con PCR (giagrave pronti)Marcatore di peso molecolare (DNA del plasmide pUC8 tagliato con lrsquoenzima di restrizione HaeIII)Agarosio in polvere (060 g)Intercalante del DNA (SYBR Safe)Colorante di caricamento 6χAcqua distillata sterile

1 Per la preparazione di tutti i reagenti indicati in grassetto nellrsquoAppendice si rimanda alla fine dellrsquoAppendice stessa



118

Pesare la soluzione di agarosio (lrsquoacqua del tampone bollendo egrave evaporata) e riportarela soluzione di agarosio al peso originale utilizzando una spruzzetta con H2O distillataAttenzione far cadere lrsquoacqua delicatamente facendola scivolare lungo i bordi della beutaevitando la formazione di bolleAggiungere 3 μl di intercalante del DNA (SYBR Safe) nella beuta con lrsquoagarosioAspettare 3-5 minuti coprendo la beuta contenente la soluzione di agarosio con un pezzettodi stagnola per evitare lrsquoevaporazione Lrsquoagarosio deve raggiungere una temperatura intornoai 60 degC altrimenti rovina il supporto di plastica della vaschetta dellrsquoelettroforesiVersare la soluzione di agarosio evitando di formare bolle nella vaschetta per elettroforesi doveegrave giagrave stato inserito un pettine che serve per formare dei pozzetti nei quali saranno depositati icampioni da analizzare I pozzetti si formano quando solidificato il gel viene tolto il pettineLasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 minuti Quando il gel egrave solidificato diventaopacoTogliere il nastro di carta dalla vaschetta e metterla nella cella elettroforeticaVersare il tampone TBE 1times nella camera di corsa evitando che si formino bolle fino a coprirecompletamente il gel Se si formano bolle toglierle con la punta di una micropipettaTogliere lentamente il pettine agendo perpendicolarmente rispetto al gel stesso

Corsa elettroforeticaA ciascuno studente viene consegnata una provetta eppendorf contenente 10 μl di DNA(circa 200 ng) la tabella riassume gli schemi di caricamento per i diversi esperimenti

Scrivere su ciascuna provetta con un pennarello resistente allrsquoacqua una sigla identificativadel campioneAggiungere 2 μl di colorante di caricamento 6times e risospendere con la micropipetta evitando diformare bolle Il glicerolo presente nel colorante di caricamento serve a rendere piugrave densa la soluzionedi DNA da caricare nel pozzetto e quindi a facilitare la deposizione del campione nel pozzettoSe si formano bolle centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorfCaricare lentamente ciascun campione (12 μl) nei singoli pozzetti (ogni pozzetto ha unvolume di circa 15 μl) ponendosi con la punta della micropipetta in un angolo del pozzetto eperpendicolarmente rispetto al gel facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto stesso ea non far uscire il campione dal pozzettoIn un pozzetto laterale caricare i marcatori di DNA a peso molecolare notoChiudere il coperchio della cella elettroforeticaCollegare i morsetti dei cavi ai poli del generatore di corrente detto anche ldquoalimentatorerdquo o powersupply Il DNA egrave carico negativamente e migra verso il polo positivoFissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica percirca 40 minutiOsservare la migrazione dei coloranti presenti nella soluzione di caricamento per valutare lamigrazione del DNA che essendo incolore non si puograve vedere Il blu di bromofenolo (piugrave scuro)migra alla stessa velocitagrave di un frammento di DNA a doppia elica di circa 100 pb mentre lo xilenecianolo (piugrave chiaro) migra alla stessa velocitagrave di un frammento di circa 800-900 pb

Attenzione fermare la corsa elettroforetica quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1-2 cm dallafine del gel in modo da evitare che il DNA esca dal gel stesso Se dovesse succedere si perdono icampioni di DNA

CHI Egrave IL

COLPEVOLE

PM(Peso molecolare)

V(vittima)

SC(scena crimine)

S1(sospettato 1)

S2(sospettato 2)

S3(sospettato 3)

Biancodi PCR

IDENTIFICAZIONE

DI UN OGM

1(cloroplasto)

2(zeina)

3(campione)

4(controllo +)

5(controllo -)

SANO O MALATO1(individuo III1)

2(individuo III2)

3(individuo IV1)

4(individuo IV2)

5(individuo IV3)

6(individuo IV4)


Protocolli 1 2 3

119

Operazioni da svolgere alla fine della corsa elettroforeticaAl termine della corsa indossare guanti monouso e togliere delicatamente il gel dalla cellaelettroforetica trasferendolo sul transilluminatoreOsservare il gel al transilluminatore proteggendo gli occhi dai raggi UV con appositi occhialiDocumentare il risultato del gel facendo una fotografia (ricordarsi di portare una macchinafotografica digitale)Il tampone della corsa elettroforetica puograve essere riutilizzato alcune volte Recuperare il tamponeusato versandolo in una bottiglia con lrsquoaiuto di un imbuto



120


121

Protocollo 4

4 Clonaggio del DNA Bianco o blu

PROTOCOLLO SPERIMENTALEDEL CLONAGGIO DEL DNAATTIVITAgrave 1 BIANCO O BLU

Apparecchiature e strumentazionimicropipette 220 μlmicropipette 20200 μlmicropipette 1001000 μlpuntaliprovette da 15 mlprovette falcon da 15 mlportaprovettepiastrespatole sterilistufa a 37 degCtermoblocco a seccostuzzicadenti sterili


Cellule di Escherichia coli XL1 Blue rese competenti con un trattamento con CaCl2 aliquote da 200 μlcongelate a ndash80 degC in provette eppendorfMiscela di ligazioneVettore pUC19H2O distillata sterileLB sterile in provette da 15 mlPiastre con LB + agar + ampicillinaIPTG 01 MX-GAL 40 mgmlampicillina 10 mgml

Trasformazione battericaPer effettuare la trasformazione batterica ogni gruppo di studenti riceveragrave

sospensione di cellule di E coli XL1 Blue competenti unrsquoaliquota da 200 μl per ogni studentela miscela di ligazione (contenente il plasmide pUC19 linearizzato con lrsquoenzima di restrizioneEcoRI e un frammento di DNA genomico anchrsquoesso tagliato con EcoRI)il vettore pUC19acqua sterile

Lasciare scongelare in ghiaccio le cellule competentiRisospendere delicatamente le cellule con piccoli colpi delle dita sulla provettaSiglare le provette con un pennarello waterproof con numeri progressivi (da 1 a n a seconda delnumero di repliche che sono allestite) per la trasformazione con la miscela di ligazione (+) per ilcontrollo positivo (ndash) per il controllo negativo

1 Per la preparazione dei reagenti in grassetto si rimanda alla fine dellrsquoappendice



122

In base a come egrave contrassegnata ogni studente aggiungeragrave alla propria provetta contenente le cellule

Incubare in ghiaccio per 20 minutiTrasferire nel termoblocco a secco a 37 degC per 5 minuti (fase di heat shock)Porre per 1 minuto in ghiaccioAggiungere sterilmente 800 μl di LB medium senza antibiotico (volume finale circa 1 ml)Incubare in termoblocco a 37 degC per 30 minuti (tempo di espressione del gene ampR)

Nel frattempo distribuire a ogni studente una piastra contenente LB con agar e ampicillinaPreparare per ogni piastra una miscela di40 μl di IPGT 01 M-20 μl di X-GAL 40 mgml-

Per far questo conviene preparare una miscela contenente le due soluzioninelle opportune proporzioni (2 IPGT 1 X-GAL) e pipettarne 60 μl su ciascuna piastra (NBdistribuire il liquido in modo uniforme sulla superficie della piastra utilizzando lrsquoapposita spatolasterile)

Trascorsi i 30 minuti di incubazione delle cellule piastrare diverse quantitagrave di cellule trasformatecon la miscela di ligazione ad esempio 50 μl 100 μl 150 μl 200 μlAllestire un controllo negativo piastrando 100 μl di cellule trasformate con acqua distillata sterileAllestire un controllo positivo piastrando 100 μl di cellule trasformate con pUC19

(NB distribuire le cellule in modo uniforme sulla piastra utilizzando lrsquoapposita spatola sterile)Capovolgere le piastre (per evitare che in stufa la condensa cada sulle cellule) e incubarle in stufaa 37 degC per una notte

Conteggio del numero di colonie batteriche trasformateIl conteggio del numero di colonie batteriche trasformate presenti in una singola piastra serve percalcolare il livello di competenza delle cellule batteriche ossia lrsquoefficienza di trasformazione batterica(numero di cellule trasformateμg di DNA)Il conteggio del numero di colonie presenti viene effettuato sulla piastra di controllo positivo incui sono stati piastrati 100 μl (110) della sospensione di cellule trasformate con 1 ng di pUC19 equindi trasformate con 01 ng di DNA

Capovolgere la piastra in modo che il coperchio appoggi sul banco di lavoroCon un pennarello dividere la piastra in 4 settori ugualiContare il numero di colonie presenti in due settori e fare la media dei due valoriMoltiplicare il valore medio ottenuto per 4 (si ottiene il numero di colonie totalipiastra)Calcolare lrsquoefficienza di trasformazione

(ndeg colonie01 ng DNA) times 10 000(ricordarsi che 1 μg = 1 000 ng)

Esempio supponiamo che il numero di colonie totalipiastra sia risultato pari a 100 Dal momentoche era stato piastrato 110 di sospensione di cellule trasformate il numero totale di batteritrasformati nella provetta egrave 100 times 10 = 1000 e lrsquoefficienza di trasformazione egrave pari a 106 colonietrasformateμg DNA

Allestimento di una minicoltura battericaPer confermare che le colonie batteriche bianche contengano davvero un vettore che ha incorporatoun inserto egrave necessario estrarre il DNA plasmidico dalle colonie trasformate e analizzare le

1hellipn 10 l di miscela di ligazione

+ 10 l di vettore pUC19 (1 ng totale) controllo positivo

- 10 l di acqua controllo negativo (-DNA)


123

Protocollo 4

dimensioni dellrsquoinserto si procede allestendo una minicoltura batterica in terreno liquido peramplificare il numero di cellule da cui estrarre il plasmide

Mettere 05 ml di terreno di coltura con ampicillina in una provetta da 15 mlIdentificare una colonia batterica sia essa bianca o blu purcheacute sia singola e ben separata dallealtre colonieCon uno stuzzicadenti sterile prelevare la colonia batterica e stemperarla nel terreno di colturaChiudere la provetta e incubare per una notte a 37 degC

ATTIVITAgrave 2 RICOMBINANTE O NON RICOMBINANTE

Apparecchiature e strumentazionimicropipette 220 μlmicropipette 20200 μlmicropipette 1001000 μlpuntaliprovette da 15 mlprovette falcon da 15 mlportaprovettebeuta da 100 mlcilindro graduato da 50 mlbilanciaforno a microondeapparato per elettroforesinastro adesivo di cartaalimentatorecentrifugavortexstufa a 37 degCtransilluminatoretermoblocco a secco

Reagenti e materiali biologiciMinicolture batteriche precedentemente preparate (Attivitagrave 1)Soluzione AProteinasi K 20 mgmlLisozima 10 mgml sterilizzato mediante filtrazioneTE + RNasi A 50 μgmlAlcol isopropilico (isopropanolo)TBE 1χAgarosio in polvereIntercalante del DNA (SYBR Safe)Colorante di caricamento 6χEtanolo 70H2O distillata sterileTampone di digestione di EcoRI 10χEnzima EcoRI (5 Uml)Marcatore di peso molecolare lineare 1 kb DNA ladder

MINIPREP DI DNA PLASMIDICO METODO BOILINGQuesto esperimento ha lo scopo di estrarre il DNA plasmidico al fine di confermare se esso egravericombinante oppure no



124

La lisi delle cellule avviene con un trattamento al calore (donde il nome boiling dato a questo metododi estrazione di DNA plasmidico)

Estrazione del DNA plasmidicoCentrifugare la mini-coltura batterica 5 minuti a 13 000 rpm (rivoluzioni per minuto) edeliminare il surnatante la provetta va poi fatta sgocciolare sulla carta assorbenteRisospendere il pellet con 530 μl di soluzione A giagrave addizionata con 1 μl di proteinasi KMiscelare con la micropipetta per risospendere le celluleAddizionare 25 μl della soluzione di lisozimaMiscelare per inversione (5 volte)Incubare per 10 minuti a 95 degC in un termoblocco a seccoCentrifugare 10 minuti a 13 000 rpmTrasferire il surnatante in una nuova provetta

Precipitazione del DNAAl surnatante addizionare 450 μl di isopropanoloPassare su vortexTenere 5 minuti a temperatura ambienteCentrifugare 5 minuti a 13 000 rpm eliminare il surnatanteAddizionare 400 μl di etanolo 70Centrifugare 5 minuti a 13 000 rpm eliminare il surnatanteAsciugare il pellet in un termoblocco a seccoRisospendere con 50 μl TE + RNasi APassare su vortexIncubare 10 minuti a 37 degC

Digestione con un enzima di restrizioneUna volta estratto il DNA plasmidico dalle cellule batteriche trasformate bisogna determinare se ilplasmide egrave ricombinante (contiene un inserto) oppure no Il colore della colonia batterica (biancoo blu) egrave giagrave un indizio tuttavia la presenza dellrsquoinserto nel vettore estratto dalle colonie batterichebianche deve essere verificata Per fare ciograve egrave necessario effettuare la digestione con un enzima direstrizione che consenta di ldquoritagliarerdquo (ossia escidere) lrsquoinserto dal vettore Lrsquoinserto viene escissocon lo stesso enzima di restrizione utilizzato per clonarlo

Prelevare 3 μl (equivalente a circa 3 ng di DNA) di DNA plasmidico risospeso in TE+RNasi AAggiungere 1 μl di tampone di digestione di EcoRI 10timesAggiungere 1 μl di enzima EcoRI (5 Uml)Aggiungere 5 μl di acqua distillata sterileIncubare 30 minuti a 37 degC

Elettroforesi del DNAIn questo esperimento lrsquoelettroforesi del DNA ha lo scopo di

verificare la presenza di DNA plasmidico nella miniprepverificare se si tratta di un plasmide ricombinante oppure nonel caso di un plasmide ricombinante determinare il peso molecolare dellrsquoinserto

Preparazione dei campioniScrivere su ciascuna provetta da 15 ml con un pennarello waterproof il tipo di campione che vi verragravetrasferito

B = plasmide estratto da colonia blu non digeritoW = plasmide estratto da colonia bianca non digerito

