SEMEIOTICA MEDICINA DI LABORATORIO

SEMEIOTICA-MEDICINA DI LABORATORIO

Sommario1.Flogosi e indice di flogosi .............................................................................................................. 1

La Proteina C Reattiva (PCR o CRP): ......................................................................................... 2 La VES ......................................................................................................................................... 4 La flogosi ..................................................................................................................................... 6

2.Markers cardiaci .......................................................................................................................... 9 3.Diagnosi per apparati .................................................................................................................. 13

1.Pancreas .................................................................................................................................. 13 Diabete ............................................................................................................................. 14

2.Colon ....................................................................................................................................... 15 3.Fegato ..................................................................................................................................... 17 4.Elementi di ematologia .......................................................................................................... 24 5.Apparato urinario ................................................................................................................. 28

4.Markers tumorali ....................................................................................................................... 32

1.Flogosi e indice di flogosila flogosi è una risposta difensiva locale di un tessuto vascolarizzato, ad un danno. Mediata e controllata da mediatori biochimici.

E' caratterizzata da:

1.Effetti locali:rubor, tumor, dolor, calor, functio laesa: si avrà dolore, tumefazione, riduzione dell'attività dell'organo, arrossamento...

2.Effetti sistemici:Sintomi specifici in base alla patologia/patogeno, febbre, leucocitosi e modificazioni biochimico-cliniche di fase acuta (le ultime 2 di maggior interesse laboratoriale).

Tali modificazioni sono il risultato di diversi regolatori dell'infiammazione: 1.TNF-α: citochina scoperta inizialmente a livello delle cell tumorali, e poi scoperte anche in altre cell. Regola l'espressione di altre citochine infiammatorie, come IL-1, IL-6, IL-8 (prima 1 poi 6 e 8).Varierà anche il picco, aumenta di più il TNF, poi IL-1 e poi IL-6 e 8. Avverrà poi sintesi di diverse citochine proinfiammatorie che si porteranno a livello epatico: il fegato produrrà diversi mediatori della fase acuta, detti proteine della fase acuta, come per es la serum amyloid protein, PCR, fibrinogeno (che quindi aumenteranno in fase infiammatoria).

Modifiche che avvengono durante la fase acuta:1.Proteina C reattiva: aumenta anche di dieci volte il normale2.VES3.Fibrinogeno: aumenta tipicamente nell'infiammazione (è collegato ad essa, non solo quindi a coagulazione). Aumenta anche del 200-400%. 4.Leucociti

Semeiotica-Medicina di laboratorio-Pippo Federico-A.A. 2009-2010 1

Ci sono altri parametri che potrebbero essere dosabili (per es ferritina, aptoglobina, ceruloplasmina...), ma sono esami più specifici, più costosi, ma non danno ulteriori informazioni a quelle date dai 4 fattori precedenti-->ergo non vengono eseguiti di norma.

Oltre alla risposta biochimica, ci sarà anche una risposta cellulare:per es:1.aumento dei globuli bianchi, in modo differente per es in base al tipo di infiammazione (virus:aumentano i linfociti, batteri: i granulociti); 2.oppure interverranno i fibroblasti per riparare le lesioni causate dalla flogosi. La formazione della cicatrice è l'unico modo che l'organismo ha per riparare dei danni, non ci sarà la sostituzione con un tessuto analogo, diverso dalla zona colpita:ciò avrà dei lati negativi, ma anche positivi (rapidità di riparazione con tale metodo per es). Da notare che solo nelle prime fasi di sviluppo l'organismo riesce a riparare con tessuto analogo a quello danneggiato.

La Proteina C Reattiva (PCR o CRP):fa parte delle pentrassine, proteine con forma pentamerica, famiglia con 2 gruppi, con lunghezze differenti:1.Pentrassine corte: PCR, SAP2.Pentrassine lunghe: PTX3, neuropentrassine 1 e 2

La differenza tra PCR e PTX3 è l'origine: PCR-->fegato; PTX3:a livello locale.

Hanno però un dominio comune, identico, nonchè una sequenza aminoacidica identica: intervengono nell'apoptosi (o morte cellulare programmata, diversa dalla necrosi perchè il primo è stabilito dal sistema, il secondo fenomeno non è regolato dall'organismo stesso); saranno quindi diverse per il dominio N terminale, simili o uguali per il C terminale. L'apoptosi procede con la formazione di corpi apoptotici, che saranno eliminati dai macrofagi, e non scateneranno una flogosi: il fagocita è dotato di appositi recettori per il corpo apoptotico. Tali corpi apoptotici impediscono sversamento di elementi cellulari, che, se liberati in matrice extracellulare sarebbero proinfiammatori. La PCR facilita il riconoscimento, facilita cioè la fagocitosi. Ciò avviene o senza C1q (elemento del complemento) o con esso; il macrofago inoltre produce interleuchine (come IL-10, oppure TGF β ) antinfiammatorie.

• Deficit di C1q possono predisporre a malattie autoimmuni come il Lupus ES (non si sa bene perchè, forse per eccesso di stimolo antigenico da ridotta eliminazione delle cellule andate incontro ad apoptosi).

• La SAP "rimpiazza" il colesterolo sull'apolipoproteina A delle HDL, favorendo uptake di tali particelle da parte dei macrofagi che possono usarle per produrre energia e promuovere fagocitosi.

• Accenno sulle HDL: le HDL trasportano il cosidetto colesterolo buono: sono prodotte a livello epatico, hanno maggior quantitativo di colesterolo + alcune apolipoproteine (C, E, A). Sono capaci di prendere il colesterolo a livello periferico (in particolare vasi) e riportarlo al fegato.

Dosaggio della PCR:1.Nefelometria2.RIA3.Immunodiffusione(non serve imparare i valori di riferimento, perchè nell'esame viene sempre indicato il range corretto).(4.per la PTX 3, scoperta e usata attivamente solo nel 2004, ci sono ancora delle riserve, proprio per il suo ancora troppo recente uso. La PCR è collaudata!).

1.Nefelometria:sfrutta una caratteristica fisica (effetto Tyndall): delle particelle sufficentemente piccole rispetto a una lunghezza d'onda, riflettono e rifrangono tale onda (effetto della luce in un luogo umido come in un bosco, per capirsi). E' una relazione tra la lunghezza d'onda e le particelle quindi. Tanto più la luce viene deviata, e tanto più sarà concentrata la PCR. Tecnica molto precisa e sensibile.


2.RIA (Radio Immuno Assay): supporto solido su cui sono fissati anticorpi anti PCR (ovviamente tale tecnica è usata anche per altre proteine, cambieranno gli Ab).Sarà un test di competizione tra la PCR del sangue e una PCR (a concentrazione nota) marcata appositamente: le 2 PCR competono per il legame con Ab-->maggiore è la concentrazione di una PCR, maggiore sarà la quantità che si lega. Si misura la radioattività residua dopo uno o più lavaggi: tanto più il test sarà radioattivo, e tanto meno PCR nel campione del paziente ci sarà, e viceversa.

3.Immunodiffusione:gel con una rete polimerica all'interno di cui si possono spostare delle componenti, come un Ab VS PCR e la PCR stessa. Tali elementi possono migrare, grazie a un gradiente di concentrazione e incontrarsi-->se si incontrano avviene formazione di un precipitato. Tanto + precipitato, tanta più PCR era presente all'inizio.

Nota bene: iIn ogni caso la PCR è aspecifica: non si può definire la causa della presenza della PCR, per lo meno dal PDV laboratoriale. Il clinico comprenderà il quadro generale e riuscirà a capire perchè c'è un elevato livello di tale proteina.

Valori di riferimentoraggiunge prima un picco, forma una campana molto stretta all'inizio di un evento flogistico. Poi, se la causa infiammatoria viene meno, cala abbastanza rapidamente. Anche il fibrinogeno varierà la sua concentrazione, ma calerà con minor rapidità. Quindi in caso di fibrinogeno elevato e PCR quasi normale: si sarà di fronte a un quadro in risoluzione o risolto. Viceversa, si sarà di fronte a un caso appena iniziato.

• La VES avrà un andamento fibrinogeno simile, si farà un ragionamento analogo. • Nello studio dei dati laboratoriali, sarà importante considerare anche il tempo, l'andamento dei

dati in base al tempo. • Altra importante applicazione della PCR: aterosclerosi: tanto più c'è infiammazione, tanto più si

può instaurare l'aterosclerosi o complicarsi. Sarà utile studiare la PCR quindi nonchè altri valori, come la colesterolemia. Si può valutare la PCR con tecniche ad alta sensibilità: mentre per la flogosi basta individuare grosse variazioni di tale proteina, per l'aterosclerosi serviranno variazioni più piccole.

• Infine, la PCR è elevata in IMA (infarto miocardico acuto) in cui si ha necrosi del tessuto miocardico-->stimolerà la flogosi, ecco quindi perchè si ritroveranno alti livelli di PCR.

• PTX3: come anticipato è prodotto localmente, in ogni sistema (caridiaco, renale...) è il miglior indice prognostico di morte a 3 mesi dall'evento infarto cardiaco. Svantaggio: deve essere prelevato localmente, perchè li è prodotto.

• Colesterolo e PCR: è utile misurare colesterolo totale/HDL ("buono")-->si ricaveranno dei valori (ottimale: minore di 3.4):Alti valori di colesterolemia e di PCR: rischio di malattie cardiovascolari: alto, molto alto. Bassi valori di PCR e di colesterolo: il top, rischio minimo o nullo. Tale tabella si userà soprattutto se sono presenti altri fattori di rischio (ipertensione, familiarità...). Si potrà intervenire farmacologicamente sulla colesterolemia, ma non si potrà agire contro la PCR.

• Si è visto in un trial clinico come l'aumento di LDL sia associato a una maggior produzione di PTX3: tutto ciò sarà direttamente proporzionale all'aumento del rischio aterosclerotico:si è analizzato l'espressione in RNA della proteina PTX3 (è possibile che una proteina prodotta a gran velocità e in grandi quantità possa non essere stabile-->è possibile venga degradata).Non si è associato un aumento di PCR, aspettato dato l'aumento di PTX, ma questo può essere dovuto al fatto che non sia stata valutata la PCR ad alta sensibilità.

• E' possibile una correlazione tra PCR e lo sviluppo del cancro al colon o del polmone. Infine, i valori di PCR aumentano quindi nelle infiammazioni (batteriche, immunitarie: morbo di Chron, artrite reumatoide per es, tumori: perchè c'è una componente infiammatoria associata+componente necrotica del tumore, in cui la vascolarizzazione delle masse tumorali è imperfetta).


04.03.2010La VESDOMANDE SU VES E SUA VARIAZIONEMisura la rapidità con cui le emazie sedimentano nel plasma in cui sono sospese (si aggiunge eparina come anticoagulante; la temp è controllata): i GR si depositeranno, il plasma sarà al di sopra. L'altezza della colonna viene misurata per comprendere stati infiammatori o meno. Si basa sulla legge di Stokes, in cui la velocità dipenderà dal raggio al quadrato del corpo, la densità, l'accelerazione di gravità (costante) diviso 9 per la viscosità del liquido.

Da qui si possono comprendere che ci sono delle variabili che modificano la VES:1.Il raggio: il fatto che sia al quadrato è importante, piccole variazioni dello stesso avranno grandi effetti, saranno significative: può variare per es in caso di anemie microcitiche ipocromiche, in cui i GR hanno diametro ridotto (media di 80 femtolitri), che può verificarsi per es in caso di mancanza di ferro, oppure in caso di α o β talassemie. Oppure macrocitiche se manca fattore intrinseco, folati...I folati sono coinvolti nella sintesi delle basi azotate-->se mancano, la cellula inizia a organizzarsi per la moltiplicazione, ma se mancano le basi azotate non potrà completare il processo-->per questo resteranno in circolo cellule di grandi dimensioni-->aumento del raggio-->influenza su VES.2.Densità del GR: (massa/volume):di norma è in ogni caso costante 3.Densità del plasma: costante (sulla terra!)4.Viscosità: tanto più aumenta, tanto più si abbassa la VES (perchè la viscosità è al denominatore): è anche ovvio perchè un corpo in un liquido denso andrà a fondo più lentamente. 5.Temperatura:influisce sulla viscosità e quindi la VES, deve essere di norma a 24 gradi. Influirà anche sulla velocità dei GR, cioè aumenta l'energia cinetica-->ad alte temp avranno più energia cinetica, quindi non si depositano facilmente. 6.Concentrazione proteica:influenza la viscosità: ipoalbuminemie modificano la viscosità (per es in caso di patologie epatiche avanzate, perchè il fegato è la sua sede di sintesi, oppure in caso di sindromi nefrosiche, in cui si ha notevole albuminuria, oppure le enteropatie proteinodisperdenti, come il morbo di Chron, infiammazione autoimmune di 4 tipo in cui non si avrà assorbimento dei nutrienti).7.Fibrinogeno:è una proteina con carica globale positiva: le membrane dei GR (grazie ad abbondante acido sialico) e in genere tutte le cell hanno carica globale negativa. L'aumento di fibrinogeno neutralizza tali cariche negative, e i GR tenderanno più facilmente a depositarsi. Fibrinogeno influisce su viscosità e cariche quindi, ma non sarà possibile prevedere facilmente il risultato.

Valori di riferimento La VES varia in base all'età: suggetto giovane: VES più bassa rispetto all'adulto. Nell'uomo si calcola come età/2, nella donna (età+10)/2.

• Si ricorda la differenza tra plasma e siero: il secondo sarà plasma privo di fibrinogeno.

Come viene misuratacampione di sangue+citrato di sodio-->posto in provetta, tenuta verticalmente-->si calcola dopo 1 e/o 2 ore ciò: si legge l'altezza della colonna di plasma formata sopra la parte corpuscolata. Si può usare una formula (indice di Katz) in cui si analizza si altezza dopo prima che seconda ora, ma ora si usa più spesso l'altezza della colonna dopo la prima ora e basta.

Una nuova tecnica, la fotometria capillare quantitativa, permette sempre di misurare la VES: valuta il processo dinamico con cui i GR precipitano, è una misurazione dinamica. Non varia in base al numero, forma dei GR o per presenza di certe proteine (tumorali): è utile per questo, ma è ancora poco usata.

Anche la VES è un marker aspecifico di infiammazione: non si può definire la causa della VES, ma solo sapere che è in atto. E' utile andare ad analizzare la differenza tra la VES rispetto a uno stato (personale) basale: più che un


valore assoluto, conta quindi il valore differenziale,ossia l'aumento rispetto alla normalità per quel paziente.

• E' utile per es in patologie croniche per monitorare il decorso della patologia; una riduzione dello stato infiammatorio può essere un segno positivo.

