RELAZIONE SCIENTIFICA ANNUALE UNITA’ 6 “UNIBA” ATTIVITA’ 3°ANNO: 2004/2005

Progetto FIRB RBNE01458S Coordinatore Prof. Rolando Barbucci Università di Siena

Responsabile Prof. Pietro Favia Scientifico Dipartimento di Chimica, Università di Bari UNIBA Via Orabona 4, 70126, Bari Tel. 080 5443430; Fax 080-5443405;

e-mail: favia@chimica.uniba.it ATTIVITA’ UNIBA L’attività di UNIBA durante il terzo anno di progetto si è svolta sui seguenti temi, tutti articolati su modificazioni via plasma a radiofrequenza (RF, 13.56 MHz) di polimeri di interesse biomedico:

1. Processi di nanostrutturazione tramite litografia colloidale. 2. Deposizione di film antibatterici contenenti cluster nanometrici di argento in matrice PEO-like.

3. Processi di deposizione di film nanostrutturati da plasmi alimentati con gas fluorurati.

1. PROCESSI DI PATTERNING PER COLLOIDAL LITHOGRAPHY SUPPORTATI DA PROCESSI PLASMOCHIMICI Pietro Favia, Elaisa Sardella, Sara Lovascio, Riccardo d’Agostino

Durante il terzo anno di progetto UNIBA si è occupata di una nuova tecnica per micro- e nano-strutturare superfici polimeriche che combini processi plasmochimici e colloidal lithography. Il lavoro di ricerca si è basato sull’ottimizzazione della tecnica di patterning per colloidal lithography, al fine di ottenere materiali con strutture superficiali di forme e dimensioni differenti capaci di stimolare diverse risposte cellulari, o da poter essere utilizzate nell’ambito della diagnostica biomedica (es. platform di sensori per biomolecole). Si sono inoltre esplorate alcune combinazioni di processi plasmochimici (trattamenti e etching) e colloidal lithography, al fine di modificare le caratteristiche chimiche e/o morfologiche delle superfici sottoposte a nanostrutturazione. Sono state utilizzate nanosfere polimeriche in polistirene da soluzioni colloidali monodisperse, capaci di autoassemblarsi su superfici piane in monostrato compatto a simmetria esagonale. Il monostrato è stato quindi utilizzato come maschera fisica, nelle fasi di nanostrutturazione: 1. auto assemblaggio (self-assembling) delle nanosfere dalla soluzione colloidale alla superficie di un

materiale polimerico (realizzazione della maschera fisica) reso idrofilo via plasma; 2. trasferimento del pattern prodotto dalle sfere sul substrato in processi di plasma etching ; 3. rimozione del residuo delle nanosfere dalla superficie del substrato (lift-off ) in bagno ad

