Retrovirus e HIV

7/22/2019 Retrovirus e HIV

1/96

Retrovirus Classificazione:La famigliaRetroviridaeviene tradizionalmente suddivisa in 3 sottofamiglieBasandosi sulla patogenicit:Oncovirusche causano trasformazione cellulare in vitro e in vivo Spumavirus che causano effetti citopatici in vitro ma non ancora associati adalcuna patologia

Lentivirus che inducono lentamente progressive compromissioni del sistemaimmunitario e neurologiche

Recentemente sottodivisi in 7 generi, molto diffusi nel regno animale, con tropismo

per diversi tessuti e associati a patologie talvolta molto diverseIsolati e caratterizzati due retrovirus patogeni per luomo:HIV human immunodeficiency virus(un lentivirus): due sierotipi HIV-1 e HIV-2 HTLV human T Lymphotropic virus(un oncovirus): due sierotipi HTLV-1 e HTLV-2


2/96

Ultima classificazione taxonomica della famiglia dei Retrovirus


3/96

Genus Example isolates Comments

Avian-leukosis-sarcoma (s) Rous sarcoma virus (RSV) exogenous, oncogene-containing

Rous associated virus 0 endogenous, benign

Rous associated virus 1 to 50 exogenous, cause B-lymphoma, and

other diseases

Mammalian C-type (s) Feline leukemia virus exogenous, causes T-cell lymphoma,

immunodeficiency and other

diseases

Simian sarcoma virus exogenous, oncogene-containing

B-Type viruses (s) Mouse mammary tumor virus endogenous and exogenous, causes

mostly mammary carcinoma

D -Type viruses (s) Mason-Pfizer monkey virus exogenous, unknown pathogenicity

HTLV-BLV viruses (c) Human T-cell leukemia virus exogenous, causes T-cell lymphoma

(HTLV)-1 and -2 and neurological disorders

L entiviruses (c) Equine infectious virus (EIAV) exogenous, causes autoimmune

hemolytic anemia

Visna/maedi virus causes encephalopathy and lung

disease in sheep

Caprine arthritis-encephalitis virus causes encephalopathy and

(CAEV) immune deficiency

Bovine immunodeficiency virus (BIV) causes lymphadenopathy and

neurological disorders

Feline immunodeficiency virus (FIV) causes immune deficiency

Simian immunodeficiency virus (SIV) causes immune deficiency

and encephalopathyHuman immunodeficiency virus causes immune deficiency

(HIV)-1 and -2 and encephalopathy

Spumaviruses (c) Simian foamy virus (SFV) exogenous, apparently benign

Human foamy virus exogenous, apparently benign

Table 1.1 Retroviruses Genera. (s) Indicate simple and (c) complex retroviruses.


4/96

Retrovirus

Caratteristica:Il virione, grossolanamente sferico, con diametro di 100-120 nm,

contiene due catene identiche di RNA genomico ss a polarit

positiva, un enzima DNA polimerasi RNA dipendente, la trascrittasi

inversa, che retrotrascive lRNA virale in DNA, che viene poi

integrato nel genoma della cellula ospite a opera dellintegrasi

virale.

Tutti presentano 3 geni: gag, pol, env


5/96

Around 8% of the human genome is derived from sequences withsimilarity to infectious retroviruses, which can be easily recognized

because all infectious retroviruses contain at least all three genes,

including gag,poland envas well as long terminal repeats (LTRs). These sequences, human endogenous retroviruses (HERVs),represent the remnants of ancestral retroviral infections that became

fixed in the germline DNA.

Subsequent retrotransposition events amplified these elements to ahigh load within genome, during early Old World primate radiation.

Human endogenous retroviruses (I)


6/96

STRUTTURA DEI RETROVIRUS

- Membrana lipidica

- Involucro (ENVELOPE) glicoproteico

- CORE virale interno costituito da diverse proteine

- RNA virale a singola elica (circa 10 kb) in due copie identiche tr

- Trascrittasi inversa

- Altre proteine funzionali e regolatorie virali.


7/96

TRASCRITTASI INVERSA (RT/RNAseH)

Enzima virale essenziale per la replicazione con 3 funzioni:

-DNA-Polimerasi RNA-Dipendente

-DNA-Polimerasi DNA-Dipendente (simile alle DNA-Polimerasi cellulari).

-RNAsi H (simile alle RNAsi cellulari).

Circa 30 molecole per virione.

DNA-polimerasi ad alta percentuale di errore (1000/10000 volte superiore alla

DNA-Polimerasi cellulari). Ci spiega, almeno in parte, la frequente insorgenzadi mutanti.

Leggendo il filamento di RNA-transfer (primer) costruisce un filamento di DNA

virale (Minus Strand analogo allRNA virale) utilizzando le basi puriniche e

pirimidiniche trifosforilate dagli enzimi cellulari.

Per la sua peculiarit il principale bersaglio dei farmaci anti-HIV.

Lalta percentuale di errori rende le particelle virali antigenicamente

disomogenee, e ci rende conto della difficolt di identificare vaccini efficaci

contro i diversi ceppi virali.


