STRATEGIE PER AUMENTARE LA RESA

DI PROTEINA RICOMBINANTE IN E. coli

1. COESPRESSIONE CON CHAPERON MOLECOLARI

2. AUTOINDUZIONE

3. MARLEY

4. DOPPIA SELEZIONE

5. mazF

6. Coespressione di piu’ proteine target

CHAPERONINE BATTERICHE

TRIGGER FACTOR

DnaK/DnaJ

CHAPERONI BATTERICI

GroEL/GroES

Si legano ai peptidi nascenti

Si occupa del 30-50% delle proteine solubili di E. coli

TRIGGER FACTOR: peptidil-prolil cis/trans isomerasi stabilmente associata ai ribosomi

coopera con DnaK/DnaJ nel folding di polipeptidi nascenti

DnaK (Hsp70): il dominio C-terminale lega peptidi idrofobici

il dominio N-terminale ha attività ATPasica

DnaJ (Hsp40): co-chaperone di DnaK, attiva l’idrolisi di ATP e facilita lo scambio ADP/ATP

Il sistema DnaJ/DnaK è molto importante per le proteine il cui

C-terminale è necessario per il folding corretto

GroEL: 2 anelli di 7 subunità da 58 kDa ciascuno che formano una cavità centrale

GroES: eptamero di subunità da 10 kDa ognuna, interagisce con GroEL formando la cavità che ospita la proteina non foldata

R. J. Ellis Current Biology Volume 13, Issue 22, 11 November 2003, Pages R881–R883

1. COESPRESSIONE CON CHAPERONINE

A. Trasformazione con plasmidi contenenti i geni per le chaperonine

B. Preparazione di cellule competenti contenenti il

plasmide con i geni delle chaperonine

C. Trasformazione con plasmide per l’espressione

della proteina ricombinante

1. COESPRESSIONE CON CHAPERONINE

● Metodo descritto da Studier FW et al. (2005) Protein Expr. Purif. 41(1): 207-

234.

● Basato sulla capacità di alcuni terreni di indurre l’espressione di proteina in E.

coli

● Risultato di differenti stati metabolici dei batteri

● Studio dei componenti del terreno che sono necessari per l’autoinduzione

2. AUTOINDUZIONE

IN ASSENZA DI GLUCOSIO

Operone Lac

● L’operone di Lac contiene tre ORF: lacZ: -galattosidasi, lacY: permeasi del lattosio, lacA: trigalattoside transacetilasi.

● L’operone lac è regolato dal repressore Lac: lacI● Anche CAP (Catabolite Activator Protein) regola

l’operone. È un recettore di cAMP. ● Il repressore Lac lega il DNA solo in assenza di

lattosio. ● CAP è un attivatore, e lega il DNA solo in assenza di

glucosio, quando cAMP è alto.

Il repressore lac si lega ai due operatori come tetramero

● L’ansa si forma tra il repressore legato all'operatore principale e quello a monte, ausiliario a 90 bp. Un'ansa del tutto simile si può formare in alternativa con un operatore a valle, a 400 bp

I tre geni lacZ, LacY e lacA sono trascritti come un unico mRNA. L'operatore si trova sul promotore nella regione legata dalla RNA polimerasi e il sito CAP si trova proprio a monte del promotore.

L'operone Lac

La regione di controllo dell'operone lac. Sono mostrate le sequenze nucleotidiche e l'organizzazione della regione di controllo dell'operone lac. Le barre colorate sotto e sopra indicano le regioni coperte dalla RNA polimerasi e dalle proteine regolatrici. Si noti che il repressore lac copre più DNA della sequenza definita come il minimo sito di legame dell'operatore, e la RNA polimerasi copre più DNA di quello definito dalle sequenze che formano il promotore.

L'espressione dei geni lac.

La presenza o l'assenza degli zuccheri lattosio e di glucosio controlla il livello di espressione dei geni lac. Livelli elevati di espressione necessitano la presenza del lattosio (quindi la assenza di un repressore lac funzionale) e l'assenza della preferenziale forma di energia, il glucosio (e quindi la presenza dell'attivatore CAP).

Quando è legato all'operatore il repressore Lac esclude la polimerasi, indipendentemente dalla presenza di CAP attivo.

CAP porta la polimerasi sul promotore sul promotore lac dove va incontro ad una isomerizzazione spontanea a compresso aperto.

L'attivazione del promotore lac da parte di CAP.

Il legame dell’RNA polimerasi al promotore lac con l'aiuto di CAP. Il CAP è riconosciuto dalla CTD della subunità alfa.

struttura del complesso CAP-alfa CTD-DNA. CAP è mostrato legato al suo sito sotto forma di dimero. Inoltre viene mostrato l‘alfa-CTD della RNA polimerasi legata ad un pezzo di DNA adiacente e mentre interagisce con il CAP. Il sito di interazione su ciascuna proteina coinvolge residui identificati geneticamente. CAP è in turchese, alfa-CTD in viola. Ad ogni molecola di CAP è legata una molecola di ATP

Quando interagisce con il CAP l'alfa-CTD contatta anche il DNA adiacente al sito CAP.