• Può essere usata anche per analizzare una risposta alla terapia. • Ogni variazione in positivo, ossia in aumento della VES è indice di flogosi, poi si faranno esami

più precisi.

Esempi di variazione di VESAumento:Malattie infiammatorie, aumento delle proteine Ig (mieloma multiplo per es), perdita di proteine, necrosi estesa (perchè è proinfiammatoria), traumi, tumori, infarto miocardico... Diminuzione:fattori visti correlati alla legge di Stokes

Quindi sia VES sia PCR sono aspecifiche, VES aumenta e cala più lentamente, rispetto a PCR in cui entrambe le fasi sono più rapide.

Il fibrinogenoProdotto dal fegato, è fondamentale per la formazione del coagulo. E' una forma inattiva che viene attivato dalla trombina, (forma attiva a partire dalla protrombina): la fibrina è la forma attiva che formerà la rete che bloccherà le componenti cellulari. E' un esamero, con catene α, A e β : sono caratterizzati da fibrinopeptidi che vengono rimossi dalla trombina, per attivare il fibrinogeno-->le catene α e β vengono così rilasciate. Fegato produrra fibrinogeno grazie allo stimolo citochinico dovuto all'infiammazione.

Misurazione:1.Metodo di Clauss:il primo è caratterizzato dalla mescolazione di eccesso di trombina:misurerò la velocità di formazione del coagulo, che si basa sul fibrinogeno: se c'è poco fibrinogeno, ci vuole più tempo e viceversa. Le altre componenti sono a concentrazione nota. 2.Metodo PT derivato: metodo fotometrico, permette di valutare la concentrazione di fibrinogeno tramite la variazione di assorbanza durante il dosaggio del tempo di protrombina. In tal modo si può misurare sia il fibrinogeno sia il tempo di PT (o di quick, ossia il tempo necessario a formazione di coagulo nel plasma dopo l'aggiunta di fosfolipidi, fattori tissutali e Ca2+).Ha un risultato simile al precedente (200-450 mg/dl).3.Immunologico: sfrutta la reazione Ag-Ab, in cui Ag è il fibrinogeno stesso.

Correlazione tra fibrinogeno e aterosclerosi• sembra che elevati livelli di fibrinogeno possano promuovere l'aterosclerosi;• variazioni di VES (aumento viscosità) che esso causa avrà influenze anche sulla circolazione

sanguigna;• favorisce l'aggregazione piastrinica• aumento dei rischi coronarici e vascolari• sembra sia proinfiammatorio• Mentre è possibile abbassare la concentrazione del colesterolo (tramite statine per es, che

inibiscono un enzima epatico importante per la sintesi del colesterolo: competono per un sito dell'enzima), non si può intervenire senza gravi rischi nei confronti del fibrinogeno.


10.03.10La flogosi

Cenni su i globuli bianchi

POLIMORFONUCLEATI:Granulociti:neutrofili: deputati a fagocitosi di batteri o ogni corpo estraneo che arriva nell'organismo. Eseguono fagocitosi mediata da C3b o da Ab. Contengono granuli primari con enzimi battericidi, mieloperossidasi...granuli secondari: con lisozima, collagenasi...

• Granulomatosi cronica (CGD): genetica, rara, che colpisce tutta la catena enzimatica (NADPH ossidasi) che sintetizza i battericidi come H2O2, OH-...tutti i ROS quindi, che ossidano le componenti batteriche, ma sono anche dannosi per organismo stesso. Sono racchiuse in granuli per evitare danni a cellula stessa. I granulociti fagocitano il patogeno, ma non la eliminano: si chiama così perchè avviene un accumulo progressivo di neutrofili, che formano granulomi in tale modo. Si possono usare gli antibiotici come cura.

• Aspergillomi: granulomi causati a partire da miceti. In entrambi i casi sono malattie pediatriche.

Eosinofili:degranulano loro componenti, come perossidasi, contro i parassiti. Aumentano anche nelle atopie. Basofili: contengono amine vasoattive come istamina e serotonina. Hanno recettore per C3 del complemento. Hanno azione contro parassiti di solito.

MONONUCLEATI:Linfociti:divisi in T e B: B: deputati a immunità umorale, specifica. T:coinvolti in immunità cellulomediata, riconoscono cioè un agente esogeno solo se viene presentato tramite il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Sono attivi contro patogeni, cellule tumorali, infettate dai virus...Monociti: forma immatura dei macrofagi, a cui danno origine dopo l'attivazione da parte della flogosi. Producono IL-1, responsabile di molti aspetti della fase acuta della flogosi. Sono fagociti.

Formula leucocitariaMOLTO IMPORTANTE, DA SAPERENeu: 55-70%Eos: 1-4%Bas:0,1-1%Monoc:2-8%Linf:20-30%Conta totale: 5000-10000 per mm3

E' importante sapere il numero e la tipologia di componente che varia, perchè può aiutare molto nella diagnosi.

La leucocitosiAumento numerico dei GB, la morfologia deve essere conservata (esistono patologie tumorali in cui aumentano i GB, ma senza flogosi: tali cell hanno una morfologia anormale, diversa da quelle fisiologiche). In genere l'aumento dei GB è molto pronunciato in patologia tumorale, rispetto all' infiammazione. Si parla di forme globali, se aumentano tutti, e parziali, se aumenta una classe (si parla di leucocitosi granulocitica, linfocitica, monocitica...).Si parla poi di leucocitosi da ripartizione (leucocitosi relative, ossia per migrazione di GB da milza, fegato o dai tessuti in genere al sangue: non aumenta il numero globale) e leucocitosi da produzione: leucocitosi vere, dovute a un aumento della produzione: aumenta il numero globale, per azione del midollo: le cause possono essere una prolungata flogosi, patologie ematologiche, oppure per distruzione durante la loro attività... .


Neutrofilia:si verifica in caso di, in ordine di importanza:i primi 3-4 sono più imp da ricordare:a.malattie infettive battericheb.Sforzi fisici, stress c.ustioni (danno tissutale-->flogosi/ingresso facilitato per patogeni)d.necrosi tissutale, come infarto miocardicoe.vasculitif.gottag.alcuni farmaci (non è così netto l'aumento)h.altre come: neoplasie, malattie metaboliche...

Eosinofilia:a.allergia (da alimenti,pollini, farmaci...)b.asma bronchiale, ricollegata ad allergia...c.infestazioni da vermi etc...d.collagenopatie

Basofilia:a.malattie allergicheb.disordini mieloproliferativi (come leucemia mieloide cronica)c.raramente n caso di malattie infiammatorie croniche

Leucocitosi monocitica o monocitosi:in caso di infezioni a decorso subacuto-cronico, quindi che perdurano nel tempo:a.tubercolosi, sifilide, brucellosib.malaria, leishmaniosic.endocardite batterica subacutad.leucemie, linfomi, sindromi mieloproliferative e mielodisplastiche...

Linfocitosi:a.patologie viralib.tubercolosi, brucellosi, sifilidec.patologie neoplastiche, come leucemia linfatica cronica Si ha leucocitosi fisiologica nel neonato nella prima settimana di vita e nella donna in gravidanza.

La misurazione:1.Contaglobuli:Al clinico serve sapere il numero totale dei GB e il numero specifico delle singole classi appena viste. Prelievo, con provetta+EDTA e o eparina-->analizzato tramite contaglobuli automatico, molto rapido ed affidabile.

2.Citometria a flusso:permette di valutare volume cellulare e la complessità cellulare, nonchè il rapporto nucleo/citoplasma. In tal modo si possono distinguere e quantificare le cellule. Possono essere valutati appositi antigeni che aiutano nello studio delle cellule. Valuta le cosidette sospensioni cellulari monodisperse, ossia cellule analizzate una per una. Si basa su principi di focalizzazione idrodinamica: si usa un ago che aspira il sangue nella provetta: ad un certo punto, nel macchinario avviene un restringimento, fin tanto che le cellule passano una alla volta. Verranno analizzate tramite un apposito laser, incidente (la luce viene difratta, refratta o in generale deviata-->ogni cellula causa una specifica deviazione. ). Se le cellule sono marcate con appositi Ab si potranno analizzare anche chimicamente. E' presente anche un sistema fluidico, che diluisce la soluzione. Il raggio laser colpisce la cellula: si ha deviazione della luce a 90 gradi rispetto al raggio laser (dovuto a rifrazione e riflessione, e il fenomeno è chiamato side scatter : dipende dalla complessità interna della cellula). Si avrà poi anche lo scatter lineare (FSC o forward scatter ), a 0 gradi: dovuto alla diffrazione, e dipende dalle caratteristiche volumetriche della cellula.


E' poi possibile marcare anche cell con appositi fluorocromi, che vengono eccitati quando la cell passa sotto il laser: si utilizzano o ligandi flurescenti, oppure Ab marcati con fluorocromi. Si sfrutta semplicemente i principi della fluorescenza.Possono essere visualizzati anche gli acidi nucleici, ma è meno frequente. In realtà è più conveniente, come visto in immunologia e microbiologia, usare degli anticorpi anti cellulare (anticorpi primari), e poi un Ab fluoresceinato anti anticorpo (Ab secondari), VS la regione conservata.Ovviamente GR e piastrine vengono eliminati: sono molto piccoli, quindi si può stabilire il cut off di sensibilità per la macchina (che non li vedrà proprio). Oppure posso separarli fisicamente, in precedenza. In tale esame i linfociti verranno visualizzati con una certa compattezza, mentre i neutrofili variano molto dal PDV del rapporto citoplasma-nucleo (quindi analizzato dal side scatter). Ci sono anche dei detriti, dovuti a rottura di cell durante le operazioni.

• Linfociti leucemici, o comunque in caso di patologie non infiammatorie, quindi tumori a carico di cell bianche, per es, saranno disposti diversamente nel grafico che si ottiene. Diagnosi differenziali di fronte a dati di tale macchina possono essere eseguite anche studiando le quantità, le variazioni numeriche di tali cellule (enorme nei tumori, meno elevata in caso di flogosi).

• Ad ogni modo tutte le altre fasi che conducono alla diagnosi sono certamente orientative: per avere informazioni più precise saranno necessari altri esami, come per es nel caso di sarcoidosi, ossia patologia cronica multisistemica, caratterizzata da aumento di linfociti T helper (segno patognomonico).

• La differenza tra il LT, dal PDV dei marcatori, degli antigeni:TH: CD45+, CD3+, CD4+CTL: CD45+, CD3+, CD8+

Per rilevare tali differenze, si utilizzano degli Ab contro tali Ag:di sicuro si userà Ab contro CD45, per delineare i linfociti, e averne la certezza. Poi, è possibile evidenziare l'area in cui si trovano i linfociti, e chiedere alla macchina di discriminare i LTH dai CTL. In base ai rapporti dei linfociti si potrà, nel caso specifico, individuare se c'è aumento, e se tale aumento è correlato alla patologia o no (ovviamente saranno opportunamente marcati anche i CD4+ e CD8+). Tale esame sarà utile anche nell'AIDS, in cui il rapporto T4/T8 si avvicinano a 0. In base al rapporto si potrà delineare la prognosi, comprendere l'andamento della patologia... (tale sistema di misurazione non è comunque routinario, ma usato in casi specifici).

• Si può, come anticipato, anche colorare il DNA, per capire come e quanto prolifera una cellula, per es (sarà utile in futuro per le patologie cellulare).

• Si ricorda che la cell ha diverse fasi: G0, ossia fase non proliferativa-->G1, in cui la cell si prepara alla divisione (avviene la preparazione degli enzimi per la moltiplicazione del DNA)-->fase S, in cui si moltiplica il DNA-->G2, cell si prepara a divisione, avviene la cariocinesi e citocinesi-->fase M, in cui avviene la divisione del materiale genetico. Si può individuare una cell in fase di attiva sintesi di DNA: Si usa il propidio ioduro per "colorare" il DNA; che non sarebbe altrimenti visibile: si intercala sul DNA, (è un intercalante cioè si inserisce allìinterno del DNA stesso. Tanto più si rileva una fluorescenza, tanto più intercalante si è "agganciato" e tanto più DNA sarà presente.Si può anche ricavare quando DNA neosintetizzato viene prodotto in fase S: si usa la bromodeossiuridina, che viene utilizzata al posto della timidina da parte degli enzimi neosintetizzanti. Si usa poi Ab marcati contro tale sostanza: la quantità di BrDU è dir prop a quantità di DNA neosintetizato. Successivamente è possibile, tramite un grafico, ricavare sia il contenuto del DNA con BrDU e con Propidio Ioduro: in base alla posizione nel grafico si potrà comprendere se una cell si trova in fase S (quadrante in alto a sn), G2 o M (in alto e in basso a dx), G1 o G0 (in basso a sn). Alcune cell saranno "fuori dalla norma", nel senso che sono in una posizione che può sembrare errata: in realtà significa solo che le cellule si sono già moltiplicate prima delle procedure. Cell tumorali:tra fase S e G2 (sregolato controllo del ciclo cellulare).

• Cenni sull'impiego in clinica dei SIRNA (Small Interfering RNAs): tali RNA possono ridurre l'attività di un gene coinvolto nel passaggio della cellula da fase G1 a S: il uso impiego ottimale potrebbe essere quello di ridurre la stimolazione/proliferazione delle cellule muscolari lisce post inserimento di uno stent a livello coronarico. Altrimenti, la crescita di tali cellule porterebbe ad una nuova occlusione.


17.03.102.Markers cardiaci Per diagnosticare correttamente un infarto miocardico è necessario si presentino almeno due di questi casi:1.Dolore toracico.2.Innalzamento, e successiva decrescita dei markers cardiaci, che segnalano la comparsa di un danno al tessuto cardiaco. 3.Evoluzione delle modifiche dell'ECG, che possono essere molto indicative.

1.Il dolore:Tipi di dolore toracico:

1.Di origine cardiaca:A.Ischemico: cioè dovuto a riduzione del flusso:

a. Cause coronariche: aterosclerosi e occlusione vasale, spasmi coronarici, cioè restrizione dei vasi in risposta a una forzata attività dilatativa, trombi, cocaina (provoca vasospasmo coronarico), alterazioni del microcircolo.

b. Cause non coronariche: tachicardia e aumento dei consumi, aumento del precarico e del postcarico.

B.Non ischemico: pericardite, ossia infiammazione del pericardio di origine infettiva, dissezione aortica.