8/96

CICLO REPLICATIVO DEI RETROVIRUS

- Adesione e penetrazione nella cellula

- UNCOATINGe liberazione del genoma virale nel citoplasma.

- Retrotrascrizione (via RT) del genoma a RNA singola elica in DNA a

doppia elica.

- Digestione (via RNAsi H) dellRNA genomico-virale.

- Circolarizzazione del DNA virale e penetrazione nel nucleo.

- Integrazione (via integrasi) nel DNA cellulare random.

- Stato di quiescienza (durata variabile).

- Trascrizione di RNA messaggero dal DNA virale.

-Scissione enzimatica (via proteasi virali) delle poliproteine in proteinemature.

- Glicosilazione delle proteine.-Assemblaggio delle proteine con lRNA virale genomico neoformato.-Formazione di particelle virali complete.-Fuoriuscita della cellula con meccanismo di BUDDING.


9/96

Schema del ciclo replicativo dei retrovirus


10/96

Relazioni filogenetiche allinterno della famiglia dei Retrovirus


11/96

Electron micrographs of representative virion particles. The diameters

of all the particles are approximately 100 nm.Panel A: Type A particles. Intracisternal A particles in theendoplasmic reticulum.Panel B: Betaretrovirus. Mouse mammary tumor

virus (MMTV), type B morphology (top, intracytoplasmic particles;middle, budding particles; bottom, mature extracellular particles).

Panel C: Gammaretrovirus. Murine leukemia virus (MLV) type Cmorphology (top, budding; bottom, mature extracellular particles).Panel D: Alpharetrovirus. Avian leukosis virus, type C morphology

(top, budding; bottom, mature extracellular particles). Panel E:Betaretrovirus. Mason Pfizer monkey virus (MPMV), type D

morphology (top, intracytoplasmic A-type particles; middle, budding;

bottom, mature extracellular particles). Panel F: Deltaretrovirus.Bovine leukemia virus (BLV) (top, budding; bottom, mature

extracellular particles). Panel G: Lentivirus. Bovineimmunodeficiency virus (top, budding; bottom, mature extracellularparticles).

Panel H: Spumavirus. Bovine syncytial virus (top, intracytoplasmicparticles; middle, budding; bottom, mature extracellular particles).

Panel I: Betaretrovirus. Mouse mammary tumor virus, type Bmorphology, visualized by negative staining with phosphotungsticacid.

Panel J: Gammaretrovirus, visualized as pseudoreplica stained withuranyl acetate. Panel K: Lentivirus. Purified cone-shaped cores

of equine infectious anemia virus (top, cores visualized by shadowcasting technique; bottom, cores visualized by negative stainingwith phosphotungstic acid). Panel L: Budding retroviral particles

visualized by scanning electron microscopy. (Micrographs arecourtesy of Dr. Matthew Gonda and reproduced from ref. 708, with

permission.)


12/96


13/96

Strutture schematiche di RNA e DNA dei retrovirus

durante il ciclo replicativo

Reverse transcription of the RNA soon after infection involves the duplication and translocation of u5 and u3sequence blocks, and it results in the formation of a double-stranded DNA molecule containing two terminal LTRs.The integration of the DNA genome occurs at the terminal sequences, establishing a provirus that is collinear withthe preintegrative DNA.

The forward transcription of the provirus is initiated at the U3/R border in the provirus; the resulting RNAs arecleaved and polyadenylated at the r/u5 border, recreating a viral RNA genome (bottom) identical to the infecting

RNA.


14/96

Modello di retrotrascrizione ad opera della RT

PBSPrimer binding siteInnesco per la RT e 3del tRNA lisinaPer la sintesi di DNA -

PPTPoypurine tractInnesco per la RT per la sintesi del DNA +

DNA -DNA +


15/96

Integrazione del DNA virale nel DNA della cellula ospite

con formazione del provirus integrato

Sequenza arbitraria nel DNA cellulare

The precursor for the formation of the provirus is a linear double-stranded DNA containing two

LTRs (boxes) and with inverted repeat sequences at the termini.


16/96

Integrazione del DNA virale nel DNA della cellula ospite

The full-length linear DNA (top) is processed by the viral integrase by the endonucleolytic removal of

dinucleotides at the 3 termini. The resulting DNA is then used in a strand transfer reaction in which the 3 OH

ends make staggered breaks in the two strands of the target site DNA. The resulting gapped intermediate is

presumably repaired by host enzymes.


17/96

Esempi di cleavaggio dei polipeptidi Gag-Pol

nei diversi retrovirus

Proteine mature funzionali

presenti nel virione


18/96

HIVAgente eziologico della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS)

1981- Descrizione della sindrome in uomini omosessualicaratterizzata da

infezioni opportunisticheSarcoma di KaposiLinfomi e altri tumori 1983- Isolamento dellHIV-1

1985- Sequenziamento del genoma

1987- Isolamento dellHIV-2


19/96

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV):

The causative agent of

acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)

?