L’attività di Lac repressor e CAP sono regolate allostericamente

● Il lattosio si trasforma in allolattosio e si lega al lac repressor.● In assenza di allolattosio il repressore è attivo, e si lega al

DNA ● Il legame con allolattosio ne fa cambiare la conformazione, che

non è più competente a legare il DNA. Il sito di legame è diverso da quello del DNA.

● La presenza di glucosio mantiene bassa la concentrazione di cAMP.

● In basso glucosio cAMP aumenta, si lega a CAP e lo rende competente a legare il DNA, e ad agire da attivatore.

● CAP regola vari altri geni, tra cui cui quelli dell’operone Galattosio. CAP à una molecola che in tutti gli organismi funge da segnale di carenza energetica

Duplice controllo dell’operon di lac

Repressione glucosio-dipendente

Glucose is known to repress a large number of inducible enzymes in many different bacteria. Glucose represses the induction of inducible operons by inhibiting the synthesis of cyclic AMP (cAMP), a nucleotide that is required for the initiation of transcription of a large number of inducible enzyme systems including the lac operon.

cAMP is required to activate an allosteric protein called CAP (catabolite activator protein) which binds to the promoter CAP site and stimulates the binding of RNA polymerase to the promoter for the initiation of transcription. Thus, to efficiently promote gene transcription of the lac operon, not only must lactose be present to inactivate the lac repressor, but cAMP must be available to bind to CAP which binds to DNA to facilitate transcription. In the presence of glucose, adenylate cyclase (AC) activity is blocked. AC is required to synthesize cAMP from ATP. Therefore, if cAMP levels are low, CAP is inactive and transcription does not occur. In the absence of glucose, cAMP levels are high, CAP is activated by cAMP, and transcription occurs (in the presence of lactose).

Glucosio:» Fonte di energia primaria» Repressione

Glicerolo:» Fonte di energia tardiva

Lattosio:» Induzione

2. AUTOINDUZIONE

Vantaggi rispetto all’induzione con IPTG:

● Non è necessario monitorare OD600

● Possono essere eseguite numerose colture in parallelo● OD600 finale è più alto che con l’induzione con IPTG

(LB/IPTG ~ 1.8, Auto-induzione ~ 5)● Maggiore resa di proteina

2. AUTOINDUZIONE

• La velocità di crescita di E. coli in terreni minimi è generalmente più

bassa rispetto ai terreni ricchi

• Un metabolismo più lento può ridurre i livelli di overespressione della

proteina ricombinate a causa di:

Instabilità plasmidica

Accumulo di metaboliti tossici e proteasi

• La velocità di produzione della proteina è direttamente correlata alla

velocità di crescita del batterio:

Cambiando il tempo di duplicazione di E. coli da 100 a 24 minuti si

ottiene un aumento di 10 volte del numero di ribosomi per cellula

3. MARLEY

3. MARLEY

The cell pellets were resuspended in 250 ml of either 13C labeled minimal media at cell concentrations 1×, 2×, 4×, and 8× greater relative to the originating LB cellgrowths (e.g. 1× results in an OD600≈0.7 and 8×results in OD600≈5.6 suspended in 250 ml of minimal media)

(1X – 2X – 4X – 8X)

OD600 = 0.7 - 0.9

1 h

4. DOPPIA SELEZIONE

● Non tutte le colonie di una piastra sono identiche in

termini di livelli di espressione

● La doppia selezione delle colonie permette di selezionare

la colonia con il migliore livello di overespressione della

proteina ricombinante

● Gli stock in glicerolo fatti da colonie selezionate

mantengono un alto livello di overespressione non è

necessaria una trasformazione fresca.

Steps fondamentali:

1. Scegliere alcune colonie da una piastra di cellule trasformate e

crescerle singolarmente in LB fino a OD600=0.6-0.9 ed eseguire

un test di espressione inducendo l’espressione di proteina con

IPTG

2. Piastrare in una nuova piastra 5ul della coltura non indotta (diluita

a OD600= 0.05) che dal test di espressione ha espresso la quantità

di proteina maggiore

3. Selezionare alcune colonie dalla piastra e ripetere il test di

espressione

4. Piastrare o preparare uno stock in glicerolo dalla coltura migliore

4. DOPPIA SELEZIONE

4. DOPPIA SELEZIONE

Tre metodi di espressione a confronto:Standard IPTG induction

with medium switch Auto-induction

MarleyHigh cell density.IPTG induction

Induzione con IPTG tradizionale

VS

espressione ad alte densità cellulari

• Maz-F is a sequence specific endoribonuclease that cleaves

ssRNA* at ACA sequence.

