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Le Biotecnologie modernehanno avuto un notevolesviluppo nell’ultimo trenten-

nio e uno dei maggiori campi diintervento è stato nel settore me-dico e nello sviluppo dei farmaci.Tra questi, si può considerareuna pietra miliare la descrizione,da parte di Köhler e Milstein(1975) del metodo per l’otteni-mento di anticorpi monoclonali.Già dalla prima descrizione delmetodo apparve chiaro il poten-ziale di questa tecnica ai fini del-la produzione di anticorpi con at-tività terapeutica e di interesseper la ricerca diagnostica.

Cosa sono gli anticorpi

Gli anticorpi sono proteine chevengono prodotte dai linfociti Bin seguito ad uno stimolo antige-

nico derivante dal riconoscimen-to della presenza di un elementoestraneo all’organismo, da partedel sistema immunitario. Essihanno una struttura complessacostituita da quattro catene poli-peptidiche: due catene leggereidentiche (a basso peso moleco-lare) e due pesanti ad alto pesomolecolare. Agli estremi delle ca-tene leggera e pesante vi sonodelle regioni cosiddette “variabi-li”, che grazie alla loro strutturasono in grado di riconoscere l’an-tigene specifico (Figura 1). E’stato calcolato che i linfociti Bhanno la possibilità teorica diprodurre 108 diversi anticorpi. Laporzione costante dell’anticorpodetermina la classe dell’anticorpoe le sue funzioni fisiologiche.Gli anticorpi appartengono allaclasse di proteine dette “immu-noglobuline” di cui esistono 5

di Marco Racchi Dipartimento di Farmacologia Sperimentale ed Applicata Università di Pavia

Gli anticorpi monoclonali in terapia

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classi distinte secondo strutturae funzioni nel contesto della ri-sposta immunitaria dell’organi-smo. Gli anticorpi monoclonalisono anticorpi prodotti da un sin-golo “clone”, cioè da una popola-zione cellulare geneticamenteidentica perché derivata da un’u-nica cellula madre e riconosconouna sola struttura antigenica.

Come si producono glianticorpi monoclonali

La tecnologia descritta da Köhlere Milstein è, almeno nella teoria,molto semplice.In un animale da laboratorio, nor-malmente un topo, si induce la ri-sposta immunitaria verso un an-tigene specifico, somministrandolo stesso antigene agli animali.Una volta verificata l’avvenutastimolazione della risposta im-munitaria, vengono prelevati ilinfociti B del topo immunizzato equeste cellule vengono poste incoltura con cellule derivanti daun tumore del sangue murino(un mieloma), non producenteanticorpi.Le condizioni di coltura sono talida favorire la fusione tra i linfoci-ti e le cellule di mieloma. Inoltreil terreno di coltura è apposita-mente modificato così che solo lecellule derivanti dalla fusione diuna cellula di mieloma e un linfo-cita B, chiamate “ibridomi”, sonoin grado di sopravvivere, in quan-to i soli linfociti non possono pro-liferare in assenza di stimoli anti-genici e le cellule tumorali nonproliferano in modo indipenden-te poichè sono deficitarie di alcu-ni enzimi per la sintesi delle basinucleotidiche del DNA. Gli ibri-domi mantengono quindi, da unlato la capacità, propria dei linfo-citi, di produrre anticorpi specifi-ci, dall’altro assumono dal mielo-ma la proprietà, tipica di tutte lecellule tumorali, di dividersi pres-

soché infinitamente. Con questatecnica quindi, da un unico clonespecifico si possono produrreelevate quantità dell’anticorpo.