28 years

10 years

2009


20/96

SIVcpz (Simian Immunodeficiency Virus of chimpazees) immediate precursor of HIV-1The circumstances leading to the cross-species transfer cpz-human are still unknown


21/96

HIV-1

*M(major ) with 9 pure subtypes: A, B, C, D, F, G, H, J, K

> 40 major circolating recombinant forms (CRFs) *O(outlier)*N(non M-non O)

Variation between clades 20-30%

Variation intra-clade 10-15%

Wainberg M.A

3 Groups


22/96

HIV-1

*M(major ) with 9 pure subtypes: A, B, C, D, F, G, H, J, K

> 40 major circolating recombinant forms (CRFs) *O(outlier)*N(non M-non O) & *P (from gorillas)

Wainberg M.A

4 Groups

Plantier et al, Nature Medicine, 2009


23/96

Non-B subtypes accountfor 88% of HIV infections

Osmanov et al., 2002


24/96


25/96

Phylogenetic relationship between HIV subtypes


26/96

HIV-1 subtypes differ in disease progression

Kanki et al., 1999. J Infect Dis


27/96

HIV-1 retrovirus caratterizzato da un genoma alquanto complesso

se paragonato a quello degli altri retrovirus: 9 geni

diversi.- ciclo replicativo erelativamente complesso.

- Ha effetto citopatico, ossia uccide, di norma, le cellule

che infetta. Leffetto citopatico, tuttavia, richiede alcuni

giorni prima di manifestarsi (alcuni virus, es. a RNA,

richiedono solo poche ore). - Il suo ciclo replicativo nei linfociti CD4 infettati etanto

piurapido quanto piui linfociti sono attivati.


28/96

GAG

POL

ENV


29/96

ssRNA

gp120 SU gp41 TM

p17 MA p24 CA p7 NC

p66 51 RT p32 INp10 PR

vpr p15 Vpr

Fig. 1.2 HIV-1 mature virion structure. Modified fromWebPath resource collection(Klatt,

2000). Typical lentivirus particles are spherical, about 80-110 nm in diameter, and consist of a

lipid bilayer membrane surrounding a conical core. The two identical single-stranded RNA(ssRNA) molecules, of about 9.2kB each, are associated with the nucleocapsid proteins p7gag

(NC). They are packed into the core along with virally encoded enzymes: reverse transcriptase

(RT), integrase (IN), and protease (PR). P24gag comprises the inner part of the core, the capsid(CA). The p17gag protein constitutes the matrix (MA) which is located between the

nucleocapsid and the virion envelope. The viral envelope is produced by the cellular plasma

membrane and contains the protruding viral Env glycoproteins: gp120 surface glycoprotein (SU)

and gp41 transmembrane protein (TM). A mong the accessory proteins encoded by HIV-1,

certainly Vpr and perhaps Nef and Vif are packaged into virions, although the precise location

have not yet been e lucidated. Neither the other accessory protein Vpu nor the regulatory proteins

Tat and Rev have been detected in virion particles.


30/96

LTR(long terminal repeat): Sequenze laterali del genoma di HIV che controllano e attivano la

replicazione virale, attraverso una fine regolazione dellespressione dei geni dell'HIV, e una

interazione con i geni e le proteine della cellula ospite. Geni codificanti per proteine strutturaliGAG= Gene codificante per le proteine di struttura:p17matrice, p24capside, p7

nucleocapsidePOL= Gene codificante per gli enzimi:- Transcrittasi inversa: DNA polimerasi RNA dipendente, sintetizza DNA da RNA e DNA

(genera errori:priva di attivit di correzione di bozze)-Ribonucleasi H:degrada RNA diibridi RNA/DNA

- Integrasi : integra il DNA virale nel genoma della cellula ospite (provirus)- Proteasi: scinde in modo specifico le poliproteine virali Gag/Gag-Pol in proteine mature

e funzionali del virus ENV= Gene codificante per le proteine dellenvelope:

- gp 120: Glicoproteina che lega il recettore CD4 sulla superficie cellulare, e

permette linizio del ciclo replicativo. Tramite il legame gp120-CD4 si formano

sincizi cellula-cellula- gp 41 : Glicoproteina che regola lancoraggio e la fusione del virus con la

membrana cellulare


31/96

Geni codificanti per proteine regolatriciTAT: Proteina essenziale RNA-binding che incrementa la trascrizione e la produzione di

mRNA virale e quindi la sintesi delle proteine virali.

REV: Proteina essenziale RNA-binding che incrementa la stabilit e la fuoriuscita

nucleare dell'RNA virale contenente introni, favorendo la produzione delle proteine virali

tardive.Geni codificanti per proteine accessorieNEF: Proteina che regola linfettivitavirale. Ceppi virali privi di nef non sono

infettanti.Aumenta la replicazione virale; coinvolta nella diminuzione di espressione di CD4 e

MHC I sulla superficie delle cellule infette. Ruolo nella patogenesi.VIF : Proteina che incrementa l'infettivit virale (APOBEC).VPR: Proteina che incrementa linfezione virale e/o la replicazione (import nucleare del

PIC, attivazione della trascrizione virale, blocco ciclo cellulare G2, induzione di apoptosi)

ruolo nellinfezione dei macrofagi.VPU: Proteina che incrementa la produzione di particelle virali e degradazione del CD4.