2.Di origine non cardiaca: a. Gastroenterico, causato da: spasmo esofageo, reflusso gastroesofageo, dovuto da insufficienza di sfintere esofageo inferiore e risalita del succo gastrico nell'esofago-->dolori e bruciori a livello esofageo, ulcera peptica: dolorosa, a livello della parte bassa del torace o non localizzata con precisione,pancreatite: meno toracico, più verso la parte bassa del torace/parte alta addome: non precisamente individuabile. b. Polmonare: embolia polmonare, pneumotorace (distacco dei foglietti pleurici tra loro)c. Mediastinico d. Neuromuscolare: Herpes Zoster Virus, costocondrite. e. Psicogeno: correlato ad ansia, attacchi di panico, depressione.

La riduzione del flusso coronarico affinchè si abbia manifestazione clinica-sintomatologia evidente, l'occlusione deve essere significativa:la riduzione di flusso deve superare il 75%, in alcuni casi fino all'80%. Una riduzione del 50% non apporta sintomi notevoli. Gli eventi infartuali si manifesteranno di norma in tarda età proprio perchè il fenomeno di occlusione impiega molto tempo affinchè si instauri e si evolva. A tale fenomeno segue una vasodilatazione dell'arteria interessata, nonchè aumento del VEGF-->aumento di vasi che bypassano l'ostacolo.

Come studiato in patologia, la placca si può evolvere in più direzioni: si può infatti ulcerare, oppure aumentare di volume per effetto dello scatenamento della cascata coagulativa (nonchè embolizzare, danneggiare la tonaca media, causare aneurismi, subire emorragie...)

Dal punto di vista (PDV) clinico si potrà avere:1.Angina pectoris, ossia dolore toracico dovuto a calo di nutrienti a livello cardiaco-coronarico. 2.l'arresto cardiaco-->si può evolvere in morte del soggetto se non si interviene prontamente. 3.Infarto: quando il tessuto cardiaco muore 4.Scompenso cardiaco: quando il cuore non riesce a far fronte alle necessità dell'organismo, dopo un danno di tale tipo. 5.Aritmie: dovute a cardiomiopatie ischemiche: per mancanza di ossigeno/metaboliti, le cellule


cardiache iniziano ad utilizzare la glicolisi come sistema per sopravvivere-->acidificazione dell'ambiente circostante-->ingresso degli H+ nelle cellule-->depolarizzazione delle cell stesse per effetto di H+ e per il blocco delle pompe-->aritmie. EpidemiologiaLe malattie cardiovascolari sono la causa della quasi metà delle morti totali in Italia: 35% correlate a ischemia (70.000-80.000 casi annui). Un milione di persone circa sono affette da tale patologia ischemica.

I fattori di rischio implicati sono età, sesso, fattori genetici, storia personale. Non sono modificabili, lo sono invece per lo meno in parte l'ipertensione arteriosa, il diabete mellito (le cell muscolari lisce crescono maggiormente in caso di iperglicemia), ipercolesterolemia e bassi livelli di HDL (come detto il "colesterolo buono") , obesità: correlata all'ipercolesterolemia e associata spesso a un generalizzato stato infiammatorio del soggetto. Infine fattori modificabili totalmente sono il fumo e l'assunzione di alcol.

2.I markers Meno del 20% dei pazienti ricoverati per dolore toracico presenta effettivamente infarto del miocardio-->dosare i marker diventa importante per escludere tale patologia.

A. Troponine cardio specificheIl più specifici dal PDV diagnostico. Mai presenti in condizioni normali nel sangue. Si ricorda che anatomicamente il cuore possiede una muscolatura involontaria, nonchè una striata o strata-simile: in tutto ciò sono fondamentali le cosidette gap junction, che permettono la trasmissione dell'impulso elettrico alle cell vicine, in modo tale che si formi il cosidetto sincizio funzionale.

• Il fatto che delle cell staminali producano tali sistemi di adesione è indicativo del fatto che si sono integrate e adattate al miocardio.

• Presenza, anche minima di troponine in circolo, è già sintomatico per danni cardiaci. • Aterosclerosi:pare ci sia una correlazione tra il rischio di rottura di un placca aterosclerotica e

livelli di troponina.

Meccanismo di funzionamento del cuore Il meccanismo di trasmissione è simile a quello del muscolo striato: sono sempre implicate actina e miosina, nonchè le troponine:a riposo l'actina è circondata dalla troponina, che è sensibile al legame con il Ca2+: è trimerica, costituita cioè dalla porzione I, C, T; nonchè dalla tropomiosina, che avvolge l'actina, oscurandone i siti di legame. Quando viene liberato il Ca2+, la troponina si attiva e stimola lo spostamento della tropomiosina, da una posizione di inibizione a una di attivazione-->avviene così la contrazione. Infine, l'associazione actina miosina è possibile in presenza di ATP, Mg2+, associato a troponina, permette la liberazione del sito di legame, il Ca2+ (liberato dal reticolo sarcoplasmatico).

Proprio le troponine saranno liberate nel sangue a seguito della necrosi tissutale: in condizioni normali il 6% della troponina T , il 3% della troponina I sono presenti nel citoplasma della cellula: ecco perchè quando la cell va incontro a necrosi vengono liberate. La troponina C invece viene liberata solo quando il danno è notevole e la cellula è completamente degradata: non è utile come marker precoce. Meno frequentemente, le troponine si innalzano anche in caso di: cardiomiopatie non ischemiche (infettive per es), pazienti con un recente intervento di coronaroplastica nella loro storia clinica. Si ricorda anche che le troponine sono presenti anche nel muscolo scheletrico, benchè le isoforme siano un po' differenti: possono aumentare anche in caso di sforzo fisico. Per discriminare le diverse tipologie si impiegano quindi degli anticorpi monoclonali superspecifici.

CineticaLe troponine utilizzabili durano nel sangue per un periodo sufficientemente lungo rispetto all'evento infartuale: Troponina cardiaca I: dura 7-10 gg dall'eventoTroponina cardiaca T: dura 10-14 gg


Compaiono comunque a partire da 3 ore dall'evento, e sono piuttosto specifiche.

B.Lattico deidrogenasi Enzima responsabile dello scambio tra lattato a piruvato, collocato a valle della glicolisi. Viene rilasciato in caso di necrosi tissutale. Esso è caratterizzato da diverse subunità, H ed M, combinate tra loro in modo tale da formare 5 combinazioni possibili.E' un enzima piuttosto ubiquitario, quindi non sarà possibile individuare con facilità l'organo implicato nel danno tissutale. In ogni caso può derivare dal miocardio, dal rene, dai Globuli Rossi (sarà individuata per es in caso di emolisi intravascolare quindi: utile per fare diagnosi differenziale rispetto all'ittero). Le isoforme potranno essere distinte in base a una elettroforesi su gel.

In condizioni fisiologiche prevalgono le LDH2, e sono comunque molto presenti le LDH1 e 3. In caso di infarto invece la LDH1 aumenta notevolmente, ma non a sufficienza per diagnosticare correttamente un infarto.

CineticaPiù lenta rispetto alle troponine, l'aumento inizia dopo 24 pre, il picco è raggiunto al 4 giorno, e al 12 giorno il livello è nuovamente normale.

C.Creatinfosfochinasi-CPK Molto specifico e largamente utilizzato. E' un enzima che trasporta un gruppo fosforico dalla creatina fosfato all'ADP-->ottenendo ATP: rende così disponibile l'energia che è stata accumulata dalla creatina fosfato. E' correlata alla glicolisi, nonchè al sistema actomiosinico: fornisce energia rapidamente.

Anche in questo caso esistono diverse isoforme: citosoliche e mitocondriali: citosoliche: collocata vicino a banda M, coinvolta nella contrazione, fornendo ATP.

Dosaggio Si esegue tramite un metodo chimico in cui si sviluppa una serie di reazioni: creatina fosfato+ADP-->creatina+ATP :La creatinfosfochinasi catalizza tale reazioneATP+glucosio-->ADP+glucosio 6 fosfato : la reazione è catalizzata dalla esochinasi. Glucosio 6 fosfato+NADP-->6 fosfogluconato + NADPH : la reazione è catalizzata dalla glucosio 6 fosfato deidrogenasi (G6PDH).

Si valuta quindi il livello di NADPH prodotto: le altre componenti sono poste a saturazione, così che la velocità della reazione dipenda solo dalla creatin fosfochinasi presente.

18.03.10Esistono 3 diversi enzimi CPK (diversi isotipi): cardiaco (subunità M, B: CPK MB), muscolare (2 subunità M: CK MM), cerebrale (2 subunità B: CPK BB). Quella di interessa sarà ovviamente quella cardaica.Elevati valori di CPK totali non sono assolutamente indicadivi di IMA (Infarto Miocardico Acuto). Elevati valori di CPK BB indica ischemia cerebrale-->interesse neurologico-neurochirurgico.

Distinti su base elettroforetica, grazie al diverso peso molecolare delle subunità: la distanza della migrazione è inv. proporzionale al peso. Come riferimento si può utilizzare la normale elettroforesi proteica: in corrispondenza o quasi delle γ globuline si ha per es l'isotipo MM, delle β le MB, delle albumine le BB.

I vari tessuti del corpo presentano dei livelli di CPK MM, MB, BB: per es il cuore è abbondante MM, ma anche una (bassa) percentuale di MB, e così anche in altri tessuti. Quindi la CPK non è così specifica come lo sono invece le troponine.

Si confrontino esami diversi usati per diagnosticare un IMA:ECG: sensibilità: 73% ; Specificità: 100%CPK: sens: 98% ; spec: 75%


CPK MB: sens:98-99% ; spec: 95-97%(possono essere usati insieme per avere una maggiore certezza diagnostica)La misurazione di CPK MB può essere eseguita anche tramite immunoinibizione: si usano Ab VS la subunità M, che viene inibita dall'anticorpo-->se si aggiunge del substrato si avrà la reazione, lo stesso, perchè resta una subunità B, non inibita da Ab. (nel caso di CK MM non si avrebbe reazione perchè gli Ab inibirebbero entrambe le subunità).

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Per valori molto bassi di CPK MB, i pazienti avranno solo un danno muscolare (scheletrico): per valori di CPK MB < 6% ci sarà una probabile lesione al muscolo scheletrico, mentre se il valore è superiore al 6%, sarà probabile l'infarto al miocardio, questo è il cutoff. (a Trieste si utilizza come valore discriminante il 10%). I valori possono variare nel tempo: quindi in caso di pazienti border-line è utile misurare nuovamente i valori dopo un paio d'ore, per comprendere se c'è un aumento o no. In + la CPK MB aumenta prima, cioè ha un picco già dopo 4 ore l'evento di danno, e scende successivamente con molta velocità. La CPK totale invece sale meno velocemente, e ha un profilo più smorzato. In oltre sarà utile anche tenere sotto controllo i valori della CPK muscolare, per capire se si è di fronte a un danno al miocardio o al muscolo scheletrico.

• Esistono isoforme degli isoenzimi CPK MB: non sono ancora usati nel dosaggio, ma pare possano essere utili, in futuro, si potrà avere una percentuale di sicurezza maggiore.

• Possono esserci dei falsi (+ o -) in base all'esame che si sceglie come standard (CPK o troponina), ma sono casi rari e/o teorici.

• Inoltre, le troponine sieriche sembrano dare informazioni anche sulla prognosi: se sono in elevata concentrazione infatti, pare abbiano un potenziale prognostico sfavorevole.

D.MioglobinaProteina molto simili all'emoglobina, è formata da un'unica catena+ gruppo EME+ Ferro. Ha il compito di immagazzinare l'O2, legandosi in modo reversibile ad esso. Può essere considerata come un "deposito di O2", si trova a livello muscolare: tanto maggiore è la massa muscolare, tanto più sarà alto il contenuto di mioglobina. Ha un peso molecolare di 18 kD; precoce marker di danno cellulare (un po', ma non troppo rispetto alla CPK); bassa specificità (indistinguibile da muscolo caridaco-scheletrico); picco: 4-8 ore; emivita: 10-20 min.La misurazione di solito avviene per CPK e per troponine; in alcuni casi anche la mioglobina: da sola, in ogni caso, non è un esame utile e certo per fare una corretta diagnosi.

------Esistono infine altri markers utilizzabili, come il dosaggio di catene della miosina, ma non è utilizzata praticamente, perchè non da nessuna informazione in più rispetto agli esami precedenti. Sarebbero utili altri markers se fossero più precoci di quelli attuali, più specifici...quindi per ora ci si accontenta di quelli già presenti.


3.Diagnosi per apparati

1.Pancreas

Cenni anatomofisiologiciRetroperitoneale, collocato a livello della C duodenale (testa); emette gli enzimi digestivi a livello duodenale, tramite un dotto collegato a cistifellea.La componente esocrina è molto prevalente, e ne determina la morfologia; quella endocrina è caratterizzata in particolare dalle isole di Langerhans.

Patologie correlatein particolare la pancreatite acuta: dovuta a:a. malattie delle vie biliari: litiasi (calcoli-->ostruzione del dotto, liberazione di enzimi-->autodigestione ), infezioni, anomalie congenite del dotto.b. Alcolismo cronicoc. Forme miste alcolico-biliari

Enzimi prodottia. Lipasi: attive sui trigliceridi; se non liberate a livello duodenale causano necrosi per azione locale.b. Tripsina, chimotripsina: agiscono a livello proteico; idem come prima se non agiscono in sede corretta. c. Elastasi, collagenasi: agiscono su alimenti in genere, oppure sul dotto se non sono liberate in sede corretta.

α amilasiL'aumento nel siero degli enzimi pancreatici è l'unico dato dotato di una certa affidabilità: per es:enzima più importante è l'α amilasi (l'a.a. P è quella tipica del pancreas, ma viene prodotta anche in altri organi), che degrada zuccheri complessi in altri più semplici (agendo su legami α 1,4 D glucosidici). Benchè l'aumento dell'αamilasiemia non sia specifico, è molto sensibile e facilmente dosabile.Tale enzima è prodotto anche dalla parotide (isoamilasi S) e dal fegato, intestino tenue e reni; distinto così dall'amilasi pancreatica (isoamilasi P).L'α amilasi è presente nel siero in piccole quantità, in condizioni normali, ma aumenta notevolmente in caso di pancreatite acuta. L'aumento è precoce, raggiunge il massimo dopo 2 gg, e si normalizza in 3-5 gg. La sua misurazione avviene per unità/litro (quindi quantità di enzima funzionante), e non moli/litro.E' possibile anche valutare l'amilasuria, perchè tale proteina viene smaltita a livello renale (amilasuria 60-100 Unità/24 ore:diagnosi di pancreatite acuta).

Lipasi pancreaticaStacca gli acidi grassi dal glicerolo, ha una attività migliore con la colipasi. Pare sia più specifica di amilasi, ma in ogni caso si preferisci misurare l'a.a. I livelli di lipasi aumentano anche in caso di tumori pancreatici, patologie epatiche e renali: in questi casi ci sono aumenti non notevoli, mentre nella pancreatite acuta c'è un grande innalzamento dei livelli.