Le prime applicazioni el’evoluzione tecnica

Le prime applicazioni terapeuti-che degli anticorpi monoclonalisono state fatte con anticorpi diderivazione murina. L’efficacia diquesti anticorpi è risultata limita-ta da una serie di fattori fisiologi-ci tra cui la inefficace funzione diriconoscimento reciproco tra

l’anticorpo murino e il corrispon-dente recettore umano, una ri-dotta emivita e soprattutto lo svi-luppo della risposta anticorpaleumana contro gli anticorpi muri-ni (human anti mouse antibodiesHAMA), in quanto riconosciuticome estranei dal sistema immu-nitario. Quest’ultima è stata giu-dicata il maggiore ostacolo all’uti-lizzo degli anticorpi monoclonaliin terapia, tuttavia si è riusciti adaggirare questo problema grazieallo sfruttamento della tecnologiadel DNA ricombinante che hapermesso di generare anticorpicostituiti dalla regione variabile

STRUTTURE DI ANTICORPI MONOCLONALI

Figura 1

Nella figura sono schematizzate le strutture di anticorpi monoclonali uti-

lizzabili in terapia. Sono indicate soprattutto le differenze di struttura tra

anticorpi murini/umani e gli anticorpi chimerici e umanizzati. Gli an-

ticorpi chimerici sono ottenuti accoppiando le regioni variabili e di le-

game all’antigene derivanti dal gene murino con le regioni costanti di

origine umana. Negli anticorpi umanizzati invece, le regioni di legame

all’antigene di origine murina sono impiantate su una struttura intera-

mente umana attraverso l’ingegnerizzazione (con la tecnica del DNA ri-

combinante) dei geni codificanti per le catene leggere e per le catene pe-

santi delle immunoglobuline. Gli anticorpi umani sono ottenibili attra-

verso la tecnica del “phage dysplay” oppure possono essere prodotti da to-

pi transgenici che esprimono i geni delle immunoglobuline umane al po-

sto di quelli delle immunoglobuline murine

murina e dalla regione costanteumana, cosiddetti anticorpi “chi-merici”. Queste modificazioni sisono ulteriormente evolute finoad ottenere anticorpi in cui laproteina murina è rappresentatasolo in quelle parti dell’anticorpoche interagiscono con l’antigene(regione ipervariabile) mentre ilresto della immunoglobulina èumano, in questo caso si parla dianticorpi “umanizzati”. Inoltre,grazie alle tecnologie disponibiliper la creazione di animali tran-sgenici, l’informazione geneticaper la sintesi di immunoglobulineumane è stata trasferita in un to-po creando pertanto un animaleche produce (dopo esposizionead un antigene) degli anticorpiidentici a quelli umani (Figura 1).

Applicazioni in campo medico

Il campo di impiego in ambito te-rapeutico e diagnostico è, almenoteoricamente vastissimo. Princi-palmente a scopo diagnostico, glianticorpi monoclonali, grazie allaselettività di legame antigene-an-ticorpo, vengono utilizzati per laricerca e la misurazione delleconcentrazioni ematiche di nu-merose sostanze siano esse di ri-levanza fisiologica o patologica.Gli anticorpi monoclonali sonoabitualmente utilizzati per la de-terminazione di antigeni relativialla presenza di agenti infettivi,per antigeni specifici di tessutitumorali solidi e per lo studio dileucemie e linfomi; per lo studioe la rilevazione di antigeni coin-volti nelle patologie autoimmuni,nel diabete, nelle collagenopatiee nelle miopatie.Per quel che riguarda gli usi interapia la specificità degli anti-corpi monoclonali potrebbe pre-vedere un utilizzo molto esteso diqueste molecole. Tuttavia in te-rapia non sono moltissimi i pro-

