“Sperimenta il BioLab”

Chi è il colpevole?

Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano

Laboratorio 105

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Indice

1. Conoscenze propedeutiche

• 1.1 Cosa è il DNA p. 3 • 1.2 Struttura del DNA p. 3 • 1.3 Dal DNA al cromosoma p. 4 • 1.4 Aploidia e diploidia p. 4 • 1.5 Gene, locus, alleli p. 5 • 1.6 Polimorfismi p. 5

• 1.6.1 polimorfismi allelici p. 5 • 1.6.2 polimorfismi di sequenza (microsatelliti) p. 6

• 1.7 Genotipo e fenotipo p. 7 • 1.8 Quadro riassuntivo: geni, alleli, polimorfismi, genotipo, fenotipo p. 7 • 1.9 Replicazione del DNA p. 8

2. Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio

• 2.1 PCR p. 8 • 2.1.1 termociclatori p. 9 • 2.1.2 Taq polimerasi p. 9 • 2.1.3 scelta dei primer p. 9

• 2.2 Elettroforesi p. 9 3. Chi è il colpevole?

• 3.1 Antefatto p. 11 • 3.2 DNA profiling (test del DNA) p. 11 • 3.3 Schema dei microsatelliti utilizzati p. 12

• 3.3.1 esercizi p. 13 • 3.4 Schema dell’esperimento p. 16 • 3.5 Protocollo sperimentale p. 16

• 3.5.1 principali unità di misura in biologia cellulare e molecolare p. 16 • 3.5.2 strumentazione e materiale a disposizione p. 17 • 3.5.3 soluzioni e reagenti p. 17 • 3.5.4 preparazione del gel di agarosio p. 18 • 3.5.5 corsa elettroforetica p. 19 • 3.5.6 marcatore di peso molecolare di DNA utilizzato p. 21

• 3.6 Risultati p. 21 • 3.7 Interpretazione p. 22

• 3.7.1 domande di riepilogo p. 22

4. Norme generali di sicurezza in laboratorio p. 23 5. Quiz di autovalutazione p. 24 6. Glossario p. 30 7. Siti web utili p. 32 8. Concorso “Una settimana da ricercatore” p. 32

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1. Conoscenze propedeutiche 1.1 Cos’è il DNA? DNA sta per Deoxyribo Nucleic Acid; è una complessa sostanza chimica che si trova nel nucleo di tutte le cellule e porta l’informazione per lo sviluppo degli organismi.

• Il DNA è il materiale ereditario responsabile delle caratteristiche degli individui e quindi delle somiglianze e differenze tra gli stessi.

• Il DNA è unico per ogni individuo e diverso da individuo a individuo, eccetto che per i gemelli monozigotici, il cui DNA è identico.

• Il DNA è visualizzato sotto forma di cromosomi durante la divisione cellulare.

1.2 Struttura del DNA La molecola del DNA è un polimero, ossia è un insieme di tanti monomeri: i nucleotidi. Ogni nucleotide è costituito da tre componenti: un gruppo fosfato, uno zucchero (desossiribosio) e una base azotata. La molecola di DNA è formata da due catene polinucleotidiche avvolte l’una intorno all’altra con andamento destrorso. Le due catene sono antiparallele, ossia i due singoli filamenti sono orientati uno in direzione 5’ → 3’ e l’altro 3’ → 5’. Gli scheletri zucchero – fosfato si trovano all’esterno, le basi azotate all’interno. Le basi delle due catene sono unite tra loro mediante legami a idrogeno (Fig. 1). Le basi sono complementari e il loro appaiamento è: A=T Adenina - Timina G≡C Guanina - Citosina L’informazione genetica risiede nella sequenza di basi. 1.3 Dal DNA al cromosoma Ciascun cromosoma eucariotico contiene una lunga doppia elica di DNA che si estende da una estremità all’altra del cromosoma stesso. La lunghezza complessiva del DNA, che costituisce i 46 cromosomi di una cellula umana è di circa 2 metri; ne deriva quindi la necessità di compattare (spiralizzare) la molecola affinché la sua lunghezza sia compatibile con le dimensioni del nucleo. Alla molecola di DNA sono associati gli istoni (proteine basiche), che sono essenziali per permettere l’avvolgimento e il ripiegamento del DNA in strutture estremamente compatte, vale a dire i cromosomi, visibili solo durante la divisione cellulare. Il processo di spiralizzazione del DNA (Fig. 2) prevede livelli successivi di avvolgimento (compattamento).

(bp=paia di basi, base pairs)

Fig. 1. Struttura della doppia elica del DNA.

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Fig. 2 I livelli di organizzazione della cromatina che danno origine ad un cromosoma euariotico. a) Doppia elica di DNA

b) “Collana di perle” di nucleosomi

c) Fibre di nucleosomi addensati a forma di solenoide

d) Domini ad anse

e) Spirali condensate

f) Cromosoma metafasico

a)

b)

c)

d)

e)

f)

1.4 Aploidia e diploidia

Nel nucleo delle cellule somatiche della maggior degli organismi, i cromosomi sono presenti in coppie di membri morfologicamente simili, detti cromosomi omologhi. Nel nucleo dei gameti (cellule riproduttive, gli spermatozoi e le cellule uovo), ogni cromosoma è invece presente in singola copia. La condizione che si ritrova nelle cellule somatiche è detta diploidia, quella

nei gameti aploidia. Un individuo diploide è quindi tale perché nelle sue cellule somatiche sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma. Nelle cellule somatiche umane osserviamo ad esempio 46 cromosomi, ovvero 23 paia. Un cromosoma di ciascuna coppia di cromosomi omologhi è ereditato dal genitore femminile e l’altro dal genitore maschile.

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1.5 Gene, locus, alleli Ogni cromosoma può essere immaginato come una successione lineare di geni o loci. Il gene è l’unità ereditaria fondamentale e consiste di specifiche sequenze di nucleotidi. Il locus è la posizione, ovvero il sito occupato dal gene su un cromosoma. I due termini, gene e locus, sono sinonimi. Ogni paio di cromosomi contiene gli stessi geni nello stesso ordine lineare, ma non necessariamente in forma identica. Forme diverse di un gene sono dette alleli. Poiché in ogni individuo diploide sono presenti due alleli per ogni locus, due cromosomi omologhi possono portare alleli uguali (l’individuo è detto omozigote) o diversi (l’individuo è detto eterozigote) per uno stesso locus. 1.6 Polimorfismi Il termine polimorfismo significa “esistenza di forme diverse”. In genetica, il polimorfismo può essere analizzato a livello di proteina (polimorfismo proteico) oppure di materiale genetico (polimorfismo genetico). In questo secondo caso, le forme diverse (ossia le varianti genetiche) possono riguardare un gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina, oppure un tratto di DNA non codificante. Nel primo caso, si parla di polimorfismo allelico, nel secondo caso di polimorfismo del DNA. polimorfismo proteico Polimorfismo polimorfismo allelico polimorfismo genetico polimorfismo del DNA

1.6.1 polimorfismi allelici

Per polimorfismi allelici si intende l’esistenza di due o più alleli diversi di uno stesso gene o locus. Gli alleli di un gene si formano uno dall’altro per mutazione, ossia per variazione della sequenza nucleotidica di un gene. Gli alleli di un gene possono essere identificati a livello fenotipico, perché possono determinare fenotipi diversi, ad esempio capelli neri o biondi. Se gli alleli di un gene sono due, il polimorfismo si chiama polimorfismo biallelico. Se gli alleli sono in numero maggiore di due (come nel sistema di gruppo sanguigno ABO), il polimorfismo è detto polimorfismo multiallelico.