32/96

HIV


33/96

HIV - Life History Entry into the cell

T4 (CD4+) cells are major target

Human HeLaCell

Human HeLa Celltransfected with CD4

antigen

NOT INFECTED INFECTED


34/96

HIV - Life History

CD4

CD4CD4

HIV

CCR5

CCR5

chemokine

MutantCCR5

macrophage


35/96

HIV

INGRESSO VIRALE


36/96

Viral ssRNA

Provirus

TatRev

Nef

Viral dsDNA

Unspliced mRNA (9kb)Singly spliced mRNA (4kb)

Fully splicedmRNA (2kb)

Cell membrane

Nucleus

Recognition and binding:Env

Fusion and entry:Envchemokine receptor

UncoatingReverse transcription:

RTNuclear translocation of PIC:Vpr, MA

Integration:IN

GagPol

Env

VifVprVpu

Transcriptional

activation:TatRev

Capsid assembly:Vif, Vpu

Budding:Vpu

Maturation:PR

Translation Genomic RNA

mRNA ExportmRNA Export:Late Phase:

Early Phase:

Main steps of virus replication


37/96

Ciclo di replicazionesulla superficie cellulare

- Legamedi gp120con il recettore cellulare CD4in congiunzione con un recettore per le

chemochine: CXCR4(virus linfocitotropi), CCR5 (virus monocitotropi)- Fusionedell'envelope virale (gp41) con la membrana cellulare.- Entratadel virus nella cellula.

nel citoplasma-Uncoating(scapsidamento) dell'RNA virale (tramite la fusione con i lisosomi).-Costituzione del Provirus, DNA bicatenario del corredo genetico virale, da partedella trascrittasi inversa virale-retrotrascizione di DNA con formazione di un ibrido RNA-DNA,-degradazione dell'RNA da Rnasi H,-sintesi di un secondo filamento di DNA.

- Entrata del DNA virale nel nucleo.nel nucleo

integrazione(pi o meno abbondante) nel DNA cellulare durante la duplicazione della

cellula mediata dall'integrasi virale- (LATENZA).


38/96

nel nucleo- Attivazione con trascrizione del provirus in RNAm virale da parte di RNA polimerasi

cellulare.

Fase precoce: espressione di Tat, Rev e Nef (nel citoplasma)Tat e Rev entrano nel nucleo Tat trans-attiva la trascrizione viraleRev media la fuoriuscita di RNAm virale contenente introni (RNA genomico e RNA

codificante proteine strutturali)

nel citoplasmaFase tardiva: espressione di Gag, Pol, Env,Vif, Vpr, Vpu (Rev-dipendente) - Traslazione (sintesi proteica) nei ribosomi e sintesi di poliproteine virali immature.- Modificazione delle proteine (glicosilazione, miristilazione).- Assemblamento delle componenti virali sotto la membrana citoplasmatica.- Fuoriuscita della particella virale dalla cellula tramite gemmazione ("budding")- Maturazionedelle proteine virali tramite la proteasidi HIV- Reinfezione di nuove cellule tramite contatto cellula-cellula (durante il budding) o

contatto cellula-virus libero.


39/96

Ciclo di replicazione di HIV e target

farmacologici

8Nucleoside reversetranscriptase inhibitors (NRTIs)

AZT, ddI, ddC, d4T,

3TC, ABC, TDF, FTC

9Protease

inhibitors

(PIs)

SQV,IDV,

RTV,NFV,

APV,LPV,

ATV,TPV,

DRV

4Non-nucleoside reverse

transcriptase inhibitors

(NNRTIs)

EFV, NVP, DLV, ETV

1. Binding&fusion

2. Entry3. Uncoating4. Reverse

transcription5. Integration6. Transcription7. Translation8. Assembly &

budding9. Maturation

1Fusion inhibitor

(FIs)T20

3Integrase

inhibitors (INIs)RAL,EVG,GSK572

2Entry inhibitorsMaraviroc

Vicriviroc


40/96


41/96

HIV and AIDS


42/96

Inexorable decline of CD4+ T4 cells

Of great importance to therapeutic strategy

Why do all ofthe T4 cells

disappear?