Preparazione del gel di agarosioDovendo separare molecole circolari di plasmide di qualche kb (chilobasi 1000 coppie di basi) e


125

Protocollo 4

frammenti lineari di DNA compresi tra 100 e 2000 pb (paia di basi) si utilizza un gel di agarosioallo 08 pertanto preparare il gel secondo le indicazioni del Protocollo ldquoElettroforesi del DNArdquosciogliendo 024 g di agarosio in 30 ml di tampone TBE 1χ

Corsa elettroforetica Seguire le indicazioni contenute nel Protocollo ldquoElettroforesi del DNArdquoNota bene in questo esperimento essendo diversa la concentrazione del gel di agarosio lamigrazione del colorante di caricamento ha diverse velocitagrave il blu di bromofenolo migra alla stessavelocitagrave di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 pb mentre lo xilene cianolo migra allastessa velocitagrave di un frammento di circa 9000 pb



126


127

Protocollo 5

5 Mais blu Dal fenotipo al genotipo

PROTOCOLLO SPERIMENTALE

ATTIVITAgrave 1 DAL SEME DEL MAIS AL FENOTIPO

GERMINAZIONE DEI SEMIApparecchiature e strumentazioni

vaschetta in plexiglass con coperchio di cm 50 times 60 times 20carta da filtroteli scuri

Reagenti e materiali biologiciAlmeno 50 semi di maisIpoclorito di sodio 7Acqua distillata

I semi vengono suddivisi in colorati e incolori sterilizzati in una soluzione di ipoclorito di sodio al7 (la candeggina commerciale) per circa 20 minuti e quindi sciacquati abbondantemente in acquadistillataLa germinazione avviene al buio a temperatura ambiente (20-25 degC) in vasche di plexiglass sucarta da filtro (tre fogli di carta da filtro per vasca) bagnata con acqua di rubinetto (non distillatapercheacute ritarda la germinazione) Prima di bagnare la carta si suddivideragrave (tracciando con la matita)la superficie a disposizione in due porzioni per tenere separati i semi colorati dagli incolori I semivengono disposti con lrsquoembrione verso lrsquoalto (fig 1) e coperti con un singolo foglio di carta da filtroSi bagna fino alla completa imbibizione della carta da filtro accertandosi che non rimanga acqualibera nella vasca percheacute potrebbe inibire la germinazione dei semi Si chiude la vasca con una lastradi vetro e la si mette al buio Quando i semi sono germinati dopo circa 4 giorni a 26 degC la vascaegrave esposta alla luce per circa 5-7 giorni per permettere lo sviluppo delle plantule e lrsquoaccumulo dipigmenti antociani nelle radici (fig 2) controllando circa ogni due giorni che la carta da filtro siasempre bagnata

Analisi del fenotipoUna volta cresciute le piantine contando i tre diversi fenotipi egrave possibile verificare la segregazionedegli alleli del gene R1 come attesa in una generazione F2 con il test del χ2 che prevede lrsquoapplicazionedella formula

Inoltre tra le piantine si sceglieranno quelle da analizzare a livello molecolare nella seconda partedellrsquoattivitagrave prendendo nota del fenotipo (colore della cariosside e colore della radice)

Figura 2

Piantine di maisin vasca di germinazione

Figura 1

Posizione dellrsquoembrionein una cariosside di mais

χ2 = (o-a)2

a



128

ATTIVITAgrave 2 ANALISI MOLECOLARE DI UN MARCATORE GENETICOProtocollo per lrsquoestrazione del DNA genomico da foglia

Apparecchiature e strumentazionimicropipette 220 μlmicropipette 20200μlmicropipette 1001000 μlpuntaliprovette da 15 mlprovette da 2 mlprovette da 02 ml per PCRpestelli conici in teflonprovette falcon da 15 mlportaprovettebeuta da 100 mlcilindro graduato da 50 mlbilanciaforno a microondeapparato per elettroforesialimentatorecentrifugavortexstufa a 37 degCtermociclatoretransilluminatoretermoblocco a secco


Piantine di maisExtraction Buffer (EB)SDS 20Ammonio acetato 5MAlcol isopropilico (isopropanolo)Etanolo 70TE + RNAsi 50 μgmlTampone TBE (Tris-Borato-EDTA) 1χAgarosio in polvereIntercalante del DNA (SYBR Safe)Colorante di caricamento per gel di agarosio 6χH2O distillata sterileMarcatore di peso molecolare

Estrazione di DNA genomicoPorre un pezzo di foglia (~2cm 2) tagliato con le forbici in una eppendorf da 2 ml sulla qualeverragrave riportato il codice identificativo del campioneAddizionare 375 μl di EB e 25 μl di SDS 20Macinare il tessuto con un pestelloIncubare in stufa alla temperatura di 60 degC per circa 30 minutiPreparare delle nuove provette eppendorf da 15 ml per il passaggio successivo riportando icodici identificativi precedentemente assegnati ai propri campioniCentrifugare per 15 minuti a 13 000 giri (rpm rivoluzioni per minuto)Trasferire 150 μl di surnatante nella nuova eppendorf preparata precedentemente

1 Per la preparazione dei reagenti in grassetto si rimanda alla fine dellrsquoAppendice


129

Protocollo 6

Addizionare 150 μl di ammonio acetato e 300 μl di isopropanoloMiscelare invertendo le eppendorfIncubare a temperatura ambiente per 15 minutiCentrifugare per 10 minuti a 13 000 rpmEliminare il surnatante stando attenti che il pellet rimanga attaccato allrsquoeppendorfLavare il pellet addizionando 500 μl di etanolo 70 e centrifugare per 5 minuti a 13 000 rpmEliminare il surnatante e lasciare asciugare il pellet (attaccato allrsquoeppendorf) in stufa a 60 degC per5-10 minutiQuando il pellet egrave completamente secco risospenderlo in 30 μl di TE con RNasiIncubare 10 minuti a 37 degCPer la PCR usare 2 μl di DNA genomico il resto puograve essere conservato a ndash20 degC

PCR SUL DNA GENOMICO ESTRATTO

Schema della PCRLa reazione di amplificazione viene effettuata in un volume finale di 25 μl contenente DNA e unamiscela (MIX) di tutti i reagenti necessari allo svolgimento della reazioneComponenti della MIX

25 μl Taq Buffer 10χ-05 μl dNTP (10 mM)-05 μl + 05 μl primer bnlg1028 (forward e reverse) concentrazione 10 pmoliμl (10 mM)-02 μl Taq DNA Polymerase (5 Uμl)-1880 μl H- 2O distillata sterileTotale 23 μl-

I primer per bnlg 1028 sono riportati nella seguente tabella (temperatura di appaiamento specifica 57 degC)

Dato che i volumi di ciascun reagente della MIX sono molto piccoli si consiglia di preparare unvolume di MIX sufficiente per allestire 10 campioni da amplificare

Preparare le provette da 02 μl su cui va riportato il codice identificativo del campioneTrasferire 23 μl della MIX e 2 μl di DNA genomico nella provettaAllestire un controllo negativo con 20 μl di MIX (senza DNA)Tenere le provette in ghiaccio fino al momento di metterle nel termociclatore

Importante ricordarsi di sostituire i puntali ogni volta che si prelevano i diversi reagenti e ogni voltache si trasferisce la MIX nelle singole provette

Lo schema generale del programma di PCR egrave il seguente

Una volta finita lrsquoamplificazione dopo circa 2 ore i campioni vengono caricati nel gel per la corsaelettroforetica (vedi Protocollo ldquoElettroforesi del DNArdquo)

Tdeg T´

94 degC 2acute 30acuteacute 1 unico ciclo iniziale di denaturazione

94 degC 45acuteacute denaturazione

57 degC 1acute appaiamento o annealing

72 degC 1acute30acuteacute estensione

72 degC 5acute estensione

4 degC infin (conservazione dei campioni)

32 cicli

Primer forward AGGAAACGAACACAGCAGCT

Primer reverse TGCATAGACAAAACCGACGT



130


Protocolli 1 2 3

131

6 Analisi cromosomiche

Reagenti e materiali biologiciEtanolo assolutoAcqua distillata sterileColorante Giemsa (Carlo Erba)Sospensioni di linfociti B in soluzione di fissaggio

Striscio su vetrinoLa sospensione cromosomica viene strisciata su un vetrino sgrassato e lavato effettuando i seguenti passaggi

Prelevare con una pinzetta un vetrino portaoggetto da un becker contenente etanolo assolutoAsciugarlo perfettamente con un telo di linoCon una matita scrivere il proprio nome sulla parte molata del vetrinoImmergere il vetrino in una vaschetta di acqua distillata sterileRiempire il capillare della pipetta Pasteur con la sospensione cromosomicaTogliere il vetrino dalla vaschetta e lasciare cadere due gocce di sospensione su metagrave dellasuperficie del vetrino tenendolo inclinato di 30deg per distribuire la goccia sulla superficieAsciugare con carta assorbente il retro del vetrinoLasciare asciugare allrsquoaria per 5 -10 minuti e quindi procedere alla colorazione

Colorazione con colorante Giemsa (Eosina-Blu di Metilene)Egrave una metodica che determina la colorazione omogenea di tutti i cromosomi evidenziandone ladimensione e la morfologia rispetto alla posizione del centromeroLa colorazione con colorante Giemsa si basa sulla differenziazione dei costituenti cellulari quellibasici (il citoplasma e gli organelli citoplasmatici) fissano lrsquoeosina acida e si colorano in rosso-arancio mentre i componenti a reazione acida (i cromosomi) si colorano in blu con i prodotti diossidazione del blu di Metilene basici

La colorazione si effettua attraverso i seguenti passaggiImmergere i vetrini per 25 minuti in GiemsaSciacquare i vetrini con acqua distillata e lasciare asciugare allrsquoariaOsservare i vetrini al microscopio ottico

I vetrini possono essere montati con vetrino coprioggetto in modo permanente utilizzandoapposite resine(NB tutti i procedimenti per la colorazione vanno effettuati con i guanti)

PROTOCOLLO SPERIMENTALEApparecchiature e strumentazione

vetrini portaoggetto molati-sabbiativaschette in vetro borosilicato per colorazione vetrini ldquoHellendhalrdquo con coperchiovaschette per risciacquo in polimetilpentene ldquoHellendhalrdquopinzettePasteur di vetrotettarelle in lattice per pipette Pasteurmicroscopiopennarelli indelebilifogli da lucidocarta assorbente



132

Cariotipo umano normale o patologicoSono disponibli alcune fotografie di cariotipi umani con bandeggio Q appartenenti a individuidiversi di cui non egrave specificato il sesso e lrsquoeventuale presenza di patologie Gli studenti dovrannosovrapporre un foglio di acetato alla foto e utilizzando un pennarello per cancellare i cromosomidurante il conteggio contare i cromosomi e riconoscere le coppie di omologhiDovranno quindi rispondere alle seguenti domande1 Il cariotipo che stai osservando egrave di un maschio o di una femmina2 Riconosci una patologia dal conteggio del numero dei cromosomi3 Se sigrave di quale patologia si tratta

Istruzioni per il conteggio dei cromosomi delle immagini allegateLe metafasi illustrate nelle fotografie sono state ottenute applicando il bandeggio Q (colorazionecon quinacrina e osservazione al microscopio a fluorescenza) Gli studenti dovranno prima contareil numero totale di cromosomi e per formulare una risposta utilizzare come criterio il conteggio elrsquoosservazione dei cromosomi acrocentrici corti (21 22 e Y) simboleggiati nel modo seguente^ acrocentrico corto (21 e 22)^ cromosoma Y (nella foto risulta molto brillante)

1) Femmina normale 46 cromosomi (XX)Cromosomi acrocentrici corti 4 ^ ^ ^ ^

21 22

2) Maschio normale 46 cromosomi (XY)Cromosomi acrocentrici 5 ^ ^ ^ ^ ^

21 22 Y

3) Down 47 cromosomi (XX)Cromosomi acrocentrici 5 ^ ^ ^ ^ ^

21 22

4) Down 47 cromosomi (XY)Cromosomi acrocentrici 6 ^ ^ ^ ^ ^ ^

21 22 Y

5) Klinefelter 47 cromosomi (XXY)Cromosomi acrocentrici 5 ^ ^ ^ ^ ^

21 22 Y

6) XYY 47 cromosomi (XYY)Cromosomi acrocentrici 6 ^ ^ ^ ^ ^^

21 22 Y

7) Turner 45 cromosomi (X0)Cromosomi acrocentrici 4 ^ ^ ^ ^

21 22


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Protocollo 7

7 Anche i geni possono diventare reporter

Apparecchiature e strumentazionimicropipette 220 μlmicropipette 20200 μlmicropipette 1001000 μlpuntaliprovette da 15 mlpestelli conici in teflonprovette da 02 ml per PCRprovette falcon da 15 mlportaprovettepiastrebeuta da 100 mlcilindro graduato da 50 mlbilanciaforno a microondeapparato per elettroforesinastro adesivo di cartaalimentatorecentrifugavortexstufa a 37 degCtermociclatoretransilluminatoretermostato a seccocappa chimica

Reagenti e materiali biologiciPiantine di Arabidopsis thaliana selvatiche e transgenicheSoluzione di colorazione per saggio GUSEtanolo assoluto e al 70 vvTampone high-saltFenolocloroformioisoamilalcol (25241)Alcol isopropilico (isopropanolo)TBE 1χAgarosio in polvereIntercalante del DNA (SYBR Safe)Colorante di caricamento per gel di agarosio 2χ(si prepara facendo una diluizione 13 della soluzione stock 6χ)H2O distillata sterileAcqua 01 DEPC (inibitore di RNasi) con DNasi (1 mgml)dNTPs (10 mM ciascuno)Oligo dT 50 μMRT buffer 10χMgCl2 25 mM




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DTT (ditiotreitolo agente riducente) 01 MRNaseOUT (inibitore della RNasi) 40 UμlSuperscript II RT (trascrittasi inversa) 200 UμlPbull rimer forward e primer reverse per GUSPbull rimer forward e primer reverse per S16Bbull uffer 10χ per PCRTaq polimerasi 5 Uμl