1.6.2 polimorfismi di sequenza (microsatelliti)

Nel caso dei polimorfismi del DNA, contrariamente ai polimorfismi allelici, la variazione di sequenza nucleotidica avviene in genere in un tratto di DNA non codificante, che nel suo complesso costituisce circa il 98% del genoma. I polimorfismi del DNA sono quindi più frequenti dei polimorfismi allelici e conseguentemente più utili nella ricerca genetica. E’ stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Poiché interessano generalmente il DNA non codificante, i polimorfismi del DNA rappresentano differenze tra individui, senza conseguenze sul fenotipo. Quindi, non è possibile rilevarli osservando le caratteristiche fenotipiche di un individuo. Esistono diversi tipi di polimorfismi del DNA: 1. polimorfismi di singoli nucleotidi = SNP (single nucleotide polymorphism) 2. polimorfismi di ripetizione = VNTR (V= variable, N= Number, T= Tandem, R= Repeats) 3. polimorfismi di restrizione = RFLP ( R= restrition, F= fragment, L= lenght, P= polymorphism)

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Noi ci occuperemo solo dei polimorfismi di ripetizione (VNTR), vale a dire i polimorfismi dovuti alla presenza di un numero variabile di sequenze nucleotidiche ripetute in tandem (in orientamento testa-coda, una

di seguito all'altra). I VNTR comprendono i microsatelliti e i minisatelliti, che differiscono tra loro per la lunghezza dell’unità di ripetizione. Nei minisatelliti, le ripetizioni sono più lunghe (qualche decina o un centinaio di basi). Nei microsatelliti, le ripetizioni sono più corte, di-, tri- o tetra- nucleotidi, ad esempio (AC)n oppure (CAG)n. Per questo motivo, i microsatelliti sono detti anche STR (Short Tandem Repeats, ripetizioni brevi in tandem). Per un determinato microsatellite possono di conseguenza esistere numerosi alleli diversi, che differiscono tra loro per il numero di ripetizioni, ad esempio da 1 a 20 ripetizioni. I microsatelliti sono quindi un esempio di polimorfismo multiallelico. Il profilo del DNA (“DNA profiling”) serve per identificare gli individui e distinguere un individuo dall’altro. Se due individui presentano caratteristiche simili, ad esempio hanno capelli dello stesso colore, occhi dello stesso colore, stessa altezza, stesso gruppo sanguigno ecc. non è possibile distinguerli. Caso estremo di individui con le stesse caratteristiche e quindi non distinguibili tra loro, è rappresentato dai gemelli identici, monozigotici.

Ne consegue che per poter distinguere due individui, bisogna riferirsi a caratteristiche che siano diverse nei due soggetti. Le caratteristiche in esame nel caso del DNA profiling sono i microsatelliti. Due individui sono diversi tra loro, se posseggono alleli diversi dei singoli microsatelliti in esame, e quindi posseggono due alleli diversi dello stesso microsatellite. E’ intuitivo che tanto maggiore è il numero di alleli che esistono per un certo gene, tanto maggiore è la probabilità che un individuo sia eterozigote e quindi diverso da un altro individuo. Dato il loro elevato polimorfismo (elevato numero di alleli), i microsatelliti sono pertanto degli ottimi marcatori genetici, in quanto consentono di “marcare”, vale a dire distinguere tra loro due individui.

I microsatelliti possono essere studiati con la PCR e successiva elettroforesi del DNA e sono utilizzati per effettuare il test del DNA (vedi §3.2).

1.7 Genotipo e fenotipo Il genotipo è la costituzione genetica di una singola cellula o di un singolo organismo, mentre il fenotipo è l’insieme delle caratteristiche visibili o in qualche modo evidenziabili di una cellula o di un organismo. Ad esempio, fenotipo è non solo il colore degli occhi, il colore della pelle o l’altezza (caratteristiche visibili), ma anche il tipo di gruppo sanguigno (caratteristica non visibile, ma evidenziabile con saggi di laboratorio), così pure i polimorfismi del DNA non si vedono osservando un individuo, ma possono essere evidenziati con la PCR e successiva elettroforesi (vedi § 2.1 e 2.2). Il fenotipo non è determinato solo dai geni, ma dipende anche dall’interazione del genotipo con l’ambiente. La statura di una persona, ad esempio, è influenzata dai geni, tuttavia la loro espressione può essere modificata dalle interazioni con l’ambiente esterno (ad esempio, alimentazione) o interno (ad esempio, ormoni).

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1.8 Quadro riassuntivo: geni, alleli, polimorfismi, genotipo, fenotipo

Genetica classica Genetica molecolare

Diploide: in ogni individuo sono presenti due copie di ogni tipo di cromosoma e quindi due alleli di

ogni locus

A

a

4 ripetizioni

7 ripetizioni

Alleli: forme diverse dello stesso

gene o locus

2 alleli diversi dello stesso

locus: A e a

2 tratti di DNA dello stesso locus che

differiscono per il numero di ripetizioni di una corta sequenza di

basi

Genotipo

Aa

4,7

Fenotipo

A

nessuno

Polimorfismo: esistenza di due o

più varianti genetiche (alleli, sequenze nucleotidiche, ecc.)

Polimorfismo

allelico

Polimorfismo di sequenza

(microsatelliti)

Come si evidenzia

Osservazione dell’individuo o delle sue cellule, ad es: colore degli occhi, gruppo sanguigno

PCR ed elettroforesi

1.9 Replicazione del DNA La replicazione del DNA in tutte le cellule viventi, dai batteri all’uomo, è un processo complesso, che richiede l’intervento di più di una dozzina di enzimi diversi. La replicazione comincia in corrispondenza di siti detti origine di replicazione presenti ad intervalli lungo i cromosomi. In questi siti, alcune proteine srotolano la doppia elica di DNA, rompendo i legami a idrogeno tra le basi dei due filamenti complementari.

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L’allineamento e unione tra loro dei nucleotidi complementari avviene per azione della DNA polimerasi che procede solo in direzione 5’→3’. La DNA polimerasi per iniziare il processo ha anche bisogno di un innesco (detto anche primer), a cui attaccarsi e procedere con la polimerizzazione. Durante la replicazione del DNA, il primer è costituito da una corta sequenza polinucleotidica di RNA. La replicazione è semiconservativa: ogni emi-elica (singolo filamento) della molecola madre serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, per cui ogni doppia elica figlia sarà costituita da un filamento vecchio e da un filamento nuovo. Le molecole risultanti sono copie esatte dell’originale. Da una doppia elica madre derivano due doppie eliche figlie uguali tra loro e uguali alla molecola madre.

2. Le tecniche che utilizzeremo in laboratorio 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction) Si tratta di una tecnica innovativa che consiste nell’amplificazione specifica di tratti di DNA mediante reazioni a catena della DNA polimerasi. Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA a doppio filamento e due corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complementare ad un tratto di filamento ad una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l’altra complementare ad un altro

tratto posto all’alt

ra estremità

(reverse primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una miscela di desossinucleotidi trifosfati in appropriate condizioni di reazione, è possibile far copiare numerosissime volte il tratto compreso tra i due primer, semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione. Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (circa 95°C), la doppia elica

si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per una eventuale sintesi delle catene complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si

Numero di cicli

Numero molecole della sequenza di DNA bersaglio

1 2 2 4 3 8 5 32

10 1.024 20 1.048.576 30 1.073.741.824

Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR.

Fig. 3. Rappresentazione grafica della replicazione del DNA, con la formazione dei due nuovi filamenti complementari ai filamenti “stampo” della molecola originaria.

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Zona amplificata

rinaturi e, in presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamenti singoli. Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo "denaturazione – annealing – extension" numerose volte (in genere da 20 a 30), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un dato tratto di DNA che può quindi essere analizzato e studiato in dettaglio. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenti:

♦ è molto rapido (da 60 a 90 minuti), ♦ la manualità è semplicissima, ♦ è automatizzato, ♦ i risultati sono visualizzabili con facilità mediante elettroforesi del DNA (vedi §2.2)

Importanti ambiti di utilizzo della PCR sono la diagnosi prenatale di malattie genetiche e le indagini di medicina legale (sia civile che penale), 2.1.1 termociclatori

Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero processo in modo automatico all’interno di strumenti detti termociclatori (thermal cycler), in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Il costo di un thermal cycler si aggira sui 10.000 euro.

Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore è il seguente:

1. denaturazione del DNA: 30 sec a 94°C 2. appaiamento (annealing) dei primers: 30 sec a 50°-60°C 30-35 cicli 3. sintesi (extension) di DNA: 30 sec- 5 minuti a 72°C 2.1.2 Taq polimerasi Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi

termostabile estratta da batteri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus aquaticus. L’isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall’ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione!