Variazioni della lipasemia: i livelli sierici aumentano dopo quelli dell'α amilasi, e restano elevati per un tempo superiore a quello dell'amilasi (71-0 gg): sarà utile quindi per fare una diagnosi tardiva di pancreatite acuta, perchè permane per più tempo.Possono essere utilizzati anche, in via teorica, gli altri enzimi, ma non danno ulteriori informazioni rispetto a quelli già descritti. Da ricordare che le transaminasi sono elevate anche in pancreatite acuta, ma non sono affidabili al 100%, perchè sono implicate anche in danni epatici.

Altri esami correlati:il pancreas danneggiato dai suoi enzimi sarà sede di flogosi-->esami ed indagini che saranno quindi implicati:leucocitosi, VES, PCR; ecotomografia, risonanza magnetica, TC, sono utili per confermare la diagnosi della malattia, per definire la morfologia del danno, valutare il grado di diffusione peripancreatica, ricercare complicanze, controllare a distanza l'evoluzione.


DiabeteE' un disordine del metabolismo, sintomatologicamente-dal PDV del laboratorio è caratterizzato da glicosuria, iperglicemia, + altre complicazioni (accelerata aterosclerosi, danni vasali che si ripercuotono su organo interessato: nefropatia, neuropatia, retinopatia che si manifestano a distanza di anni dall'inizio della patologia: come accennato le cell muscolari lisce in caso di iperglicemia, proliferano di più-->ecco perchè aumenta il rischio cardio-vascolare nei pazienti diabetici, che sono esposti anche ad altri rischi, per es in caso di operazioni al cuore con stent: avranno una tendenza maggiore alla reocclusione).Questo perchè i tessuti periferici resistono all'azione dell'importante ormone ipoglicemizzante insulina; oppure perchè l'insulina viene poco prodotta. Oppure può esserci una somma di tali condizione. E' una patologia poligenica, c'è cioè una base genetica, ma non si conosce bene la causa, perchè ci sono molti geni-->è difficile o impossibile agire con diagnosi-metodiche molecolari (non so quello che devo cercare, perchè ci sono molto probabilmente più geni coinvolti).

Esiste il diabete di tipo I e II:I:giovanile, per ridotta-mancata produzione di insulina. Cause: distruzione/incapacità di produrre insulina; mediata da S.I. (influenza di particolari assetti di HLA) Oppure è idiopatica, ossia senza una causa chiara. II:adulto: da ridotta sensibilità dei tessuti periferici a insulina. Gestazionale: forma che insorge in gravidanza e che si risolve poi, e in alcuni casi invece slatentizza un cosidetto prediabete. Può dare macrosomia fetale (crescita maggiore del bambino) in questo caso -->difficoltà maggiori nel parto.

Misurazione della glicemiaPrelievo del campione: da siero o plasma, da sangue venoso (normale, solito). Analisi andrebbe fatta entro un ora dal prelievo. Se il campione deve essere conservato per tempi più lunghi si deve inibire la glicolisi (NaF, KF), perchè è possibile che il glucosio sia metabolizzato, andando quindi a sottostimare il livello glicemico (ci sarà un errore dei dati quindi).

Test (esochinasi):

Glucosio + ATP--> G6P + ADPG6P + NADP-->Gluconato-6-P + NADPH + H+ La quantità di NADPH formatasi è direttamente proporzionale alla quantità di G6P e quindi di glucosio; l’NADPH viene misurato in base al suo assorbimento a 340 nm.

ValoriNormale, a digiuno: <100 mg/dl-110 mg/dl (più comune il secondo valore soglia);Patologici:110-125: ridotta tolleranza, prediabete>126: diabete In caso di tali ultimi 2 valori si fa un altro test, OGTT (Oral Glucose Tolerance Test , si fa un carico orale di glucosio, 75 g per via orale negli adulti): si valuta la cinetica di scomparsa dei livelli di glucosio: dopo 2 ore ci dovrebbero essere dei valori <140 mg/dl se sano; tra 140-199 si è in prediabete; > o uguale a 200: diabetico. Si fanno 2 prelievi, a tempo 0 e dopo 2 ore: il diabetico avrà un andamento uguale, ma più in alto rispetto al sano. Eseguibile anche in caso di diabete gestazionale, con caratteristiche differenti, ma simili.

• (a digiuno si intende per almeno 8 ore, ottimale 12 ore: si fanno tali test alla mattina per evitare di sottostimare il livello, perchè di giorno ci sarebbe comunque attività, nonchè un diverso assetto ormonale: ottimale è fare l'esame alla mattina quindi).

DiagnosiDa analisi del sangue appena vista+:a. Sintomi di iperglicemia: pioliuria, polidipsiab. Valori di glucosio, prelevati in un momento a caso, superiore a 200 mg/dlc. Valori superiori a 200 mg dopo OGTT.


Patologie correlate-sintomi1.Glicosuria:Misura la quantità di glucosio nelle urine solitamente rapportata alle 24 ore. Quando la quantità di glucosio filtrato supera la soglia di riassorbimento tubulare a livello del nefrone, corrispondente a circa una glicemia di 180 mg/dl, il glucosio passa nelle urine e si può dosare. Misurare la glicosuria è utile se si vuole fare un controllo poco invasivo. Si possono usare anche delle apposite apparecchiature che da poche gocce di sangue ricavano e analizzano la glicemia.

2.Insulinemia:Più che il dosaggio basale riveste una maggiore importanza quella dopo stimolo in corso di curva da carico. Ridotta nel diabete di tipo I sia basale che dopo stimolo. Normale o aumentata nel diabete di tipo II, in particolare presenta un ritardo nel raggiungimento del picco:in primi momenti scattano sistemi di feedback, che fanno produrre più insulina alle cell β del pancreas-->dopo anni però avviene esaurimento delle cell pancreatiche, quindi i valori di insulina restano invariati.

Emoglobina glicosilataIn adulto è formata da diverse catene: più imp è l'Emoglobina A1: divisibile in altri sottogruppi, tra cui A1c, che si lega al glucosio, di interesse in questo caso: in caso di alte concentrazioni di glucosio, per lungo tempo, aumentano i livelli di coniugazione:

gluc+Hb-->complesso instabile-->chetoammina (stabile)

La chetoammina si forma solo se l'Hb è a contatto con alti valori di glucosio per molto tempo: è un indice utile quindi per valutare la glicemia nel lungo periodo. Valori possibili:<6%: nella media<7.5%: poco superiore alla media <8.5%: apprezzabile <10%: alto >10%: molto alto

Di interesse clinico è la forma stabile che rappresenta un indice dei livelli della glicemia nei tre mesi precedenti il test. Infatti, una volta formatasi la forma stabile di Hb-glicosilata nei globuli rossi, permane per la durata dello loro vita (circa 120 giorni): sarà indicativo della situazione dei 2-3 mesi precedenti.

24.03.102.Colon

Analisi delle feci1.Ricerca di sangue occulto2.Ricerca di markers di infiammazione e proliferazione tumorale3.Coprocoltura4.Analisi microscopica

1.Ricerca sangue occultoLa sua presenza può essere collegabile a patologie anche serie (neoplasie, non sono le più frequenti, diverticolosi, sanguinamento emorroidario (molto frequente) ).I sanguinamenti non sono continui, ma saltuari: anche il test più specifico e sensibile può non essere utile se non c'è sanguinamento al momento dell'esame.

Una volta era necessario seguire una dieta priva di carne-alimenti con GR e Hb. Ora non è più necessario, perchè i test moderni discriminano ottimamente l'Hb umana. E' utile evitare farmaci antinfiammatori (FANS), che possono dare sanguinamenti per danneggiamento mucosale (possono dare falsi positivi). Sarebbe da stare attenti anche a spazzolarsi i denti con delicatezza (per evitare microemorragie).


I nuovi test sono di tipo immunochimico, non comportano quindi restrizioni dietetiche. (non serve ricordare i valori!): si individuano le catene α e β con gli appositi anticorpi monoclonali specifici, oppure l'eme:esistono diversi test che individuano diversamente i prodotti del metabolismo dell'Hb-eme: più si sale a livello del tubo gastroenterico, e più le componenti saranno degradate. Altri test individuano invece l'eme intatta, ma anche i derivati della degradazione dell'eme: tale test da maggiori informazioni se il sanguinamento avviene a livello delle alte vie digestive. E' un test molto sensibile (anche troppo...rileva anche un piccolo sanguinamento anche di nullo interesse clinico-->saranno necessarie ulteriori analisi, anche strumentali per evitare falsi positivi). Quindi l'esame di ricerca del sangue occulto non può sostituire gli esami endoscopici per l'esatta diagnosi di origine del sanguinamento.

Nuovi marker Utili per stabilire quando sono necessarie endoscopie e quando no.

1.M2-PKisoenzima della piruvato chinasi (imp nel metabolismo del glucosio). E' un tetramero. In presenza di un tumore si trasforma in una forma dimerica, meno attiva, localizzata a livello tumorale. Tale minore attività si riflette in un accumulo di metaboliti a monte del PEP, che verrà utilizzato per ridurre fosfolipidi e aminoacidi-->utilizzati per la patologica proliferazione delle masse tumorali. Elevati livelli nelle feci di M2-PK potrebbero essere utili per diagnosticare correttamente una patologia neoplastica a carico del colon- malattia infiammatoria intestinale. E' anche vero che le cell dell'epitelio intestinale hanno un elevato turn-over:potrebbe ridurre l'affidabilità del test. In realtà questo non succede, perchè lo switch tra la forma a 4 unità e 2 è determinato da apposite oncoproteine, mutate nei tumori. E' una tecnica da perfezionare, in cui è necessario migliorare la sensibilità e specificità; viene quindi affiancato alla pancolonscopia.

• E' molto importante individuare i polipi benigni-->se asportati riducono di molto il rischio di sviluppo di carcinomi al colon.

2.CalprotectinaProteina legante il Ca2+, prodotta da monociti e granulociti neutrofili (sarà utile quindi in caso di infiammazioni del tratto gastroenterico: colite ulcerosa, morbo di Chron). E' collegata a un indice di riparazione cellulare, non tanto a un indice di proliferazione cellulare. Pare sia poi correlata ad alcuni adenocarcinomi nell'uomo. Può essere utile in età pediatrica (problematico l'utilizzo di tecniche invasive).Tale proteina aumenta anche in caso di patologie flogistiche in genere, e non solo a carico dell'apparato gastrointestinale (artrite reumatoide, ma anche HIV, fibrosi cistica...).

2.Coprocoltura

Diversi tipi: Batteri:coli ("diarrea del viaggiatore", non colpisce autoctoni perchè immunizzati)shighelle (colite acuta infettiva)klebsiella (diaree)salmonella (typhi e paratyphi sono responsabili del tifo: emorragie mucosa intestinale, febbre elevata, epatosplenomegalia...)

in + possono essere individuati anche parassiti:tenieprotozoiamebiasitricomoniasigiardiasi

Per i parassiti sarà utile anche un esame del sangue (si avrà basofilia-eosinofilia)


Altri elementi individuabili nelle feci:a. cellule epitelialib. GRc. leucociti (in caso di processi flogistici)d. fibre muscolari, amido (patologie pancreatiche, insufficienza-->ridotta digestione delle proteine). L'eccesso di grassi (steatorrea) può essere anch'esso dovuto a insufficienza pancreatica. e. muco (flogosi)

3.FegatoSottodiaframmatico. I suoi epatociti vivono in media 150 gg. Riceve una grande quantità di sangue:1.5 l al min.

Funzioni1.Interviene nel metabolismo dei glucidi-glicogeno2.interviene in sintesi di acidi grassi3.Sintesi colesterolo; (molecola non viene degradata, metabolizzata (perso in parte con i sali, acidi biliari)-->ciò è problematico!). 4.Emocateresi, e recupero del Fe.5.Metabolismo alcol e sostanze tossiche/farmaci/tossine introdotte dall'esterno6.Deposito di vitamina e ferro/loro metabolismo7. Catabolizza le proteine8.Converte acido lattico in glucosio (ciclo muscolo-fegato)9.Sintesi di aminoacidi non essenziali (per transaminazione) e di proteine plasmatiche (albumina, fattori coagulazione...)10.Produzione ed escrezione della bile.

Esami di laboratorio:1.Di I livelloI principali e più importanti. Quelli di II livello lo sono meno. a. Valutazione bilirubinab. Presenza di enzimi (fosfatasi alcaline, γ GT...)c. Livelli di albuminemiad. Fattori della coagulazione

a.Bilirubina:La > parte (80%) è prodotta per emocateresi dei GR-->degradato in fegato e milza-->recupero di EME.Per il 20% si ottiene dal catabolismo di proteine sieriche (mioglobina, citocromi, perossidasi, catalasi), nonchè dall'eritropoiesi midollare inefficace.

CatabolismoEME-->biliverdina (tramite eme ossidasi)-->bilirubina (biliverdina-reduttasi): detta non coniugata, o indiretta, ed è insolubile: x essere trasportata nel sangue deve essere legata ad albumina. La bilirubina non coniugata arriva al fegato e viene scisso il legame con l'albumina-->internalizzata tramite la ligandina (deficit ereditario di tale proteina si manifesta con iperbilirubinemia congenita benigna: si parla di sindrome di Gilbert).Viene quindi coniugata con acido glucuronico-->diventa solubile con il plasma-->La bilirubina così coniugata viene quindi escreta dell'epatocita nella bile (in micelle miste con gli acidi biliari), per essere riversata nel duodeno.Nel colon: la bilirubina è trasformata da idrolasi batteriche in urobilinogeno-->ossidazione di urobilina-->stercobilinogeno. Nel caso in cui non si abbia il caratteristico colore scuro delle feci, si può presumere danni alle vie appena analizzate (si parla di feci acoliche).


ValoriNormali:Bilirubinemia totale: 0.4-1 mg/dl, quasi tutta legata ad albumina (non coniugata)Bilirubinemia coniugata: o diretta, cioè si lega a sali di diazonio per formare composti colorati (reazione di Van der Bergh diretta).B. non coniugata: o indiretta, cioè si lega ai sali solo dopo liberazione dell'albumina tramite solvente organico. (reazione di VdB indiretta).

Di norma la bilirubina non coniugata non viene filtrata dal glomerulo, per il forte legame con albumina. La bilirubina coniugata, a causa della buona solubilità con acqua, viene filtrata dal glomerulo-->se aumenta nel sangue, conferisce colorazione giallo-marrone alle urine.

