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RIUNIONE NAZIONALE FIL FONDAZIONE ITALIANA

LINFOMI

FIL-‐MRD NETWORK: STANDARDIZZAZIONE E

SVILUPPI TECNICI

Ilaria Del Giudice Sapienza Università di Roma

Napoli, 5-‐7 Novembre 2015

Claudio Agos>nelli, Simone Ferrero, Sara Galimber>, Pier Paolo Piccaluga, Gianluca Gaidano, Marco LadeEo Marzia Cavalli, Elena CiabaH, Irene Della Starza, Luciana De Novi, Daniela Drandi, Anna Gazzola, Elisa Genuardi, Susanna Grassi, Claudia Mannu, Barbara Mantoan, Luigia Moni>llo

SCOPI DI FIL MRD NETWORK

§  Nato il 30/09/2009

§  Armonizzazione delle tecniche per lo studio della malaHa minima residua (MRD) nei linfomi

§  Mantenere a l> l i ve l l i d i r iproduc ib i l i tà interlaboratorio (necessità di periodici “Quality Control” (QC) standardizza>)

§  Sviluppi tecnici innova>vi

FIL MRD NETWORK

MRD del linfoma follicolare (FL) BCL2/IGH@

-‐ PCR qualita?va (nested PCR) -‐ PCR quan?ta?va (RQ-‐PCR)

MRD del linfoma mantellare (MCL)

IGH@ -‐ PCR qualita?va (nested PCR) -‐ PCR quan?ta?va (RQ-‐PCR)

Protocolli FIL con

arruolamento >100

pazienti (studi fase III)

Facility a disposizione

anche per studi con <100

pazienti (fasi I/II)

LABORATORI FIL MRD NETWORK

BLUE LAB Ematologia 1 -‐ Torino

PINK LAB Ematologia -‐ Pisa

YELLOW LAB Ematologia -‐ Bologna

GREEN LAB Ematologia – RM Sapienza

Referente scien?fico: S. Ferrero

Referente tecnico: B.Mantoan

Referente scien?fico: S. Galimber>

Referente tecnico: E. CiabaH

Referente scien?fico: C. Agos>nelli

Referente tecnico: A. Gazzola

Referente scien?fico: I. Del Giudice

Referente tecnico: I. Della Starza

FIL MRD NETWORK

Torino Pisa Bologna Roma

ESG-MRD-ALL-NHL LABORATORIES

Paris-‐Créteil Kiel

QUALITY CONTROL (QC) FIL MRD NETWORK

QC Inverno/Primavera QC Autunno §  Task 1 (interpretazione di curve di RQ-‐PCR e quan>ficazione MRD per BCL2/IGH secondo le

linee guida europee ESG-‐MRD-‐ALL)→ FL

§  Task 2 (nested PCR)→ FL

§  Task 3 (RQ-‐PCR) → FL

§  Task 4a, b, c → MCL

§  Sessione educazionale, Sessione casi difficili

Technical reports FOLL05 tumor burden

FLAZ12

Nested PCR BCL2: dal metodo “in house” al comune

Nested PCR BCL2: sensibilità 10^-‐5 RQ-‐PCR BCL2: uniforme S e QR

RQ-‐PCR IgH: Standard primers-‐probe

IgH: IMGT

Criteri di refertazione per protocolli di intensificazione e deintensificazione

Se^embre 2009

QC1 Feb 2010

QC2 O^ 2010

QC3 Mar 2011

QC4 Nov 2011

QC5 Mag 2012

FIL MRD network

I PRIMI 5 QC (DAL 2010 AL 2012)…

Della Starza et al. Hematol Oncol 2014 Mannu et al Leuk Lymphoma 2015 GalimberJ et al. Clin Can Res 2014

Standard estrazione DNA

Wet-‐lab Data base comune

NGS vs RQ-‐PCR

Task 5 Nested PCR BCL2 riarrangiamen? minoritari

TASK 6 DD-‐PCR per BCL2

Task 4c: Nested PCR per IgH

Refertazione per protocolli di intensificazione e deintensificazione

QC6 O^ 2012

QC7 Apr 2013

QC8 O^ 2013

QC9 Mag 2014

QC10 Nov 2014

QC11 Mag 2015

Campioni a difficoltà crescente

…E I SUCCESSIVI 6 QC (2012-‐2015) FOLL12, MIRO’, RENOIR

Ficoll vs Lysis

DD-‐PCR vs RQ-‐PCR

An?coagulan? cf-‐DNA: MRD su plasma

TASK 2-‐3

9

QC TREND -‐ TASK 2/3

TASK 2 -‐ BCL2 NESTED PCR TASK 3 – BCL2 RQ-‐PCR

0

20

40

60

80

100

QC6 QC7 QC8 QC9 QC10 QC11 0

20

40

60

80

100

QC6 QC7 QC8 QC9 QC10 QC11

REFERTAZIONE AD USO PROTOCOLLO: CONCORDANZA100%

Task 4

primer 3’ specific paJent

FR1 FR2 FR4 FR3 CDR1 CDR2 L CDR3




consensus probe derived from FR3

QR



Consensus primer 5’ Consensus primer 3’