2.1.3 scelta dei primer Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse). La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere amplificazione specifica di un tratto di DNA. I primer devono essere “disegnati” a livello di sequenze uniche nel genoma (presenti una sola volta), in modo che possano appaiarsi al DNA solo nella zona di interesse e non in altre zone.

2.2 Elettroforesi E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel è costituito generalmente da agarosio e può essere immaginato come una rete tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le molecole sotto l’azione di un campo elettrico. Il campo elettrico è generato da un apparecchio, detto alimentatore o power supply. Le molecole di DNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo verso il polo positivo.

Fig. 8. Cella elettroforetica e alimentatore.

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Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del peso molecolare: tanto più grande è la molecola, tanto minore è la velocità di migrazione. E viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di migrazione. Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame precedentemente separate mediante elettroforesi, viene “caricato” sul gel anche il cosiddetto marcatore di peso molecolare, ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso molecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile calcolare il peso molecolare di questi ultimi, ossia la loro lunghezza. La separazione elettroforetica dura circa 30 min - 1 ora. Al termine, i vari frammenti di DNA, essendo incolori, possono essere visualizzati, immergendo il gel in un colorante. Il DNA delle diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA.

In genere in laboratorio le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta. Questo è dovuto al fatto che, durante la preparazione del gel, all’agarosio è stato aggiunto l’Eurosafe, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV.

Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta.

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3. Chi è il colpevole? 3.1 Antefatto Gianni, un ragazzo di quindici anni, vince una gara di bicicletta e tornando a casa si imbatte in un gruppo di teppisti che vogliono rubargli il trofeo e la bici. Dopo una colluttazione conclusasi con il furto del trofeo al vincitore e la fuga dei teppisti, arriva il vigile di quartiere che soccorre il malcapitato e lo riaccompagna a casa. I genitori decidono di denunciare il fatto alla polizia e dopo accurate ricerche vengono rintracciati alcuni ragazzi, presenti durante la gara e rientrati a casa con evidenti e sospette ferite. Anche la bicicletta di Gianni è macchiata di sangue, così come i suoi vestiti. La polizia scientifica inizia l’analisi del materiale biologico e decide di identificare il colpevole, facendo il profilo del DNA. 3.2 DNA profiling (test del DNA) E’ una nuova tecnica di genetica molecolare, utilizzata in tutti quei casi in cui è necessario effettuare l’identificazione di un individuo. Oltre che nei laboratori di ricerca in genetica molecolare, questa tecnica è usata nei laboratori di medicina legale di tutto il mondo. Il DNA profiling può essere applicato all’identificazione di materiale per attribuirne l’appartenenza a vittime o sospetti, come succede nei casi di incidenti aerei, delitti, stupri. Il test del DNA può essere applicato anche alla determinazione di relazioni familiari come paternità, nascite conseguenti a stupri o incesti. Un vantaggio di questa tecnica è che essa consente di analizzare il DNA di un individuo, partendo da quantità molto piccole di materiale biologico. E’ sufficiente una piccola quantità di cellule, come un capello o le tracce di saliva su un bicchiere o su una sigaretta per poter effettuare il test del DNA con la PCR. Il test del DNA si basa sull’analisi dei microsatelliti (vedi § 1.6.2), dopo estrazione del DNA dal campione in esame, amplificazione delle sequenze di DNA relative ai microsatelliti (tramite PCR) ed elettroforesi.

Se l’individuo è omozigote per il locus analizzato (sui due cromosomi omologhi è presente lo stesso numero di ripetizioni), sul gel si osserverà una sola banda, il cui peso molecolare corrisponde alla lunghezza della ripetizione. Se invece l’individuo è eterozigote (sui due cromosomi omologhi il numero di ripetizioni è diverso), sul gel si osserveranno due bande di diverso peso molecolare a seconda della lunghezza della ripetizione.

Fig. Schema di elettroforesi su gel di due microsatelliti situati su cromosomi omologhi materni e paterni (omozigoti per il locus analizzato) e del figlio (che sarà eterozigote per lo stesso lucus).

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3.3 Schema dei microsatelliti utilizzati Sono stati analizzati i tre seguenti marcatori microsatelliti: i microsatelliti 1, 2 e 3, localizzati su tre cromosomi diversi.

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3.3.1 Esercizi

Prima di andare avanti, svolgere i seguenti esercizi. Nota per l’insegnante: gli esercizi dal numero 2 al numero 8 cercano di familiarizzare lo studente con l’importanza che i marcatori microsatelliti siano altamente polimorfici, vale a dire esista per ogni marcatore un numero elevato di alleli. Però attenzione: ricordare allo studente che, anche se per un dato marcatore esistono molti alleli, un individuo ne porta sempre e solo due, perché è diploide! 1. Si consideri un marcatore del DNA, di cui esistono due alleli (allele 1 e allele 2).

Rispondere alle seguenti domande. a) Quanti sono i genotipi omozigoti e quali? Numero di genotipi omozigoti: _____Genotipo: _______ b) Quanti sono i genotipi eterozigoti e quali? Numero di genotipi eterozigoti: ____Genotipo: _______ Risposta domanda a: i genotipi omozigoti sono 2 e precisamente: 1, 1 e 2, 2. domanda b: vi è 1 solo genotipo eterozigote e precisamente: 1, 2. Nota per l’insegnante: sottolineare allo studente che se il numero di alleli è piccolo, come in questo esempio, il numero di genotipi possibili è piccolo.

2. Relativamente ai marcatori microsatelliti 1, 2, 3, sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, scrivere il peso molecolare degli alleli di ciascuno dei tre microsatelliti.

Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 allele 1 _________ allele 13_________ allele 2 _________ allele 14_________ allele 3 _________ allele 15_________ allele 4 _________ allele 16_________ allele 5 _________ allele 17_________ allele 6 _________ allele 18_________ allele 7 _________ allele 19_________ allele 8 _________ allele 20_________ allele 9 _________ allele 21_________ allele 10_________ allele 22_________ allele 11_________ allele 23_________ allele 12_________ allele 24_________

allele 1 _________ allele 2 _________ allele 3 _________ allele 4 _________ allele 5 _________ allele 6 _________ allele 7 _________ allele 8 _________ allele 9 _________ allele 10_________ allele 11_________ allele 12_________ allele 13_________ allele 14_________ allele 15_________ allele 16

allele 1 _________ allele 12_________ allele 2 _________ allele 13_________ allele 3 _________ allele 14_________ allele 4 _________ allele 15_________ allele 5 _________ allele 16_________ allele 6 _________ allele 17_________ allele 7 _________ allele 18_________ allele 8 _________ allele 19_________ allele 9 _________ allele 20_________ allele 10_________ allele 21_________ allele 11_________

Risposta Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 allele 1: 414 allele 13: 450 allele 2: 417 allele 14: 453 allele 3: 420 allele 15: 456 allele 4: 423 allele 16: 459 allele 5: 426 allele 17: 462 allele 6: 429 allele 18: 465 allele 7: 432 allele 19: 468 allele 8: 435 allele 20: 471 allele 9: 438 allele 21: 474 allele 10: 441 allele 22: 477 allele 11: 444 allele 23: 480 allele 12: 447 allele 24: 483

allele 1: 224 allele 2: 228 allele 3: 232 allele 4: 236 allele 5: 240 allele 6: 244 allele 7: 248 allele 8: 252 allele 9: 256 allele 10: 260 allele 11: 264 allele 12: 268 allele 13: 272 allele 14: 276 allele 15: 280 allele 16: 284

allele 1: 102 allele 12: 146 allele 2: 106 allele 13: 150 allele 3: 110 allele 14: 154 allele 4: 114 allele 15: 158 allele 5: 118 allele 16: 162 allele 6: 122 allele 17: 166 allele 7: 126 allele 18: 170 allele 8: 130 allele 19: 174 allele 9: 134 allele 20: 178 allele 10: 138 allele 21: 182 allele 11: 142

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3. Relativamente ai marcatori microsatelliti 1, 2, 3, sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, quanti sono i genotipi omozigoti e quali?

Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 N. genotipi omozigoti: ________ Genotipi: ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________

N. genotipi omozigoti: ________ Genotipi: _______________________________ _______________________________ _______________________________ _______________________________

N. genotipi omozigoti: ________ Genotipi: ______________________________ ______________________________

Risposta Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 N. genotipi omozigoti: 24 Genotipi: 414,414; 417,417; 420,420; 423,423; 426,426; 429,429; 432,432; 435,435; 438,438; 441,441; 444,444; 447,447; 450,450; 453,453; 456,456; 459,459; 462,462; 465,465; 471,471; 474,474; 477,477; 480,480; 483,483;

N. genotipi omozigoti: 16 Genotipi: 224,224; 228,228; 232,232; 236,236; 240,240; 244,244; 248,248; 252,252; 256,256; 260,260; 264,264; 268,268; 272,272; 276,276; 280,280; 284,284

N. genotipi omozigoti: 21 Genotipi: 102,102; 106,106; 110,110; 114,114; 118,118; 122,122; 126,126; 130,130; 134,134; 138,138; 142,142; 146,146; 150,150; 154,154; 158,158; 162,162; 166,166; 170,170; 174,174; 178,178; 182,182

4.Relativamente al marcatore microsatellite 1 sulla base dello schema riportato nella sezione 3.3, indicare almeno 5 possibili genotipi eterozigoti. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es, 5,9; vedi §1.8). Genotipo eterozigote 1 _______________ Genotipo eterozigote 2 _______________ Genotipo eterozigote 3 _______________ Genotipo eterozigote 4 _______________ Genotipo eterozigote 5 _______________ Risposta: per scrivere un genotipo eterozigote, bisogna abbinare un allele con un determinato peso molecolare, ossia con un dato numero di ripetizioni, con un altro allele di peso molecolare diverso dello stesso microsatellite, ad esempio 7,12 oppure 4,5. 5. Scrivere un possibile genotipo di un individuo eterozigote per tutti e tre i marcatori microsatelliti analizzati. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi §1.8).

Risposta: marcatore microsatellite 1: due alleli diversi, ad esempio 2,9 marcatore microsatellite 2: due alleli diversi, ad esempio 4,16 marcatore microsatellite 3: due alleli diversi, ad esempio 8,15 6. Scrivere un possibile genotipo di un individuo omozigote per il marcatore microsatellite 1 ed eterozigote per i marcatori microsatelliti 2 e 3. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi §1.8). ______________________

Risposta: marcatore microsatellite 1: due alleli uguali, ad esempio 3,3 marcatore microsatellite 2: due alleli diversi, ad esempio 5,10 marcatore microsatellite 3: due alleli diversi, ad esempio 1,9

7. Si consideri l’individuo il cui genotipo è stato scritto nel problema 6, ossia un individuo omozigote per il microsatellite 1 ed eterozigote per i microsatelliti 2 e 3. Si supponga di aver prelevato un campione di cellule da questo individuo, ad esempio un prelievo di sangue, di aver estratto il DNA, di aver tipizzato questo individuo mediante PCR per i microsatelliti 1, 2 e 3 e di aver fatto migrare i prodotti di PCR su gel di agarosio. Disegnare che tipo di bande di DNA ci si aspetta di osservare sul gel e in che posizione, rispetto ad un marcatore di peso molecolare.

15

8. Si considerino tre individui, A, B e C. Relativamente al marcatore 1, si supponga che l’individuo A sia omozigote per l’allele 6, l’individuo B eterozigote per gli alleli 10 e 15 e l’individuo C omozigote per l’allele 11. Relativamente al marcatore 2, si supponga che l’individuo A sia eterozigote per gli alleli 3, 8, l’individuo B eterozigote per gli alleli 1 e 12 e l’individuo C omozigote per l’allele 4. Relativamente al marcatore 3, si supponga che l’individuo A sia omozigote per l’allele 9, l’individuo B eterozigote per gli alleli 10 e 12 e l’individuo C eterozigote per gli alleli 16 e 21. Disegnare le bande di DNA che ci si aspetta di osservare sul gel e in che posizione, rispetto ad un marcatore di peso molecolare.

risposta

risposta

16

V SC S1 S2 S3

3.4 Schema dell’esperimento

Il campione di materiale biologico di Gianni è indicato con V= vittima Il campione prelevato sulla scena del crimine è il sangue ritrovato sulla bicicletta ed è indicato con la

lettera SC I campioni prelevati dai sospettati sono indicati con: S1, S2, S3

Dai campioni viene estratto il DNA, viene poi applicata la tecnica della PCR, utilizzando coppie di primer specifiche per i tre diversi microsatelliti; successivamente si effettua l’elettroforesi e si analizzano i risultati.

3.5 Protocollo sperimentale

3.5.1 principali unità di misura usate in biologia cellulare e molecolare a) alcuni prefissi comuni

Prefisso Simbolo Multiplo o

sottomultiplo Esempio

chilo k 103 1 kg è 1.000 grammi centi c 10-2 1 cm è 0.01 di un metro milli m 10-3 1 mL è 10-3 di un litro micro µ 10-6 1 µm è 10-6 di un metro nano n 10-9 1 ng è 10-9 di un grammo pico p 10-12 1 pg è 10-12 di un grammo

femto f 10-15 1 fg è 10-15 di un grammo atto a 10-18 1 ag è 10-18 di un grammo

b) unità di volume

Nell’esperimento che effettueremo, useremo per il DNA volumi molto piccoli, pari a circa 10 µl e per il tampone volumi maggiori, pari a circa 30-300 ml.

Quantità Abbreviazione Equivalente litro l

millilitro ml 10-3 l (1 ml = 1 cm3 = 1 cc) microlitro µl 10-6 l (1 µl = 1 mm3)

V

I sospetti

SC V S1; S2; S3

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Soluzioni e reagenti • tampone TBE (Tris-Borato-EDTA) 1x. Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10 della soluzione “madre” TBE 10x, la cui composizione è:

Tris 108 gr (0,89 M) acido borico 55 gr (0,89 M) EDTA 9.3 gr (0,02 M) pH 8,3 H2O a 1 litro. Il pH 8,3 viene raggiunto automaticamente.

• DNA prodotti con la PCR, già pronti • marcatore di peso molecolare (DNA del plasmide pUC8 tagliato con l’enzima di restrizione HaeIII) • agarosio in polvere (0.6 gr) • soluzione EuroSafe (1 µg/ml) • loading dye 6x, già pronto in eppendorf e contenente: • alcool etilico denaturato e H2O distillata

Preparazione del gel di agarosio

Nota di laboratorio: la concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle dimensioni dei frammenti di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA compresi tra 100 e 2.000 bp (base pairs, coppie di basi), si utilizza un gel di agarosio al 2%. Operazioni preliminari per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elastico prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani pulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturato prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la strumentazione che dovrà

utilizzare, in modo particolare con le micropipette Preparazione del gel preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di “nastro adesivo di carta” verificare che il piano su cui si appoggia la vaschetta per elettroforesi sia a bolla misurare 30 ml di tampone TBE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro pirex che contiene già 0,6

gr di agarosio. Attenzione a non rovesciare la beuta. L’agarosio costa 600 euro al chilo! pesare la beuta contenente la soluzione di agarosio e segnare il peso sul protocollo: _______ leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione del forno a microonde” sciogliere l’agarosio nel forno a microonde impostato sulla potenza indicata da una figura con tre

fiammelle ( circa 500V) per 1 minuto. Aprire poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendo attenzione a non scottarsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per un ulteriore minuto alla stessa potenza

pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare la soluzione di agarosio al peso originale, utilizzando una spruzzetta con H2O distillata. Attenzione: far cadere l’acqua delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenti si formano delle bolle