Patologici:L'ittero si rende evidente quando la bilirubinemia è di 2-2.5 mg/dl. bisognerà capire la causa dell'ittero, se dovuto ad aumento di bilirubina coniugata e/o non, o se aumenta quella totale. Si può cercare poi presenza di bilirubina nelle urine (bilirubinemia): l’iperbilirubinemia è correlata all'aumento di bilirubina di tipo coniugato mentre la sua assenza suggerisce che l’ittero sia dovuto alla bilirubina non coniugata che non può essere filtrata dal glomerulo.

Si avrà ittero in caso di:1.Iperproduzione: aumentata distruzione dei GR-->aumenta EME e prodotti metabolici: si verificherà in caso di emolisi intravascolare (ittero pre-epatico). Aumenta bilirubina non coniugata: no bilirubina nelle urine.Si rileverà anche una reticolocitosi, causata da ipossia e quindi da stimolazione delle cellule juxtaglomerulari-->EPO; oppure anemia di grado variabile.Inoltre si rileva un grande aumento di lattico deidrogenasi: in assenza di altre patologie evidenti+ con i segni già visti: si ricorda infatti che l'aumento di LDH è segno di grossa distruzione cellulare, necrotica: il suo valore è direttamente proporzionale alla diffusione della necrosi.

2.Diminuita captazione epatica: a causa di farmaci oppure nella sindrome di Gilbert.

3.Ridotta coniugazione epatica, con acido glucuronico: aumento di bilirubina non coniugata, calo della bilirubina coniugata. No bilirubinuria.

4.Ridotta escrezione nella bile per cause epatiche (necrosi epatocita: ittero epatocellulare) o extraepatiche (tumori, stenosi dotti biliari, calcolo del dotto biliare-->impedita la liberazione della bile) (ittero postepatico o ostruttivo o colestatico). Si avrà bilirubinuria (urina scura), nonchè aumento bilirubina coniugata (notevolmente aumentata) e non. L'epatite causa il quadro identico, si avranno sia danni a captazione, coniugazione ed escrezione.

Un paio di casi clinici:

1.Ittero emoltico: si avrà:reticolocitosi: correlata a iperproduzione di GRanemia: correlata al calo di emoglobina, di grado diverso. Aumento di LDH: utile da analizzare soprattutto se non sono evidenti i segni precedenti. Maggiore è il danno emolitico, maggiore sarà il danno.La bilirubina aumenterà ma non eccessivamente.

2.Ittero colestatico: aumentano anche le transaminasi (AST e ALT: indice di necrosi epatica), fosfatasi alcalina (aumenta notevolmente), γ GT, LDH: sono indice di danno epatico/aumentata produzione come nel caso di ittero colestatico. Nell'ittero epatocellulare ci sarà invece notevole aumento delle AST e ALT; meno di fosfatasi alcalina. L'entità dell'aumento deve essere rilevata e tenuta in considerazione.


25.03.10b.Enzimi

TransaminasiIl loro ruolo è spostare gruppi amminici; sono degli ottimi indicatori di danno cellulare, sono infatti liberati in caso di rottura della cellula. Sono tipicamente epatici, ma si trovano anche a livello del tessuto muscolare (in caso di miositi, infiammazioni...)-cuore (la durata di tali enzimi è più bassa nel sangue in questo caso). In ogni caso l'aumento è sempre elevato in caso di danno epatico-->per prima cosa in caso di valori elevati si sospetterà principalmente una patologia epatica;la durata nel sangue sarà prolungata in questa situazione.

Valori normali:<35 U/l

Valori patologici:1. >20 volte il normale: epatite virale o tossica (in caso di assunzione di sostanze dannose)2. 3-10 volte il normale: epatite nella mononucleosi (ricerca Ab anti EBV), epatite cronica attiva, ostruzione dei dotti biliari extra-epatici (aumento di fosfatasi alcalina (ALP)).

• Gli esami per individuare i virus possono basarsi anche su appositi sistemi che individuano il patrimonio genetico dei virus (soprattutto in caso di virus con un periodo finestra, in cui non sono presenti ancora gli Anticorpi VS il virus; discorso analogo per l'HIV, che presenta anche esso un periodo finestra).

3.Valori lievemente aumentati: cirrosi biliare

LDHIl suo aumento, unito a quello di altri markers, può indirizzare verso un danno epatico. Si ricorda infatti che da solo non è assolutamente indicativo, perchè è presente in molti altri organi.

Indicatori di colestasi1.Si ricorda le fosfatasi, capaci di sposatare gruppi fosforici: esistono diverse forme isoenzimatiche della fosfatasi alcalina (ALP): epatica, ossea, intestinale e pancreatica, caratterizzate da una diversa mobilità elettroforetica e distribuzione tissutale. Non sono un marker molto specifico (si trovano in altri tessuti), ma sono un buon indice di colestasi. Si trovano spesso in cell molto attive o con un notevole metabolismo (cell epatiche, intestinali, osteoblasti...)L'attività delle ALP aumenta nel siero in caso di ostruzione delle vie biliari, sia di natura meccanica che non: pare che l'aumento sia dovuto a una aumentata sintesi da parte delle cell epiteliali biliari, piuttosto che da un rigurgito secondario da ostruzione. 2.γ glutamiltranspeptidasi: è una transferasi; si trova nel fegato e in epitelio tubulare renale; non da più info degli altri marker visti, ma solitamente viene indicata. Serve più che altro per confermare un esame precedente dei livelli di ALP, in caso di dubbi.

c-d.Proteine plasmatiche

1.AlbuminaFegato sintetizza 12 g di albumine al giorno; il contenuto totale è di 300 g, 60% nel pool extravascolare e il 40% in quello intravascolare. Le funzioni principali dell’albumina sono il mantenimento della pressione oncotica ed il trasporto di numerose sostanze ( bilirubina, acidi grassi liberi, ormoni tiroidei, farmaci etc).

Valori normali: 4-5g/dl; se i valori scendono al di sotto di 2,5 g/dl come nella cirrosi epatica-danni epatici (ma anche nella sindrome nefrosica e nelle enteropatie proteino-disperdenti: i danni ai glomeruli sono tali che l'albumina passa attraverso il glomerulo, che di norma non permetterebbe ciò)-->si ha la formazione dell’ascite causata da una riduzione della pressione oncotica ma anche da altre meccanismi (tra cui aumento della pressione portale).


Oppure in caso di enteropatie proteino-disperdenti-->l'epitelio intestinale non avrà più microvilli o l'orletto a spazzola sarà molto danneggiato-->perdita della capacità riassorbente.

2.Fattori della coagulazione1.Fibrinogeno: in caso di epatopatie croniche si può avere una ridotta quantità di fibrinogeno plasmatico con conseguente alterazione della coagulazione. 2.Trombina: prodotta dal fegato, circola nel sangue come protrombina; la formazione dipende dalla vitamina K. Il tempo di protrombina (PT) è il periodo di tempo, in secondi, necessario affinchè una certa quantità di plasma coaguli quando messo in contato con tromboplastina e ioni Ca++ a 37°C;

• la misurazione seriata del PT può essere utilizzata per distinguere tra colestasi e malattia epatocellulare grave: il PT viene misurato dopo somministrazione di vitamina K, carente nella colestasi per ridotto assorbimento intestinale; si pensa alla colestasi se il PT è normale dopo somministrazione di vitamina K, ad una patologia epatocellulare se non è normale (questo per lo meno a livello teorico).

Altri esami1.Acidi biliari2.Urea 3.Ione ammonio

1.Acidi biliariDerivano dal metabolismo parziale del colesterolo, sono prodotti e recuperati sempre a livello epatico. Gli acidi biliari prodotti vengono coniugati con una molecola di glicina o taurina: si parlerà di sali biliari coniugati in questo modo (saranno denominati acido glicocolico, glicochenodesossicolico, taurocolico e taurochenodesossicolico).La presenza di glicina o taurina determinano la presenza di un gruppo carbossilico con un pKα inferiore (glicina) o un gruppo solfato (taurina), completamente ionizzati a pH fisiologico; per questa caratteristica, i sali biliari sono più marcatamente anfipatici degli acidi biliari.I batteri presenti nell’intestino possono rimuovere la glicina e la taurina, riformando gli acidi biliari.Inoltre, possono rimuovere un gruppo OH dagli acidi biliari primari, formando degli acidi biliari detti secondari (acido desossicolico a partire dall’acido colico e litocolico a partite dall’acidochenodesossicolico).

• Escrezione fecale degl acidi biliari: 0.5 g/die (si perde poco colesterolo con questa modalità). • l’incremento della concentrazione di acidi biliari a digiuno potrebbe indicare un’alterato uptake

o secrezione epatica e quindi essere la prova di una sofferenza epatica; misurazioni seriale degli acidi biliari possono essere utili per monitorare pazienti con sospetta o provata sofferenza epatica.

2-3.Urea e ione ammonioUrea deriva da catabolismo proteico: si trova in circolo e viene escreta dal rene, è idrosolubile.¼ passa nell'intestino,e viene convertita in ammoniaca, da ureasi batteriche:l’ammoniaca (tossica) è quindi riassorbita e riportata al fegato dove viene riconvertita in urea.Nelle gravi epatopatie (compromissione di > del 90% del parenchima) si ha riduzione dei livelli plasmatici di urea e conseguente iper-ammoniemia: il fegato non è più in grado di riconvertire l'ammoniaca in urea in questo caso, per i notevoli danni subiti (saranno casi in cui è già precedentemente nota la patologia epatica).

• Valori normali: 11-50 mg/dl

Diagnosi molecolare per l'infezione da virus dell'epatite CCome anticipato non è sempre immediatamente possibile rilevare gli anticorpi contro il virus, questo perchè può essere caratterizzato da un periodo finestra.

Epatite A: benigna, meno grave. Epatite B: esiste un vaccino, è più grave. Epatite C: la più pericolosa: più degli altri virus epatitici possono dare prima cirrosi e poi carcinoma epatico. E' una infezione grave, che cronicizza e viene monitorata nel tempo.


Sarà utile identificare, quantificare e genotipizzare il virus: tali tecniche permettono quindi di dare molte informazioni sul virus in esame. Tale virus è responsabile del 90% di tutte le epatiti non A non B; il 30% delle infezioni acute diventa cronica con complicazioni viste prima. E' un virus piccolo, policistronico, esistono 10 genotipi differenti, sarà importante sapere il tipo che ha infettato il paziente. Codifica per una sola poliproteina che viene processata per dare origine a proteine strutturali e non strutturali. E' a RNA, a polarità positiva: il numero di filamenti di materiale genetico a polarità negativa è utile per capire l'indice di proliferazione virale che in atto.

Test1.Qualitativo: per confermare l'infezione in atto (tramite RT-PCR: Reverse Transcriptase-PCR)2.Quantitativo3.Genotipizzazione: il metodo principale è la PCR-RFLP

La RT-PCR

http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU&feature=related

La PCR permette di amplificare il numero di molecole di una certa parte di DNA: serve per es per sapere se c'è un virus: posso capire se è presente però solo moltiplicando notevolmente il patrimonio genetico, che non sarebbe individuabile da solo. Non serve amplificare tutto, basta, per convenienze e facilità, una porzione.

Meccanismo:DNA è tenuto insieme da numerosi e stabili legami a H, che dovranno essere però separati afinchè avvenga la replicazione (con formazione della forca replicativa): in laboratorio avviene tramite la temperatura, che denatura, separa i filamenti: si usa la polimerasi di thermus aquaticus (TQ polimerasi), insensibile alle alte temperature; cosa impossibile con quelle umane. Servono dei primers, ossia delle basi di partenza per avviare la replicazione: sono complementari ad apposite regioni del frammento scelto da replicare. Entra così in azione la polimerasi che si lega al DNA e polimerizza in senso 5 primo-->3 primo (a 72 gradi). In tempi brevi si ha un aumento lineare (teorico) delle molecole di DNA amplificato (in realtà non è efficiente al 100%, ma è un sistema comunque molto efficace). Si userà anche l'etidio bromuro, intercalante tra le basi, alla fine dei cicli di reazione: si fa poi una elettroforesi su gel-->la velocità di migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del frammento. Sarà necessario in ogni caso anche un controllo negativo, ossia una zona senza DNA: questo perchè la PCR produce molte molecole, ma senza specificità: ossia possono essere presenti nel laboratorio delle molecole di DNA (da altre fonti, esami...) che possono essere amplificate per "errore". E' utile quindi eseguire le operazioni di replicazione e di analisi in stanze differenti. (quindi praticamente si fa "girare a vuoto" la reazione, senza materiale amplificabile, come controllo).

31.03.10• Con questo sistema però non si può quantificare quanto virus era presente, si può solo indicare

se c'è o no: per avere dati di tipo quantitativo si usa la PCR real-time: nata dalla combinazione tra normale PCR+ fluorimetro, che rileva i segnali luminosi emessi dal DNA amplificato: come avviene?1.DNA+polimerasi + primer-->2.aggiunta di frammenti di DNA ibridizzabile con una regione interna rispetto ai primer+aggiunta di 2 molecole, 1 verde (reporter), che emette fluorescenza e 1 rossa, inibitrice (quencher) : la molecola verde non emette fluorescenza se legata o vicina alla rossa. La polimerasi elimina l'inibitore quando usa la sonda e la ingloba nella copia-->avverrà emissione di fluorescenza che sarà così quantificabile dal fluorimetro e direttamente proporzionale al DNA prodotto: il numero ottenuto è relativo, e non assoluto. Il numero di molecole finali è dato da: N.iniziali*(1+efficienza)n con efficienza maggiore di zero e minore di 1. Inizialmente la fluorescenza non è rilevabile, poi aumenta, in modo quasi rettilineo, e poi si ha una fase di plateau.La macchina può rilevare il segnale a un determinato valore di fluorescenza,


http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU&feature=related

posto come ciclo soglia: tale ciclo sarà differente in base alla quantità iniziale di molecole: ovviamente quindi, maggiore sarà il numero iniziale di molecole e più rapidamente verrà raggiunta la soglia, e quindi meno cicli saranno necessari per raggiungerla. Il numero iniziale non sarà individuabile in maniera precisissima, ma da una buona stima, una buona approssimazione delle molecole all'inizio della reazione.

Conseguenze: polarità di RNA : se +: per la retrotrascrizione serve un primer inverso, 3 primo 5 primo, antiparallelo e complementare: avverrà in tale modo SOLO trascrizione di questo filamento, e non quello opposto e quindi uguale. Viceversa, analogo discorso per il filamento n.2, a polarità negativa: in base a quanto filamento negativo si ottiene (fondamentale per la replicazione), si ricava il quantitativo di virus in attiva replicazione: in base al primer usato quindi si può valutare per capire se al momento del prelievo del campione c'è o meno una attiva replicazione: può essere utile per comprendere lo stato di avanzamento della malattia.