• Maz-F efficiently and selectively degrades all mRNAs in vivo.

Other types of ssRNAs seems to be protected from cleavage:• tRNAs have a very extended secondary structure• rRNAs are tightly associated to ribosomal proteins

5. mazF: single protein production (SPP) system

The pACYCmazFThe pACYCmazF• MazF has been succesful clone in a plasmid T7-controlled, IPTG inducible.

• MazF induction effect:

• Severe reduction of protein synthesis

• Growth arrest, i.e. MazF induction in E. coli causes a novel physiological

state called ‘quasi-dormancy,’ under which cells are fully metabolically

active and capable of synthesizing protein even in the total absence of

cell growth

Only the ACA-less mRNAs coming from an engineered sequence will

be successfull expressed

5. mazF

Sequence optimization (ACA-less RNA)Sequence optimization (ACA-less RNA)

Remove ACA sequence in the whole gene without considering the reading frame !!

5. mazF

Altered codons are optimized for usage in Escherichia coli. Altered

bases are in red. X is an unspecified nucleotide, which is variable

according to the amino acid code for the amino acid listed. X should not

be changed when ACA sequences are altered.

Sequence optimization (ACA-less RNA)Sequence optimization (ACA-less RNA)

5. mazF

WT Vs. ACA-less optimized seqWT Vs. ACA-less optimized seq

Efficiency of protein production in the single protein production (SPP) system. Wild-type (WT) (left panel) and ACA-less CspA (right panel) are expressed in the SPP system using pColdIV (SP-2)cspA (WT or ACA-less), together with pACYCmazF. SDS–polyacrylamide gel electrophoresis and Coomassie blue staining.

The bacterial protein background remains constant during the three days of induction. The amount of target proteins increases during the time. It means the cells are only working to express our target protein. We have therefore E. coli cells working as single protein production (SPP) system.

5. mazF

Expression of eotaxin in BL21(DE3) cellsExpression of eotaxin in BL21(DE3) cells

Cells were pulse-labeled with 35S-Met for 15 min before (lane C) or after MazF induction at the time points indicated. Left panel: E. coli BL21(DE3) cells transformed only with pColdI(SP-2)eotaxin. Right panel: E. coli BL21(DE3) cells transformed with pACYCmazF and pColdI(SP-2)eotaxin5 were used. Molecular weight markers are shown on the left.

The intensities are related to the rate of protein synthesis and not to the proteins concentration.

5. mazF

Applications and advantagesApplications and advantages• Over-expression of recombinant proteins with minimum

protein background from the host cell. High signal to noise

ratio.

• Isotopic labeling for NMR :

• Quasi-exclusive labeling of target proteins.

• NMR of cell lysates

• In-Cell NMR spectroscopy. Protein studies (dynamics,

interactions…) in truly physiological conditions.

• Culture condensation (cSPP) up to 100 folds: cost

effective isotopic labeling with especially for deuterium

5. mazF

• Toxic protein expression

• Reduced proteases activity

• Low temperature induction systems (pCOLD) improve protein

stability and solubility.

• Possibility of very long induction times for protein

accumulation.

Applications and advantagesApplications and advantages

5. mazF

The Duet vectors are designed for the cloning and coexpression of two target ORFs. Every Duet vector contains two multiple cloning sites (MCS) each of which is preceded by a T7 lac promoter and ribosome binding site (rbs). Multiple Duet vectors, codifing for different antibiotic resistance, may be used together in compatible host strains to coexpress up to 8 target proteins

Pduet: A system for protein co-expression

I 2 inserti devono essere clonati con coppie diverse di

enzimi di restrizionein 2 step consecutivi

METODI DI CLONAGGIO: plasmidi per coespressione pET Duet___

Vengono trascritti 2 mRNA

Livelli di espressione migliori rispetto a mRNA policistronici

(Un cistrone è quindi una sequenza di basi nucleotidiche compresa tra

una tripletta di inizio AUG e una di stop)

Pqlink: A new approach

Siti di restrizione in grigio

3’-> 5’ exonuclease activityNucleic Acids Res. 18, 6069– 6074 Mol. Cell. Proteomics 2004;3:934-938.

Siti di stop per attività esonucleasica di T4 DNA polimerasi

dCTP for PacI dGTP for SwaI

Nucleic Acids Res. 2007;35(6):e43.

The vectors pQLinkH and pQLinkG contain Gateway attB sites and inserts can be shuttled by a reverse Gateway reaction into a pDONR donor vector to obtain Entry clones.

METODI DI CLONAGGIO: plasmidi per coespressione pQLink_____