Aggiungere 1 µl di Eurosafe aspettare 3-5 minuti, coprendo la beuta contenente la soluzione di agarosio con un pezzetto di stagnola,

per evitare l’evaporazione. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai 60°C, altrimenti rovina il supporto di plastica della vaschetta dell’elettroforesi. Quindi versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vaschetta per elettroforesi dove è già stato inserito il pettine, nella quale va inserito il pettine. I pozzetti si formano quando, una volta solidificato il gel, viene tolto il pettine

lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Quando è solidificato, il gel diventa opaco mentre si aspetta che il gel solidifica, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel (12µl di loading

dye 1x) su altri gel già pronti togliere il nastro di carta dalla vaschetta e metterla nella cella versare il tampone TBE 1x nella camera di corsa (servono circa 250 ml), evitando che si formino bolle,

fino a coprire completamente il gel. Se si formano bolle, toglierle con la punta di una pipetta Pasteur togliere lentamente il pettine, tenendosi perpendicolare rispetto al gel

blu di bromofenolo 0.25% xilene cianolo 0.25% glicerolo 30%

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Corsa elettroforetica

scrivere su ciascuna eppendorf con un pennarello waterproof il tipo di campione che vi verrà trasferito: V = vittima; SC = scena del crimine; S1 = sospettato 1; S2 = sospettato 2; S3= sospettato 3; PM = marcatore di peso molecolare

prelevare 10 µl di ciascun campione di DNA e trasferirli nella eppendorf corrispondente aggiungere 2 µl di loading dye 6x e risospendere con la micropipetta, evitando di formare bolle. Il

glicerolo presente nel loading dye serve per rendere più densa la soluzione di DNA da caricare nel pozzetto e quindi a facilitarne l’entrata nel pozzetto

se si formano bolle, centrifugare brevemente (1 sec) in una microcentrifuga eppendorf (in gergo di laboratorio, si dice “spinnare” da spin, centrifugare)

leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione della centrifuga” posizionare la vaschetta per l’elettroforesi su un foglio nero, perchè sia più facile individuare i pozzetti caricare lentamente ciascun campione (12 µl) nei singoli pozzetti (ogni pozzetto ha un volume di circa 15 µl), ponendosi con la punta della micropipetta in un angolo del pozzetto e perpendicolare rispetto al gel, facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto stesso e a non far uscire il campione fuori dal pozzetto

in un pozzetto laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto chiudere il coperchio della cella elettroforetica leggere attentemente la “Nota di sicurezza sulla utilizzazione dell’apparato per elettroforesi” collegare i morsetti alla camera di corsa e ai poli del generatore di corrente, detto anche power supply; il

DNA è carico negativamente e migra verso il polo positivo fissare il voltaggio al valore costante di 100 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 50 min fare attenzione che la banda del blu di bromofenolo non esca dal gel (altrimenti alcune bande di DNA

possono uscire dal gel) osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendo incolore, non si

può vedere. Il blu di bromofenolo migra alla stessa velocità di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre lo xilen cianolo migra alla stessa velocità di un frammento di circa 4.000 bp. Attenzione: fermare la corsa elettroforetica quando il blu di bromofenolo si trova a circa 1-2 cm dalla fine del gel, in modo da evitare che il DNA esca dal gel stesso. Se dovesse succedere, si perdono i campioni di DNA!

Operazioni da svolgere alla fine della corsa elettroforetica. al termine della corsa, indossare i guanti monouso “disposable”, togliere delicatamente il gel dalla cella

elettroforetica fare un risciacquo del gel per togliere l’eccesso di colorante, trasferendo il gel in un’altra vaschetta

contenente 300 ml d’acqua a temperatura ambiente (va bene l’acqua di rubinetto) osservare il gel al transilluminatore documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel (ricordarsi di portare una macchina fotografica

digitale!) il tampone da elettroforesi TBE (Tris/Borato/EDTA) può essere riutilizzato diverse volte. Recuperate il

tampone usato e versatelo in una bottiglia con un imbuto pulire le apparecchiature ed il banco di lavoro con acqua ed etanolo denaturato dopo aver finito di lavorare, lavarsi le mani

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Nota di sicurezza Utilizzazione del forno a microonde

• non accendere il forno se è vuoto • non utilizzare il forno con materiali infiammabili • non utilizzare il forno con recipienti sigillati (potrebbero esplodere): svitare i tappi delle bottiglie, rimuovere i

coperchi • non utilizzare il forno con oggetti metallici o metallizzati: (es. bottiglie coperte di stagnola) e con carta d’argento • non riempire eccessivamente i recipienti: il liquido bollendo, potrebbe traboccare • proporzionare la potenza e il tempo di riscaldamento al contenuto in acqua di quanto viene riscaldato. In particolare,

nel caso di soluzioni acquose, il liquido potrebbe surriscaldarsi oltre il punto di ebollizione, senza che appaiano bollicine. Ciò può portare al traboccamento improvviso di liquido bollente. Per prevenire questo pericolo, mescolare il liquido prima di scaldarlo e lasciarlo riposare per qualche minuto prima di togliere il recipiente dal forno

• utilizzare i guanti imbottiti per togliere i recipienti dal forno • dopo l’uso pulire il forno con carta spruzzata con detersivo per vetri • in caso di incendio del contenuto del forno, tenere chiusa la porta, spegnere il forno, staccare la spina dalla presa di

corrente lasciando che il fuoco si estingua per soffocamento

Nota di sicurezza Utilizzazione dell’apparecchiatura per elettroforesi

• assicurarsi che l’alimentatore sia spento, prima di collegare i morsetti • assicurarsi che il coperchio della vaschetta sia correttamente posizionato, prima di collegare i morsetti • prima di rimuovere il coperchio della cella elettroforetica, spegnere l’alimentatore e staccare i morsetti

Nota di sicurezza Utilizzazione della centrifuga

• chiudere accuratamente il tappo delle provette, per evitare la fuoriuscita di liquido e la formazione di aerosol • assicurarsi che il rotore sia bilanciato: provette di ugual peso devono essere inserite negli alloggiamenti

diametralmente opposti • chiudere il coperchio della centrifuga prima di avviarla • non cercare di aprire il coperchio prima del completo arresto del rotore. In caso di fuoriuscita dei liquidi dalle

provette, avvertire il personale docente

Nota di sicurezza Smaltimento dei rifiuti

• tutto il materiale monouso (puntali, provette, pipette ecc.) va messo in appositi contenitori per rifiuti • cercare di ridurre al minimo il materiale da eliminare, visto i costi elevati del loro smaltimento

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3.5.6 marcatore di peso molecolare di DNA utilizzato

Come marcatore di peso molecolare è stato utilizzato il plasmide pUC8. Si tratta di una molecola di DNA a doppia elica, con struttura circolare, formata da circa 2.700 bp. Questo plasmide deriva, per successive modificazioni in laboratorio, da molecole di DNA normalmente presenti nei batteri. Come in tutte le molecole di DNA, nella sequenza nucleotidica di questo plasmide sono presenti i cosiddetti siti di restrizione, ossia delle particolari sequenze di basi (come GAATTC oppure GGCC), in corrispondenza delle quali particolari enzimi, detti enzimi di restrizione, tagliano la molecola di DNA. E’ un pò come tagliare un cerchio di corda (il DNA plasmidico) con delle forbici (gli enzimi di

restrizione) in punti specifici (i siti di restrizione). Se si conosce il peso molecolare del plasmide, ossia la sua lunghezza in coppie di basi, e la posizione dei siti di restrizione di un dato enzina di restrizione, tagliando a pezzetti una molecola circolare si formano frammenti lineari di DNA a peso molecolare noto. Questi costituiscono il marcatore di DNA a peso molecolare noto. Nel nostro caso, il marcatore di peso molecolare è costituito dal plasmide pUC8, tagliato con l’enzima di restrizione HaeIII.

