S. Del Vecchio

XII CONGRESSO NAZIONALE AIMN 2015

Rimini 16 - 19 aprile

Reversione del fenotipo glicolitico

mediante terapie a bersaglio molecolare

Dipartimento di Scienze Biomediche Avanzate Università degli Studi di Napoli Federico II

Metabolismo del glucosio

Nature Reviews Cancer 2004, 4: 891

La glicolisi viene inibita in presenza di ossigeno che permetteai mitocondri di ossidare il piruvato a CO2 e H2O

Nei lieviti che sono organismi facoltativamente anaerobi il consumo di glucosio e’ ridotto in presenza di O2 (Effetto Pasteur)

Le cellule maligne derivate da tumori umani se messe in coltura in presenza di ossigeno mantengono il loro fenotipo di esaltata glicolisi

Glicolisi e respirazione cellulare sono vie alternative del consumo di glucosio nelle cellule normali

Ma non nelle cellule neoplastiche

Effetto Warburg o glicolisi aerobica

Le cellule tumorali hanno un elevato consumo di glucosio attraverso la glicolisi con conseguente produzione di acido lattico anche in presenza di ossigeno

Le cellule neoplastiche sono strettamente dipendenti dall’apporto esterno di glucosio perché il metabolismo energetico attraverso la glicolisi è altamente inefficiente (solo 2 molecole di ATP contro le 36 del ciclo di Krebs)

Il fenotipo glicolitico delle cellule tumorali non è adattativo ma costitutivo

L’attivazione di alcuni oncogeni, la perdita di funzione di alcunigeni oncosoppressori o la stabilizzazione costitutiva di HIFpossono causare:

una iperespressione di GLUT o una traslocazionedei GLUT sulla membrana plasmatica

una aumentata attività o espressione di enzimi glicoliticiin particolare delle esochinasi

oppure una riduzione della funzione mitocondriale e quindidella respirazione cellulare

Acquisizione del fenotipo glicolitico costitutivo

Cantor JR Cancer Discovery 2012,2:881

Red : oncogenes

Green :tumor suppressors

Glucose metabolism in cancer

P P

Cellule con EGFR wild type Cellule con mutazione attivante EGFR

P PP PP P

La trasformazione neoplastica innescata da mutazioniattivanti del EGFR comporta, oltre che una proliferazionecellulare incontrollata, una riprogrammazione del metabolismo del glucosio

Vander Heiden MG et al., Science 324: 1029-1033, 2009

Metabolismo del glucosio e cancro

Ipotesi di lavoro

L’inibizione di EGFR mutato determina la reversione del fenotipo glicolitico e la riattivazione della respirazione ossidativanelle cellule trasformate

Glycolytic pathway

• GLUT1 and GLUT3• HK1 and HK2• PKM1 and PKM2• OXPHOS: subunits of mitochondrial

complexes (I-V)

Proteins of interest

Substrate

• Glucose• 18F-Fluorodeoxyglucose

Biochemical end points

• ATP• LactateATP

H1975 cells

kinasedomain

L858R(exon 21)

T790M(exon20)

EGFR

TKIs

Non-small cell lung cancer cell lines

T790M-mediatedresistance

H1993 cells

kinasedomain

EGFR

TKIs

MET

MET-mediatedresistance

Efficient and inefficient inhibition of EGFR signaling

H1975 WZ4002

H1993 MET-inhibitors: PHA 665,752crizotinib

Cell line Efficienttreatment

Inefficienttreatment

Erlotinib

Erlotinib

Sensitivity of NSCLC cells to WZ4002 and PHA-665,752

WZ4002 caused a concomitant decrease of p-EGFR, p-AKT, p-ERK and cyclin D1 levels

Erlotinib 1 µM WZ4002 0.1 µM

WZ4002 1 µM

p-ERK 1/2

EGFR

actin

p-AKT

Cyclin D1

p-EGFR

ERK 1/2

AKT

Erlotinib 1 µM PHA-665,752 1 µM

H1993- + - - - +

H1975

- + - - - - + - - - - +

MET

p-MET

In addition H1993 cells showed a p-MET and p-EGFR decrease after treated with PHA-665,772 and erlotinib, respectively

Levels of proteins involved in glycolysis in response to treatment

p-PKM2

HK 2

GLUT 1

GLUT 3

PKM1

PKM2

HK 1

actin

Erlotinib 1 µM WZ4002 0.1 µM

WZ4002 1 µM PHA-665,752 1 µM

48h

- + - - - - + - - - - +

H1975

- + -

- - +

H1993NT erlotinib WZ4002 0.1 µM WZ4002 1 µM PHA-665,772 1 µM

*

H1993H1975% 1

8F-F

DG

up

tak

e ov

er c

trl

*

0

20

40

60

80

100

120

140

Decrease after treatment with efficient inhibitors of expression of HK2 and phospho-PKM2 (Tyr 105)