Crescita delle piantine di Arabidopsis thalianaSemi sterilizzati di Arabidopsis selvatica e transgenica vengono seminati su piastra in condizioni disterilitagrave su terreni di crescita contenenti agar con e senza cadmio (sotto forma di cloruro di cadmioCdCl2) Nella tabella sono indicati i principali componenti del terreno di crescita I sali elencatiforniscono alla pianta i nutrienti (N Mg S K P Ca Mn Fe Zn Cu Co Mo I) di cui ha bisognoper una corretta crescita il saccarosio costituisce la fonte di carbonio (in questo caso le piante inpiastra si comportano come organismi eterotrofi) lrsquoagar permette al terreno di solidificare I semicrescono per 10 giorni in una camera di crescita mantenuta a 23 degC con un fotoperiodo di 16 oreAl termine del periodo di crescita trasferire le plantule in due serie (4 per il saggio istochimico e 4per lrsquoestrazione del RNA) di eppendorf da 15 ml opportunamente siglate

Saggio istochimicoAggiungere a ogni provetta 700 μl di soluzione di colorazione per saggio GUSIncubare le provette per una notte a 37 degC in assenza di luceAl termine del periodo di incubazione procedere alla decolorazione dei tessuti con etanoloassoluto per 1-2 ore e quindi allrsquoosservazione delle piante con il fine di evidenziare eventualicolorazioni indaco

Estrazione di RNAAggiungere 500 μl di tampone high-salt alle provette e macerare le piantine con lrsquoausilio di un pestelloAddizionare sotto cappa chimica alle eppendorf 500 μl di una miscela fenolocloroformioisoamilalcol(25241) e miscelare

NH4NO3 2061 mM

CaCl2 299 mM

MgSO4 150 μM

KNO3 1879 mM

KH2PO4 125 mM

H3BO3 100 μM

Na2-EDTA 100 μM

MnCl2 100 μM

ZnCl2 2991 μM

Fe2(CH4O6)3 184 μM

CoCl2 0110 μM

CuCl2 0100 μM

(NH4)6Mo7O24 1030 μM

KI 5 μM

saccarosio 10 g l-1

agar 8 g l-1


135

Protocollo 8

Centrifugare a massima velocitagrave per 10 minutiRecuperare 400 μl di surnatanteMiscelare con 400 μl di H 2O distillata e 560 μl di isopropanolo per favorire la precipitazione degliacidi nucleiciCentrifugare a massima velocitagrave per 10 minuti ed eliminare il surnatanteLavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70 vv e centrifugare a massima velocitagrave per 5 minutiAsciugare il pellet in termoblocco e risospendere in 50 μl di acqua DEPC contenente DNAsi

Determinazione della quantitagrave di RNA estratto mediante elettroforesiAllo scopo di verificare la qualitagrave dellrsquoRNA unrsquoaliquota della preparazione viene sottopostaa separazione elettroforetica su gel di agarosio

Aggiungere 8 μl di RNA estratto in una provetta contenente 8 μl di colorante di caricamentoin concentrazione 2χCentrifugare per pochi secondi

Preparazione del gel di agarosioPreparare il gel drsquoagarosio alla concentrazione 1 secondo le indicazioni del ProtocolloldquoElettroforesi del DNArdquo sciogliendo 030 gr di agarosio in 30 ml di tampone TBE 1times

Corsa elettroforeticaCaricare sul gel di agarosio 15 μl della miscela di RNA e colorante di caricamentoSeguire le indicazioni contenute nel protocollo ldquoElettroforesi del DNArdquo

Analisi dellrsquoespressione del gene reporter attraverso RT-PCRSi utilizza la tecnica RT-PCR (PCR con retrotrascrizione) che combina la reazione della trascrittasiinversa con una normale tecnica di amplificazione del DNA per sintetizzare specifiche molecole dicDNA a partire da uno stampo di mRNA Partendo dal RNA estratto dalle foglie di Arabidopsis conopportuni primer vengono prodotti cloni parziali di cDNA codificanti per il gene GUS e per un genedi controllo S16 Questrsquoultimo codifica per rRNA della subunitagrave minore dei ribosomi di plastidi emitocondri e serve come controllo per verificare il funzionamento della reazione di RT-PCRPer lrsquoottenimento del cDNA viene utilizzato il Protocollo SuperScripttrade First-Strand SynthesisSystem for RT-PCR (Invitrogen)

RetrotrascrizionePreparare una miscela contenente dNTPs e Oligo dT 11Preparare per ogni campione una provetta da PCR contenente 2 μl di miscelaAggiungere 8 μl di RNA (contenente circa 1 μgμl di RNA) e incubare a 65 degC per 5 minutiper distendere i filamenti di RNAMettere in ghiaccio per almeno 1 minutoPreparare una quantitagrave opportuna di una miscela contenente 2 μl di RT buffer 10times 4 μl di MgCl 225 mM (per permettere la formazione dei complessi dNTP-Mg++ che sono il substrato dellatrascrittasi inversa) 2 μl di DTT 01 M 1 μl di RNaseOUT e 1 μl di Superscript II RTAggiungere 10 μl in ogni campioneIncubare a 42 degC per 50 minutiTerminare la reazione portando i campioni a 85 degC per 5 minuti allo scopo di denaturarelrsquoenzima e bloccare la reazione



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OLIGO SEQUENZA NUM DI BASI TA (degC)

GUS forward ATTACGGCAAAGTGTGGGTC 2058

GUS reverse CAGAAAAGCCGCCGACTTCG 20

S16 forward GGCGACTCAACCAGCTACTGA 2154

S16 reverse CGGTAACTCTTCTGGTAACGA 21

AmplificazioneLe coppie di primer utilizzate per amplificare le sequenze del gene GUS e del gene S16 sono statedisegnate facendo riferimento alle sequenze depositate in banca dati (The Arabidopsis InformationResource httpwwwarabidopsisorg)Le coppie di primer utilizzate e le rispettive temperature di appaiamento o annealing (Ta) sonoriportate in tabella

Preparare due diverse miscele di amplificazione una per il gene reporter GUS e una per il gene S16Le miscele sono cosigrave composte

primer forward 1 μl-primer reverse 1 μl-dNTPs 3 μl-buffer 10χ 2 μl-Taq 1 μl-H- 2O distillata sterile 12 μlAliquotare 20 μl della miscela di amplificazione in provette da PCR e aggiungere 5 μl del cDNAottenuto con retrotrascrizioneIncubare in termoblocco da PCR e impostare il seguente programma

Preparazione del gel di agarosioPreparare il gel secondo le indicazioni del Protocollo ldquoElettroforesi del DNArdquo sciogliendo 030 g diagarosio in 30 ml di tampone TBE 1χ

Corsa elettroforeticaA PCR terminata miscelare in una provetta 8 μl di prodotto di PCR e 8 μl di colorante di caricamento 2χCentrifugare per pochi secondiCaricare su gel di agarosio 15 μl di ogni campione

Seguire le indicazioni contenute nel Protocollo ldquoElettroforesi del DNArdquo

Tdeg Tacute94 degC 2acute 1 unico ciclo iniziale di denaturazione


58 degC 45acuteacute annealing


72 degC 10acute 1 unico ciclo finale di sintesi


25 cicli (Ta ottimale per i primer di GUS)


Protocolli 1 2 3

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8 Separazione e immuno-rilevamento di proteine

Apparecchiature e strumentazionimicropipette 220 μlpuntaliprovette da 15 mlprovette falcon da 15 mlportaprovettecilindro graduato da 50 mlcilindro graduato da 500 mlbottiglie di pirex da litrovaschette in pirex (8 times 15 cm)vaschette in plastica (15 times 25 cm)oscillatorecella per elettroforesi verticalealimentatoreapparato per trasferimento su membrana (elettroblotting)griglia per trasferimentocentrifugatermoblocco a seccofogli di acetatopinzettemollette

PRIMA PARTE ASeparazione delle proteine mediante SDS-PAGE


Tampone di corsa per SDS-PAGEDue estratti proteici da cellule di Saccharomyces cerevisiae trattate con TCA (acido tricloro-acetico) in colorante di caricamento per proteine (gli estratti proteici provengono da un ceppo dilievito irraggiato e da un ceppo non irraggiato con raggi UV)Marker di proteine in colorante di caricamentoGel di poliacrilammide PRECASTBlu di Coomassie Safety (Biorad)Acqua distillata sterile

Corsa elettroforeticaIncubare 05 ml dei due campioni nel termoblocco a 100 degC per 5 minuti per favorire ladenaturazione delle proteineCentrifugare i campioni per 30 secondi a 13 000 rpm per raccogliere sul fondo il liquidocontenuto nella provettaAprire i gel precast e sciacquarli dolcemente con acqua distillata togliere i pettini e le guarnizioni adesivealla base del gel montare i gel sullrsquoapposito sostegno





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Riempire lo spazio tra i due gel con il tampone di corsaNel primo pozzetto caricare 5 μl del marker di proteineCaricare 10 μl degli estratti proteici nei pozzetti successivi (seguendo lo schema sottoriportato)

Schema caricamento del gel PM (marker proteine) ndash (estratto di proteine da cellule lievito nontrattate con raggi UV) + (estratto di proteine da cellule di lievito trattate con raggi UV)

Posizionare lrsquoapparato con i gel nella cella elettroforetica e riempirla con il tampone di corsaApplicare al sistema una differenza di potenziale di 200 V per 40 minuti circa (fincheacute il fronte bludel colorante non si vede quasi ldquouscirerdquo dal gel)

PRIMA PARTE BColorazione del gel con Blu di Coomassie Safety

Al termine della corsa ogni gel viene tagliato a metagrave con un bisturi Una metagrave serviragrave per il trasferimentosu membrana (western blotting) la seconda metagrave viene sottoposta alla colorazione con Blu di CoomassieSafety (il colorante si lega alle proteine con interazioni deboli)Porre una metagrave del gel in una vaschetta e fare 3 lavaggi di 5 minuti con acqua distillata tenendo il gel inblanda agitazioneDopo lrsquoultimo lavaggio aggiungere 50 ml di Blu di Coomassie Safety e lasciare in blanda agitazioneper una notteTrasferire il gel in acqua per rimuovere lrsquoeccesso di colorante in 5-10 minuti sono visibilinumerose bande blu

SECONDA PARTE ATrasferimento delle proteine su membrana in PVDF (Polivinildenfluoruro)

Reagenti e materiali1

Tampone di trasferimento perwesternblottingMembrana in PVDFCarta da filtro 3MEtanolo assolutoPBST soluzione di lavaggioSoluzione di incubazione con anticorpi primari (PBST + latte in polvere al 5 con anticorpi primarimonoclonali di topo Anti-Rad53 diluiti 1100)Soluzione di incubazione con anticorpi secondari (PBST + latte in polvere al 5 con anticorpisecondari di capra coniugati con la perossidasi di rafano diluiti 150 000)Liquidi di sviluppo per la reazione con luminolo soluzione 1 e 2Lastre fotograficheLiquidi di sviluppo e fissaggio per lastre fotografiche

Immuno-decorazione o western blottingAl termine della corsa elettroforetica la prima metagrave di ogni gel egrave sottoposta a western blotting ovvero altrasferimento delle bande proteiche dal gel di poliacrilamide a una membrana in PVDF

Preparare la griglia di trasferimento aprendola in una vaschetta di plastica con la parte nera

Pozzetto 1 Pozzetto 2 Pozzetto 3 Pozzetto 4 Pozzetto 5 Pozzetto 6 Pozzetto 7 Pozzetto 8 Pozzetto 9

PM + + +Solo

colorantePM + - +



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Protocollo 8

appoggiata al fondoPosizionare in sequenza una spugnetta bagnata di tampone di trasferimento e un foglio di carta 3Manchrsquoesso imbevuto di tamponeDelicatamente appoggiare il gel sulla carta 3MAttivare la membrana in PVDF precedentemente tagliata sullrsquoangolo a destra in alto (per ricordarelrsquoorientamento della membrana) tenendola almeno 10 secondi in una vaschetta di plasticacontenente etanolo assoluto la membrana va sempre maneggiata con i guantiPosizionare la membrana in PVDF sul gel evitando che si formino bollePosizionare un secondo foglio di carta 3M e infine la seconda spugnetta (sempre imbevuti ditampone di trasferimento)Chiudere la griglia(sandwich)Inserire il sandwich nella camera di un apparato per elettroblottingRiempire di tampone di trasferimento lrsquoapparato La struttura dellrsquoapparato egrave tale per cui il campoelettrico viene applicato perpendicolarmente al piano del sandwich Il trasferimento viene realizzatoapplicando unrsquointensitagrave di corrente di 400 mA per unrsquoora Una volta completato il trasferimentoimmergere la membrana PVDF in etanolo Questo passaggio serve per fissare le proteine allamembrana In etanolo la membrana diventa trasparente Lasciarla asciugare su un foglio di carta 3M

SECONDA PARTE BIndividuazione immunologica di una specifica proteina

Dopo il western blottingIncubare per un ora con la soluzione contenente anticorpi primari (monoclonali di topo diretticontro la proteina Rad53) in blanda agitazioneEffettuare 3 lavaggi della membrana come segue

rimuovere la soluzione di incubazione-immergere la membrana in PBST per 5 minuti cambiare il liquido di lavaggio e ripetere-lrsquooperazione due volte

Incubare la membrana con la soluzione di incubazione contenente gli anticorpi secondari (anticorpi dicapra diretti contro gli anticorpi di topo) per 45 minutiEffettuare 3 lavaggi della membrana come segue


E ora al BUIOIn una camera oscura illuminata solo da due lampade a luce rossa preparare due vasche di plastica una conil liquido di sviluppo e una con il liquido di fissaggio una vasca di plastica con acqua distillata una lastrafotografica ben chiusa fogli di acetato pinzette un pennarello

Preparare le soluzioni 1 e 2 in quantitagrave opportune in relazione al numero di membrane da sviluppare(per ogni membrana occorrono 5 ml di soluzione 1 e 5 ml di soluzione 2)Spostare la membrana in una vaschetta versarvi prima la soluzione 1 e poi la soluzione 2Incubare la membrana per 3 minuti il luminolo viene ossidato dallrsquoossigeno liberato dallrsquoazione dellaperossidasi (coniugata agli anticorpi secondari) sullrsquoacqua ossigenata con concomitante produzione di lucePosizionare la membrana tra due fogli di acetatoSegnare con un pennarello i quattro angoli della membrana e la posizione delle bande del markerSovrapporre una lastra fotografica e tenere coperto e fermo 3 minuti esercitando una leggera pressioneRimuovere la lastra con una pinzetta e immergerla nella vasca contenente il liquido di sviluppo fino acomparsa delle bandeSciacquare la lastra nella vasca piena drsquoacqua e passarla nella vasca con il liquido di fissaggio fino a che nondiventa trasparenteAppendere con due mollette la lastra ad asciugare