3.5 Risultati Il risultato del gel di agarosio è riportato nello schema sottostante.

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3.7 Interpretazione La foto del gel va osservata attentamente per stabilire quale indiziato ha lo stesso profilo del DNA di quello prelevato dalla scena del crimine. Per avere la certezza è necessario che le bande dell’indiziato coincidano tutte perfettamente con quelle del campione trovato, ossia presentino lo stesso profilo di DNA. Nel nostro caso questo accade per l’indiziato 2. Attenzione: in genetica, una rondine non fa primavera, ma neanche due! In altri termini, per poter fare il profilo di un individuo ed ottenere risultati attendibili, bisogna analizzare secondo l’FBI almeno 13 microsatelliti. Nel nostro esperimento, abbiamo analizzato 3 microsatelliti e non 13, per motivi di tempo, di spazio e di costi. 3.7.1 domande di riepilogo Analizzare attentamente il risultato e rispondere alle seguenti domande. 1. Determinare il n° di ripetizioni degli alleli dei tre microsatelliti analizzati, tenendo presente lo schema

dei microsatelliti riportato nella sezione 3.3.

Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3 Allele

(peso mol.) N° ripetizioni Allele

(peso mol.) N°

ripetizioni Allele

(peso mol.) N° ripetizioni

Risposta

Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3

Allele (peso mol.)

N° ripetizioni Allele (peso mol.)

N° ripetizioni Allele (peso mol.)

N° ripetizioni

483 24 284 16 182 21 465 18 272 13 154 14 432 7 244 6 126 7 414 1 224 1 102 1

2. Determinare il genotipo degli individui relativo a ciascuno dei microsatelliti analizzati, compilando la tabella sottostante. Identificare gli alleli in base al numero di ripetizioni (ad es. 5, 9; vedi §1.8).

V SC S1 S2 S3 Microsatellite 1 Microsatellite 2 Microsatellite 3

Risposta

V SC S1 S2 S3 Microsatellite 1 1,18 7,24 1,24 7,24 1,18 Microsatellite 2 1,16 16,16 16,16 16,16 6,13 Microsatellite 3 1,14 1,21 7,14 1,21 7,21

3. Quale dei tre microsatelliti non è risultato utile per l’identificazione personale e perché? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ Risposta Il microsatellite 2, perchè alcuni individui (S1 e S2) sono risultati omozigoti. Come pure omozigote è risultato anche il DNA del campione SC. Se gli individui sono omozigoti, ossia presentano in omozigosi lo stesso allele, non è possibile distinguerli.

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4. Norme generali di sicurezza in laboratorio Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono essere tassativamente rispettate. • Entrando in laboratorio, individuare le vie di fuga, indicate dalla segnaletica verde. • In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davanti, con maniche lunghe e

polsini ad elastico. Al termine delle attività, prima di lasciare il laboratorio, togliersi il camice. In ogni caso, non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree (biblioteca, uffici, bar, ecc.), senza aver prima tolto il camice.

• Non introdurre in laboratorio borse, zaini o altro materiale non necessario. • Indossare guanti monouso durante la manipolazione di sangue o di materiale da esso derivato non fissato.

I guanti devono essere rimossi con attenzione e sostituiti quando sono visibilmente contaminati. I guanti si sfilano rovesciandoli e vanno gettati negli appositi contenitori.

• Gli studenti che presentano dermatiti o altre lesioni sulle mani, devono indossare guanti protettivi in tutte le fasi di lavoro.

• I guanti vanno tolti, quando si usino strumenti di qualsiasi natura (telefono, tastiera, strumenti scientifici, maniglie, ecc.). I guanti usati non vanno riutilizzati.

• Lavare le mani routinariamente, immediatamente dopo la manipolazione di materiali contaminati e, in ogni caso, dopo la fine delle attività, anche quando sono stati indossati i guanti. Lavare sempre le mani prima di lasciare il laboratorio.

• In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare oggetti alla bocca ed applicare cosmetici. • Non pipettare mai con la bocca, ma utilizzare le apposite propipette. • Non appoggiare recipienti contenenti liquidi biologici vicino al bordo del banco di lavoro. • Tutto il materiale biologico d'origine umana (sangue, ecc.) deve essere considerato come potenzialmente

infetto e pertanto trattato con le necessarie precauzioni. • Segnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento di materiale biologico (ad es. schizzi di

sangue) sul piano di lavoro, affinché si provveda alla decontaminazione con un germicida chimico appropriato (candeggina, ecc.).

• Decontaminare e pulire sempre, al termine del loro utilizzo, le apparecchiature scientifiche e, al termine della attività, i piani di lavoro.

• Seguire scrupolosamente le indicazioni di sicurezza riportate nei protocolli di esperimento. • Raccogliere tutti i liquidi biologici (sangue, terreni di coltura venuti a contatto con le cellule, cellule, ecc.)

in speciali contenitori per rifiuti, che verranno successivamente eliminati previo trattamento con candeggina al 15%.

• Mettere il materiale disposable (pipette, fiasche ecc.) venuto a contatto con materiale biologico in un sacco apposito, che verrà smaltito mediante incenerimento.

• Stante i costi elevati dello smaltimento, ridurre il più possibile l’uso del materiale disposable. • Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di materiale di

protezione

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5. Quiz di autovalutazione

1. Completa il brano, scegliendo tra i seguenti termini: somatiche, diploidi, aploidi, poliploidi, germinali, embrione, spora, sessuali, mitosi, meiosi, gameti, cellula uovo, spermatozoo, zigote, aneuploidi, fecondazione. Nella maggior parte degli esseri viventi, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia le cellule…………, hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono dette cellule………….. Mediante il processo di………………, alcune cellule cellule, dette………….danno origine a cellule riproduttive o ……………… Queste cellule si chiamano……………. e …………………, rispettivamente nel maschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della ………….. e danno origine alla prima cellula del nuovo organismo, detta………….

2. Il DNA dell’uomo è diverso da individuo a individuo, eccetto che nel caso di: A. marito e moglie B. fratello e sorella C. genitori e figli D. gemelli dizigotici E. gemelli monozigotici

3. Questo disegno rappresenta un nucleotide. Definisci le parti A, B e C:

A……………………………. B …………………………… C …………………………….

4. Le due emieliche di una molecola di DNA sono antiparallele. Questa affermazione significa che: A. una emielica ha la direzione 5’P 3’OH e l’altra 3’OH 5’P B. i legami chimici che tengono uniti i nucleotidi in ciascuna emielica sono diversi C. le due emieliche sono complementari D. una sola delle due emieliche viene trascritta E. la replicazione del DNA è semiconservativa

5. Indicare il corretto ordine decrescente di dimensioni:

A. gene, cromosoma, nucleotide, codone B. cromosoma, gene, codone, nucleotide C. nucleotide, cromosoma, gene, codone D. cromosoma, nucleotide, gene, codone E. gene, cromosoma, codone, nucleotide

6. Gli istoni sono:

A. tratti di DNA specifici per l’attacco della polimerasi B. proteine basiche utilizzate come marcatori nell’elettroforesi C. proteine basiche coinvolte nella spiralizzazione del DNA nei cromosomi D. sequenze di DNA codificante particolari proteine E. sequenze ripetute di DNA, che determinano polimorfismo allelico

7. La denaturazione del DNA consiste nella distruzione:

A. dei legami tra nucleotidi adiacenti B. dei legami tra zuccheroo e base azotata dei nucleotidi C. della struttura a doppia elica D. della sequenza nucleotidica della doppia elica E. nessuna delle precedenti

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8. In un organismo che produce gameti contenenti 32 cromosomi, il numero dei cromosomi contenuti

in una cellula somatica è: A. 16 B. 32 C. 4 D. 64 E. 8

9. Al microscopio ottico è possibile osservare:

A. virus B. ribosomi C. proteine D. batteri E. molecole inorganiche

10. Definite i seguenti termini: gene …………………………………………………………………………………… locus …………………………………………………………………………………… 11. In questo diagramma del processo di replicazione del DNA, i quadratini neri contrassegnati da D ed

E sono:

A. RNA iniziatore (primer) B. DNA filamento stampo (template strand)

C. frammenti di Okazaki D. DNA polimerasi

E. filamento di DNA di nuova sintesi

12. La replicazione del DNA: (Identificare l’affermazione sbagliata) A. è catalizzata dall’enzima DNA polimerasi B. avviene in modo simile in tutte le cellule di tutti gli organismi C. richiede l’intervento di numerosi enzimi D. necessita della presenza di un innesco a RNA E. avviene mediante aggiunta di nucleotidi in direzione 3'→5'

13. La replicazione semiconservativa del DNA assicura che siano prodotte: A. due molecole identiche di DNA, ognuna formata da una emielica già esistente e da una emielica neo-formata B. molte molecole di RNA, delle quali solo alcune maturano a RNA messaggeri C. quattro molecole di DNA, delle quali solo due vengono conservate D. due emieliche identiche di DNA, ognuna complementare al DNA stampo E. una sola emielica di DNA, copiando uno solo dei due filamenti stampo di DNA

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14. Una molecola di DNA è formata da un filamento che in un certo tratto è costituito dalla seguente sequenza nucleotidica:

5’ ATCCATTGTGTCAATT 3’. Scrivi quella del filamento complementare, indicandone la polarità.

