modello di dinamica molecolare dell'inibitore della tripsinapancreatica bovina (BPTI) - il «topo di laboratorio» dei chimiciinformatici per via della sua relativa semplicità - appare circon-dato dall'acqua (sfere verdi e bianche). Sebbene complichi molto icalcoli necessari per creare modelli di proteine, l'acqua deve esse-re inclusa per comprendere il comportamento delle molecole bio-.

•logiche nell'ambiente acquoso della cellula.

Simulare molecole biologiche in acquaModelli al calcolatore dimostranocome l'ambiente acquoso influisca

su struttura e funzionamentodi molecole fondamentali per la vita

di Mark Gerstein e Michael Levitt

'acqua è a buon mercato, se nongratis, in buona parte del mon-do. Ma nell'estate del 1986, uno

di noi (Levitt) spese mezzo milione didollari per una quantità di acqua cheavrebbe potuto bagnare la punta di unospillo. Il denaro ovviamente non servìper acquistare quella minuscola quantitàdi acqua, ma per pagare le due settima-ne circa di lavoro su un enorme super-computer necessario per creare un mo-dello del processo con cui l'acqua in-fluisce sulla struttura e sulla dinamicadi una certa proteina.

La molecola in questione era l'inibi-tore della tripsina pancreatica dei bovini(BPTI), che si trova nel pancreas di que-sti ruminanti. La BPTI rappresenta unsoggetto di elezione per chi crea modellial calcolatore, semplicemente perché èuna proteina di dimensioni relativamen-te modeste e quindi più facile da studia-re rispetto ad altre. Essa era stata studia-ta in precedenza da Martin Karplus ecollaboratori della Harvard University,nel 1977, ma solamente in vacuo, ossiasenza altre molecole che potessero inte-ragire. Nessuno aveva mai visualizzatochiaramente la BPTI come esiste real-mente in una cellula vivente, circondatada migliaia di molecole di acqua.

Il mezzo milione di dollari risultòben speso. Non solo consentì a Levitt ealla sua collaboratrice Ruth Sharon diaccertare che il modello in vacuo dellaBPTI non era in grado di descrivere co-me la proteina appare e si comporta nel-la realtà; ma la scoperta aprì anche lastrada alla simulazione al computer del-la struttura di altre molecole biologichenel loro normale ambiente acquoso.

Attualmente, grazie ai grandi pro-gressi nella tecnologia dei computerrealizzati dal 1986, è possibile creare inun paio di giorni modelli di proteine co-

me la BPTI, con le molecole di acqua aloro associate, su un comunissimo desk-top. Sono ormai state simulate al calco-latore le forme idrate di più di 50 pro-teine e acidi nucleici come il DNA.

Perché è tanto importante compren-dere gli effetti dell'acqua sulle strutturedelle molecole biologiche? Principal-mente perché fornisce indicazioni sulleloro funzioni, aiutando gli studiosi acomprendere le interazioni biochimicheche nel loro insieme costituiscono la vi-ta. Su un piano più pratico, capire lestrutture delle molecole biologiche inambiente acquoso potrà un giorno faci-litare la formulazione di nuovi farmaciche agiranno bloccando o potenziandodiverse vie biochimiche.

Dentro l'acquaPer capire come l'acqua possa influi-

re sulla struttura delle molecole biologi-che, occorre in primo luogo valutare leproprietà dell'acqua stessa. Esse deriva-no dalla sua particolare struttura e dalmodo in cui questa permette all'acquadi «gestire» le cariche elettriche di altremolecole.