140


141

Protocollo 11

11 Le forme invisibili

Nellrsquoesperimento la proteina lisozima viene cristallizzata mediante la tecnica della diffusione divapore (in configurazione di ldquogoccia sedutardquo o sitting drop) equilibrando una goccia contenenteuna miscela 11 di proteina e di soluzione di cristallizzazione contro la stessa soluzione contenutain un pozzetto sottostante la goccia (fig 1) Sono utilizzate due diverse condizioni sperimentaliper identificare le condizioni ottimali di cristallizzazione Per questo esperimento la soluzione dicristallizzazione egrave costituita da una miscela di Na-acetato e NaCl

PROTOCOLLO DI CRISTALLIZZAZIONE

Apparecchiature e strumentazionimicropipette 220 μlmicropipette 20200 μlmicropipette 1001000 μlpuntaliprovette da 15 mlprovette falcon da 15 mlportaprovettepiastre per cristallizzazionemicroscopio


Soluzione precipitante 100 ml di NaCl 20 wvSoluzione tampone 100 ml di Na-acetato (pH 46) 3MLisozima 40 mgml

Figura 111

Il metodo della diffusione di vapore egrave una delle tecniche usate piugrave frequentemente per ottenere cristalli di una proteina (a) Una goccia di proteinadi alcuni μl viene mescolata ad una goccia di pari volume di soluzione di cristallizzazione prelevata dal pozzetto (b) Il pozzetto viene sigillato ed ilprocesso di cristallizzazione comincia sfruttando la distillazione di H2O dalla goccia al pozzetto (diffusione di vapore)

a) b)


SOLUZIONE DI CRISTALLIZZAZIONE

H2O H

2O

NASTRO ADESIVO SIGILLANTE

PROTEINA



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Preparazione delle prove di cristallizzazionePipettare 05 ml di soluzione di cristallizzazione (composta da soluzione precipitante + soluzionetampone + H2O) in due pozzetti adiacenti della piastra di cristallizzazione seguendo lo schema indicatoin Tabella

Pipettare 2 μl di soluzione proteica nel ponticello presente al centro del pozzetto di cristallizzazioneAggiungere alla soluzione proteica 2 μl di soluzione di cristallizzazione (presa dal fondo delpozzetto) e mescolare La goccia finale avragrave quindi un volume di 4 μlSigillare il sistema goccia-pozzetto con il nastro adesivo trasparente per prevenire lrsquoevaporazionedella goccia e garantire il corretto raggiungimento dellrsquoequilibrio di vapore necessario per lacristallizzazione della proteinaMantenere le prove di cristallizzazione alla temperatura costante di 21 degC per alcune ore (minimo2) in condizioni di assoluta immobilitagraveLa formazione dei cristalli egrave monitorata mediante osservazione al microscopio ottico dopo 2 orePer raggiungere la loro dimensione massima i cristalli impiegheranno alcuni giorni Paragonandoi risultati ottenuti nelle due prove di cristallizzazione egrave possibile identificare la migliore condizionedi cristallizzazione della proteina

Pozzetto 1 Pozzetto 2

NaCl 20 200 μl

Tampone Na-acetato 3M pH 46 25 μl

H2O 275 μl

NaCl 225 μl


H2O 250 μl


NaCl 8tampone acetato pH 46 015 M


Si ottengono le seguenti condizioni di cristallizzazione


143

Reagenti utili

Elenco dei reagenti utili per le esperienze di laboratorio

In questo elenco troverete tutti i reagenti (in ordine alfabetico) che servono per le attivitagrave illustratenel libro Di alcuni reagenti segnaliamo anche la marca per evitare confusioni nellrsquoacquisto delprodotto

SOLUZIONI STOCK1

Ampicillina 1000X (100 mgml)Sciogliere 100 mg di ampicillina in polvere (usare i guanti) in 1 ml di acqua distillata e conservare a -20degC

ACIDO BORICO (H3BO3)ACIDO CLORIDRICO (HCl) 37ACIDO ETILENDIAMINOTETRACETICO (EDTA)ACIDO PARACUMARICO (C9H8O3)ACIDO TRICLOROACETICO (CCl3COOH)ACQUA OSSIGENATA (H2O2)AGARAGAROSIOAMMONIO ACETATO NH4(CH3COO)AMPICILLINAANTICORPI PRIMARI MONOCLONALI DI TOPO ANTI-RAD53ANTICORPI SECONDARI DI CAPRA ANTI TOPO CONIUGATI CON LAPEROSSIDASI DI RAFANOATPBLU DI BROMOFENOLOBLU DI COOMASSIE SAFETY (BIORAD)BSA 1 mgml (albumina di siero bovino)CLORURO DI MAGNESIO (MgCl2)CLORURO DI SODIO (NaCl)DIETIL PIROCARBONATO (DEPC)DIIDROGENOFOSFATO DI SODIO NaH2PO4

DIIDROGENOFOSFATO MONOSODICO (NaH2PO4)-2H2ODIMETILFORMAMMIDEDIMETILSULFOSSIDO (DMSO)DISODIO-EDTA DIIDRATO (Na2EDTA2H2O)DISODIOIDROGENO FOSFATO (Na2HPO4)-2H2ODITIOTREITOLO (DTT)DNAsidNTPs (10 mM ciascuno)ESTRATTO DI LIEVITOETANOLO ASSOLUTO (C2H5OH)ETIDIO BROMUROFENOLOCLOROFORMIOISOAMIL ALCOL (25241)FERRICIANIDE DI POTASSIO K3Fe(CN)6

FERRICIANIDE DI POTASSIO TRIIDRATO K4Fe(CN)63H2OGIEMSA (REAGENTE PER MICROSCOPIA CONTIENE ALCOL METILICOAZZURRO EOSINA BLU DI METILENE) codice Carlo Erba 45361301GLICEROLO (C3H5(OH)3)GLICINAIDROSSIDO DI SODIO (NaOH)IDROSSIFOSFATO DISODICO (Na2HPO4)-2H2OINTERCALANTE DEL DNA (SYBR SAFE)

IPOCLORITO DI SODIO (candeggina) 7ISOPROPANOLO (C3H7OH)ISOPROPIL szlig-D-TIOGALATTOPIRANOSIDE (IPTG)LATTE IN POLVERELIQUIDI DI SVILUPPO E FISSAGGIO PER LASTRE FOTOGRAFICHELISOZIMALUMINOLO (3-AMINOPHTHALYDRAZIDE)MARCATORE DI PESO MOLECOLARE PER DNA (negli esperimenti diquesto libro egrave stato usato pUC18 tagliato con HaeIII)

MARCATORE DI PESO MOLECOLARE PER PROTEINEMETANOLO (CH3OH)MONOIDROGENOFOSFATO DI SODIO (Na2HPO4)N-LAUROYL SARCOSINE o N-METIL-N-(1-OSSODODECIL)-GLICINA(C15H29NO3)Oligo-dT 50 μMPLASMIDE pUC19 DIGERITO CON EcoRIPROTEINASI KpUC19RNasi ARNaseOUT (inibitore RNasi) 40 UμLRT BUFFER 10xSACCAROSIO (C12H22O11)SODIO ACETATO 3M (pH 46)SODIO DODECILSOLFATO (SDS)SODIOMETABISOLFITO (Na2S2O5)SOLFATO DI SODIO (Na2SO4)SUPERSCRIPT II RT 200 U μl (trascrittasi inversa)T4 DNA ligasi

TAQ BUFFER 10χ con MgCl2

TAQ POLIMERASI 5 UμlTRIPTONETRIS (IDROSSIMETIL)AMINOMETANO (Tris)

TRITON χ100TWEEN 20 (POLIOSSIETILENSORBITAN MONOLAURATO)UREAX-GALX-GLUCXILENE CIANOLO



144

EDTA 05M pH 80

In 600 ml di acqua distillata sciogliere Na2EDTAmiddot2H2O (peso molecolare 3722) portare il pH a 8aggiungendo compresse di NaOH e controllando il pH con pH-metro o con cartine tornasole (fareattenzione ad aggiungere NaOH poco per volta percheacute la reazione egrave esotermica e NaOH egrave una basemolto forte) Portare a volume con acqua distillata sterilizzata in autoclave Autoclavare la soluzioneottenuta e conservare a temperatura ambiente

Ferricianide 100mMSciogliere 422 mg di K4Fe(CN)63H2O e 329 mg di K3Fe(CN)6 in 10 ml di acqua distillataConservare al buio a +4 degC

NaCl 5MSciogliere 2922 g di NaCl in 800 ml di acqua distillata quindi portare il volume a 1000 ml con acquadistillata Autoclavare e conservare a temperatura ambiente

NaCl 20 wvSciogliere 200 g di NaCl in 800 ml di acqua distillata quindi portare il volume a 1000 ml con acquadistillata Autoclavare e conservare a temperatura ambiente

NaOH 10MSciogliere 80 g di NaOH in 200 ml di acqua distillata Conservare a temperatura ambiente

RNasi A (10 mgml)Sciogliere lrsquoenzima in acqua distillata (10 mgml) Aliquotare e conservare a ndash20 degC

PBS 10times

Portare la soluzione a pH 74 con NaOH 10M usando il pH-metro o cartina tornasoleConservare la soluzione a temperatura ambiente

SDS 20Mettere 200 g di SDS in 900 ml di acqua distillata scaldare a +68 degC e sciogliere con un agitatore magnetico abassa velocitagrave Se necessario aggiustare il pH a 72 aggiungendo poche gocce di HCl controllando il pH conpH-metro o con cartine tornasole Portare il volume a 1000 ml Non autoclavare Conservare a temperaturaambiente

[ ] finale

Na2EDTA middot 2H2O 1861 g 05 M

NaOH compresse circa 20 g

[ ] finale

NaCl 5M 200 ml 1 M

NaH2PO4 ndash 2H2O 117 g 0075M

Na2HPO4 ndash 2H2O 5695 g 0320 M

Portare a 1000 ml con acqua distillata



145

Reagenti utili

[ ] finale

Tris-HCl 1M pH 76 2 ml 02 M

MgCl2 102 mg 50 mM

DTT 77 mg 50 mM

BSA 5 mg 500 μgml

ATP 28 mg 5 mM

[ ] finale

Tris 108 g 089 M

EDTA 05 M pH 80 40 ml 002 M

Acido Borico 55 g 089 M

[ ] finale

Tris 3030 g 025 M

Glicina 15014 g 2 M

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 80 ml


Fare aliquote da 50 μl da conservare a ndash20degC

Conservare a temperatura ambiente




Tampone di ligazione 10times

Tampone fosfato 100 mMPreparare 250 ml di soluzione A e 250 ml di soluzione B aventi le seguenti composizioni

soluzione A 2999 g di NaH- 2PO4 in 250 mL di acqua distillatasoluzione B 3549 g di Na- 2HPO4 in 250 mL di acqua distillata

Miscelarle fino a raggiungere pH 7 controllando il pH con pH-metro o con cartine tornasoleConservare a temperatura ambiente

TBE (Tris-borato-EDTA) 10X

Tris glicina 10times

Il pH deve essere 83-87 In caso fosse troppo alto aggiungere qualche grammo di glicinaConservare a temperatura ambiente

Tris-HCl 1M pH 68

Sciogliere in 700 ml di acqua distillata 12114 g di Tris portare a pH 68 aggiungendo HCl 37 (circa80 ml) controllandone il valore con pH-metro o con cartina tornasole portare a volume con acquadistillata e autoclavare Conservare a temperatura ambiente



146

Tris-HCl 1M pH 76


Tris-HCl 1M pH 80


Soluzioni utilizzate per gli esperimenti(in rosso tra parentesi il numero del capitolo di riferimento)

Ammonio acetato 5M [5]Sciogliere 335 g di ammonio acetato in 800 ml di acqua distillata portare al volume di 1 litro esterilizzare per filtrazione Lrsquoammonio acetato egrave utilizzato per lrsquoestrazione del DNA consente laprecipitazione del DNA in presenza di isopropanolo ed etanolo Questi alcoli impoveriscono lo stratodrsquoidratazione attorno agli acidi nucleici lasciando cosigrave esposte le cariche negative dei gruppi fosfato Sein soluzione ci sono cationi (come lo ione ammonio NH4

+) questi neutralizzano le cariche negativeinducendo aggregazione e precipitazione degli acidi nucleici

Colorante di caricamento per gel di agarosio (6times) [1 2 3 4 5 7]

Si utilizza per lrsquoelettroforesi di DNA su gel di agarosio Il glicerolo presente nel colorante di caricamentoserve a rendere piugrave densa la soluzione di DNA da caricare nel pozzetto e quindi a facilitare ladeposizione del campione nel pozzetto Il blu di bromofenolo e lo xilene di cianolo coloranti a caricanegativa migrano verso il polo positivo a diverse velocitagrave separandosi nella zona tra i due colorantimigrano la maggior parte dei frammenti di DNA Quando la banda del blu di bromofenolo (che migrapiugrave velocemente) si approssima alla fine del gel si puograve interrompere la corsa

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 60 ml

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 40 ml

[ ] finale

Blu di bromofenolo 25 mg 025

Xilene cianolo 25 mg 025

Glicerolo 3 ml 30 vv




Conservare a +4 degC


147

Reagenti utili

Colorante di caricamento per gel di proteine (2times) [8]

Si utilizza per il caricamento di campioni proteici durante SDS-PAGE Il Tris-HCl egrave un tamponeche mantiene il pH a 68 SDS e DTT denaturano le proteine il primo conferisce a tutte le proteinecariche negative cosiccheacute la loro migrazione saragrave influenzata solo dal peso molecolare il secondorompe i ponti disolfuro Il glicerolo appesantisce i campioni facilitandone il caricamento mentre ilblu di bromofenolo egrave un colorante di piccole dimensioni carico negativamente che migra verso il polopositivo piugrave velocemente delle proteine

Etanolo al 70 (vv) [4 5 7]In un cilindro graduato misurare 70 ml di etanolo assoluto quindi aggiungere acqua distillata fino a 100ml Lrsquoetanolo egrave usato per la precipitazione degli acidi nucleici

Extraction Buffer (EB) [5]

Questo tampone si utilizza per lrsquoestrazione di DNA il Tris-HCl mantiene il pH a 8 e interagisce coni lipopolisaccardi di membrana destabilizzandola insieme allrsquoEDTA che interagendo con gli ionibivalenti Ca e Mg inibisce anche possibili nucleasi Il sale NaCl dissocia il DNA dalle proteine dellacromatina Il sodiometabisolfito egrave un antiossidante che protegge il DNA da danni ossidativi