15. La Taq polimerasi è: A. un enzima che interviene nella replicazione del DNA B. un enzima estratto da un batterio termofilo, usato nelle reazioni della PCR C. il colorante che permette di visualizzare le bande di DNA nell’elettroforesi D. l’enzima che favorisce l’annealing dei primer nei termociclatori E. un marcatore di peso molecolare usato nell’elettroforesi

16. Gli enzimi di restrizione:

A. separano la doppia elica di DNA nei due singoli filamenti B. copiano una porzione ristretta di DNA C. introducono geni estranei nel DNA D. tagliano il DNA a livello di sequenze nucleotidiche specifiche E. eliminano tratti di DNA

17. Quale delle seguenti affermazioni riguardo all’elettroforesi del DNA su gel di agarosio è

corretta? A. l’elettroforesi su gel separa le singole basi azotate del DNA B. nel corso dell’elettroforesi su gel i frammenti di DNA migrano verso l’elettrodo positivo

a causa della loro carica negativa C. i frammenti più grandi di DNA copriranno, nello stesso tempo, distanze maggiori nel gel

rispetto ai frammenti più piccoli D. questa tecnica è usata per amplificare il DNA E. é una tecnica che permette di tagliare il DNA in frammenti

18. Effettuando l’elettroforesi del DNA spiegate:

a - quale carica assume il DNA e a cosa è dovuta b - il verso di migrazione

19. L’acronimo PCR sta per: …………………………………… 20. La tecnica della PCR consiste di vari cicli di amplificazione della sequenza “bersaglio” di

DNA. Ogni ciclo di amplificazione, a sua volta, è costituito da tre fasi. Indicare quali. fase 1: _______________________ fase 2: ________________________ fase 3: _________________________

21. I primer utilizzati nella PCR:

A. sono sequenze ripetute di DNA B. sono oligonucleotidi ritagliati dagli enzimi di restrizione C. per essere utilizzabili devono essere presenti molte volte nel filamento di DNA D. sono corte sequenze nucleotodiche artificiali complementari al DNA da amplificare E. costituiscono i marcatori di peso molecolare usati come riferimento nell’elettroforesi

22. I markers di peso molecolare usati nell’elettroforesi per individuare la lunghezza dei

frammenti di DNA sono miscele di: A. molecole proteiche, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cella elettroforetica insieme ai campioni da analizzare B. molecole di DNA, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cella elettroforetica insieme ai campioni da analizzare

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C. varie molecole di DNA e proteine, a peso molecolare noto, che vengono fatte migrare nella cella elettroforetica insieme ai campioni da analizzare

D. isotopi radioattivi usati per marcare i frammenti di DNA da analizzare E. coloranti a peso molecolare noto che vengono fatte migrare nella cella elettroforetica

insieme ai campioni da analizzare

23. La tecnica della PCR: (Identificare l’affermazione sbagliata) A. necessita di elevate quantità di DNA per poterne effettuare l’amplificazione B. consente di amplificare una regione specifica del genoma C. si basa sull’utilizzo di due primer D. è costituita da vari cicli di amplificazione E. utilizza una DNA polimerasi termostabile

24. I cromosomi omologhi

A. sono presenti nelle femmine, ma non nei maschi B. sono diversi per forma e dimensioni, ma portano geni identici C. sono simili nella struttura e nella posizione occupata dai geni corrispondenti D. sono diversi a seconda che si trovino nei maschi o nelle femmine E. sono i cromosomi sessuali, contrapposti agli eterocromosomi

25. Osservando i risultati dell’elettroforesi su gel, quali conclusioni possiamo trarre se: A. notiamo una sola banda per un locus analizzato

B. notiamo due bande di diverso peso molecolare per lo stesso locus

26. I microsatelliti: A. sono corte sequenze nucleotidiche ripetute in numero variabile nei diversi individui, che

generano polimorfismo B. sono i punti di innesco della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA C. sono polimorfismi del DNA, facilmente identificabili dalle differenze nel fenotipo D. non sono utilizzabili come marcatori genetici perché presenti diffusamente in tutti gli

individui E. rappresentano differenti proteine codificate da alleli polimorfici

27. Quali sono le differenze tra polimorfismo allelico e polimorfismo del DNA?

………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………

28. Quanti diversi alleli di un singolo microsatellite è possibile identificare con il DNA profiling in un individuo eterozigote?

A. 1 B. 2 C. 4 D. 8 E. 6

29. I microsatelliti sono ottimi marcatori genetici perché:

A. sono frequenti in corrispondenza di loci cromosomici noti B. sono molto rari nella popolazione e quindi facilmente riconoscibili C. le sequenze ripetute determinano un elevato polimorfismo riconoscibile nel fenotipo D. la variabilità connessa al numero di sequenze ripetute garantisce un elevato

polimorfismo, in particolare negli eterozigoti E. sono facilmente identificabili dai primer forward e reverse

30. In un caso di attribuzione di paternità, il DNA del bambino viene confrontato con quello di

due uomini indicati dalla madre quali presunti padri. Il DNA profiling della madre rivela per un singolo microsatellite una singola banda di circa 220 bp. Il DNA del bambino rivela due

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bande di 220 e 232 bp. Il DNA del presunto padre 1 mostra due bande di 180 e 202 bp, mentre il DNA del presunto padre 2 rivela due bande di 202 e 232 bp. Quale uomo potrebbe essere il padre? A. presunto padre 1 B. presunto padre 2 C. entrambi D. nessuno dei due E. non si può determinare

31. La figura riporta i DNA profiling relativi a numerosi microsatelliti effettuati su 4 coppie di

gemelli (indicate con le lettere da A a D). Indicare quali coppie sono costituite da gemelli dizigotici.

A. coppie A e B B. coppie A e C C. coppie A e D D. coppia B e C E. coppie C e D

32. Da una madre con gruppo sanguigno A e un padre B può nascere un figlio con gruppo

sanguigno 0? In caso di risposta affermativa, indica la percentuale di figli con gruppo sanguigno 0 e il genotipo dei genitori.

33. Individua il peso molecolare totale in bp di due marcatori costituiti rispettivamente da:

- primo marcatore: un primer forward da 90 bp, un primer reverse da 50 bp, con 15 unità di ripetizione da 2 bp - secondo marcatore : un primer forward da 100 bp, un primer reverse da 120 bp, con 8 unità di ripetizione da 3 bp

RISPOSTE 1.Nella maggior parte degli esseri viventi, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia le cellule somatiche, hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono dette cellule diploidi. Mediante il processo di meiosi, alcune cellule cellule, dette germinali danno origine a cellule riproduttive o gameti. Queste cellule si chiamano spermatozoo e cellula uovo, rispettivamente nel maschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della fecondazione e danno origine alla prima cellula del nuovo organismo, detta zigote. 2. E 3. A. (base azotata); B. (ribosio o desossiribosio); C. (gruppo fosfato)

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4. A 5. B 6. C 7. C 8. D 9. D

10. gene: unità funzionale di eredità che corrisponde a un segmento di DNA che codifica per una proteina locus: posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene o da un suo allele

11. A 12. E 13. A 14. 3’ TAGGTAACACAGTTAA 5’ 15. B 16. D 17. B 18. A- Il DNA assume carica negativa per la presenza di gruppi fosfato

B - dal polo negativo al polo positivo

19. Polymerase Chain Reaction 20. Fase 1: denaturazione del DNA; fase 2:appaiamento (annealing) dei primer; fase 3: sintesi

(extension) di DNA 21. D 22. B 23. A 24. C 25. A – il soggetto è omozigote per quel carattere; B- il soggetto è eterozigote 26. A 27. polimorfismo allelico: si riferisce a sequenze di DNA codificante

polimorfismo del DNA: sequenze di DNA in genere non codificante 28. B 29. D 30. B 31. C 32. sì, 25%, A0, B0 33. 170 e 244 bp

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6. Glossario

Agarosio sostanza organica estratta da alcune alghe rosse e usata come gelificante

Allele Una delle possibili forme alternative che un gene, localizzato in uno specifico sito cromosomico, può assumere.