dotti che hanno superato con ef-ficacia il vaglio della sperimenta-zione clinica. L’efficacia terapeu-tica degli anticorpi monoclonalidipende infatti da diverse varia-bili, quali le caratteristiche del-l’antigene, le sue funzioni e la suadensità a livello cellulare. Non èpossibile dimenticare le caratte-ristiche intrinseche dell’anticor-po stesso tra cui l’affinità per l’an-tigene fra le più importanti. Oc-corre sottolineare che spesso ilmeccanismo attraverso il qualel’anticorpo monoclonale esercitala sua attività, non è completa-mente noto. Tra i meccanismipostulati, il blocco della funzionedell’antigene per ingombro steri-co, la citotossicità verso la cellulabersaglio attraverso meccanismimediati dall’attivazione attraver-so la via classica del complemen-to, o anche una fine modulazionedelle funzioni di trasduzione delsegnale dell’antigene stesso.In aggiunta a quanto precedente-mente citato un’ulteriore appli-cazione prevede l’utilizzo dell’an-ticorpo monoclonale come veico-lante di una molecola in grado disostenere un meccanismo cito-tossico (specialmente nelle ap-plicazioni oncologiche). L’agentecitotossico associato all’anticorpoè spesso una tossina catalitica,un agente chemioterapico o unradioisotopo.Il trattamento con anticorpi mo-noclonali può essere effettuato informe e regimi terapeutici diver-si. Per esempio l’anticorpo puòessere somministrato come mo-noterapia, tuttavia esistono sche-mi di trattamento che prevedonola somministrazione dell’anticor-po in associazione ad una che-mioterapia.La forma di somministrazione piùcomune è quella per infusioneendovenosa. I tipici eventi avver-si riscontrabili durante la sommi-nistrazione di anticorpi monoclo-nali comprendono sintomi simil

influenzali come febbre, brividi,mal di testa, dolori muscolari earticolari, nausea, vomito, spos-satezza, che si manifestano pocodopo la somministrazione del far-maco e scompaiono dopo pochigiorni e che possono essere con-trollati con anti-infiammatori. Sipossono avere inoltre reazioni al-lergiche tipicamente caratteriz-zate da eruzioni cutanee e pruri-to. Nelle prime fasi del tratta-mento potrebbe verificarsi unatemporanea riduzione dei globulibianchi, con conseguente mag-giore esposizione al rischio di in-fezione.

Alcuni anticorpi monoclonali in usoterapeutico

Le strategie terapeutiche con ap-plicazione di anticorpi monoclo-nali che hanno ottenuto il mag-gior interesse e i maggiori suc-cessi sono dirette all’inibizionedell’attivazione della risposta im-munitaria nel trapianto di organi,nella terapia antitumorale e nellaterapia antivirale. Faremo ora al-cuni brevi esempi di farmaci abase di anticorpi monoclonali at-tualmente approvati e utilizzati.Inibizione della reattività

immunitaria nel trapianto

d’organi

Nel 1985 venne approvato perl’uso terapeutico il primo anticor-po monoclonale, noto con il no-me di OKT3 (muromonab CD3),un anticorpo murino impiegatocome immunosoppressore antirigetto nel trapianto del rene, og-gi la sua indicazione è limitata aicasi di rigetto resistente all’im-munosoppressione con steroidi.L’anticorpo agisce contro unamolecola (CD3) presente sullamembrana dei linfociti T e bloc-cando le funzioni impedisce difatto l’attivazione della rispostaimmunitara. Cercando di svilup-

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pare molecole con maggiore spe-cificità sono stati ottenuti dueanticorpi, uno chimerico (Basi-liximab) e uno umanizzato (Da-clizumab) che hanno come ber-saglio il recettore per interleuchi-na 2 (CD25), citochina fonda-mentale per l’espansione clonaledei linfociti T. Il primo agisce le-gandosi in modo specifico, all'an-tigene CD25 sui linfociti T attiva-ti e impedisce il legame del re-cettore con l’interleuchina-2,bloccando quindi un segnale diproliferazione per i linfociti stes-si. Daclizumab agisce sostanzial-mente nello stesso modo legandocon elevata affinità la subunità al-fa del recettore di interleuchina2, inibendo il legame e l’attivitàbiologica della citochina.Trattamento delle patologie

autoimmuni

L’uso di anticorpi monoclonali èstato studiato anche per patolo-gie che comprendono l’aberranteattivazione del sistema immuni-tario contro antigeni propri del-l’organismo. I migliori risultati cli-nici sono stati ottenuti indivi-duando come bersaglio il fattoredi necrosi tumorale o TNF (tu-mor necrosis factor). Questa èuna citochina che possiede unampio spettro di attività biologi-che tra le quali la regolazione dialcune importanti citochine emediatori dell’infiammazione, inparticolare nelle patologie comel’artrite reumatoide e il morbo diCrohn. Infliximab è un anticorpochimerico con elevata affinità dilegame nei confronti della formasolubile e transmembrana del re-cettore per il TNFalfa. Nel tratta-mento della artrite reumatoideInfliximab permette la riduzionedell'infiltrazione delle cellule in-fiammatorie nelle articolazionidei pazienti. Allo stesso modo neipazienti con morbo di Crohntrattati con Infliximab è possibileosservare diminuzione della con-centrazione sierica di marcatori

dell’infiammazione e una riduzio-ne dell’infiltrazione di cellule del-l'infiammazione nelle aree del-l'intestino coinvolte.Trattamento oncologico