Una singola molecola d'acqua (H2O)ha una geometria essenzialmente tetrae-drica, con un atomo di ossigeno al cen-tro del tetraedro, gli atomi di idrogeno adue dei quattro angoli e nubi di carichenegative agli altri due angoli. Questenubi elettroniche derivano dal modo incui si combinano le strutture atomichedi ossigeno e idrogeno. In parole piùsemplici, l'ossigeno possiede otto elet-troni, con carica negativa, che ne cir-condano il nucleo, carico positivamen-te: due elettroni sono disposti in un gu-scio interno e sei in uno più esterno. Lacapacità massima del livello interno è didue elettroni, cosicché esso è completo,

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I legami idrogeno danno al-l'acqua le sue caratteri-stiche peculiari. In questomodello di acqua allo statoliquido, la molecola centra-le (sfere rossa e bianche) haformato legami idrogeno(linee verdi) con cinque al-tre molecole di acqua (V ro-sa). I suoi atomi di idroge-no (in bianco) sono legatiagli ossigeni di altre duemolecole di acqua, e l'ato-mo di ossigeno (in rosso) èlegato a un idrogeno di cia-scuna delle altre tre mole-cole di acqua. Ogni moleco-la di acqua liquida di solitoforma quattro o cinque le-gami idrogeno.

Molecole di forma quasi identica interagiscono in modo diverso con l'acqua, a se-conda che siano polari - ovvero che abbiano cariche parziali su alcuni atomi - o chenon abbiano cariche e quindi siano prive di polarità. L'urea, una molecola polareche si trova nell'urina, forma legami idrogeno con le molecole di acqua (sfere viola,in alto). Invece l'isobutene, non polare, non forma tali legami; le molecole d'acqualegate tra loro con legami idrogeno attorno all'isobutene formano una struttura agabbia (sfere verdi, in basso).

ma il livello esterno può contenerne fi-no a otto. L'idrogeno possiede un soloelettrone. Quando l'ossigeno si combinacon i due idrogeni, attrae l'elettrone diciascun idrogeno nel tentativo di riem-pire il proprio guscio esterno. Poichéogni elettrone dell'idrogeno passa piùtempo attorno all'atomo di ossigeno cheattorno al proprio nucleo carico positi-vamente, la molecola d'acqua risultapolare: essa possiede due nubi con lievecarica negativa attorno all'atomo di os-sigeno, mentre i due atomi di idrogenorimangono con una piccola carica posi-tiva. Questi due tipi di carica, tuttavia,si equilibrano l'uno con l'altro, e la mo-lecola di acqua è elettricamente neutra.

I chimici, solitamente, non raffigura-no le nubi di carica negativa attorno al-l'atomo di ossigeno di una molecola diacqua; per convenzione, essi la rappre-sentano come una V (si veda la figurain alto). Ogni lato della V corrisponde aun legame ossigeno-idrogeno di circa10-8 centimetri di lunghezza. L'angolo

Il sito attivo del lisozima (un enzima na-turale che uccide i batteri demolendo lemolecole zuccherine delle loro pareticellulari) si trova nel solco principaledella proteina (in alto a sinistra). Il sol-co è modellato esattamente per acco-gliere le molecole tagliate dall'enzima(sfere viola, in alto a destra). Un modellodi come l'acqua (sfere verdi e bianche,in basso a sinistra) interagisce con il sol-co aiuta gli studiosi a disegnare unamappa del sito attivo (in basso a destra;la sfumatura verde indica le molecoled'acqua che vengono facilmente sposta-te). Queste mappe possono rappresen-tare la chiave per realizzare nuovi far-maci che blocchino o favoriscano l'atti-vità di un particolare enzima.

formato dai due lati della V è di circa105°, ossia un po' meno dei 109,5° cherappresentano la misura dell'angolo for-mato dai lati di un tetraedro perfetto.

A causa della polarità delle molecoled'acqua, le interazioni tra l'idrogeno, acarica positiva, di una molecola d'acquae l'ossigeno, a carica negativa, di un'al-tra sono favorite. Tali interazioni sonodenominate legami idrogeno. Rispec-chiando la propria geometria tetraedri-ca, nell'acqua allo stato liquido spessoogni molecola forma quattro legamiidrogeno: due tra i suoi idrogeni e gliatomi di ossigeno di due altre molecoledi acqua, e due tra il suo atomo di ossi-geno e gli idrogeni di altre molecole diacqua. Ma la struttura di dettaglio del-

l'acqua liquida (diversamente dal ghiac-cio, che di solito è composto da un reti-colo di molecole di acqua disposte se-condo una geometria tetraedrica perfet-ta) può essere abbastanza casuale e irre-golare. Il numero effettivo di legamiidrogeno per molecola di acqua liquidaoscilla dai tre ai sei, con una media dicirca 4,5. La necessità di mantenere unaconfigurazione tetraedrica a legami i-drogeno dà all'acqua una struttura «a-perta», poco compatta se paragonatacon quella della maggior parte degli al-tri liquidi, come gli oli o l'azoto liquido.