• Primer: diversi per i virus rispetto ai batteri: oligo T per i batteri, per i virus per es si usa un pool di oligonucleotidi random, con una serire più alta possibile di combinazioni.

• Per la ricerca per es delle clamidie a livello delle urine è utilizzata la PCR: tali patogeni non sono di facile o immediata coltura, quindi è molto preferibile utilizzare questo metodo.

• Polimerasi Tth: doppia funzione, a una temperatura più bassa sarà retrotrascrivente (qindi sarà utile partendo da RNA), a quelle più alte sarà DNA polimerasi: in tal modo non serve aprire le provette, i tubini, riducendo i tempi e i rischi di contaminazione.

QUINDI:PRO amplificazione rapida ed esponenziale del materiale, spiecificità elevata, grazie ai primers usati, non servono sonde marcate, è automatizzato.

CONTROrischio contaminazione con materiale esterno, rivelazione dei prodotti può essere labororiosa (perchè serve l'elettroforesi-fotografia dopo la PCR). I primer per ogni set di amplificazione sono molto costosi (in particolare per la PCR RT), perchè è complesso produttre sonda, quencher, etc...

• HCV:Infetta LB da modificare il comportamento-->possono portare a linfomi di tipo non Hodgkin. C'è un alta associazione tra epatite C e criogloblobulinemia senza significati difensivi/correlati a linfomi. 1 paziente su 4 che soffre di epatite ha anche criogloblobulinemia; in percentuale più bassa si hanno linfomi. Questo per lo meno in area europea, in Giappone invece ciò non accade: forse per motivi di dieta (pochi grassi, meno carne...).

• E' possibile quindi che il virus dell'epatite C possa infettare anche i linfociti: è possibile di conseguenza che in un paziente trapiantato la malattia si manifesti nuovamente, perchè si è nascosto nei linfociti.

• E' necessario capire a che sottogruppo appartiene l'HCV esaminato: esistono delle sequenze peculiari per ogni classe: si studiano quindi nell'amplificato la sequenza di alcune zone, da cui si ricava la specie, la tipologia di quel virus dell'epatite: si utilizza un piccolo oligonucleotide che si lega solo a quegli amplificati che sono complementari. Tali oligonucleotidi sono legati da una parte a una membrana e dall'altra parte sono liberi, per complementarsi con l'amplificato (se c'è ovviamente la zona complementare). Per ogni campione si fanno 10 reazioni diverse, per i 10 set di oligonucleotidi. A questo si aggiungono dei coloranti appositi, oppure fluoresceina o radioattività: ci possono essere delle variazioni nei risultati (maggior o minore colore nel risultato), per es una sonda si potrà legare anche a più genotipi, ma di virus differenti-->infezione da virus con genotipi diversi.

Fegato e lipoproteine plasmaticheColesterolo: deriva dalla dieta, dalla sintesi dei tessuti epatici ed extraepatici. Viene usato, consumato nella formazione delle VLDL, oppure nella secrezione di bile-acidi biliari. I livelli di colesterolo sono coordinati al rischio cardiovascolare, è importante quindi monitorare e tenere in osservazione la colesterolemia.


Viene trasportato dalle apolipoproteine, che hanno una componente proteica, una parte esterna fosfolipidica+ eventuale colesterolo non esterificato. All'interno ci sono lipidi, molto idrofobici (trigliceridi e colesterolo). Ci sono 5 classi di apolipoproteine, e alcune sono più importanti da considerare.

Chilomicroni: Prodotti in base a grassi assunti con la dieta. Ciclo di produzione:Intestino tenue assorbe i grassi e li riorganizza in chilomicroni, contenenti i triacilgliceroli. Tali chilomicroni passano nel linfatico e sboccano a livello della succlavia di sn-->circolo. Nell'immissione nel circolo acquisiscono la APO-C II che attiva le lipoprotein-lipasi che assumono e metabolizzano i trigliceridi: nel tessuto adiposo vengono asorbiti, nel muscolo vengono consumati. In questo modo il chilomicrone sarà ricco di colesterolo a questo punto. La APO E è fondamentale invece per l'uptake epatico, che prende il rimanente della molecola. la QP 48 serve invece per l'assemblamento del chilomicrone.

VLDLSono ottenute dalle rimanenza dei chilomicroni. Formate, vanno in circolo ematico e si legano ad APO C ed E. Inizialmente sono più ricche di trigliceridi, piuttosto che di colesterolo. La VLDL poi diventa IDL (densità intermedia), e diventa LDL (Low Density): con alto contenuto in colesterolo e basso di trigliceridi: in parte termina nei tessuti periferici, e in parte nel fegato: tali depositi possono formarsi anche a livello vasale, ecco perchè elevati livelli di LDL sono correlati allo sviluppo di patologie cardio-vascolari (si parla di particelle proaterogeniche).

HDLProdotte da fegato e intestino. Prendono colesterolo dalla periferia (anche vasi) e lo riportano al fegato (trasporto inverso del colesterolo). Elevati livelli di HDL sono inversamente proporzionali al rischio di sviluppo di malattie cardio-vascolari.

I macrofagi, entro certi livelli, possono rimuovere il colesterolo depositato: se però si raggiunge dei limiti, si formano cellule schiumose, "ingolfate" e quindi inattive, e che si accumulano: saranno rilevabili a livello delle placche aterosclerotiche. I livelli di LDL ossidate, quelle più pericolosi (perchè prima causa alla base del danno vascolare), sono collegati ai livelli di LDL non ossidate. Viene descritta poi brevemente la patogenesi della formazione della placca-->vedi patologia generale. Saranno benefici alti livelli di HDL quindi, e bassi di LDL. In ogni caso anche l'ipertrigliceridemia è un fattore di rischio cardio-vascolare.

Colesterolo e laboratorioMetodiche con errore dell'8% circa, quindi non bassissimo. Non è necessario misurare la colesterolemia a digiuno. In realtà si fa comunque a digiuno perchè altri esami (glicemia, trigliceridemia) necessitano di un digiuno.

Valori normali 220-200 mg/dl. In Europa per lo meno. In Giappone saranno auspicati valori più bassi. Non esiste un valore soglia, ogni livello di colesterolemia è associato a un determinato rischio, ovviamente correlato alla quantità di colesterolo.

Valori desiderabili di HDL: > 40 mg/dl

COL. TOT/HDL=5 (o meglio 3)

Valori di LDL: < a 160 mg/dl. Non direttamente misurate, ma tramite formula di Friedewald:

( (COL TOT)- (HDL+TG ) )/ 5


1.04.104.Elementi di ematologia

MisurazioneFondamentale è la conta dei GR (diam: 7 micron; spessore: 2.6 micron) per unità di volume. Avviene tramite contaglobuli parametrici: avviene con metodi simili alla citofluorimetria: valuta solo parametri fisici, non chimici: cell passano una alla volta, è sottoposta a un campo elettrico che viene schermato dalla composizione del GR: in base alle sue caratteristiche scherma più o meno il passaggio della corrente-->la schermatura, rilevata dalla macchina, riconverte tutto in volume-->viene registrato e viene determinato il VCM (volume corpuscolare medio).

Conduttività: da la misura dell'opacità cellulare (ossia la complessità): c'è una corrente ad alta frequenza, variabile in base alla complessità cellulare-->la corrente passante viene misurata e viene elaborato il dato (non serve sapere i dettagli). In ogni modo così si potrà comprendere la complessità interna delle cellule: sarà più utile per i GB.

Granularità: un laser colpisce le cellule contemporaneamente alla misura di impedenziometria e di opacità: serve per valutare la luce diffratta dalle cellule, che sarà direttamente proporzionale alla loro granularità e alla struttura della membrana cellulare.

Parametri 5 milioni nell'uomo4.5 milioni nella donnaIl loro numero sarà direttamente proporzionale alla capacità di trasportare O2 quindi.

Ematocrito: quantità di volume occupata dei GR rispetto al volume totale: dice quanto sono concentrati i GR: si calcola dal prodotto del numero dei globuli rossi per i volume corpuscolare medio; valori normali 41-50% per i maschi e 36-46% per le femmine. Valori alti saranno segnale di maggior quantitativo di GR e viceversa se bassi.

Fisiologicamente aumenta in caso di disidratazione o in vita ad alta quota (ossia in caso di ipossia: questo per attività delle cell juxtaglomerulari che producono più EPO ). Il vantaggio è che viene trasportato più O2: MA: eccessivi aumenti di GR vanno ad aumentare la viscosità (non è la densità) del sangue-->minor scorrimento-->favorita l'occlusione nei piccoli vasi. Cala in caso di aumento di VCE, per aumento della componente liquida del sangue.

MCV: volume corpuscolare medio: volume medio del GR, espresso in femptolitri: valori normali tra 80-94. Si parla di microcitosi quando MCV è <60-65; macrocitosi: >100, 120.

RDW: misura l'anisocitosi ossia l'ampiezza della distribuzione eritrocitaria: è espresso come coefficiente di variazione (= deviazione standard della distribuzione dei volumi eritrocitari/MCV) e i valori normali sono compresi tra 11.5 e 14.5. Più piccola è la DS e più i dati sono vicini tra loro: valori bassi: se media è vicina alla deviazione standard.

14.04.10Le macchine contaglobuli possono misurare anche altri valori tramite le misure di scattering, come per es:HCHM: mean Hb corpuscolar concentration: varia tra 13.7-17 g/dl nel maschio e 12.5-16 g/dl nella donna. HDW: ampiezza della dstribuzione di Hb-->indice relativo alla diversa distribuzione delle concentrazioni di Hb nella popolazione di eritrociti: calcolata in base al rapporto tra deviazione standard e valore medio di HCMC. Valori normali: 13.5-17 g/dl nell'uomo e 12.5-16g/dl nella donna.

Indici eritrocitariPoiché MCHC e MHC sono calcolati, vengono definiti indici eritrocitari.

MCHC o concentrazione corpuscolare media di Hb, si ottiene dal rapporto tra la concentrazione di Hb/dl e l’ematocrito(Ht); di fatto HCMH e MCHC sono uguali tranne per il motivo che il primo è


misurato, il secondo è calcolato da altri parametri misurati.Valori normali: 32-36%.

Un altro parametro calcolato è l’ MHC o Hb corpuscolare media : è il contenuto medio (massa) di emoglobina per globulo rosso, espresso in picogrammi e viene calcolato dal rapporto tra il valore della concentrazione di Hb ed il numero di globuli rossi/mm3.Valori normali: 26 e 32 picogrammi.

E' possibile anche analizzare le popolazioni eritrocitarie, ossia è possibile suddividere i GR in base alla forma, dimensione, contenuto di emoglobina:Normociti: 80 femptolitri circa. Non sanno ossidare gli acidi grassi perchè non hanno mitocondri. L'unica fonte riducente deriva dallo shunt dell'esosomonofosfato: difetti a livello di tale via e in particolare glucosio 6 fosfato deidrogenasi, possono alterare meccanismi di trasporto/ esposizione a danni ossidativi e quindi a crisi emolitiche (favismo). Sanno solo trasportare O2. Reticolociti o neociti: sono più grandi, più complessi, sono ancora cellule, così denominati perchè alla colorazione presentano un reticolo peculiare: 120 femptolitri. In condizioni normali sono 0.5-2% dei GR totali. In caso di anemia per es emorragica: a ore di distanza da evento emorragico-->aumenta il loro numero. Si avrà quindi macrocitosi. Gerociti o sferociti: 60 fl.

EritropoietinaProduzione di GR è continua e dipende dall'ossigenazione dei tessuti. E' dosata tramite RIA (radio-immuno assay). Diminuisce in modo inversamente proporzionale all'ematocrito (Ht). Nell'insufficienza renale cronica si può avere meno produzione. Aumenterà ovviamente in caso di ridotta pressione parziale di O2: inufficienza respiratoria, alta montagna, shunt polmonare, anemia. IMPORTANTE DOMANDA ESAME

• EPO viene usata per aumentare prestazioni fisiche: ma in tal modo aumenta viscosità del sangue-->si aumenta molto il rischio di micro o macro infarti. Una volta si usava EPO esogena, ora addirittura sequenze circolari di DNA (plasmidi) codificanti per EPO stessa.

Metabolismo del ferro e proteine correlateFe è fondamentale per legare O2, in quando componente fondamentale dell'EME. Non può circolare libero perchè è tossico, deve essere sempre legato a proteine. Ricco in cibi come fegato, pesce, carne. Il duodeno è la sede principale di assorbimento del Fe: deve essere coniugato con ferritina dentro le cellule della mucosa. Per essere liberato nella circolazione, viene legato alla transferrina.

Ferritina: depositi. Globulare, localizzata in prevalenza nel fegato. Può contenere migliaia di ioni ferro, costituita da nanogabbie e da 24 subunità identiche H ed L (H coinvolta forse nel caricamento del ferro). La ferritina può anche circolare, ma poca, rispetto a quella presente nei tessuti: la concentrazione di ferritina nel siero è strettamente correlata con la quantità di ferritina intracellulare che è a sua volta prodotta in funzione del livelli di ferro intracellulare: Bassa ferritinemia=bassi livelli tissutali=bassi livelli di Fe, basse riserve. In patologie infiammatorie, epatiche, tumori, la ferritina può aumentare! Attenzione a non interpretare male i valori quindi.

Transferrina: circolo. Il ferro passa dal circolo al fegato, viene legato dal recettore (TfR)-->usato dal fegato-->la transferrina invece non viene degradata ma rimandata in superficie, riciclata, subisce ricircolo. E' utile per stabilire quanto Fe c'è in circolo quindi. La velocità di produzione di tale proteina è inversamente proporzionale alle scorte di Fe. La transferrina può essere misurata come massa (mg/dl) ma anche tramite indice di saturazione della transferrina: tale indice si calcola dal valore della sideremia (corrispondente a quota di ferro legata alla transferrina) e dalla capacità di legare Fe (TIBC: total iron binding capacity, ossia quanto il ferro satura la transferrina).

Si avranno quindi informazioni differenti dai valori di tali proteine.


Le anemieConoscere i valori di Fe sono utili nelle anemie: per anemia si intende una riduzione delle quantità totale di emoglobina circolante nel sangue periferico all'interno degli eritrociti.

La quantità di globuli rossi/µl può non riflettere il grado di anemia: infatti nelle anemie microcitiche-ipocromiche (deficit di ferro, anemia mediterranea) il calo di Hb si associa ad una numero normale o aumentato di globuli rossi.

Sono principalmente di 2 tipi:1.Iporigenerative:a. Produzione insufficiente di GR da cause midollari b. Difetti qualitativi dell'eritropoiesi (difetti di sintesi di DNA, macrocitosi per blocco della divisione tra cellule). c. Difetti di sintesi di Hb.