At early stagesof infection

only 1 in 10,000

cells is infected

Late 1 in 40


43/96

HIV

LISI CELLULARE


44/96

HIV

SYNCYTIA


45/96

HIV

LISI MEDIATA DAI CTL


46/96

Why do all CD8+ killer cells disappear?At a late stage of HIV infection, the cytotoxic T

cells disappear very rapidly

These cells do not have CD4 antigen

They are not infected by HIV

There is a correlation of control of virus and

presence of CD8+ cells

HIV subtypes present in late infection cause mass

apoptosis of CD8+ cells

Cytotoxic T cells do have CXCR4 co-receptor. HIV

binds but does not enter cells

Signal from binding prompts mass suicide ofCD8+/CXCR4+ cells


47/96

Binding to

CXCR4 results in

expression of

TNF-alpha on the

cell surface

G protein

signal

Binding to CXCR4

results in

expression of TNF-

alpha receptor II

CD8 cell(no CD4 antigen)

Macrophage

CXCR4

HIVgp120

chemokine

Apoptosis of T cells


48/96

CD8 cell Macrophage

CXCR4

Death

CD8 T cell

apoptotic

bodies

Macrophage ingests CD8 cell

apoptotic bodies


49/96

Immune responses against HIV


50/96

Macrophages may be infected

by two routes CD4

Fc receptor

HIV gp120 binds tomacrophage CD4 antigen

Virus is opsonized by antigp120 antibodies which

bind to macrophage Fc

receptors - an enhancing

antibody

HIV gp120

HIV

Anti-gp120


51/96

Cytokine networks that regulate

human immunodeficiency virus

(HIV) replication.


52/96

3 Typical cytopathic effect of human immunodeficiency virus

(HIV)-1 in cell culture; syncytium

formation with multinucleated giant cells is shown in a

culture of CD4+ T cells.


53/96

Chemochine e recettori specifci per lentrata e linibizione

dellentrata di HIV

Dal 2007 un farmaco inibitore di CCR5 entrato in uso nella pratica clinica


54/96

Stato di latenza di HIV in cellule T prima dellintegrazione e

dopo lintegrazione genomica


55/96

CARATTERISTICHE DI HIV

- E un virus scarsamente resistente allambiente

esterno (in paragone ad altri virus, come il virus

dellepatite B).

- Sopravvive per poco tempo (ore o giorni, a

seconda della temperatura, umidita, ecc) in

ambiente esterno.

- E inattivato rapidamente da:

- Calore (56C per 10 minuti)

- Perossido di idrogeno

- Ipoclorito di sodio al 10%

- Alcool etilico 40%- Paraformaldeide

- Raggi ultravioletti


56/96

EPIDEMIOLOGIA DI HIVTempo di latenza per la sieroconversione (dal

momento del contatto con il virus): 6 settimane

(media)

Tempo di latenza dalla sieroconversione alla malattia

(senza terapia):2 mesi!15 e piuanni.La sieroconversione definitiva, con leccezione di

alcuni bambini di madre sieropositiva

umero di sieropositivi che andranno incontro alla

malattia (in assenza di terapia) = >80 %

Tutti i siero positivi, anche se asintomatici, sono

portatori del virus , e quindi potenzialmente

infettanti.


57/96

VIE DI TRASMISSIONE DELLA MALATTIA - Antigeni di HIV, o anche particelle virali complete, sono riscontrabili praticamente in tutti i

fluidi e secrezioni dellorganismo. Tuttavia, HIV einfettante solo in alcuni di essi: Infettivita

- Sangue ++++ - Liquido seminale ++++ - Secrezione vaginale +++- Latte materno +- Saliva ? (probabilmente -)- Lacrime ? (probabilmente -)- Sudore -- Urine ? (probabilmente -)- Liquor cerebrospinale ?- Fluido alveoli polmonari ?

- Derivati del sangueche:Trasmettono il virus Non trasmettonoil virus (in linea di massima)- Sangue intero - Immunoglobuline- Cellule ematiche - Albumina- Plasma - Alcune frazioni plasmatiche- Fattori della coagulazione - Fattori della coagulazione di sintesi

Non stato segnalato nessun caso di infezione tramite punture di insetti, o legata alla

condivisione di o etti otenzialmente infetti ( osate, bicchieri, lenzuola, ecc.)


58/96

TRASMISSIONE EMATICA E PARENTERALE DI HIV - Circa l80% degli emofiliaci trattati con fattori della coagulazione estratti dal sangue

sono sieropositivi per HIV. - La percentuale di tossicodipendenti sieropositivi non enota con sicurezza, ma si ritiene

che superi il 50%. - Politrasfusi hanno un rischio attuale di infezione molto modesto (inferiore a 1 sacca su

100.000 trasfuse).- Linfezione del ricevente epiuprobabile se il donatore di sangue infetto eanche

sintomatico.- Rischio di trasmissione da organo da sieropositivo (circa il 100%)- In nessun caso il donatore di sangue puoinfettarsi.- Dose minima infettante di virus: non nota.- In caso di contaminazione parenterale (puntura accidentale), il rischio di infezione

(sieroconversione) elargamente inferiore all1%, confrontato con quello da virus

dellepatite B (superiore al 12%). La possibilitadi acquisire il virus per puntura

accidentale ecomunque maggiore se la quantitadi sangue inoculato era notevole, e se la

ferita era profonda


59/96

TRASMISSIONE PERINATALE DI HIV - Rischio globale di infezione del bambino da madre sieropositiva (portatrice del virus):

circa il 30-40% (in assenza di terapia)

- Vie di infezione del bambino : - Intrauterina (intorno alla 12-16 settimana, tramite la placenta)- Durante il parto (contatto sangue materno-sangue fetale, ingestione di fluidi infetti)- Allattamento

- Tutti i bambini di madri sieropositive sono a loro volta sieropositivi, in quanto hanno nel

sangue gli anticorpi anti-HIV materni. - Falsi sieropositivi: Il titolo anticorpale cala con il tempo, per scomparire tra il secondo e il

diciottesimo mese dopo la nascita. Sono tutte IgG. Eimpossibile isolare il virus dal sangue.