IPTG 01M (24 mgml) [4]Sciogliere 024 g di IPTG in 10ml di acqua distillata filtrare e mettere in una provetta falcon da 15ml Conservare a ndash20deg C IPTG (un analogo del lattosio) fa da induttore per lrsquooperone lac ossia silega al repressore consentendo la trascrizione del gene lacZ (β-galattosidasi)

[ ] finale

Tris-HCl 1M pH 68 125 ml 125 mM

SDS 20 2 ml 4 wv


Blu di bromofenolo 2 mg 02 wv

DTT 031 g 200 mM

[ ] finale

EDTA 05M pH 8 140 ml 70 mM


NaCl 5M 400 ml 2 M

Sodiometabisolfito 38 g 20 mM

DTT 031 g 200 mM



QUALCHE ESERCIZIOE SEMPLICI CALCOLI

Ricordarsi che

il peso molecolare egrave la somma-dei pesi atomiciil numero di moli corrisponde a peso-in grammipeso molecolarela molaritagrave (M) corrisponde-al numero di moli in un litrodi soluzione

Cosa significa fare una soluzione 1M

Vuol dire pesare una quantitagrave ingrammi di un prodotto pari al suo pesomolecolare e scioglierlo in un litro diacqua distillata

Ad esempio preparazione di un litro

di NaCl 1M

Si pesa una quantitagrave in grammi di NaClpari al suo peso molecolare (5844i pesi molecolari si trovano indicatisulle bottiglie dei reagenti) e si scioglieil prodotto in acqua distillata fino alvolume finale di 1 litro

Preparazione di un litro di NaCl 1 mM

Pesare 11000 di mole di NaCl cioegrave005844 g e scioglierlo in un litro diacqua distillata Alternativamentediluire 11000 una soluzione 1M

Come fare le diluizioni

Un paio di esempi

Diluizioni 110 mettere 1 ml di unasostanza in 9 ml di acqua distillata(volume finale 10 ml)Diluizioni 120 mettere 05 ml di unasostanza in 9 ml di acqua distillata(volume finale 10 ml)



148

LB = Lysogeny Broth [4]Mettere in un becker 800 ml di acqua distillata e mentre egrave in agitazione aggiungere le polveriLasciar sciogliere completamente e portare a volume Distribuire in bottiglie e autoclavareLB egrave un terreno di coltura i cui componenti estratto di lievito e peptidi ottenuti da digestione dicaseina con tripsina forniscono carboidrati aminoacidi nucleotidi sali e vitamine per la crescitabatterica Il sale NaCl serve per creare un ambiente isotonico

LB + ampicillina [4]Al terreno LB dopo autoclavatura e raffreddamento (almeno 50 degC) aggiungere ampicillina (usando iguanti) 100 μl di ampicillina 1000times in 100 ml di brodo sterile (100 μgml di ampicillina finale)Lrsquoaggiunta dellrsquoantibiotico ampicillina al terreno LB serve a selezionare la crescita dei soli batteri chepresentano il carattere di resistenza a questo antibiotico

LB + Agar + ampicillina [4]Preparare il terreno LB e addizionare 15 gl di agar prima di autoclavareLasciar raffreddare a circa 50 degC quindi aggiungere lrsquoampicillina (usando i guanti)100 μl di ampicillina 1000times in 100 ml di brodo sterile (100 μgml di ampicillina finale)Versare 1520 ml per piastra con 1 litro si ottengono circa 50 piastre Lasciar solidificare e riporre lepiastre a +4 degC capovolteLrsquoagar serve a rendere solido il terreno LB egrave un polisaccaride estratto da alcune alghe rosse si scioglienel terreno di coltura a temperatura superiore a 80 degC e gelifica sotto i 40 degC

Liquidi di sviluppo per la reazione Luminolo [8]Soluzione 1

Soluzione 2

Il luminolo sviluppa una chemioluminescenza bluastra in seguito a reazione con lrsquoossigeno che inquesto caso egrave prodotto dalla scissione di acqua ossigenata ad opera dellrsquoenzima perossidasi (legato

[ ] finale

Luminolo (44 mgml in DMSO) 2 ml

Acido paracumarico (15 mgml in DMSO) 08 ml


[ ] finale

H2O

2al 30 120 μl




Preparare aliquote da 2 ml di luminolo (44 mgml) in DMSO e conservare a ndash80 degCPreparare aliquote da 1 ml di acido paracumarico (15 mgml) in DMSO e conservare a ndash80 degC

Conservare la soluzione a +4 degC avvolta in carta stagnola

Conservare la soluzione +4 degC avvolta in carta stagnola

[ ] finale

Triptone 10 g 1 wv

Estratto di lievito 5 g 05 wv

NaCl 10 g 1 wv



149

Reagenti utili

allrsquoanticorpo secondario) La luce serve a impressionare una lastra fotografica individuando cosigrave laproteina ricercata

Lisozima 10 mgml [4]Sciogliere 100 mg di lisozima in 10 ml di acqua distillata sterilizzare mediante filtrazione econservare a ndash20 degC Si utilizza per lrsquoestrazione di DNA da batteri questo enzima causa la rotturadella parete batterica di peptidoglicano

Lisozima 40 mgml [11]Sciogliere 400 mg di lisozima in 10 ml di acqua distillata Conservare a ndash20 degC

Miscela di ligazione [4]

Si utilizza per trasformare batteri resi competenti Contiene i prodotti di ligazione del plasmidee del frammento di DNA esogeno tagliati con lo stesso enzima di restrizione si possono formareplasmidi ricombinanti plasmidi che si sono richiusi su se stessi frammenti di DNA legati fra loro

PBST 1times [8]Diluire 110 il PBS 10X e aggiungere 2 ml di Tween (concentrazione finale 02 vv)Questa soluzione si utilizza per il western bloting e per i successivi lavaggi della membranadi trasferimentoIl PBS egrave una soluzione isotonica tamponata Lrsquoaggiunta di Tween un detergente serve a ridurre i legamiaspecifici delle biomolecole a una superficie solida (membrana di trasferimento)

PBST + latte in polvere [8]Sciogliere 5 g di latte in polvere in 100 ml di PBST 1 times Conservare a +4 degC per non piugrave di tre giorniQuesta soluzione si utilizza per diluire gli anticorpi primari e secondari per lrsquoimmunorilevamentodi proteine Il PBS egrave una soluzione isotonica tamponata lrsquoaggiunta di Tween e di latte riduce laformazione di legami aspecifici

Proteinasi K [4]Sciogliere 20 mgml in acqua distillata aliquotare e conservare a ndash20 degC La proteinasi K digerisce leproteine e inattiva le nucleasi DNasi e RNasi Egrave un enzima comunemente utilizzato per lrsquoestrazione diacidi nucleici

[ ] finale

Plasmide pUC19 digerito con EcoRI 50 ng

DNA esogeno digerito con EcoRI 30 ng

Tampone di ligazione 10X 1 μl

T4 DNA ligasi 1 μl

Portare a 10 μl con acqua distillata

Incubare a +14 degC per una notte e conservare a ndash20 degC in provette da 15 ml



150

Soluzione A (per estrazione di DNA) [4]

Questa soluzione si usa per lrsquoestrazione di DNA Il saccarosio aiuta nella rottura delle cellulerichiamando acqua dallrsquointerno per osmosi il Triton egrave un detergente non carico che permeabilizza lemembrane e denatura le proteine dissolvendo le interazioni idrofobiche e i legami idrogeno aiuta aseparare gli acidi nucleici dalle proteine e inibisce le nucleasi LrsquoEDTA destabilizza le membrane

Soluzione di colorazione per saggio GUS [7]

Questa soluzione egrave usata per il saggio GUS X-Gluc fa da substrato per lrsquoenzima β-glucoronidasi (ilprodotto del gene GUS) X-Gluc egrave scisso dallrsquoenzima formando acido glucoronico e una molecola chedopo dimerizzazione forma un composto blu insolubile Il tampone fosfato mantiene il pH nel mezzodi reazione la ferricianide accelera la formazione del prodotto finale e ne previene lrsquoossidazione il TritonX-100 egrave un tensioattivo che permeabilizza le membrane e consente lrsquoingresso di X Gluc nelle cellule

Tampone high-salt [7]

Questo tampone egrave usato per lrsquoestrazione di RNA rompe le cellule e permette di estrarne ilcontenuto N-Lauroyl-Sarcosina egrave un detergente anionico usato per solubilizzare proteine elipoproteine di membrana ed egrave utilizzato per la lisi cellulare durante lrsquoestrazione di RNA Il Tris-HClmantiene il pH a 8 lrsquoEDTA destabilizza le membrane interagendo con gli ioni bivalenti di Ca++ e Mg++

[ ] finale

Tampone fosfato 100 mM 25 μl 50 mM

Ferricianide 100 mM 250 μl 05 mM

Triton X-100 50 μl 01 vv

X-Gluc in DMSO (25 mg in 500 μl) 500 μl 05 mgml

[ ] finale

urea 168 g 28 M

Na2SO4 50 g 035 M

Tris-HCl 1M pH8 200 ml 02 M

EDTA 05 M 16 ml 8 mM

N-Lauroyl-Sarcosina 10 g 37 mM



Una volta portato a volume filtrare e conservare a -20 degC

Il pH deve essere 8 Filtrare e conservare a +4 degC

[ ] finale

Saccarosio 80 g 8

EDTA 05M pH8 100 ml 50 mM

Tris-HCl 1M pH8 10 ml 10 mM

Triton X-100 467 ml 05 vv


In 700 ml di acqua distillata sciogliere il saccarosio aggiungere EDTA e Tris-HCl portare a volume eautoclavare dopo autoclavatura a soluzione fredda aggiungere Triton X-100 Conservare le bottiglie a +4 degC


151

Reagenti utili

[ ] finale

Tris glicina 10χ 100 ml 0025 M e 02 M

Metanolo 70 ml 7

[ ] finale


TrisHCl 1M pH 80 5 ml 10 mM

[ ] finale

Tris glicina 10χ 100 ml 0025 M e 02 M rispettivamente

SDS 20 5 ml 01




Tampone di corsa per SDS-PAGE (Tris glicina SDS) [8]

Questo tampone egrave utilizzato per lrsquoelettroforesi di proteine in condizioni denaturanti (SDS-PAGE)Il Tris mantiene stabile il pH a 8 gli ioni di glicina servono per il passaggio di corrente SDS (undetergente fortemente anionico) mantiene le proteine denaturate e cariche negativamente

Tampone di trasferimento (per western blotting) [8]

Il Tris mantiene stabile il pH a 8 gli ioni di glicina (punto isoelettrico = pH 606) servono per ilpassaggio di corrente Il metanolo serve a fissare le proteine sulla membrana di trasferimento

TBE 1X [1 2 3 4 5 7]Diluire 110 la soluzione di TBE 10timesIl TBE 1times si usa come tampone di corsa per lrsquoelettroforesi su gel di agarosio e per preparare il gelstesso Il Tris mantiene stabile il pH a 8 Na2EDTAmiddot2H2O egrave un chelante degli ioni Ca++ Mg++ Zn++ einibisce le nucleasi che richiedono cationi bivalenti per funzionare per cui il DNA non egrave degradatolrsquoacido borico fornisce lrsquoappropriata forza ionica al tampone

TE [4]

Si utilizza nellrsquoestrazione di acidi nucleici li solubilizza e li protegge dalla degradazione

TE + RNasi A (50 μgml) [4]Addizionare 50 μl RNasi A (10 mgml) in 10 ml di TELrsquoenzima RNAsi A degrada le molecole di RNA in questo modo nella soluzione di TE contenentegli acidi nucleici estratti egrave possibile isolare il solo DNA

X-Gal (40 mgml) [4]Sciogliere 04 g di X-Gal in 10 ml di dimetilformamide (lavorare sotto cappa) e mettere in unaprovetta da 15 ml (usare vetro o polipropilene) avvolgerla in carta drsquoalluminio per mantenerla albuio e conservare a ndash20 degCX-Gal fa da substrato per la β-galattosidasi una volta scisso dallrsquoenzima in seguito a dimerizzazioneforma un precipitato blu




Fare unrsquoesperienza di laboratorio durante il percorso scolastico puograve essere unrsquooccasione indimenticabile che perograve in molti casi egrave accessibile solo a un numero limitato di studentiLe dodici esperienze contenute in questo libro offrono la possibilitagrave di conoscere e di provare le metodologie e le tecniche della ricerca scientifica in campi quali la genetica la biologia molecolare e la bioinformatica Partendo da uno scenario reale gli studenti sono posti di fronte a un problema e stimolati a cercare una soluzione allestendo un esperimento per poi discutere criticamente i risultati applicando il metodo scientifico proprio come si fa in un vero laboratorio di ricerca

Queste esperienze sono proposte dal CusMiBio (Centro Universitagrave ndash Scuola per la diffusione delle Bioscienze e delle Biotecnologie) che ha sviluppato presso lrsquoUniversitagrave degli Studi di Milano un progetto di collegamento tra ricerca e scuola per rispondere alle esigenze di aggiornamento su bioscienze e biotecnologie

Nel libro

Chi egrave il colpevole Determinazione del laquoprofilo del DNAraquo per stabilire lrsquoidentitagrave personale a livello molecolare e identificare lrsquoautore di un reatoChe cosrsquoegrave un organismo geneticamente modificato (OGM) Come si puograve evidenziare la presenza di un transgene in un organismo vegetaleSano o malato I polimorfismi di restrizione del DNA per la diagnosi di alcune malattie geneticheClonaggio del DNA bianco o blu Come trasformare un batterio con un plasmide laquoricombinanteraquo che contiene un tratto di DNA esogeno lrsquoingegneria genetica come strumento della ricerca e le sue applicazioni biomediche Le analisi cromosomiche Per conoscere le metodologie usate in citogenetica umana per lo studio dei cromosomi e imparare a riconoscere e interpretare cariotipi normali e patologici

Su httpaulascienzescuolazanichelliit trovi video e interviste a scienziati e ricercatori

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le rubriche degli esperti di matematica fisica e chimica per rispondere alle tue domande



