Annealing (appaiamento) formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla complementarietà delle basi

Aploide cellula o individuo con una sola copia (n) di ciascun cromosoma

Basi azotate molecole contenenti azoto, costituenti il filamento del DNA insieme allo zucchero deossiribosio e al gruppo fosfato. Sono quattro e si classificano in basi puriniche (A e G) e pirimidiniche (T e C)

Cellula Unità elementare di un organismo pluricellulare ed essa stessa, come unità singola, un organismo elementare

Cellula germinale o gamete Cellula aploide (n) deputata alla riproduzione (cellula uovo e spermatozoo)

Cellula somatica Cellula diploide (2n) destinata alla formazione del corpo (in greco “soma”) di un organismo e contrapposta a quella della linea germinale, deputata alla riproduzione

Cromosoma Struttura generalmente allungata, costituita da cromatina, visibile al microscopio ottico durante la divisione cellulare e contenente i geni in successione lineare

Cromosomi omologhi Coppie di cromosomi di forma generalmente simile, che contengono informazioni per gli stessi caratteri. Portano gli stessi geni, non necessariamente gli stessi alleli. Si appaiano alla meiosi

Denaturazione

perdita della configurazione originale di una macromolecola, dovuta ad es. all’aumento di temperatura, a cambiamenti estremi di pH, a trattamenti chimici o altro; generalmente è accompagnata a perdita dell’attività biologica. Nel caso del DNA, la denaturazione consiste nella separazione dei due filamenti della doppia elica per rottura dei legami a idrogeno tra le basi azotate

Diploide Cellula o organismo avente due copie di ciascun cromosoma dell’assetto (2n)

DNA abbreviazione di acido deossiribonucleico. Il DNA constituisce il materiale genetico di tutti gli organismi ( ad eccezione di alcuni virus). E’ costituito da due catene polinucleotidiche avvolte a doppia elica

DNA polimerasi enzima che sintetizza DNA unendo insieme nucleotidi e usando un singolo filamento di DNA come stampo

Elettroforesi tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente, mediante la migrazione in un campo elettrico

Enzima Proteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di una via metabolica in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quanto riconosce il substrato su cui agire

Enzima di restrizione detto anche endonucleasi di restrizione o forbice molecolare; enzima che taglia il DNA a doppia elica (e non quello a singolo filamento!), in corrispondenza di sequenze specifiche dette siti di restrizione

Eterozigote Organismo o cellula diploide, in cui sono presenti due alleli diversi di uno stesso gene (Aa)

Fenotipo Insieme delle caratteristiche visibili di un organismo, che risultano dall’interazione tra genotipo e ambiente

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Gemelli monozigotici

gemelli derivati dalla fecondazione di una singola cellula uovo e successiva separazione delle cellule dopo le primisisme divisioni mitotiche dello zigote. I gemelli monozigotici sono identici geneticamente

Gemelli dizigotici

gemelli derivati dalla fecondazione indipendente di due cellule uovo con due diversi spermatozoi. I gemelli dizigotici sono geneticamente simili quanto due fratelli. Possono essere dello stesso sesso oppure di sesso diverso

Gene unità funzionale di eredità che corrisponde di solito al segmento di DNA che codifica per una proteina

Genoma quantità totale di materiale genetico di una cellula; negli eucarioti indica anche l’assetto aploide dei cromosomi di una specie

Genotipo costituzione genetica di un organismo

Istoni proteine basiche ricche in arginina e lisina che partecipano alla formazione del nucleosoma nei cromosomi eucariotici

Locus ( plurale loci) posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel liguaggio comune il termine viene spesso usato come sinonimo di gene

Microsatelliti (STR)

Short Tandem Repeat. Polimorfismo del DNA corrispondente a una regione del genoma in cui segmenti identici di DNA di 2, 3 o 4 paia di basi sono ripetuti e disposti uno di seguito all’altro in posizione testa-coda (arrangiamento in tandem)

Mutazione Cambiamento del patrimonio genetico ereditabile, raro, improvviso e casuale; può verificarsi spontaneamente oppure essere indotto da agenti chimici o fisici

Nucleotide unità base ( monomero) del DNA e dell'RNA, formata da gruppo fosfato, zucchero e base azotata

Oligonucleotide corta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento di poche decine di paia di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti di ibridazione molecolare e nella PCR

Omozigote organismo o cellula diploide che porta alleli identici di uno steso gene (AA o aa)

PCR (polymerase chain reaction)

tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempo tratti specifici di DNA, purché se ne conosca almeno in parte la sequenza nucleotidica

Plasmide piccola molecola di DNA extracromosomico dei procarioti che ha la possibilità di trasferirsi da una cellula all’altra previa duplicazione.

Polimorfismo Esistenza di forme diverse. Può essere riferito a: alleli (polimorfismo allelico), proteine (polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA)

Polinucleotide Lunga molecola costituita da più nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici

Primer

corta catena polinucleotidica, a DNA o RNA, alla quale vengono aggiunti nuovi nucleotidi nel corso della sintesi di DNA. Noto anche con il termine di innesco. Nella PCR si utilizza una coppia di primer

Profilo del DNA (DNA profiling)

tecnica di genetica molecolare per identificare gli individui e distinguere un individuo dall’altro. Si basa sull’analisi dei microsatelliti

STR (Short Tandem Repeat, corta ripetizione in tandem)

vedi microsatellite

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7. Siti web utili Aspetti forensi http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/forensics.shtml http://whyfiles.org/014forensic/genetic_foren2.html http://www.laboratoriogenoma.it/indagini_paternita_come.asp Esercizi interattivi e laboratorio virtuale http://www.dnai.org/d/index.html http://www.molecularlab.it/interactive/index.asp http://www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html Approfondimenti http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/pv92/aluframeset.htm http://www.racine.ra.it/curba/biotecnologie/index.html (in italiano) 8. Concorso “Una settimana da ricercatore” Al termine delle attività di laboratorio, verrà distribuito agli insegnanti un quizzario con 30 domande da far svolgere in classe e che potrà servire sia come verifica del lavoro svolto che per selezionare lo studente migliore nella classe che avrà la possibilità di partecipare al concorso: “Una settimana da ricercatore”. Il concorso si svolgerà in un pomeriggio del mese di maggio presso l’Università degli Studi di Milano (il pomeriggio della prova verrà comunicato successivamente), attraverso una prova al computer, basata su test interattivi a risposta multipla. Per i primi classificati, il premio consisterà in uno stage presso un laboratorio di ricerca dell’Università degli Studi di Milano nel campo della Genetica molecolare. Lo stage si svolgerà al termine dell’anno scolastico, nei mesi di giugno o luglio.

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Supervisione di: Prof.ssa Maria Luisa Tenchini, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano. A cura di:

• Prof.ssa Silvana Dolfini Faccio, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche, Università degli Studi di Milano;

• Prof.ssa Cinzia Grazioli, insegnante di Scienze delle scuole secondarie di secondo grado, distaccata presso il Cus-Mi-Bio

• Prof.ssa Anna Cartisano, Liceo Vico, Corsico • Prof.ssa Anna Cimino, IIS Leonardo da Vinci Cologno Monzese • Prof.ssa G. De Falco, Liceo Scientifico Cremona , Milano • Prof.ssa R. Quarta, Itc Schiapparelli, Milano • Prof.ssa G. Tabita, IIS Leonardo da Vinci Cologno Monzese

Si ringrazia la Eppendorf Italia