Bambini non infettati - Veri sieropositivi: Il titolo anticorpale resta invariato o addirittura aumenta. Sono presenti,

nelle prime settimane, IgM. Epossibile isolare il virus dal sangue. Bambini infettati- Il decorso della malattia nei bambini portatori del virus esolitamente pi rapido che

nell'adulto. In alcuni casi, fortunatamente, epossibile arrivare alla pubert ancora in fase

asintomatica.


60/96

I soggetti infettati perdono progressivamente negli anni

gran parte del loro patrimonio di Linfociti helper ediventano suscettibili a numerose infezioni

"opportunistiche",

specialmente fungine (candidosi, aspergillosi,

criptococcosi), protozoarie (toxoplasmosi, pneumocistosi)

e virali (infezione da Herpes e Cytomegalovirus);

anche la suscettibilit a particolari tipi di tumori (sarcoma

di Kaposi, linfoma non-Hodgkin) notevolmenteaumentata.


61/96

With giemsa stain intracystic

bodies of Pneumocystiscariniiin lungare seen in this

cytologic preparation from a

bronchoalveolar lavage

dissemination to extrapulmonary

sites, Pneumocystis carinii tends to

produce foci with prominent

calcification, as seen in the kidney

here grossly.

HIV, AIDS andPneumocystis carinii


62/96

HIV and AIDSan infectious agent Kaposis Sarcoma


63/96

Candida infectionsare common with AIDS,but most often appear as oral thrush, which i

a nuisance but not life-threatening.

Disseminated infections are uncommon, buthere is a rare Candida pneumonia, which

resembles a bacterial bronchopneumonia.

HIV and AIDS

AIDS St ti ti


64/96

Approximately 8500 new HIV infections occur dailyaround the world

Over 90% of these are in developing countries

1000 are in children less than 15 yearsof age.

Worldwide

Current estimates are that in 2007, 33.2 million peoplehave HIV infectionUSA

As of June 2000, 753,907Americans reported with AIDS. At least 438,795 of them have died.

Sub-Saharan AfricaAbout 1 million new cases of AIDS per year22.5 millionpeople with HIV infectionSeveral countries in sub-Saharan Africa report infection rates of 20-25%

AIDS Statistics

South and East Asia

In south and east Asia there are more than 200,000 new cases per yearand 7.3millionpeople with HIV

The cellular and immunological picture - The course of the disease


65/96

Perdita di CD4+T4 cellule helper

Malattiacon CD4+< 250 cells/

mm3

Malattia avanzataPerdita di CD4+T4

e

CD8+cellule killer

The cellular and immunological picture - The course of the disease


66/96

Natural history of human

immunodeficiency virus (HIV)

infection.


67/96

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS

PATOGENESI

Perdita T cellule CD4+ sviluppo di disfunzione immunitaria e infezioni opportunistiche

Corso: 8-10 anniCorso pi lungo per lHIV-2

Infezione primaria

107particelle virali/ml

sintomi di tipo inluenzale

risoluzione in poche settimane

controllo attraverso immunit umorale e cellulare

plateau: 103-105copie RNA/ml>10

5copie RNA/ml !progressone rapida


68/96

PRIMA FASE- Vie di entrata di HIV nellorganismo:

- Sangue (tossicodipendenti, trasfusi, ecc)- Organi genitali (contatti omo- eterosessuali)

- Retto (contatti omosessuali)

- Cute (punture accidentali, ferite, ecc)

- Mucose (contaminazioni, ecc)

- Organi (trapianti)

- Infezione delle cellule locoregionali

-Macrofagi-Cellule dendritiche-Linfociti CD4 helperFase clinicamente latente: puo durare da un minimo di 4-6 settimane a

solitamente non piu di 6 mesi.

- Rapida e abbondante replicazione virale

produzione anticorpale contro HIV assente : soggetto infettato ma sieronegativo

(periodo finestra).

Prima fase


69/96

Fase acuta o infezione primariaSintomi aspecifici (simil mononucleosici o similinfluenzali)Comparsa di anticorpi anti HIV (sieropositivit)Carica virale elevatissima (oltre un milione di copie di RNA virale/ml)Deplezione abbondante di CD4Risoluzione in poche settimane Controllo attraverso immunit cellulare e umorale Plateau: 10

3

-105

copie RNA/mlse > 105copie RNA/ml -> progressione rapida

Seconda fase


70/96

Terza fase

Periodo asintomatico

Latenza clinica. Da pochi mesi a 15 anni

Assenza di segni clinici della malattia.