Per costruire un modello al calcolato-re dell'acqua, occorre considerare duedifferenti tipi di forze: intra- e intermo-lecolari. Le interazioni all'interno di unamolecola d'acqua sono rappresentate daforze a breve raggio d'azione, create dailegami chimici tra gli atomi di idrogenoe ossigeno di ogni molecola. Le intera-zioni tra le molecole di acqua sono forzea lungo raggio di tipo elettrico. Le forzeintramolecolari limitano le lunghezzedei legami tra l'ossigeno di ciascunamolecola di acqua e i suoi idrogeni (el'angolo formato tra questi legami) a va-lori ben determinati. Queste forze sicomportano come molle: più una forzaesterna tende a distorcere i legami, piùessi le oppongono resistenza.

Le forze intermolecolari a lungo rag-gio d'azione si comportano diversamen-te dalle forze intramolecolari, in quantodiminuiscono di valore assoluto conl'aumento della distanza. Sostanzial-mente, le forze a lungo raggio nasconodall'attrazione tra cariche opposte e dal-la repulsione tra cariche di uguale se-

gno. Esse danno luogo ai legami idroge-no, nonché a forze più deboli, denomi-nate di van der Waals.

La simulazione al computer di mole-cole di acqua fu sperimentata per la pri-ma volta, nella seconda metà degli annisessanta, da Aneesur Rahman e FrankH. Stillinger presso i Bell Laboratories.Rahman e Stillinger simularono il motodi 216 molecole di acqua in una scatoladi forma rettangolare. (I ricercatori scel-sero questo numero di molecole perchécorrisponde a una scatola profonda, altae larga sei molecole d'acqua.) Nella lo-ro simulazione di cinque picosecondi(la più lunga possibile, usando la tec-nologia elettronica dell'epoca), Rahmane Stillinger scoprirono che il compor-tamento dell'acqua è una conseguen-za diretta delle relazioni energetiche in-tercorrenti tra le molecole. La simula-zione fu in grado di riprodurre quantita-tivamente molte delle proprietà dell'ac-qua, per esempio la sua struttura media,la velocità di diffusione e il calore dievaporazione.

La simulazione della vita

L'importanza dell'acqua nei processivitali deriva dalla sua capacità non solodi formare legami idrogeno con altremolecole d'acqua, ma anche di interagi-re con vari tipi di molecole biologiche.Per la sua natura polare, l'acqua reagi-sce facilmente con altre molecole polarie dotate di carica, come acidi, sali, zuc-cheri e varie regioni delle proteine e delDNA. Come conseguenza di tali intera-zioni, l'acqua può portare in soluzionele molecole polari, che sono pertantodenominate idrofile («attratte dall'ac-qua»). Per contro, l'acqua non interagi-sce facilmente con le molecole non po-lari, come i grassi: tutti sanno che olio eacqua non sono miscelabili. Le moleco-le non polari sono pertanto denominateidrofobe («che temono l'acqua»).

Le molecole biologiche, come le pro-teine e il DNA, contengono porzioni siaidrofile sia idrofobe distribuite in lun-ghe catene. Le strutture tridimensionalidi queste molecole sono dettate dal mo-do in cui tali catene si avvolgono instrutture più compatte, così che i gruppiidrofili stanno in superficie interagendocon l'acqua, mentre i gruppi idrofobisono confinati all'interno, lontano dal-l'acqua. Nel 1959 Walter Kauzmannpropose che tale azione idrofoba fosseessenziale per l'avvolgimento delle pro-teine e il ruolo delle proprietà idrofobein tale processo è ancora oggi un temadi grande interesse (si veda l'articolo Ilproblema dell'avvolgimento delle pro-teine di Frederic M. Richards in «LeScienze» n. 271, marzo 1991).