0

50

100

150

200

250

300

350

H19750

100

200

300

400

500

600

H1993

µg

Glu

cose

/106

cel

ls

µg

Glu

cose

/106

cel

ls ******

**

***

18F-FDG uptake and residual glucose in media in untreated and treated cell lines

Expression of mitochondrial complexes and ATP/lactate ratio

H1975

- + - - - - + - - - - +

48 h

actin

- + -

- - +

H1993

strong up-regulation of several subunits

of mitochondrial complexes involved in oxidative phosphorylation after treatment with WZ4002 and PHA-665,752

inverse relationship between intracellular ATP and lactate levels in both cell lines

ATP

/lacta

te r

ati

o p

er

10

6 c

ells

H1975 H19930

0.20.40.60.81.01.21.41.61.8

**

****

**

NT erlotinib WZ4002 0.1 µM WZ4002 1 µM PHA-665,772 1 µM (ATP5A) V

(UQCRC2) III

(COXII) IV

(SDHB) II

(NDUFB8) I

Erlotinib 1 µM WZ4002 0.1 µM

WZ4002 1 µMPHA-665,752 1 µM

Suppression of HK2 and PKM2 expression by targetedsiRNA transfection

EGFR mutatodelezione esone 19 T790M

U0126

Wortmannin

PP

RAS

BRAF

MEK

ERK

PI3K

AKT

mTOR

Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore

AKTinhibition

ERK1/2inhibition

Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore

EGFR mutatodelezione esone 19 T790M

U0126

Wortmannin

PP

RAS

BRAF

MEK

ERK

PI3K

AKT

mTOR

Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore

Cosa succede quando inibiamo EGFR

HKII

Glucosio

Glicolisi

PEPADP

ATP PKM2(alta attività)

Piruvato

OXPHOS

Biosintesi di macromolecole

Cellule tumorali

HKII

Glucosio

Glicolisi

PEPADP

ATPPKM2

fosforilazione in Tyr105(bassa attività)

Piruvato

Lattato

Biosintesi di macromolecole

OXPHOS

con EGFR attivoCellule tumorali con EGFR inibito

tumor growth (~0.8 cm)

basal: 18F-FDG PET/CT 3 days: 18F-FDG PET/CT

50 mg/kg/d p.o. for 3 days

H1975 & H1993 cells

s.c. injection of female BALB/c (nu/nu) mice

7.4 MBq of 18F-FDG through the tail vein and were subjected to microPET/CT 1 h post-injection

Animal tumor model

Ex vivo tumor analysis

Erlotinib, WZ4002, Crizotinib

18F-FDG PET/CT studies performed in nude mice bearing H1975 xenografts before and after 3 days of treatment

EGFR efficient inhibition

EGFR inefficient inhibition

Untreated

WZ4002 50 mg /kg

Untreated

Erlotinib 50 mg /kg

Glycolytic pathway and mitochondrial complexes expression in surgically removed H1975 and H1993 xenografts

H1975

Erlotinib 50 mg/kg WZ4002 50 mg/kg Crizotinib 50 mg/kg

- + - - - + - - -

actin

HK2

p-PKM2

PKM2

H1993

- + - - - - - - +

3 days

In agreement with in vitro findings, a dramatic reduction of HK2 and p-PKM2 levels was found along with a strong upregulation of mitochondrial complexes I-IV in samples from animals treated with WZ4002 and crizotinib

(ATP5A) V

(UQCRC2) III

(COXII) IV

(SDHB) II

(NDUFB8) I

SUVmax 4.2

SUVmax 6.3

FDG-PET/CT before and 1 week after erlotinib treatment in NSCLC

Baseline

1 week

University of Naples, Italy

FDG-PET/CT before and after erlotinib treatment in a non-responding metastatic lung cancer patient

Baseline 1 week

University of Naples, Italy

L’inibizione di EGFR mutato nel NSCLC determinauna reversione del fenotipo glicolitico e una riattivazione della respirazione ossidativa

Conclusioni

La riattivazione della respirazione ossidativa implicauna migliore risposta a chemio e radioterapia

18F-FDG can correctly detect T790M-mediated resistanceand its reversal by third generation TKIs early in the courseof treatment

18F-FDG cannot accurately detect MET-mediated resistance and its reversal by MET inhibitors early in the course of treatment

18F-FDG

Unchanged or increasing FDG uptake after therapy is a reliable and suitable index of non-response