Replicazione virale continua e abbondante : circa 10 miliardi di

particelle/die prodotte ed eliminate ogni giorno

Carica virale: 10.000-100.000 copie RNA/ml

Deplezione linfocitaria: Un miliardo di linfociti CD4 uccisi ogni

giorno, controbilanciati dalla neoproduzione di linfociti da parte

del timo

Alterazione dei linfonodit 1/2 virioni = 6 oret 1/2 cellule = 2 giorni

Quarta fase


71/96

Quarta fase

Fase sintomatica

Carica virale ancor pi elevata: oltre 100.000 copie RNA/ml50% dei casi varianti virali pi citopatiche

Fino a 1 milione di diverse varianti virali genetiche

- Linfociti CD4 < 300/mmc

Comparsa dei primi sintomi: candida, herpes, deperimentoorganico, primi segni di alterazioni neurologiche.

-Linfociti CD4 < 200/mmcComparsa di infezioni da germi opportunisti (pneumocystis

carinii, cytomegalovirus, micobatteri atipici, toxoplasma, ecc)- tumori rapidamente letali (linfomi, carcinomi)

- sarcoma di Kaposi

- AIDS-dementia complex


72/96

Fattori che possono influenzare l'evoluzione della malattia(accelerandone il decorso):

- Defedamento

- Immunocompromissione

- Inoculo ripetuto nel tempo di HIV- Inoculo massivo (anche se unico) di HIV

- Attivazione linfocitaria:

- Da antigeni

- Da patogeni opportunisti o meno : CMV, HBV, HCV, HSV

- Allogenica : Liquido seminale, sangue


73/96

HIV and AIDS

Good correlation betweennumber of HIV particles

measured by PCR and

progression to disease


74/96

Viral load predictssurvival time

CD4 cell count is notagood predictor of

progression to disease


75/96

NEW guidelines

On December 1, the U.S. Department of Health and

Human Services (DHHS) updated its guidelines for

antiretroviral therapy (ART) for HIV positive adults and

adolescents.

In keeping with recent research, the revision calls for earliertreatment: ART is now recommended for people with

350-500 cells/mm3, and half the expert panel favored

treatment even for those with more than 500 cells/mm3.


76/96

RT has a high error rate 1:2,000-10,000 HIV genome 9749 nucleotides

Therefore EVERY new virus has at least one mutation! Every possible single mutation arises daily

The viral population in an infected person is highly heterogeneous

Polymorphism population

vaccine problem


77/96

Population PolymorphismInitial infecting virus is macrophage-tropic(has CCR5 as co-

receptor)

These are non-syncytium-inducing strains(Note: most vaccines have been made against syncytium-

inducing T4 cell tropic strains)

As virus mutates, it changes subtypes of cells that it infectsas the ability to bind different co-receptors changes


78/96

Population PolymorphismEarly in infection:

Macrophage-tropicNon-syncytium-inducing

Slowly replicatingLate in infection

T4 cell tropicSyncytium-inducingHigh titer virus


79/96

What is Tropism? ! Tropism refers to the affinity of a virus, or the preferred

pathway a virus uses to enter a certain cell type.

!Specifically for the HIV-1 virus, the type of tropism refers towhich co-receptor the patients virus uses to enter the cells.


80/96

HIV entry

1) HIV near to target cell

2) Binding between CD4 receptor

and viral gp120

3) Conformational change

gp120-co-receptor binding

4) membrane fusion


81/96

!The tropism is based upon the presence of selected


82/96

16 V3 loop residues

are associated

with co-receptor usage

CXCR4 usage is strongly associated

with the presence of mutations

S11R and H13Y

Residues in red are determinant for the

co-receptor choice. Sing et al., 2006

!The tropism is based upon the presence of selectedaminoacids in gp120(within V3 loop, but not only). They

can confer greater affinity to CCR5 or CXCR4.


83/96

Chemochine e recettori specifci per lentrata e linibizione

dellentrata di HIV

Dal 2007 maraviroc (inibitore CCR5) entrato in uso nella pratica clinica

HIV co-receptor usage


84/96

R5 VirusThey use only CCR5 co-receptorThey are predominant at trasmissionand in early stages of infection

X4 VirusThey use only CXCR4 co-receptor

They emerge in late stages of infectionThey are associated with a morerapid decline of CD4+ T cell anddisease progression

Dual tropic VirusThey use either CCR5 or CXCR4

Viral mixedtropic

population

HIV co receptor usage

Which is the prevalence of co receptor usage?


85/96

Which is the prevalence of co-receptor usage?


86/96

CELLULE BERSAGLIO DI HIV

HIV infetta soprattutto cellule del sistema immunitario (cellule dendritiche,

macrofagi, linfociti T) e cellule endoteliali.

Causa effetti citopatici nelle cellule permissive: come sincizi, morte cellulare per

apoptosi o necrosi.

-Macrofagi(incluse le cellule microgliali del sistema nervoso centrale) elinfocitiCD4sono il principale bersaglio di HIV in vivo. La loro infezione e

in grado di spiegare praticamente tutte le alterazioni causate dal virus nei

pazienti.