Vi sono tre tipi di molecole d'acqua

che devono essere presi in considerazio-ne quando si vuole costruire al compu-ter il modello di una molecola biologicain soluzione acquosa: l'acqua «associa-ta», ossia quella che circonda la mole-cola e interagisce fortemente con essa;

l'acqua «libera» all'intorno, e quellache può essere contenuta entro la mole-cola. Una singola cellula contiene mi-liardi di molecole di acqua: quasi tuttolo spazio non occupato dagli atomi checompongono le molecole biologiche è

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L'alfa elica, una struttura che si riscontra nella maggior parte delle proteine, puòsvolgersi più agevolmente in acqua perché le molecole di acqua possono sostituire ilegami idrogeno (linee verdi) che normalmente tengono insieme l'elica. Una mole-cola di acqua (in verde) sta creando un ponte tra un atomo di ossigeno (in rosso) eun gruppo NH (in blu), che normalmente si trova legato nell'elica avvolta a spirale.

1n.

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colmato da acqua. Le cellule umane so-no, in effetti, costituite soprattutto daacqua, che rappresenta circa il 60 percento del peso del corpo umano.

Come possiamo introdurre nel mo-dello tutti questi tipi di acqua, insiemecon i singoli atomi di una molecola bio-logica? Detto in breve, descriviamodapprima le interazioni fondamentali tratutti gli atomi e lasciamo che il sistemaevolva secondo le leggi della fisicanewtoniana. Questa simulazione neces-sita di due ingredienti di base: un modoper descrivere le interazioni all'internoe tra l'acqua e le molecole biologiche(ossia le forze intra- e intermolecolari),e una procedura per riportare in graficoi loro movimenti nel tempo, che costi-tuiscono la dinamica molecolare.

Con questo metodo si ottiene una se-quenza di configurazioni molto simili aifotogrammi di un film. Ogni atomo simuove nel tempo in una serie di «passi»distinti, che chiamiamo «fasi tempora-li». Essenzialmente, la nuova posizionedi un atomo è data da quella precedentesommata alla distanza compiuta in unadata fase temporale. Se sull'atomo nonagisse alcuna forza, la distanza percorsasarebbe funzione della sua velocità nellaposizione precedente, poiché la distanzaè uguale alla velocità moltiplicata per iltempo. Durante una fase temporale, tut-tavia, le forze esercitate da altri atomiprovocano l'accelerazione dell'atomo,che quindi modifica la propria velocità.Se le forze sono costanti durantela fase temporale, le leggi diNewton stabiliscono che la va-riazione di velocità è proporzio-nale alla forza applicata, cosìche è possibile calcolare una ve-locità aggiornata. Si può inoltre

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sfruttare tale velocità per calcolare lanuova posizione dell'atomo. Gli atomidi un liquido che interagiscono forte-mente non possono allontanarsi molto, equindi è necessario utilizzare una fasetemporale molto breve: un femtosecon-do. pari a 10-' 5 secondi. In questo perio-do. una molecola d'acqua si sposta solo1/500 del suo diametro.

In una simulazione di lunga durata, ilcalcolo di ciascuna fase temporale pertutti gli atomi di una molecola biologicacon la sua acqua associata produce unaenorme massa di dati. Una piccola pro-teina in acqua, per esempio, forniscemezzo milione di teme di coordinatecartesiane in un nanosecondo, ciascunadelle quali descrive la posizione di circa10 000 atomi. Il film generato da questasimulazione è molto dettagliato: si puòvedere ogni molecola di acqua che ruo-ta, scorre e vibra in milioni di immagini.