2.Anemie rigenerativea. Da emorragia acuta b. Da emolisi

Poi si possono dividere in base alle dimensioni dei GR:1.Normocitiche normocromiche: per es in caso di emorragia importante, dopo un tempo ragionevolmente distante (1 ora: perchè la volemia è stata ripristinata, ma non i GR e quindi l'Hb. I GR presenti saranno ovviamente normali). Poi si potrà avere retricolocitosi, che può aumentare un po' le dimensioni (è possibile una macrocitosi quindi).

2.Ipocromiche microcitiche: in carenza di Fe si ha anemia sideropenica (anemia microcitica). ...

I parametri e la classificazione variano quindi in base al tempo, al contenuto di ferro.Ce ne sono molti ma consideriamo solo questi 3 casi:

1.Anemie microcitiche (ipocromiche): MCV<79 flMCHC<32%Discreto grado di anisocitosi

Le cause più comuni sono riconducibili a una carenza di ferro (anemie sideropeniche) o a difetti delle catene globiniche (talassemie).

Diagnosi differenziale: anemia sideropenica: sideremia diminuita, transferrina insatura aumentata, ferritina diminuita anemia talassemica: sideremia normale/aumentata, studio Hb mediante elettroforesi, studio familiare/test genetici.

Anemia sideropenica:

Fe in deposito Normale Leggero calo del deposito

Calo del deposito Assenza totale del deposito/ Scarso

in eritrone

TIBC: μg/100 ml 330 360 390 410

Ferritinemia:μg/100 m 100 20 10 <10

Sideremia: μg/100 m 115 115 <60 <40

Saturazione transferrina 35,00% 30,00% <15 <10

Eritrociti Normali Normali Normali Microcitici ipocromici

(ferro dell'eritrone: Fe a livello del midollo)


Si nota che progressivamente cala la ferritinemia, a partire dalla prima deplezione di Fe: prima si depauperano i depositi periferici e poi quelli midollari.

Anemia talassemica:anemia deriva dall'aumentata distruzionedei GR in seguito a difetti di sintesi di catene o α o β (CFR ematologia per maggiori dettagli). I geni per la catena α sono 4; fino alla perdita di 50% delle catene α il soggetto non viene di solito a conoscenza del problema, perchè l'anemia è lieve/non presente. Problemi ci saranno quando è ridotto il 75% delle catene-->si avrà anemia emolitica.(si avrà invece idrope fetale e quindi una condizione incompatibile con la vita quando non funziona alcun gene). La causa principale per mancata produzione di catene sono gravi problemi genetici: sarà possibile tramite apposite tecniche individuare il gene interessato.

Per la catena β invece i difetti sono più ristretti, ma molto vari, c'è una certa eterogenicità, non ci sono mutazioni "tipiche" (come in fibrosi cistica per es).

Si parla di β talassemia: in caso di aumento della quantità di HbA2 o possibile aumento di quantità di HbF (fetale). Si parla di α talassemia: in caso di ridotta quantità di HbA2.

L'elettroforesi delle Hb può essere in grado di evidenziare circa il 60% delle varianti dell'Hb. Oppure si può usare tecniche particolari come Dot Blot:si fissa su supporto solido un oligonucleotide che riconosce una sequenza mutata. Poi, dopo dei lavaggi, si può verificare se è avvenuto il legame o no (tramite tecniche colorimetriche tramite fluorocromi ).

Un'altra tecnica è l'ibridizzazione con oligonucleotidi allele specifici (ASO):Il metodo impiega sonde oligonucleotidiche complementari all’allele normale (WT, wild type) o all’ allele mutato e condizioni di ibridizzazione tali da permettere la formazione dell’ibrido solo dove la complementarietà è perfetta:

Risultato:1-4: normali2-5: eterozigoti3-6: omozigoti

Vedi slide per dettagli e disegni.

(Da internet: Definizione di: OLIGONUCLEOTIDE ALLELE-SPECIFICO (ASO)Oligonucleotide sintetico progettato per ibridizzare con una specifica sequenza nucleotidica e, in condizioni ottimali, non in grado di legarsi a sequenze simili. Anche una singola variazione nucleotidica viene identificata da un ASO specifico per una sequenza allelica. Gli ASO vengono utilizzati come primers anche in reazioni di PCR per distinguere alleli simili tra loro.)

2.Anemie macrocitiche:dovute a cause eterogenee (carenza di folati o vitamina B12, non sintetizzabile dall'organismo ma introdotta con la dieta). Sono dovute a difetto di sintesi di DNA: la cellula prima di duplicarsi deve dividersi; nel mentre, o quasi, replica anche il DNA. Se però il DNA non viene duplicato correttamente, non viene terminata la sua sintesi, non avviene la divisione corretta tra le cellule. Il nesso tra folati e DNA è il seguente: B12 viene usata prinicipalmente per neosintesi di basi DNA: in caso di deficit si avranno delle conseguenze ovvie sulla produzione delle basi.

Da acido folico-->acido tetraidrofolico-->biosintesi purine, pirimidine, aminoacidi. Poca B12: poco passaggio da acido folico ad acido tetraidrofolico.


Cause di carenze di B12:1.Deficit nutritivo2.Malassorbimento intestinale: infiammazione (morbo celiaco, morbo di Chron...).Importante in tutto ciò è anche il fattore intrinseco: è fondamentale per legare la vitamina B12, permettendone l'assorbimento in modo efficiente. Se non c'è questo fattore, aumenta la degradazione della B12, è come se non ci fosse la vitamina quindi (che sarà eliminata con le feci). In assenza del fattore intrinseco (malattie autoimmuni, patologie genetiche) portano ad anemia perniciosa (o megaloblastica).

3.Anemie normocitiche (normocromiche)Oltre a quanto già detto si deve aggiungere il fatto che possono essere dovute a lisi intravascolare dei GR (vedi favismo...). Nelle forme post-emolitiche si osserva dopo un po' di tempo dalla crisi, un aumento di bilirubina totale ed indiretta, segno di aumentato catabolismo dell'eme. Si avrà anche aumento dell'LDH, per liberazione di enzimi dei GR.

5.Apparato urinario

Cenni anatomofisiologiciL'unità funzionale è il nefrone (ansa, capsula Bowman, tubuli, ansa di Henle, collettore). 5-6 litri di sangue passano circa 20 volte in un'ora: ne passano quindi in tutto 100 litri. L'urina primitiva contiene molta acqua, sali, zuccheri e proteine. In 24 ore però i corpuscoli renali filtrano 180 litri di liquido, ma solo un litro e mezzo in media verrà eliminato. Verrà riassorbito quasi il 99% del liquido.

Escreto= filtrato glomerulare+secreto tubulare-riassorbimento tubulare

Filtrato glomerulare: simile al plasma, ovviamente senza cellule, per lo meno in condizioni fisiologiche. Albumina è filtrata solo per lo 0.005%, in quantità non nulle ma estremamente basse. In ogni caso, se non avvenisse un riassorbimento tubulare per pinocitosi, si perderebbero troppe proteine (30g).

Riassorbimento:Tubulo contorto prossimale:soglia di riassorbimento tubulare per glucosio: non superiore a 180 mg/dl: il resto verrà eliminato Riassorbiti Na, K, Ca, Mg, aminoacidi...Ansa di Henle, distale, collettore: meccanismi legati ad equilibrio idroelettrolitico, visti a profusione in fisiologia I.

Analisi urineUn analisi completa delle urine consiste in punti distinti:esame fisico, che ne rileva il colore, la trasparenza e la densità;l'esame chimico, che testa chimicamente la presenza di diverse sostanze che forniscono informazioni sullo stato di salute e di malattia;l'esame microscopico, che identifica e conta il tipo di cellule, cilindri, cristalli, e altre componenti (batteri, muco) che possono essere presenti nell'urina.L’esame microbiologico che identifica la presenza di patogeni.

Direttive su come raccogliere le urine:Le urine per l'esame chimico-fisico possono essere raccolte in qualunque momento, ma è di gran lunga migliore il campione del primo mattino perché, essendo più concentrato, offre maggiori possibilità di rinvenire eventuali risultati patologici: questo soprattutto nel caso di indagine microbiologica: l’urina del mattino permette più facilmente l’individuazione di micro-organismi a causa della stasi urinaria vescicale notturna che ne permette la crescita e quindi l’incremento di numero.Nel caso di una valutazione microbiologica dell’urina, a causa del pericolo di contaminare le urine con


batteri dalla cute circostante, nella fase di raccolta (soprattutto nelle donne), è importante che i genitali siano puliti. Appena inizia la minzione, il primo getto va eliminato, quindi si raccoglie l'urina (10 - 20 ml) in un adatto contenitore (sterile se richiesta indagine microbiologica) stando attenti ad evitare il contatto tra i genitali ed il contenitore.

Esame chimico-fisico:1.Aspetto: limpida e dal colore giallo paglierino, dovuto a urocromi, urobilinogeno, pigmenti presenti in bile ed eliminati con i reni. Se è torbida: possibile infezione batterica, cellule, muco, fosfati alcalini. Se sono presenti sfumature rosse: anomala presenza di sangue che può essere confermata dall’esame per la ricerca dell’emoglobina; (ematuria, urine a lavatura di carne...)Tra le cause patologiche invece si possono manifestare le infiammazioni della vescica, la perdita di sangue dai reni.E' possibile, raramente, l'emoglobinuria parossistica notturna, malattia autoimmune-ematologica rara, caratterizzata appunto da abbondante emoglobinuria. Una colorazione arancione: eccessiva quantità di urobilina, un prodotto della trasformazione della bilirubina, normalmente presente nell’urina solo in tracce; l’aumento dell’urobilina può essere il segnale di alcune malattie a carico del fegato o del sangue: le urine si presentano invece di colore marrone a causa dell’elevata presenza di bilirubina, indice generalmente di alterata funzionalità epatica.

21.04.102.Densità:rispetto all'acqua distillata: per mette di capire quanto il rene riesce a riassorbire, indicativo quindi della funzione tubulare. Normalmente il valore è 1005-1025: si parla di normostenuria.Il valore cambia in diverse occasioni: non assunzione di liquidi-->il peso diventa superiore a 1025;aumento dell'introito di liquidi-->il peso può diventare <1005.Spesso però urine molto diluite sono indice di fenomeni patologici in atto. 3.Ph:Varia da 4.8 a 7. Le variazioni sono comunque numerose, anche in casi fisiologici: per es diete iperproteiche portano ad abbassamento del pH; farmaci contenenti bicarbonati possono rendere il pH più basico. 4.Proteine:una loro perdita implica perdita di nutrienti. Di norma non sono perse, o comunque in quantità minime: verranno in gran parte filtrate e riassorbite. La proteinuria fisiologica si porta su valori di 40-200 mg/24 h: può essere dovuta a sforzi fisici, colpi di calore, febbre prolungata. Quantitativi maggiori vengono persi in glomerulonefriti, pielonefriti (infezioni a livello del calice-bacinetto renale), sindrome nefrosica: si avrà un notevole calo di albumine-->si possono manifestare i problemi pressori /oncotici connessi.

La proteinuria viene classificata in:a. Glomerulare: divisa in selettiva, se il danno è contenuto: si ha perdita di proteine fino a 67 Kdalton (come albumina). Non selettiva: danno maggiore, passano la barriera anche le Immunoglobuline. b. Tubulare: non si ha riassorbimento: si rileveranno nelle urine proteine di piccole dimensioni per mancato riassorbimento (alfa1 microglobulina per es).c. Forme miste: correlate a una insufficienza glomerualre, oppure quando le proteine perse sono così tante che il tubulo non riesce a riassorbirle. E' utile quindi conoscere quantitativo e tipologia di proteine disperse. 5.Bilirubina e pigmenti biliari:Se quella coniugata è superiore ai 2-2.5 mg/100 ml si sarà di fronte a bilirubinuria. Di solito si ha in caso di danno epatico. I pigmenti di norma non sono presenti, o comunque in minime quantità; se aumentano possono essere in corso patologie epatiche (epatopatie virali, tossiche, cirrosi, neoplasie, ostruzione delle vie biliari). 6.Glucosio:Come detto precedentemente di solito viene filtrato e riassorbito, fino alla soglia di 180 mg/dl a livello


ematico: in questo caso comparirà già glicosuria. 7.Urea:modalità con cui viene eliminata l'ammoniaca. I valori fisiologici sono 25-35 g/24 h. Aumentano in caso di diete iperproteiche e stati febbrili per es. Deficit di eliminazione, per causa renale, portano a iperammonemia, uremia e azotemia. 8.Corpi chetonici: derivati dagli acidi grassi, sono utili per reintegrare l'organismo in caso di calo delle riserve di zuccheri. I CC, tranne l'acetone, vengono monitorati soprattutto in relazione al diabete. Aumentano anche in caso di digiuno prolungato, stress, epatiti croniche...9.Emoglobina: compare nelle urine quando aumenta, non fisiologicamente, nel sangue (nel caso quindi di anemie emolitiche, oppure in infezione delle vie urinarie); da non confondere con l'ematuria, in quanto in quest'ultima si ha precipitazione del GR (saranno visibili più o meno microscopicamente nelle urine), mentre in caso di emoglobinuria il GR non precipita. Di solito la quantità rilevabile è proporzionata al danno.

Esame microscopico:1.GR:assenti, fisiologicamente, o presenti al massimo nel numero di 2 per campo. Al di sopra si parla di ematuria: per es in caso di calcoli renali, che danneggiano le vie urinarie; glomerulonefriti; neoplasie maligne e benigne, possono dare emorragie anche intermittenti; farmaci: in particolare gli anticoagulanti; infezioni delle basse vie urinarie. Divisa in macroematuria se è visibile ad occhio nudo, microematuria invece se visibile tramite microscopio. Si parla di ematuria glomerulare, quando i GR hanno anomalie di forma (GR dismorfici: quando l'anomalia è > o = all'80%: ciò è dovuto alle modifiche che il GR deve subire nel passaggio del glomerulo). Se sono morfologicamente normali si parla di ematuria non glomerulare.E' possibile eventualmente ricercare anche la presenza della α2 microglobulina, per valutare più‐ precisamente l'origine dei GR. E' una proteina ad alto PM, quindi non passerà mai il glomerulo: se presente nelle urine, associata ad ematuria, permetterà di risalire a un danno postglomerulare. 2.GB:indice di flogosi, se presenti massivamente, in particolare a livello di alte o basse vie urinarie. Di norma assenti o 1-2 per campo. Se moderati, possono essere segno di glomerulonefrite, prostatite, traumi, neoplasie vescicali: la presenza sarà costante. 3.Cellule epiteliali:presenti in piccole quantità; se in quantità maggiori, probabile infezione che causa il loro distacco. 4.Batteri, miceti:urina è di solito sterile. Tali patogeni+GB=infezione. Necessaria urinocoltura. 5.Cilindri:si parla di cilindruria quando sono evidenti agglomerati proteici o di altri elementi che di norma non dovrebbero essere presenti. Formano il sedimento. Di diversi tipi:cilindri cerei: in caso di nefropatie avanzate. Cilindri ialini: sopo anestesie, sforzi fisici, in nefriti. Cilindri eritrocitari e leucocitari: permettono di accertare l'origine renale di un'ematuria o di una leucocituria. Cilindri pigmentati: in ittero ed emolisi acuta. Cilindri epiteliali: formati da cellule di sfaldamento dell'epitelio, durante per es glomerulonefriti acute. 6.Cristalli:Spesso presenti nelle urine, anche senza patologie in corso. Comunemente sono rilevati fosfati amorfi, fosfati di calcio, bicarbonati di calcio, cristalli di acido urico e ossalato di Ca. In caso di patologie saranno rilevabili cristalli di:leucina:per es in caso di insuff.epaticaCistina: in patologie renali Tiroxina: aumentata in caso di insuff.epaticaCristalli di sulfadiazina: in caso di impiego di sulfamidici.