-Altre cellule potenzialmente infettabili da HIV :-Tutte le cellule umane aventi il recettore virale (CD4) sulla membrana

Ma anche cellule CD4-come cellule del SNC (astrociti, oligodendrociti)


87/96

Alterazioni immunologiche indotte da HIV:- Deplezione lenta e progressiva di linfociti CD4 (cellule chiave per lattivazionedi corrette risposte immuni dellorganismo) per uccisione diretta, formazione di

sincizi, mediata da cellule killer, da morte programmata, ecc- Produzione elevata di immunoglobuline non specifiche per nessun agente

patogeno (risposta immune non efficace)

- Alterazione della funzione dei linfociti killer (mancata risposta a infezionivirali e a tumori)

-Disfunzione dei macrofagi, con mancato inizio della risposta immune peralterata presentazione dellantigene, ridotta fagocitosi dei microorganismi(p.es. a livello polmonare)

Alterazioni neurologiche indotte da HIV-Disfunzione e morte neuronale per produzione e rilascio, da parte dei

macrofagi cerebrali infettati, di sostanze tossiche cellulari e virali.


88/96

Anti-HIV StrategiesEducation

Sexually transmitted

Not highly infectious

ChemotherapyMutation selection Resistance

but

Suppress replication No capacity for mutation



89/96


DIAGNOSI

Test sierologici antigeni o anticorpi

Ricerca diretta virus o sequenze genomiche

virali

Test sierologici

Anticorpi rilevabili dalle 6-12 settimane dallinfezione

e presenti in tutti i pazienti entro i 6 mesi

Campioni positivi sono rivalutati con test di conferma

Anticorpi contro p17, p24, p55 precoci ediminuiscono

Anticorpi contro gp160 e gp120 pi tardivi epersistenti

Positivit di un numero variabile di bande- ELISA e Western blot specificit intorno al 100%

Test per la rilevazione di antigeni


90/96

Test per la rilevazione di antigeni

ELISA per p24Infezione primaria prima sieroconversione, neonati

Screening trasfusioni

Coltura virale in vitro

Plasma o PBMC

- Sensibilit : 95%

Ricerca sequenze nucleotidiche

DNA provirale nei PBMC

RNA virale nel siero o plasma

Gene gag o pol

- Sensibilit del 99% solo se almeno 10 copiegenomiche virali presenti


91/96

HIV Infection:

Critical points in a Diagnostic Laboratory Early infection diagnosis (adults and children) Confirmation of seropositivity HIV-RNA & HIV-DNA quantification and monitoring Variability of HIV Drug-resistance and tropism


92/96

Marcatore Tempo medio per la rilevabilit Intervallo di confidenza (95%)

PROFILO CLASSICO DI SIEROCONVERSIONE

RNA virale 11 gg. 1-25 gg.Antigene p24 16 gg. 3-30 gg.

DNA provirale 16 gg. 3-30 gg.Anticorpi 21 gg. 9-34 gg

Tempi per la rilevazione dei marcatori diagnostici

Fasi finestranellinfezione da HIV

Finestraper Ab = 21 giorni


93/96

Prima generazione(marzo 1985, Abbott HTLV-IIIEIA):formato indiretto, lisato virale

Seconda generazione(1987): formato indiretto, Agricombinanti/peptidi aumento sensibilit e specificit

Terza generazione(1994): formato diretto (sandwich),Fase solida rivestita di Ag ricombinanti/peptidi,

migliore sensibilit in sieroconversione (IgM, IgA, IgG)

Quarta generazione(1999): rilevazionesimultanea di anticorpi e antigene gagp24,ulteriore riduzione della fase finestra

Le generazionidei test anti-HIV

Infezione da HIV: chiusura del periodo finestra con i


94/96

Infezione da HIV: chiusura del periodo finestra con i

diversi test sierologici e molecolari

three assays: VIDAS Ultra, VIDAS Quick, and ARCHITECT)

detected infection before the p24 specific assay (Coulter)

and less than 3 days afterNAT

da: B. Weber, Expert Rev Mol Diagn 2006; 63 (3): 399-411

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Giorni dopo l'esposizione

EIA 1 generazione

EIA 2 generazione

EIA 3 generazione

EIA 4 generazione

Ag p24

HIV-RNA (plasma)

La conferma : Western blot


95/96

Camp. Ente

gp41

1 FDA p24, p32 e gp41 e/o gp120/160

2 CDC p24 e gp41 e/o gp120/160

3 WHO gp41 e gp120/160

4 Infezione recente?

4

CAMP. 1 2 3

gp160

gp120

p65

p32

p18

p24

p55

CRITERIO

Caratterizzazione con saggio di conferma Western Blot

La conferma: Western blotCriteri di positivit

1) CDC: 2 bande tra p24,gp41, gp120/160

2) WHO: almeno 2 bande env

3) ARC: 1 gag, 1pol, 1 env

4) Mah (Africa): gp160, p31


96/96

Negative/Indeterminate + Detectable RNAHIV antibody test

If diagnosis is made by HIV RNA testing, confirmatory serologic

Diagnosis of Acute HIV infection

Retrovirus e HIV

Documents

Transcript of Retrovirus e HIV