Gli anticorpi monoclonali sonospesso utilizzati nei regimi tera-peutici antitumorali. Alcunerealtà promettenti fanno partedel bagaglio a disposizione deglioncologi. Il rituximab è uno deiprimi approvati per il trattamen-to del cancro; è un anticorpo chesi lega in modo specifico all’anti-gene CD20 che, presente suilinfociti B, è espresso nei linfominon-Hodgkin a cellule B. L’anti-gene è espresso sulle cellule nor-mali e sulle cellule tumorali manon è espresso sulle cellule sta-minali che andranno a rigenerareil patrimonio di cellule B del pa-ziente dopo che il farmaco avràindotto la distruzione delle cellu-le esprimenti CD20. Alemtuzu-mab è invece un anticorpo mono-clonale umanizzato diretto con-tro una glicoproteina della super-ficie dei linfociti denominataCD52. Alemtuzumab viene im-piegato per il trattamento di pa-zienti affetti da leucemia linfoci-taria cronica (LLC). L’indicazioneattuale è per pazienti che hannogià ricevuto cicli di chemiotera-pia con agenti alchilanti e chepresentano recidiva della malat-tia o che non hanno risposto adaltri trattamenti chemioterapici.Un’altra importante strategia an-titumorale è quella di interagirecon recettori per fattori di cresci-ta importanti per le cellule tumo-rali. Su questa strategia si basal’anticorpo trastuzumab, un anti-corpo umanizzato diretto controil dominio extracellulare del re-cettore HER2 e utilizzato princi-palmente nel trattamento del tu-more alla mammella, da solo o incombinazione con altri farmacicitostatici.Terapie antitrombotiche e te-

rapie antivirali

I due ultimi anticorpi che verran-no qui citati sono lo abcximab epalivizumab rispettivamente uti-lizzati nel trattamento delle com-plicazioni ischemiche in pazientia rischio, sottoposti ad angiopla-stica e nel trattamento delle infe-zioni provocate dal virus respira-torio sinciziale (RSV) in bambininati prematuri, Abcximab è unanticorpo monoclonale chimeri-co (un suo frammento) direttocontro il recettore glicoproteicoIIb/IIIa a livello delle piastrine. Iltrattamento con abcximab con-sente l’inibizione dell’aggregazio-ne piastrinica prevenendo l’inte-razione tra fibrinogeno e altri fat-tori pro aggreganti e la membra-na piastrinica. Palivizumab è in-vece un anticorpo umanizzato di-retto contro un epitopo del virusrespiratorio sinciziale (RSV).L’anticorpo ha una potente atti-vità neutralizzante nei confrontidel meccanismo di fusione di di-versi ceppi di RSV.

Commenti conclusivi

A chiusura di questo breveescursus nel mondo degli anti-corpi monoclonali va detto che legrandi potenzialità di questiagenti terapeutici e diagnostici,sono ancora in fervente fase disviluppo. Tra questi gli sviluppidiagnostici nel campo dei tumorisono da segnalare come tra i piùinteressanti con anticorpi in usoper l’individuazione del carcino-ma ovarico, del melanoma, delcancro al colon. Uno dei puntinon ancora completamente risol-ti, ma per ovvie ragioni, è quellodella sicurezza e del costo/bene-ficio dell’uso a lungo termine diqueste molecole. Col tempo que-sti ultimi studi daranno ulterioreimpulso all’ottimizzazione dellaproduzione e utilizzo degli anti-corpi monoclonali nella praticaclinica.