Per spiegare come la simulazione alcomputer possa rappresentare il modoin cui l'acqua influisce sulla dinami-ca molecolare, bisogna prendere in con-siderazione due semplici molecole or-

ganiche, l'isobutene e l'urea, che han-no configurazione simile ma proprietàmolto diverse. L'isobutene, un combu-stibile derivato dalla raffinazione delpetrolio, è una molecola con configura-zione a Y, non polare (e quindi idrofo-ba). il cui scheletro consiste in quat-tro atomi di carbonio, due dei quali so-no uniti da un doppio legame. L'urea èun prodotto del metabolismo proteicoescreto con l'urina. Anch'essa possiedeuna configurazione a Y: un gruppo car-bonile (C=0) è legato a due gruppi am-minici (NH2). Diversamente dall'isobu-tene, l'urea è una molecola a forte pola-rità, e quindi idrofila.

Quando si effettuano le simulazionial computer per l'isobutene e l'urea, sinota che l'acqua attorno alle due mo-lecole si comporta diversamente. Lemolecole d'acqua interagiscono diret-tamente con l'urea, formando legamiidrogeno con gli atomi di ossigeno e diidrogeno di quest'ultima, oltre che conquelli di altre molecole d'acqua. Al con-trario, le molecole di acqua rimangonolontane dall'isobutene, che è idrofobo, eformano legami idrogeno' solo tra loro,creando una «gabbia» di acqua che cir-conda la molecola dell'isobutene.

La visualizzazione del modo incui l'acqua interagisce con que-

ste molecole semplici aiuta acapirne il comportamento in

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presenza di molecole biologi-che più complesse, quali le proteinee gli acidi nucleici. L'acqua, per esem-pio, è una parte fondamentale dellastruttura del DNA. I primi tentativi dicreare modelli di dinamica molecolaredel DNA in vacuo fallirono perché leforze di repulsione tra i gruppi fosfatoche compongono lo scheletro della dop-pia elica del DNA, carichi negativamen-te, causavano la rottura della molecoladopo soli 50 picosecondi. Alla fine de-gli anni ottanta, Levitt e Miriam Hirsh-berg, del National Institute for MedicalResearch di Londra, riuscirono a creareun modello di DNA della durata di 500picosecondi includendovi molecole diacqua che stabilizzavano la struttura adoppia elica formando legami idrogenocon i gruppi fosfato. Successive simula-zioni del DNA in ambiente acquosohanno rivelato che le molecole di acquasono in grado di interagire con quasiogni porzione della doppia elica delDNA, comprese le coppie di basi checostituiscono il codice genetico.

Al contrario, l'acqua non è in gradodi penetrare in profondità nelle strutturedelle proteine, le cui porzioni idrofobesono ripiegate all'interno in un nucleocompatto. Di conseguenza, le simula-zioni acqua-proteina si sono concentratesulla superficie della molecola proteica,che è molto meno strettamente impac-cata rispetto alla parte interna.

Il modo in cui le molecole di acquainteragiscono con la superficie delleproteine dà luogo a geometrie moltointeressanti, in particolare nei solchiprofondi sulla superficie degli enzimi,proteine che favoriscono le reazioni chi-miche nelle cellule. Le molecole di ac-qua unite da legami idrogeno hanno dif-ficoltà a inserirsi in questi solchi e ven-gono facilmente spostate dai ligandi - lemolecole con le quali un enzima è desti-nato a interagire - il che può spiegare ilmotivo per cui i siti attivi degli enzimisi trovano di frequente nei solchi. Spes-so si rileva che la disposizione dellemolecole di acqua in un sito attivo vuo-to imita la geometria e la struttura delligando, un fenomeno, questo, che tal-volta si sfrutta nella formulazione deifarmaci.

simulazioni al computer mostra che, inmedia, le distanze coincidono.

Per confermare la dinamica di una si-mulazione molecolare, si mette a con-fronto il comportamento previsto dellamolecola biologica simulata in acquacon le sue proprietà verificate in labora-torio. Per esempio, la maggior partedelle proteine contiene almeno un'alfaelica, ossia una regione in cui gli ammi-noacidi che compongono la proteina siattorcigliano a formare una spirale. Dairisultati sperimentali si sa che il caloreprovoca lo svolgimento di queste alfaeliche, mentre nei primi tentativi di si-mulazione del comportamento di unaalfa elica semplice in vacuo, a elevatetemperature, l'elica rimaneva intatta.Solo introducendo l'acqua nella simula-zione Levitt e Valerie Daggett, dell'U-niversità di Washington, furono in gra-do di simulare il reale comportamentodi un'alfa elica.