SCIENZE




Sano o malato








Le forme invisibili


APPENDICE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1

9

19

29

37

47

55

63

75

85

93

103

113

INDICE





Presentazione
















Presentazione



Esercitazione n 1

1






Esercitazione n 1





2




DNA extragenico70

DNA genico30

DNA codificante2







sparse

DNAsatellite

DNAminisatellite

DNAmicrosatellite

Figura 11


Figura 12


Figura 13








nei vari cromosomi)




Esercitazione n 1

3



Figura 16


Figura 14






Figura 15



Allele 1


Allele 2


Allele 3

TPOX

D358358

D358358

D5S818

CSF1P0FGA

D75820

D851179TH01

VWA

D135317

D165539 D18531D21511

AMEL

AMEL

1 111098765432 12

14 X232221201918171615 Y



4



Figura 17


LOCUS ALLELE

(Ndeg ripetizioni)

FREQUENZA

NELLA POPOLAZIONE

FREQUENZA

COMBINATA

CSF1PO

TPOX

vWA

D5S818

1(7)

2(7)

3(11)

4(9)

1 su 25 (0040)

1 su 100 (0010)

1 su 320 (00031)

1 su 75 (00133)

allele 1x2 = 1 su 2 500

allele 1x2x3 = 1 su 800 000

allele 1x2x3x4 = 1 su 60 000 000

TABELLA 11

Figura 18



QUALI SONO LE

CARATTERISTICHE CHE




PERSONALE




Domande e risposte

Individuo A



Individuo B




6

5

4

3

2

7

1

-

+


Esercitazione n 1

5




Figura 110


Figura 19


Sindrome tripletta

ripetuta

ndeg di ripetizioni

normali

ndeg di ripetizioni

nella malattia

X Fragile

Corea di Huntington

Distrofia miotonica

CGG

CAG

CTG

da 5 a 52

da 6 a 37

da 5 a 37

da 35 a 121

da 50 a 72 000


Numero

OMIM

da 230 a 72 000

143100

160900

309550

localizzazione

del gene

Cr X

Cr 4

Cr 19



TPOX

VWA





D5S 818

110 pb

80 pb

65 pb

75 pb

55 pb

70 pb



6







Figura 111


34 57

37

46 77

37 77 3736 77 67 36

67

allele 7

allele 6

allele 5

allele 4

allele 3



Esercitazione n 1

7



Figura 113


Figura 112







Capillare

Fluorescenza

LASER(488 nm)





8


I sospettati sono















Figura 114


2=SCPM 1=V S1 CS3S2


Esercitazione n 2

9









Figura 21




10






Figura 23



Figura 22



Bacillus

thuringiensis


Esercitazione n 2

11








GRANO DURO SEGALE

TRITICALE

Figura 24


Figura 25



ampr

poly

linke

r

ori



12







Figura 26


Figura 27



Esercitazione n 2

13



Figura 28


T-DNA



cellulatrasformata




Figura 29





14





Figura 210



T-DNA

Plasmide Ti


Genidi ormoni

Genidelle opine

T-DNA

Plasmide Ti


Geninuovi











Geni virori

tet rAmpr

TransgeneP

regione T-DNA

Geni virori

Geni virori

tet r

Ampr

Tabella 21


Esercitazione n 2

15









Figura 211





16








Figura 212


(+)


egrave DNA di mais

(+)

egrave OGM(-)

non egrave OGM

PCR PCR

Genedel cloroplasto

primer

Geneper la zeina

primer


primer

PCR


Esercitazione n 2

17







Le fragole antigelo








18





Figura 213


2PM 1 3 654

587

458434

298

267

236

174

10280


Esercitazione n 3

19

3 Sanoo malato









Figura 31




20



Figura 32


Figura 33


maschio

morte


femmina



matrimonio




individui affetti





3 2

probando

1 2

1 2 3 54

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

I

II

III

IV

V


Esercitazione n 3

21












1

I

II

III

IV

2

1 2 3 4

12 13 14 15

5 6

7 8 9 10 11

I

II

III

1 2

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2

1 2 3 4

1 2

1 2 3 4 5 6

3 4 5 8

6

7

5

6

I

II

III

IV




22



1 2

1 2 3 4 5

1 2

3

6

21

I

II

III

IV

1 2

1 2 3 4 5

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2 3 4 5 6 7 8

I

II

III

IV





Esercitazione n 3

23












Alfa 141800Beta 141900







Tabella 31




















M Met METIONINA

Tabella 32





24

Tabella 33










Pleiotropia



Figura 34


Figura 35


Figura 36











Esercitazione n 3

25




Figura 38


Figura 37


Figura 39



EcoRI

5rsquo3rsquo


150 bp350 bp

5rsquo3rsquo


500 bp

12 12

11 22

1 42 3

primer


primer


MstII

5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo

6 75Codoni


5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo

1 2 3

szligSszligS

malatoszligAszligA

sanoszligAszligS

sano

mutazione


376 bp

201 bp

175 bp

szligA

szligS



26


Figura 310









Figura 311


376 pb szligS

175+201 pb szligA

+- -Y

+-

-Y

-Y

--I

II

III -Y-Y-Y-- --+-+Y+Y

31 2 4

--Ref ++ +-

10 kb

7 kb

3 kb

2 kb

07 kb

1

1

1 2 3 4 5 6 7 8

2 3 4



Esercitazione n 3

27










Terapia


di midollo osseo




Figura 312



1 2

1 2 3 4

1

1 3 42

2

6

I

II

III

IV



28








Amniocentesi


Villocentesi


Funicolocentesi



Figura 313


Figura 314


Figura 315




2PM 1 3 654 7


587

458434

298267236

174

10280


Esercitazione n 4

29









30







DNAsuperavvolte

a) b)



ori

ampR

lacZ+

pUC19(2686 kb)

EcoRI KpnI

Sacl Xmal

Smal

Xbal


BspMI SphI

BamHl

Sal I

Hinc II

Accll PstI Hind III












Figura 41





Figura 42


Figura 43




Esercitazione n 4

31












32



_ _

__

_

_ _

_ _

_

_

_ _ _ _ _

__

_

_ _ _ _ _

_ _ _


DNA

fosfolipidi

esterno

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++ Ca++

Ca++ Ca++

Ca++

Ca++

Figura 44



Esercitazione n 4

33






OD

60

0

tempo (ore)

001

0 81 2 3 4 5 6 7

01

1

10








Dopo poche oredi








con 108-109 batteri



con batteri





Figura 45


Figura 46


Figura 47


Figura 48




34





DNA

mRNAmRNA 5rsquo


5rsquo

3rsquo


RNA polimerasi

gene regolatore


operone lac

RNApolimerasi

non si forma mRNA


mRNA5rsquo

3rsquo

DNAlaci lacZ



Figura 49


Figura 410



Esercitazione n 4

35










Plasmide pUC19









Frammenti di DNA



3rsquo

3rsquo 3rsquo

3rsquo

5rsquo5rsquo

3rsquo

ampRampR

lacZ

ampR

5rsquo

5rsquo 5rsquo

Figura 411




miscela diligazione



crescitacolonie

+ + -




36








10 0008 0006 0005 000

4 000

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

750

500

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 PMLa

dder

10 000 pb8 000 pb6 000 pb5 000 pb4 000 pb

3 000 pb

2 000 pb

1 500 pb

1 000 pb

500 pb

Figura 412


Fig 413



Esercitazione n 5

37










Figura 51



A a A a A a

B b B bB b

cis trans



38


Figura 52



marcatoridel DNA

Figura 53


AG AG AG AG

(AG)4

AG AG AG AG

(AG)4


AG AG AG

(AG)3

AG AG AG AG

(AG)4


PRC



Esercitazione n 5

39



Figura 54


Figura 55

Un campo di mais

Mm1 Mm2 Mm3 Mm4

a b c d



Geni di interesse



40



pericarpio scutello

coleottile

plumula

ipocotile

radichetta

coleoriza

aleurone

endosperma

embr

ione

Figura 56


Figura 58


Figura 57


coleottile

prima foglia


a)

b)


Esercitazione n 5

41





Figura 59


Figura 510


Figura 511


HO O

OHO

OH

RR

Rr

rr



42




Figura 512





Figura 513



Cr10





Esercitazione n 5

43







Figura 514


Popolazione F2

Figura 516


Figura 515


RR

genotipo fenotipo

Rr

rr

Rr

R r

RRR Rr

Rrr rr

R

bnlg1028b

r

bnlg1028a

R

bnlg1028b

r

bnlg1028a

r

bnlg1028a

r

bnlg1028a

R

bnlg1028b

R

bnlg1028b


RR Rr rr

RR Rr rr



44





Nel nostro casoχ2 = 1645 + 4990 + 945=035 + 054 +020 = 109



Tabella 51



RR 41 45

Rr 97 90

rr 42 45

Totale 180 180

χ2 = Σ(o-a)2

a


Esercitazione n 5

45




Tabella 52


Figura 517


df 095 090 070 050 030 020 010 005 001 0001

1 0004 0016 015 046 107 164 271 384 664 1083

2 010 021 071 139 241 322 461 599 921 1382

3 035 058 142 237 367 464 625 782 1135 1627

4 071 106 220 336 488 599 778 949 1328 1847

5 115 161 300 435 606 729 924 1107 1509 2052

6 164 220 383 535 723 856 1065 1259 1681 2246

7 217 283 467 635 838 980 1202 1407 1848 2432

8 273 349 553 734 952 1103 1336 1551 2009 2613

9 333 417 639 834 1066 1224 1468 1692 2167 2788

10 394 487 727 934 1178 1344 1599 1831 2321 2959

accettare

a livello di 005

rifiutare

Probabilitagrave= p


2PM 1 3 4



46


Esercitazione n 6

47






a) b)

p

c c

q

c)






Figura 61


centromero)



48








1

6

13

19 20 21 22F G

X Y

14D

15 16 17E

18

7 8 9C

10 11 12

2A B

3 4 5

Figura 62


Figura 63



Esercitazione n 6

49








Figura 64


a) b)



50






Monoploide(n)

Triploide(3n)

Tetraploide(4n)

Diploide(2n)

1 2 3

n nn

n n2n

a) c)b)

2n


Figura 65


Figura 66

Cariotipo triploide

Figura 67


1

6

13

19 20 21 22 23

1314 15 16 17 18

67 8 9 10 11 12

2 3 4 5


Esercitazione n 6

51






Figura 69


NON DISGIUNZIONE

NON DISGIUNZIONE

GAMETI

NUMERO DI CROMOSOMI

n+1 n+1 n-1 n+1 n nn-1n-1

MEIOSI I

MEIOSI II

Tabella 61


Figura 68








47 XYY48 XXYY



MONOSOMIE POLISOMIE




52





EDCBA

EDCBA

ONML

ONMA

EDCBL

E

D

D

C

B

A

FEDCBA

F

EDCBA


Delezione

EDCBA

ED

BCA

Inversione


Figura 610






Figura 611


a)

c)

b)

d)


Esercitazione n 6

53
















Figura 612




54




Esercitazione n 7

55





Trascrizione

Gene X






Figura 71




56






PLASMIDE


ori

P

marker

R

Figura 72


Tabella 71









Figura 73



Esercitazione n 7

57

Luciferasi

HO S

S

N

N

COOH

Luce gialla

LuciferinaATP Mg++


2

HO S

S

N

N

OH




Figura 74


Figura 75


Luce blu o UV


e-Livello eccitato

Luce verde



58




Figura 76


Figura 78





Figura 77


HO


Celenteramide

O O

OH

CO2

NN

N HON

NNH

H

OH

O2

Luce blu


+

acidoglucuronico




Br BrCl Cl OH

BrCl

Br

ClONH

0

NH

acidoglucuronico

O-

+

NH

NH


Esercitazione n 7

59












Figura 79




60






Figura 711


Figura 710



Esercitazione n 7

61









PLASMIDE


ori

P

marker

gus

Figura 713


Figura 712




62





GUS

C

+Cd C +Cd

16S


Figura 716


Figura 714


Figura 715



C +Cd C +Cd


GUS

16S

a) b)


Esercitazione n 8

63







Figura 81


a)

b)

c)



64





Fibroblasti

Fegato

5rsquo 3rsquo


+

-

-

-

Figura 82



Esercitazione n 8

65


Muscolo striato 1

Muscolo striato 2

Muscolo liscio

Mioblasto

Fibroblasto

Epatocito

Neuroblasto

Figura 83





Figura 84




66

Proteasoma








Figura 85


Figura 86



Esercitazione n 8

67


Figura 87










68












Tabella 81



Esercitazione n 8

69







pozzetti

running gel

stacking gel

Figura 88




70







Figura 89


1 2 3 4 5 6 7 8


Esercitazione n 8

71










Antigeni


Figura 810


a)

b)


antigene




catena pesante

dominio VH

dominio VL

5 nm

legame disolfuro

catenaleggera



Figura 811





72


correnteelettrica



SVILUPPO



Figura 812








Esercitazione n 8

73







Figura 813


P M 1 2

a)Coomassie

245 KDa180 KDa

135 KDa

100 KDa

75 KDa

b)western blotting

c)Ponceau

P M 1 2 P M 1 2



74


Esercitazione n 9

75











Figura 91




76


1

WHOLE GENOME

14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y MT

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Figura 92


Figura 93




Esercitazione n 9

77



Figura 94


Figura 95







78



Figura 98


Figura 97


Figura 96




Esercitazione n 9

79



Figura 99

Riquadro 2

Riquadro 3

Riquadro 1



80

Figura 910

Figura 911




Esercitazione n 9

81



Figura 912



82







popolazionefinale

collo di bottiglia


Figura 913


Tabella 91


Tabella 92


MALATTIA SINTOMI





MALATTIA SINTOMI






Esercitazione n 9

83









84


Esercitazione n 10

85













86





dNTP ddNTP

Mancagruppo OH

P

PP

CH2 0

5rsquo

3rsquo

Base

OH

P

PP

CH2 0

5rsquo

3rsquo

Base

H

Primer3rsquo



Migrazionedel DNA

Rivelatore Laser



Raggio laser


Denaturazione


T

T

A

C

C

G

G

G

G

A

T

T


2 0 3 0 4 0

Figura 101


Figura 102






Esercitazione n 10

87






16S rRNA









Figura 103




88








batterio




Figura 104


Figura 105

Il CBOL nel mondo


Esercitazione n 10

89

Figura 107



Figura 106





90




ithomeindexhtml


Figura 108



Figura 109


Esercitazione n 10

91






Figura 1010

Figura 1011

Figura 1012



92


Esercitazione n 11

93











Figura 111




94




Fonte di raggi x

10000 - 40000volts


concentra i raggi x

Cristallo

Lastra fotografica


Figura 112


HC

HC CH

HC CH

CH2

CH2

C

O O-

CH2

CH2

C

O O-

C


Fenilalanina

Figura 113



Esercitazione n 11

95

Figura 114











Domande e risposte



96

Figura 115







peptidoglicano

membranaplasmatica

acidoteicoico

pentaglicina

proteine dimembrana

fosfolipidi

citoplasma


Esercitazione n 11

97





Figura 117

Figura 116




Tabella 111


U C A G

U

UUUPheF

UUC

UUALeuL

UUG

UCU

UCCSerS

UCA

UCG

UAUTyrY

UAC

UAA STOP

UAG STOP

UGUCysC

UGC

UGA STOP

UGG TrpW

U

C

A

G

C

CUU

CUCLeuL

CUA

CUG

CCU

CCCProP

CCA

CCG

CAUHisH

CAC

CAAGlnQ

CAG

CGU

CGCArgR

CGA

CGG

U

C

A

G

A

CUU

CUC IleI

AUA

AUG MetM

ACU

ACCThrT

ACA

ACG

AAUAsnN

AAC

AAALysK

AAG

AGUSerS

AGC

AGAArgR

AGG

U

C

A

G

G

GUU

GUCValV

GUA

GUG

GCU

GCCAlaA

GCA

GCG

GAUAspD

GAC

GAAGluE

GAG

GGU

GGCGylG

GGA

GGG

U

C

A

G

first

posi

tion

second position

thirdposition







98






Figura 118

Figura 119


Esercitazione n 11

99








BLAST (Basic Local



Figura 1110

Figura 1111



100









Figura 1112



Esercitazione n 11

101











Figura 1113




102













Figura 1114


Fig 1115



Esercitazione n 12

103













104








Figura 121


Figura 122



Esercitazione n 12

105
















ray



chiphtml


Figura 123




106







Figura 124


Figura 125


A B C D E F G H I L

1

2

3

4

5

6

A B C D E F G H I L


Esercitazione n 12

107



Figura 126



spot giallo)