Valutazione della funzionalità glomerulareTramite l'inulina, polimero glucidico, che viene escreta dal rene nelle urine: viene somministrata precedentemente per via endovenosa, e permette la misurazione della Velocità di Filtrazione Glomerulare (GFR o VFG), o detto più correttamente, la clearance dell'inulina. Con il termine clearance si intende la capacità renale di depurare il plasma da diverse sostanze, o meglio “si intende la quantità di sangue che viene depurata dal rene da una sostanza X nell'unità di tempo (di solito un minuto)”. l'inulina filtrata non viene riassorbita o secrete, quindi il volume di plasma da cui deriva corrisponde a tutto quello filtrato in un minuto, e di conseguenza alla VFG.

In laboratorio viene però utilizzata con maggior facilità, velocità e risparmio la clearance della creatinina, esame però meno preciso rispetto alla misurazione dell'inulina. La creatinina è una sostanza endogena, che si ottiene dal prodotto catabolico della fosfocreatina, fondamentale per accumulare energia nella cellula. Si rileva maggiormente a livello muscolare: durante l'impiego della fosfocreatina, parte di essa viene convertita in creatinina, ed eliminata dal rene.Il quantitativo prodotto è direttamente proporzionale alla massa muscolare e/o all'attività fisica, quindi varia in base all'età, sesso, alla razza. La creatinina può essere rilevata sia a livello ematico che urinario: nel primo caso è un esame routinario, basta un prelievo di sangue (a digiuno e a riposo da almeno 8 ore).

ValoriNormali: 0.6-1.2 mg/dlPatologici: la creatininemia si eleva quando circa il 40% e più del parenchima renale è danneggiato.

Nel caso della misurazione a livello urinario (creatininuria), il caso è differente: si basa su un campione raccolto nelle 24 ore: spesso è associato alla creatininemia, per ottenere una affidabilità maggiore della funzionalità renale.

Per valutare la clearance partendo dalla creatina sierica si utilizzano delle formule matematiche: i valori rilevati vanno inseriti in questa forumula:

Clearance= ([Urinaria]*Volume urine in 24 ore)/[Plasmatica]

E' possibile mettere in correlazione il valore ottenuto con la superficie corporea del paziente in questo modo:

(([Urinaria]*Volume urine in 24 ore)/[Plasmatica]) * ((1.73)/Superficie corporea paziente)

Dove 1.73 è una superficie corporea media di un soggetto di 70 Kg, espressa in metri quadrati, così come la superficie del paziente in esame (ricavata da apposite tabelle, dati peso e altezza).

Ad ogni modo spesso è preferibile utilizzare la clearance stimata della creatinina, ossia ricavata tramite formule matematiche, tenendo conto di creatininemia, peso, età e sesso del paziente.

Valutazione della funzionalità del riassorbimento tubulareUn danno tubulare può essere rilevato analizzando la concentrazione plasmatica e urinaria di elettroliti, glucosio, H+, HCO3-. Infatti, la capacità di concentrare le urine è indice di buona funzionalità tubulare; per osmolarità delle urine o peso specifico si intende il numero di particelle osmoticamente attive presenti in un Kg di solvente: sarà indipendente dalla massa delle particelle in soluzione.Oppure è possibile valutare il riassorbimento misurando la capacità di riassorbire proteine come la β2‐microglobulina, a basso peso molecolare.

Esame microbiologico:Principalmente si utilizza l'urinocoltura, per individuare tipo e quantità di patogeni nelle urine.Successivamente si compila l'antibiogramma, che permette di indicare a che antibiotici è sensibile il patogeno individuato. Fornisce risulatati più attendibili rispetto all'analisi del sedimento urinario che talvolta può dare esiti


negativi anche se i batteri sono presenti. Batteriuria >a 50000 batteri/ml urina viene considerata clinicamente significativa, da trattare (così come batteriurie < a 50000 batteri ma con sintomi correlati).

I patogeni rilevati più frequentemente sono:E.Coli, proteus, staffilococcus, enterococcus, Klebsiella, Candida albicans.

L'individuazione avviene classicamente tramite colture su terreni selettivi: la maggior parte dei patogeni sono coltivabili con rapidità o comunque caratterizzabili dal PDV del fenotipo e biochimico. Vengono invece impiegati test molecolari nel caso di microrganismi a lenta crescita o con difficoltà ad essere coltivati: per es: Clamydia Trachomatis: batterio intracellulare obbligato, la cui coltura non è immediata, si preferisce quindi ricercarne il genoma, tramite PCR; oppure Neisseria Gonorrhoeae o Mycoplasmi (Ureaplasma Urealyticum).

Infine il patogeno viene tipizzato dal PDV molecolare per determinare la resistenza agli antibiotici: molti geni plasmidici o cromosomici permettono infatti al patogeno di diventare o essere resistente agli antibiotici. Si utilizzerà, per identificarle l'antibiogramma diretto o da ceppo isolato (ricordando il concetto di MIB: minima concentrazione inibente). E' possibile anche impiegare l'analisi tramite PCR.

4.Markers tumorali 06.05.10

Tratto da: MEETING MARKERS TUMORALI

• Sono sostanze espresse sia da tessuti normali sia neoplastici. La specificità è inficiata e limitata da ciò.

• Sono prodotti in maggior quantità dai tessuti tumorali, sono degli indicatori quantitativi più che qualitativi.

• Sono presenti nel sangue in quantità proporzionale alla massa tumorale. • Sono misurabili nel sangue anche in soggetti senza tumore. Ritorna il discorso sulla

specificità.

Distinguibili in base alle proprietà biologiche:enzimi isoenzimi: PAP, NSE, PSAOrmoni: gonadotropina corionica, tireoglobulinaMolecole di adesione: CEA (antigene carcinoembrionario)Molecole di trasporto: α-fetoproteina Glicoproteine di cui si sono identificati gli epitopi che caratterizzano il marker Autoanticorpi generati VS molecole tipiche di un fenotipo tumorale (A anti p53 mutata: p53 è il guardiano del genoma, reagendo a possibili danni cellulari). Cellule tumorali in materiali biologici: non si va a visualizzare la proteina ma l'RNA codificante per la proteina (p53, k-ras-->valutabili le mutazioni del DNA ). Prima della salita dei valori proteici c'è l'aumento della salita dei valori di RNA, in questo modo, prossimamente, sarà possibile anticipare i tempi. (psa, citocheratina 20...)

P53P53: appartiene a una grande famiglia di proteine deputate al controllo della moltiplicazione e della vita della cellula, serve per controllare integrità del DNA. La cell diventa tumorale se accumula una serie di difetti e danni del patrimonio genetico. Se il danno è eccessivo, avviene interruzione della replicazione cellulare, oppure induzione di apoptosi. Se mutazioni colpiscono gene per p53-->sviluppo di molti tipi di tumori, perchè la cell non è più controllata, viene perso il freno.


La p53 ha anche altri compiti: attiva trascrizione di p21 che interagisce con altre proteine come cicline e Cycline Dipendent Kinase (CDK) che regolano proliferazione cellulare. Le molecole citate intervengono nel ciclo cellulare, con andamento ciclico dal PDV della concentrazione, da qui il loro nome. Imp sono cicline D ed E, con picco in fasi precise. P21 inibisce cicline di fase G1, da fase presintetica a quella sintetica. Mutazioni di p53 intervengono in tumori a polmone, stomaco, seno, colon, fegato...in ordine di grandezza. Ovviamente serviranno come detto anche altre mutazioni.

Tipi di markerSono divisibili in 3 gruppi:1.markers certamente utili per testimoniare diffusione malattia: markers di I scelta: in cui il rapporto costo/risultato è ottimale. (E' inevitabile considerare il costo delle operazioni!). 2.markers probabilmente utili : in cui si hanno forti evidenze in lab ma non ancora in clinica.3.markers di II scelta.

In +: markers affini: markers che non danno info in più di altri. Quindi bastano quelli che si usano già.

Uso clinico 1.Screening: anche se i markers hanno sensibilità e specificità non altissimi: vedi aumento di PSA sia in caso di tumore a prostata sia in caso di prostatite.Nonostante i limiti sono usate PSA e AFP, ma non sono certi, come può essere per es la troponina per il cuore. Eccezione fanno alcuni markers che hanno specificità tissutale, vedi: cancro a tiroide, a testicolo, a piccole cell del polmone... 2.Ricerca della sede di origine di metastasi a partenza ignota: per es in caso di comparsa di aumento dei markers nonostante asportazione della massa principale-->indice di metastasi.3.Tumore primitivo già diagnosticato: il dosaggio viene fatto per :avere un valore basale prima della terapia avere indicazioni indirette dell'estensione della malattia avere indicazioni agiuntive circa l'istotipo per i tumori nei quali diversi isotipi producono markers diversi.

Incremento del livello di marker può precedere di parecchi mesi la ripresa della malattia.

Esempi di markers 1.PSA, antigene prostatico specifico: non è strettamente correlato a tumore, infatti i suoi valori sono alti anche in caso di ipertrofia prostatica o prostatiti. Deve essere ben valutato il livello:< 4 ng/ml: normale 4-10 ng/ml: rischio tumore maggiore del normale >10 ng/ml: associazione maggiore con tumore.

2.CA-15.3: per CA a mammella. Tanto più è estesa la malattia, e tanto più verrà prodotto. Anche qui la specificità non è assoluta. Deve essere correlato ad altri esami, storia clinica... 3.MCA: mucin like cA associated Ag: uguale a CA153 o si fa il primo o questo. 4.TPA:Ag polipeptidico tissutale appartiene a famiglia delle citocheratine. E' un indice di proliferazione cellulare, correlato cioè al rate di replicazione. Dosabile sia nel siero che nelle urine. Può esserci anche in epatiti, cirrosi, infezioni del tratto biliare....anche in questo caso si dovrà sapere la storia clinica. 5.CYFRA 21-1:in tumori epiteliali, albero bronchiale...ricorda la storia clinica!6.NSE:enolasi neurone specifica, utilizzato per la stadiazione, individuazione di recidive in CA polmone a piccole cellule o neuroblastoma. 7.CA 125:Glicoproteina prodotta da organi sessuali della donna. Valutato in caso di fase post diagnostica in CA ovaio. Significato di monitoraggio di progressione malattia/efficacia della terapia messa in atto. 8.CEA:tipicamente aumentato in soggetti con CA mammella, colon-retto, gastrico. Prodotto


durante lo sviluppo fetale, ma la produzione si ferma prima della nascita. Presente anche in colite ulcerosa, pancreatite, cirrosi epatica. Ricorda la storia clinica!9.α-fetoproteina: CA epatocellulare, neoplasie germinali, oppure condizioni non neoplastiche: epatopatie acute e croniche.

Nuove tecniche1.Ricerca di RNA come detto : melanoma per es: la tirosinasi , si fa già! Sono tecniche non invasive.2.Microarray: permettono di analizzare TUTTI gli RNA prodotti da una cell: una cell tumorale è diversa da altre-->nell'evolzione del tumore ci sono diverse cell che si sviluppano, si verifica anche una selezione: Terapia: uccide tt le cell sensibili, lasciando però cell resistenti alla terapia. Si selezionano cell in tale modo. Ecco perchè si fanno delle polichemioterapie, per ridurre tali resistenze. Con le nuove tecniche, si potrà vedere quali cell si stanno selezionando e quali no, in modo tale da fermare la selezione, aggredendo con un altra terapia le cell non resistenti alla prima terapia. Come avviene?Si preleva RNA delle cell-->lo si copia e marca con rosso e verde con DNA-->gli RNA sono messi in meno di 1 cm3, gli oligonucleotidi complementari a diverse sequenze che si conoscono, circa 200.000, che si possono ibridare con l'RNA che si mette nel campione. In base al colore che si vedrà nel chip, si capirà se quel gene è espresso o da cell sane o da cell malate. In base al quantitativo di colore, la macchina può stabilire se si sono più cell tumorali che esprimono un gene piuttosto che quelle sane e viceversa. Ovviamente il "colore finale" dipende dalla quantità di cDNA prodotto.Per ogni puntino la macchina sa a che gene si associa. Gli usi sono svariati: confrontare per es l'effetto di un farmaco su delle cell, l'espressione diversa tra cell normali e cell malate...

3.Prossimamente sarà utile anche la tipizzazione proteica, tecnica complicata per ora, servono per es gli Ab; ci sono altri problemi tecnici. Sarà il futuro-->studiare le proteine prodotte in condizioni normali e patologiche. Nella diagnosi, dal PDV chirurgico un markers con un lieve aumento non è indice di neoplasia. Da soli non vengono mai presi in considerazione, benchè si è visto che per es in caso di neoplasie addominali un CEA alto è indice di prognosi peggiore. Ci sono per contro tumori avanzati con CEA basso! I più usati CEA, TPA, CICA. Enolasisi neuroendocrino, soprattutto nel follow up, ovviamente in base anche ad altri mezzi. Aumenti in pazienti già trattati, anche se di poco sopra la soglia, sono induttori di altri esami, magari anche costosi e invasivi.

Nota: possono esserci degli errori di battitura oppure di ortografia, chiedo scusa.Oltretutto potrebbero essercene di "contenuto", di concetto, quindi è bene non fidarsi troppo di

questi appunti. :)

Un grande grazie, al solito, a:

Bottosso StefanoPerin Giordano

che mi hanno prestato-donato parte del loro lavoro per controllare, correggere ed integrare i miei appunti.

Buono studio,

Federico Pippo


SEMEIOTICA MEDICINA DI LABORATORIO

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