Le simulazioni al computer fornisco-no un numero sempre maggiore di infor-mazioni riguardanti la forma di moltemolecole biologiche e il modo in cui es-se svolgono i loro compiti in un organi-smo vivente. Tuttavia, se si cerca di con-durre simulazioni di molecole biologichesempre più complesse nell'ambiente ac-quoso ci si imbatte ancora nei limiti dellatecnologia informatica e nei costi di uti-lizzo dei supercomputer. Quando gliscienziati pubblicano modelli di moleco-le biologiche, di solito li rappresentanocon colori brillanti su sfondo uniforme:ora si sa che l'ambiente in cui questemolecole esistono - l'acqua - è importan-te quanto la loro struttura stessa.

Vivere nel mondo reale

Quanto si avvicinano alla realtà le si-mulazioni delle molecole biologiche inacqua? Purtroppo non è possibile ri-spondere a tale domanda in via definiti-va, poiché nessuna tecnica sperimentalepuò fornire informazioni tanto detta-gliate riguardo alle singole molecole ealle loro interazioni quanto la creazionedi modelli al computer. Ciò che è possi-bile fare è confrontare diversi valori ot-tenuti dalle simulazioni con i risultatisperimentali.

Uno dei principali metodi di approc-cio che può essere utilizzato per verifi-care le strutture di molecole biologichesimulate in ambiente acquoso è la diffu-sione di neutroni e raggi X. In un espe-rimento di questo tipo si dirige un fa-scio di neutroni su un piccolo campionee si registra come vengono diffusi dallemolecole che lo costituiscono. Gli spaziintermolecolari si comportano ognunocome una piccolissima fenditura, chefornisce una caratteristica figura di dif-frazione. Analizzando queste figure, èpossibile determinare facilmente le di-stanze intermolecolari. Il confronto fra irisultati della diffusione di neutroni e le

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s. La doppia elica del DNA (sopra)ha due filamenti con uno schele-tro di gruppi fosfato (sfere rosse egialle) avvolti attorno a una «pi-la» di coppie di basi (sfere grigie,

i < blu, rosse e bianche). La sezionedi una simulazione di DNA in ac-r /qua (a lato) mostra come le mole-

) cole di acqua (V verdi e bianche)

4 fv. riescano a penetrare in profon-dità nella struttura a doppia elicadel DNA, rendendola più stabile.Le sfere viola indicano gli ioni so-dio nella soluzione acquosa.

MARK GERSTEIN e MICHAEL LEVITT collaborano dal 1993, quando Gersteinè diventato membro del Dipartimento di biologia strutturale della Stanford Univer-sity, dove Levitt è preside. Levitt, laureatosi nel 1971 all'Università di Cambridge, haavuto incarichi accademici presso il Laboratory of Molecular Biology di Cambridge,il Salk Institute for Biological Studies di San Diego e il Weizmann Institute of Scien-ce di Rehovot, in Israele. Già consulente di società farmaceutiche, Levitt ha fondatola Molecular Applications Group di Palo Alto, in California. Gerstein è professore as-sistente alla Yale University; ha conseguito la laurea a Cambridge nel 1993.

LEVITT MICHAEL e PARK BR1TT H., Water: Now You See lt, Now You Don't in«Structure», 1, n. 4, 15 dicembre 1993.

GERSTEIN MARK e CHOTHIA CYRUS, Packing at the Protein-Water Inteiface in«Proceedings of the National Academy of Sciences USA», 93, n. 19, 17 settembre1996.

Per gli archivi elettronici delle strutture molecolari, visitare bioinfo.mbb.yale.edue hyper.stanford.edu su World Wide Web.

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