Figura 127



A B C D E F G H I L

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

A B C D E F G H I L

6




108




Figura 129


Figura 128


2

1

3

4

5

6

A B C D E F G H I L

7

A B C D E F G H I L


Esercitazione n 12

109



NOME

DEL GENE


LrsquoESPRESSIONE


O RIDOTTA NELLE

CELLULE TUMORALI

SPIEGAZIONE

DELLA

PREVISIONE




A4



B2


B3







paziente X

paziente Y

A B C

1

2

3

4

A B C

1

2

3

4

A B C

1

2

3

4

paziente Z





Tabella 121



110






Tabella 122


a) b)


+4 +3 +2 +1 0 0 -1 -2 -3 -4

Figura 1210


A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

a) b)


Esercitazione n 12

111

(+1) ( 0) (-2) (-1) (+2) ( 0) (-2) (-2)

(+3) (-2) (-1) (-3) (+3) (-2) (+2) (-3)

(+4) (-1) (-2) (-3) (+4) (-1) (-2) (+3)

(+3) (-3) (-4) (+1) (+3) (-3) (-4) (+1)

( 0) (+2) (+4) ( 0) (+4) (+2) (+4) ( 0)


-1

-2

-3

-4

-5

1

2

3

4

5





Figura 1211

Figura 1212


Tabella 123

A

A A

B

B B

C

C C

D

D D

E

E E

F

F F

G

G G

H

H H

I

I I

J

J J

K

K K

L

L L

M

M M

N

N N

O

O O

P

P P

Q

Q Q

R

R R

S

S S

T

T T

4

3

2

1

0

-1

-2

-3

-4




112


APPENDICE


114


115

Norme generali








116






Protocolli 1 2 3

117







TBE 1χ1





118





CHI Egrave IL

COLPEVOLE

PM(Peso molecolare)

V(vittima)

SC(scena crimine)

S1(sospettato 1)

S2(sospettato 2)

S3(sospettato 3)

Biancodi PCR

IDENTIFICAZIONE

DI UN OGM

1(cloroplasto)

2(zeina)

3(campione)

4(controllo +)

5(controllo -)


2(individuo III2)

3(individuo IV1)

4(individuo IV2)

5(individuo IV3)

6(individuo IV4)


Protocolli 1 2 3

119




120


121

Protocollo 4












122
















123

Protocollo 4









124












125

Protocollo 4





126


127

Protocollo 5










Figura 2


Figura 1


χ2 = (o-a)2

a



128








129

Protocollo 6











Tdeg T´







32 cicli





130


Protocolli 1 2 3

131












132




21 22


21 22 Y


21 22


21 22 Y


21 22 Y


21 22 Y


21 22


133

Protocollo 7







134





NH4NO3 2061 mM

CaCl2 299 mM

MgSO4 150 μM

KNO3 1879 mM

KH2PO4 125 mM

H3BO3 100 μM

Na2-EDTA 100 μM

MnCl2 100 μM

ZnCl2 2991 μM

Fe2(CH4O6)3 184 μM

CoCl2 0110 μM

CuCl2 0100 μM

(NH4)6Mo7O24 1030 μM

KI 5 μM

saccarosio 10 g l-1

agar 8 g l-1


135

Protocollo 8










136




















Protocolli 1 2 3

137











138












PM + + +Solo

colorantePM + - +



139

Protocollo 8











140


141

Protocollo 11







Figura 111


a) b)



H2O H

2O


PROTEINA



142




NaCl 20 200 μl


H2O 275 μl

NaCl 225 μl


H2O 250 μl






143

Reagenti utili



SOLUZIONI STOCK1












144

EDTA 05M pH 80







PBS 10times



[ ] finale



[ ] finale

NaCl 5M 200 ml 1 M






145

Reagenti utili

[ ] finale


MgCl2 102 mg 50 mM

DTT 77 mg 50 mM

BSA 5 mg 500 μgml

ATP 28 mg 5 mM

[ ] finale

Tris 108 g 089 M

EDTA 05 M pH 80 40 ml 002 M


[ ] finale

Tris 3030 g 025 M

Glicina 15014 g 2 M

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 80 ml














Tris-HCl 1M pH 68




146

Tris-HCl 1M pH 76


Tris-HCl 1M pH 80







[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 60 ml

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 40 ml

[ ] finale









147

Reagenti utili







[ ] finale


SDS 20 2 ml 4 wv



DTT 031 g 200 mM

[ ] finale



NaCl 5M 400 ml 2 M


DTT 031 g 200 mM




Ricordarsi che





di NaCl 1M





Un paio di esempi




148





Soluzione 2


[ ] finale




[ ] finale

H2O

2al 30 120 μl







[ ] finale

Triptone 10 g 1 wv


NaCl 10 g 1 wv



149

Reagenti utili









[ ] finale




T4 DNA ligasi 1 μl





150







[ ] finale





[ ] finale

urea 168 g 28 M

Na2SO4 50 g 035 M








[ ] finale

Saccarosio 80 g 8







151

Reagenti utili

[ ] finale


Metanolo 70 ml 7

[ ] finale



[ ] finale


SDS 20 5 ml 01









TE [4]









Nel libro








Sano o malato








Le forme invisibili


APPENDICE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1

9

19

29

37

47

55

63

75

85

93

103

113

INDICE





Presentazione
















Presentazione



Esercitazione n 1

1






Esercitazione n 1





2




DNA extragenico70

DNA genico30

DNA codificante2







sparse

DNAsatellite

DNAminisatellite

DNAmicrosatellite

Figura 11


Figura 12


Figura 13








nei vari cromosomi)




Esercitazione n 1

3



Figura 16


Figura 14






Figura 15



Allele 1


Allele 2


Allele 3

TPOX

D358358

D358358

D5S818

CSF1P0FGA

D75820

D851179TH01

VWA

D135317

D165539 D18531D21511

AMEL

AMEL

1 111098765432 12

14 X232221201918171615 Y



4



Figura 17


LOCUS ALLELE

(Ndeg ripetizioni)

FREQUENZA

NELLA POPOLAZIONE

FREQUENZA

COMBINATA

CSF1PO

TPOX

vWA

D5S818

1(7)

2(7)

3(11)

4(9)

1 su 25 (0040)

1 su 100 (0010)

1 su 320 (00031)

1 su 75 (00133)

allele 1x2 = 1 su 2 500

allele 1x2x3 = 1 su 800 000

allele 1x2x3x4 = 1 su 60 000 000

TABELLA 11

Figura 18



QUALI SONO LE

CARATTERISTICHE CHE




PERSONALE




Domande e risposte

Individuo A



Individuo B




6

5

4

3

2

7

1

-

+


Esercitazione n 1

5




Figura 110


Figura 19


Sindrome tripletta

ripetuta

ndeg di ripetizioni

normali

ndeg di ripetizioni

nella malattia

X Fragile

Corea di Huntington

Distrofia miotonica

CGG

CAG

CTG

da 5 a 52

da 6 a 37

da 5 a 37

da 35 a 121

da 50 a 72 000


Numero

OMIM

da 230 a 72 000

143100

160900

309550

localizzazione

del gene

Cr X

Cr 4

Cr 19



TPOX

VWA





D5S 818

110 pb

80 pb

65 pb

75 pb

55 pb

70 pb



6







Figura 111


34 57

37

46 77

37 77 3736 77 67 36

67

allele 7

allele 6

allele 5

allele 4

allele 3



Esercitazione n 1

7



Figura 113


Figura 112







Capillare

Fluorescenza

LASER(488 nm)





8


I sospettati sono















Figura 114


2=SCPM 1=V S1 CS3S2


Esercitazione n 2

9









Figura 21




10






Figura 23



Figura 22



Bacillus

thuringiensis


Esercitazione n 2

11








GRANO DURO SEGALE

TRITICALE

Figura 24


Figura 25



ampr

poly

linke

r

ori



12







Figura 26


Figura 27



Esercitazione n 2

13



Figura 28


T-DNA



cellulatrasformata




Figura 29





14





Figura 210



T-DNA

Plasmide Ti


Genidi ormoni

Genidelle opine

T-DNA

Plasmide Ti


Geninuovi











Geni virori

tet rAmpr

TransgeneP

regione T-DNA

Geni virori

Geni virori

tet r

Ampr

Tabella 21


Esercitazione n 2

15









Figura 211





16








Figura 212


(+)


egrave DNA di mais

(+)

egrave OGM(-)

non egrave OGM

PCR PCR

Genedel cloroplasto

primer

Geneper la zeina

primer


primer

PCR


Esercitazione n 2

17







Le fragole antigelo








18





Figura 213


2PM 1 3 654

587

458434

298

267

236

174

10280


Esercitazione n 3

19

3 Sanoo malato









Figura 31




20



Figura 32


Figura 33


maschio

morte


femmina



matrimonio




individui affetti





3 2

probando

1 2

1 2 3 54

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

I

II

III

IV

V


Esercitazione n 3

21












1

I

II

III

IV

2

1 2 3 4

12 13 14 15

5 6

7 8 9 10 11

I

II

III

1 2

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2

1 2 3 4

1 2

1 2 3 4 5 6

3 4 5 8

6

7

5

6

I

II

III

IV




22



1 2

1 2 3 4 5

1 2

3

6

21

I

II

III

IV

1 2

1 2 3 4 5

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2 3 4 5 6 7 8

I

II

III

IV





Esercitazione n 3

23












Alfa 141800Beta 141900







Tabella 31




















M Met METIONINA

Tabella 32





24

Tabella 33










Pleiotropia



Figura 34


Figura 35


Figura 36











Esercitazione n 3

25




Figura 38


Figura 37


Figura 39



EcoRI

5rsquo3rsquo


150 bp350 bp

5rsquo3rsquo


500 bp

12 12

11 22

1 42 3

primer


primer


MstII

5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo

6 75Codoni


5rsquo3rsquo

3rsquo5rsquo

1 2 3

szligSszligS

malatoszligAszligA

sanoszligAszligS

sano

mutazione


376 bp

201 bp

175 bp

szligA

szligS



26


Figura 310









Figura 311


376 pb szligS

175+201 pb szligA

+- -Y

+-

-Y

-Y

--I

II

III -Y-Y-Y-- --+-+Y+Y

31 2 4

--Ref ++ +-

10 kb

7 kb

3 kb

2 kb

07 kb

1

1

1 2 3 4 5 6 7 8

2 3 4



Esercitazione n 3

27










Terapia


di midollo osseo




Figura 312



1 2

1 2 3 4

1

1 3 42

2

6

I

II

III

IV



28








Amniocentesi


Villocentesi


Funicolocentesi



Figura 313


Figura 314


Figura 315




2PM 1 3 654 7


587

458434

298267236

174

10280


Esercitazione n 4

29









30







DNAsuperavvolte

a) b)



ori

ampR

lacZ+

pUC19(2686 kb)

EcoRI KpnI

Sacl Xmal

Smal

Xbal


BspMI SphI

BamHl

Sal I

Hinc II

Accll PstI Hind III












Figura 41





Figura 42


Figura 43




Esercitazione n 4

31












32



_ _

__

_

_ _

_ _

_

_

_ _ _ _ _

__

_

_ _ _ _ _

_ _ _


DNA

fosfolipidi

esterno

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++

Ca++ Ca++

Ca++ Ca++

Ca++

Ca++

Figura 44



Esercitazione n 4

33






OD

60

0

tempo (ore)

001

0 81 2 3 4 5 6 7

01

1

10








Dopo poche oredi








con 108-109 batteri



con batteri





Figura 45


Figura 46


Figura 47


Figura 48




34





DNA

mRNAmRNA 5rsquo


5rsquo

3rsquo


RNA polimerasi

gene regolatore


operone lac

RNApolimerasi

non si forma mRNA


mRNA5rsquo

3rsquo

DNAlaci lacZ



Figura 49


Figura 410



Esercitazione n 4

35










Plasmide pUC19









Frammenti di DNA



3rsquo

3rsquo 3rsquo

3rsquo

5rsquo5rsquo

3rsquo

ampRampR

lacZ

ampR

5rsquo

5rsquo 5rsquo

Figura 411




miscela diligazione



crescitacolonie

+ + -




36








10 0008 0006 0005 000

4 000

3 000

2 500

2 000

1 500

1 000

750

500

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 PMLa

dder

10 000 pb8 000 pb6 000 pb5 000 pb4 000 pb

3 000 pb

2 000 pb

1 500 pb

1 000 pb

500 pb

Figura 412


Fig 413



Esercitazione n 5

37










Figura 51



A a A a A a

B b B bB b

cis trans



38


Figura 52



marcatoridel DNA

Figura 53


AG AG AG AG

(AG)4

AG AG AG AG

(AG)4


AG AG AG

(AG)3

AG AG AG AG

(AG)4


PRC



Esercitazione n 5

39



Figura 54


Figura 55

Un campo di mais

Mm1 Mm2 Mm3 Mm4

a b c d



Geni di interesse



40



pericarpio scutello

coleottile

plumula

ipocotile

radichetta

coleoriza

aleurone

endosperma

embr

ione

Figura 56


Figura 58


Figura 57


coleottile

prima foglia


a)

b)