FIRST PCR NOT SPECIFIC-‐TUMOR

SECOND PCR SPECIFIC-‐TUMOR

PCR QUALITATIVA PCR QUANTITATIVA

VALUTAZIONE DELLA MRD NEL LINFOMA MANTELLARE

QC TREND -‐ TASK 4

87,50% 75%

90% 100%

81% 87,50%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

mutated samples unmutated samples

Task 4b (IgH PCR qualita?va)

QC9 QC10 QC11

90% 92,50% 90% 95%

85% 90%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

mutated samples unmutated samples

Task 4c (IgH RQ-‐PCR)

QC9 QC10 QC11

Task 4a Analisi di sequenze VDJ; disegno di primers e probes paziente-‐specifici 100%

FIL MRD NETWORK – SVILUPPI TECNOLOGICI

§  Riarrangiamen> Minori BCL2 (Task 5)

§  Droplet digital (DD)-‐PCR (Task 6)

§  Cell free (cf)-‐DNA plasma>co

BCL2 RIARRANGIAMENTI MINORI

§  Studio dei RIARRANGIAMENTI MINORI associa> alla traslocazione (14;18) nei FL

“Breakpoints at 18q21 occur in the major breakpoint region (MBR) in roughly 50% to 65% of cases; in the minor cluster region (mcr) in about 10% of cases; and in additional breakpoints/clusters

between the MBR and the mcr in most of the remaining cases (25%).”

Gu et al ; Arch Pathol Lab Med. 2008

QC10 QC11

Concordanza 87.5%

BLUE LAB (TO) Minor rearrangements Quan>ta>ve PCR

BCL2 nega>ve cases In all LABs qualita>ve PCR for

minor rearrangements

TASK 5

Pa?ents Bcl2/IgH nega?ve

(MBR/mcr)

MBR dist 3’ MBR 5’ mcr

Bcl2/IgH nega?ve

(final evalua?on)

160 5 6 17 132

MARKER IDENTIFIED BY MINOR REARRANGEMENTS: 28/160 (18%)

DD-‐PCR: the 3°genera?on….

Droplet generator PCR Droplet reader

Output: numero di copie/microl

DNA di bassa qualità (es. paraffinato)

DNA di scarsa quantità (es. cf-DNA o biopsia liquida)


DD-‐PCR vs RQ-‐PCR & MRD: prime osservazioni §  DD-‐PCR è applicabile e riproducibile per lo studio di MRD basato su BCL2 o IgH del MM, MCL e FL (Drandi et al, 2015)

§  Anche nella MRD IgH/TCR delle ALL (Della Starza et al, submiSed) e JAK2V617F delle Ph-‐MPD (Fontanelli et al, 2015)

§  DD-‐PCR riduce la complessità della RQ-‐PCR (basata su curva standard)

§  Supera almeno in parte il problema dei PNQ (recupero del 20-‐30% dei casi PNQ o NEG alla RQ-‐PCR)


DD-‐PCR: TASK 6

DD-‐PCR & QC §  Training dei 4 lab dedicato alla DD-‐PCR a TO il 18-‐19 giugno 2014 §  Standardizzare DD-‐PCR per MRD quan>ta>va nel FIL MRD

network §  Definire linee guida per l’analisi ed interpretazione dei da?

§  Integrare la quan>ficazione di MRD basata su DD-‐PCR nei protocolli FIL

dal QC11: Task 6

Task 6 – QC12 – partecipazione del laboratorio di Paris-‐Créteil (Dr. Marie-‐Hélène Delfau Larue) Laboratorio di Kiel (Dr.PoE)

Cell free (cf)-‐DNA plasma?co Prove^e BCT

MRD/mutazioni su cf-‐DNA plasma?co ObieHvo MRD: verificare se MRD su cf-‐DNA plasma>co iden>fica recidive molecolari che PB e BM non vedono (es. recidive linfonodali “pure”) DLBCL: G-‐CHOP-‐Ibru?nib FL: Renoir & MIRO’ Estrarre il plasma entro 8 ore dal prelievo, oppure…..

Provette Cell-Free DNA BCT Volume di sangue 10.0 ml Anticoagulante K3EDTA Additivi Agente stabilizzante Conservazione prima dell’uso

Temperatura ambiente

Temperatura per la spedizione

Temperatura ambiente

Costo 7 euro (ciascuna provetta)

FIL MRD NETWORK Claudio Agos>nelli, Ilaria Del Giudice, Simone Ferrero, Sara Galimber>, Pier Paolo Piccaluga, Gianluca Gaidano, Marco LadeEo Marzia Cavalli, Elena CiabaH, Irene Della Starza, Luciana De Novi, Daniela Drandi, Anna Gazzola, Elisa Genuardi, Susanna Grassi, Claudia Mannu, Barbara Mantoan, Luigia Moni>llo

GRAZIE!

Torino Pisa Bologna Roma

Task 1

Valutazione della MRD della curva RQ-‐PCR per BCL2/IGH secondo le linee guida europee ESG-‐MRD-‐ALL

Sensibilità e

Range quan?ta?vo

Curva standard: -‐  slope

-‐  Coefficiente di Correlazione

Quan?ficazione MRD

QC TREND -‐ TASK 1

0

20

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100

QC6 QC7 QC8 QC9 QC10 QC11

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