Esercitazione n 5

41





Figura 59


Figura 510


Figura 511


HO O

OHO

OH

RR

Rr

rr



42




Figura 512





Figura 513



Cr10





Esercitazione n 5

43







Figura 514


Popolazione F2

Figura 516


Figura 515


RR

genotipo fenotipo

Rr

rr

Rr

R r

RRR Rr

Rrr rr

R

bnlg1028b

r

bnlg1028a

R

bnlg1028b

r

bnlg1028a

r

bnlg1028a

r

bnlg1028a

R

bnlg1028b

R

bnlg1028b


RR Rr rr

RR Rr rr



44





Nel nostro casoχ2 = 1645 + 4990 + 945=035 + 054 +020 = 109



Tabella 51



RR 41 45

Rr 97 90

rr 42 45

Totale 180 180

χ2 = Σ(o-a)2

a


Esercitazione n 5

45




Tabella 52


Figura 517


df 095 090 070 050 030 020 010 005 001 0001

1 0004 0016 015 046 107 164 271 384 664 1083

2 010 021 071 139 241 322 461 599 921 1382

3 035 058 142 237 367 464 625 782 1135 1627

4 071 106 220 336 488 599 778 949 1328 1847

5 115 161 300 435 606 729 924 1107 1509 2052

6 164 220 383 535 723 856 1065 1259 1681 2246

7 217 283 467 635 838 980 1202 1407 1848 2432

8 273 349 553 734 952 1103 1336 1551 2009 2613

9 333 417 639 834 1066 1224 1468 1692 2167 2788

10 394 487 727 934 1178 1344 1599 1831 2321 2959

accettare

a livello di 005

rifiutare

Probabilitagrave= p


2PM 1 3 4



46


Esercitazione n 6

47






a) b)

p

c c

q

c)






Figura 61


centromero)



48








1

6

13

19 20 21 22F G

X Y

14D

15 16 17E

18

7 8 9C

10 11 12

2A B

3 4 5

Figura 62


Figura 63



Esercitazione n 6

49








Figura 64


a) b)



50






Monoploide(n)

Triploide(3n)

Tetraploide(4n)

Diploide(2n)

1 2 3

n nn

n n2n

a) c)b)

2n


Figura 65


Figura 66

Cariotipo triploide

Figura 67


1

6

13

19 20 21 22 23

1314 15 16 17 18

67 8 9 10 11 12

2 3 4 5


Esercitazione n 6

51






Figura 69


NON DISGIUNZIONE

NON DISGIUNZIONE

GAMETI

NUMERO DI CROMOSOMI

n+1 n+1 n-1 n+1 n nn-1n-1

MEIOSI I

MEIOSI II

Tabella 61


Figura 68








47 XYY48 XXYY



MONOSOMIE POLISOMIE




52





EDCBA

EDCBA

ONML

ONMA

EDCBL

E

D

D

C

B

A

FEDCBA

F

EDCBA


Delezione

EDCBA

ED

BCA

Inversione


Figura 610






Figura 611


a)

c)

b)

d)


Esercitazione n 6

53
















Figura 612




54




Esercitazione n 7

55





Trascrizione

Gene X






Figura 71




56






PLASMIDE


ori

P

marker

R

Figura 72


Tabella 71









Figura 73



Esercitazione n 7

57

Luciferasi

HO S

S

N

N

COOH

Luce gialla

LuciferinaATP Mg++


2

HO S

S

N

N

OH




Figura 74


Figura 75


Luce blu o UV


e-Livello eccitato

Luce verde



58




Figura 76


Figura 78





Figura 77


HO


Celenteramide

O O

OH

CO2

NN

N HON

NNH

H

OH

O2

Luce blu


+

acidoglucuronico




Br BrCl Cl OH

BrCl

Br

ClONH

0

NH

acidoglucuronico

O-

+

NH

NH


Esercitazione n 7

59












Figura 79




60






Figura 711


Figura 710



Esercitazione n 7

61









PLASMIDE


ori

P

marker

gus

Figura 713


Figura 712




62





GUS

C

+Cd C +Cd

16S


Figura 716


Figura 714


Figura 715



C +Cd C +Cd


GUS

16S

a) b)


Esercitazione n 8

63







Figura 81


a)

b)

c)



64





Fibroblasti

Fegato

5rsquo 3rsquo


+

-

-

-

Figura 82



Esercitazione n 8

65


Muscolo striato 1

Muscolo striato 2

Muscolo liscio

Mioblasto

Fibroblasto

Epatocito

Neuroblasto

Figura 83





Figura 84




66

Proteasoma








Figura 85


Figura 86



Esercitazione n 8

67


Figura 87










68












Tabella 81



Esercitazione n 8

69







pozzetti

running gel

stacking gel

Figura 88




70







Figura 89


1 2 3 4 5 6 7 8


Esercitazione n 8

71










Antigeni


Figura 810


a)

b)


antigene




catena pesante

dominio VH

dominio VL

5 nm

legame disolfuro

catenaleggera



Figura 811





72


correnteelettrica



SVILUPPO



Figura 812








Esercitazione n 8

73







Figura 813


P M 1 2

a)Coomassie

245 KDa180 KDa

135 KDa

100 KDa

75 KDa

b)western blotting

c)Ponceau

P M 1 2 P M 1 2



74


Esercitazione n 9

75











Figura 91




76


1

WHOLE GENOME

14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y MT

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Figura 92


Figura 93




Esercitazione n 9

77



Figura 94


Figura 95







78



Figura 98


Figura 97


Figura 96




Esercitazione n 9

79



Figura 99

Riquadro 2

Riquadro 3

Riquadro 1



80

Figura 910

Figura 911




Esercitazione n 9

81



Figura 912



82







popolazionefinale

collo di bottiglia


Figura 913


Tabella 91


Tabella 92


MALATTIA SINTOMI





MALATTIA SINTOMI






Esercitazione n 9

83









84


Esercitazione n 10

85













86





dNTP ddNTP

Mancagruppo OH

P

PP

CH2 0

5rsquo

3rsquo

Base

OH

P

PP

CH2 0

5rsquo

3rsquo

Base

H

Primer3rsquo



Migrazionedel DNA

Rivelatore Laser



Raggio laser


Denaturazione


T

T

A

C

C

G

G

G

G

A

T

T


2 0 3 0 4 0

Figura 101


Figura 102






Esercitazione n 10

87






16S rRNA









Figura 103




88








batterio




Figura 104


Figura 105

Il CBOL nel mondo


Esercitazione n 10

89

Figura 107



Figura 106





90




ithomeindexhtml


Figura 108



Figura 109


Esercitazione n 10

91






Figura 1010

Figura 1011

Figura 1012



92


Esercitazione n 11

93











Figura 111




94




Fonte di raggi x

10000 - 40000volts


concentra i raggi x

Cristallo

Lastra fotografica


Figura 112


HC

HC CH

HC CH

CH2

CH2

C

O O-

CH2

CH2

C

O O-

C


Fenilalanina

Figura 113



Esercitazione n 11

95

Figura 114











Domande e risposte



96

Figura 115







peptidoglicano

membranaplasmatica

acidoteicoico

pentaglicina

proteine dimembrana

fosfolipidi

citoplasma


Esercitazione n 11

97





Figura 117

Figura 116




Tabella 111


U C A G

U

UUUPheF

UUC

UUALeuL

UUG

UCU

UCCSerS

UCA

UCG

UAUTyrY

UAC

UAA STOP

UAG STOP

UGUCysC

UGC

UGA STOP

UGG TrpW

U

C

A

G

C

CUU

CUCLeuL

CUA

CUG

CCU

CCCProP

CCA

CCG

CAUHisH

CAC

CAAGlnQ

CAG

CGU

CGCArgR

CGA

CGG

U

C

A

G

A

CUU

CUC IleI

AUA

AUG MetM

ACU

ACCThrT

ACA

ACG

AAUAsnN

AAC

AAALysK

AAG

AGUSerS

AGC

AGAArgR

AGG

U

C

A

G

G

GUU

GUCValV

GUA

GUG

GCU

GCCAlaA

GCA

GCG

GAUAspD

GAC

GAAGluE

GAG

GGU

GGCGylG

GGA

GGG

U

C

A

G

first

posi

tion

second position

thirdposition







98






Figura 118

Figura 119


Esercitazione n 11

99








BLAST (Basic Local



Figura 1110

Figura 1111



100









Figura 1112



Esercitazione n 11

101











Figura 1113




102













Figura 1114


Fig 1115



Esercitazione n 12

103













104








Figura 121


Figura 122



Esercitazione n 12

105
















ray



chiphtml


Figura 123




106







Figura 124


Figura 125


A B C D E F G H I L

1

2

3

4

5

6

A B C D E F G H I L


Esercitazione n 12

107



Figura 126



spot giallo)

Figura 127



A B C D E F G H I L

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

A B C D E F G H I L

6




108




Figura 129


Figura 128


2

1

3

4

5

6

A B C D E F G H I L

7

A B C D E F G H I L


Esercitazione n 12

109



NOME

DEL GENE


LrsquoESPRESSIONE


O RIDOTTA NELLE

CELLULE TUMORALI

SPIEGAZIONE

DELLA

PREVISIONE




A4



B2


B3







paziente X

paziente Y

A B C

1

2

3

4

A B C

1

2

3

4

A B C

1

2

3

4

paziente Z





Tabella 121



110






Tabella 122


a) b)


+4 +3 +2 +1 0 0 -1 -2 -3 -4

Figura 1210


A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Q R S T

a) b)


Esercitazione n 12

111

(+1) ( 0) (-2) (-1) (+2) ( 0) (-2) (-2)

(+3) (-2) (-1) (-3) (+3) (-2) (+2) (-3)

(+4) (-1) (-2) (-3) (+4) (-1) (-2) (+3)

(+3) (-3) (-4) (+1) (+3) (-3) (-4) (+1)

( 0) (+2) (+4) ( 0) (+4) (+2) (+4) ( 0)


-1

-2

-3

-4

-5

1

2

3

4

5





Figura 1211

Figura 1212


Tabella 123

A

A A

B

B B

C

C C

D

D D

E

E E

F

F F

G

G G

H

H H

I

I I

J

J J

K

K K

L

L L

M

M M

N

N N

O

O O

P

P P

Q

Q Q

R

R R

S

S S

T

T T

4

3

2

1

0

-1

-2

-3

-4




112


APPENDICE


114


115

Norme generali








116






Protocolli 1 2 3

117







TBE 1χ1





118





CHI Egrave IL

COLPEVOLE

PM(Peso molecolare)

V(vittima)

SC(scena crimine)

S1(sospettato 1)

S2(sospettato 2)

S3(sospettato 3)

Biancodi PCR

IDENTIFICAZIONE

DI UN OGM

1(cloroplasto)

2(zeina)

3(campione)

4(controllo +)

5(controllo -)


2(individuo III2)

3(individuo IV1)

4(individuo IV2)

5(individuo IV3)

6(individuo IV4)


Protocolli 1 2 3

119




120


121

Protocollo 4












122
















123

Protocollo 4









124












125

Protocollo 4





126


127

Protocollo 5










Figura 2


Figura 1


χ2 = (o-a)2

a



128








129

Protocollo 6











Tdeg T´







32 cicli





130


Protocolli 1 2 3

131












132




21 22


21 22 Y


21 22


21 22 Y


21 22 Y


21 22 Y


21 22


133

Protocollo 7







134





NH4NO3 2061 mM

CaCl2 299 mM

MgSO4 150 μM

KNO3 1879 mM

KH2PO4 125 mM

H3BO3 100 μM

Na2-EDTA 100 μM

MnCl2 100 μM

ZnCl2 2991 μM

Fe2(CH4O6)3 184 μM

CoCl2 0110 μM

CuCl2 0100 μM

(NH4)6Mo7O24 1030 μM

KI 5 μM

saccarosio 10 g l-1

agar 8 g l-1


135

Protocollo 8










136




















Protocolli 1 2 3

137











138












PM + + +Solo

colorantePM + - +



139

Protocollo 8











140


141

Protocollo 11







Figura 111


a) b)



H2O H

2O


PROTEINA



142




NaCl 20 200 μl


H2O 275 μl

NaCl 225 μl


H2O 250 μl






143

Reagenti utili



SOLUZIONI STOCK1












144

EDTA 05M pH 80







PBS 10times



[ ] finale



[ ] finale

NaCl 5M 200 ml 1 M






145

Reagenti utili

[ ] finale


MgCl2 102 mg 50 mM

DTT 77 mg 50 mM

BSA 5 mg 500 μgml

ATP 28 mg 5 mM

[ ] finale

Tris 108 g 089 M

EDTA 05 M pH 80 40 ml 002 M


[ ] finale

Tris 3030 g 025 M

Glicina 15014 g 2 M

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 80 ml














Tris-HCl 1M pH 68




146

Tris-HCl 1M pH 76


Tris-HCl 1M pH 80







[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 60 ml

[ ] finale

Tris 12114 g 1M

HCl 37 circa 40 ml

[ ] finale









147

Reagenti utili







[ ] finale


SDS 20 2 ml 4 wv



DTT 031 g 200 mM

[ ] finale



NaCl 5M 400 ml 2 M


DTT 031 g 200 mM




Ricordarsi che





di NaCl 1M





Un paio di esempi




148





Soluzione 2


[ ] finale




[ ] finale

H2O

2al 30 120 μl







[ ] finale

Triptone 10 g 1 wv


NaCl 10 g 1 wv



149

Reagenti utili









[ ] finale




T4 DNA ligasi 1 μl





150







[ ] finale





[ ] finale

urea 168 g 28 M

Na2SO4 50 g 035 M








[ ] finale

Saccarosio 80 g 8







151

Reagenti utili

[ ] finale


Metanolo 70 ml 7

[ ] finale



[ ] finale


SDS 20 5 ml 01









TE [4]









Nel libro





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