ultrasuoni. La formazione del monostrato, per casting o spin-coating, dipende dalle forze che agiscono tra le sfere quando si organizzano in un reticolo ad impaccamento esagonale in un film liquido esteso su una superficie piana. Perché le nanosfere si autoassemblino sulla superficie durante il processo di spin-coating occorre che la soluzione colloidale acquosa delle nanosfere possa bagnarla. La maggior parte dei polimeri utilizzati in campo biomedico, per esempio polistirene (PS) e polietilenetereftalato (PET), essendo idrofobi, non sono idonei alla realizzazione del processo, a meno di essere sottoposti a trattamento “idrofilizzante” superficiale, per esempio via plasma. Sono stati messi a punto trattamenti plasmochimici (RF, 13.56 MHz, 10sccm NH3; 200mTorr, 20W, 1min) finalizzati ad aumentare il carattere idrofilo di PS e PET, che permettano il self-assembling delle nanosfere. I trattamenti sono stati effettuati in un reattore tubolare di vetro ad elettrodi piani paralleli e simmetrici. Per realizzazione la maschera sono state impiegate sfere colloidali in PS monodisperse in acqua (Aldrich, 10% w/w) del diametro di 600±10 nm. La soluzione è stata diluita con acqua distillata o con soluzioni acquose di NaCl, in modo da ottenere concentrazioni di nanosfere tra 0.2 e 4% w/w. E’ stato studiato l’effetto dell’elettrolita sul self-assembling variando la concentrazione di NaCl tra 3.5 10-2 e 3.4 10-5 M. La soluzione acquosa è stata ulteriormente diluita con una soluzione di un tensioattivo, Triton X-100 in metanolo (Triton-X:metanolo/1:400 v/v; sono stati valutati rapporti CH3OH/H2O 1:1 e 4:1 v/v) Dopo esperimenti preliminari su silicio, PET e PS sono stati usati volumi di 50 µl. Si è quindi ottimizzato il processo di plasma etching in RF (13.56 MHz) Glow Discharges alimentate con miscele Ar/O2 per il trasferimento del pattern di nanosfere su PS. In ogni condizione operativa sono state misurate le velocità di etching mediante profilometro. La fase finale del processo litografico consiste nella rimozione di ciò che resta delle sfere colloidali dopo l’etching. Questo stadio è stato realizzato sottoponendo i substrati al lavaggio in ultrasuoni (10 min, 20 °C) in H2O deionizzata. La morfologia dei campioni è stata osservata al SEM e all’ AFM, in modalità di non contatto (NC-AFM), utilizzando una punta conica di silicio ricoperta di oro. Le misure di angolo di contatto con acqua (WCA) su PS dopo il trattamento con NH3 danno valori di circa 20±3o, di gran lunga inferiore a quello del polimero nativo (90±3o), confermandone l’aumento di carattere idrofilo. Dopo diversi esperimenti, caratterizzati al microscopio ottico e al SEM, si è osservato che su PS trattato la composizione ottimale della sospensione colloidale è quella ottenuta con un rapporto in volume CH3OH/H2Ο 1:1 con 10µl di nanosfere, 25ml di CH3OH e 15µl di H2O. Usando

50 µl di questa soluzione su PS, e ottimizzando i parametri di rotazione dello spin-coater (1000 rpm, 60s), la sospensione colloidale bagna in maniera omogenea il PS producendo un monostrato di sfere omogeneamente assemblate (Fig. 1) con struttura cristallina esagonale, a volte intervallate da zone poco estese contenenti più strati; le sfere si distribuiscono in maniera più compatta al centro del campione. Realizzato con successo l’assembling delle nanosfere su PS, si è proceduto alla ottimizzazione del processo di plasma etching, nelle condizioni di Tabella 1.

Fig. 1 Nanosfere impaccate su PS trattato via plasma (NH3 10sccm; 200mTorr, 20W, 1min) Tabella 1. Condizioni utilizzate nei processo di etching del PS ricoperto con nanosfere. Sono stati usati O2, Ar, e una miscela equimolare O2/Ar. Per ogni processo è stato variato il tempo di etching per valutare le migliori condizioni di nanostrutturazione.

condizioni O2 O2/Ar Ar

O2 (sccm) 10 5 /

Ar (sccm) / 5 10

Potenza (W) 50 50 50

Pressione (mtorr) 200 200 200

/ 5 /

10 10 /

15 / /

20 20 20

30 30 30

Tempo (min)

/ / 60

Un plasma di argon non consente di introdurre gruppi funzionali sulle superfici. Il bombardamento ionico superficiale indotto, però, può provocare la rottura e la formazione di nuovi legami chimici, quindi il riarrangiamento dei gruppi funzionali superficiali del substrato; l’impatto degli ioni positivi può, inoltre, causare la rimozione fisica (sputtering ) di materiale. La Fig. 2a riporta l’immagine SEM di un campione trattato in plasma di Ar (10 sccm, 50 W, 200 mtorr, 60min): la maschera di nanosfere colloidali sembra intatta dopo il processo. Le analisi SEM ed AFM degli stessi campioni sottoposti a lift-off rivelano rilievi (bumps ) superficiali, come si nota in Fig. 2b, disposti regolarmente, localizzati nei punti di contatto delle sfere con il substrato. Confrontando le Fig. 2a e 2b si nota anche che il diametro dei bumps è inferiore a quello delle nanosfere: queste sono ben impaccate nella maschera, in contatto fisico tra loro, mentre i bumps sono ben distanziati. La caratterizzazione AFM mostra che, nelle condizioni citate, si ottengono bumps con diametro medio di 300nm, e un’altezza media di 10±5nm.

Fig. 2: Foto SEM di campioni trattati in plasma di Ar (10 sccm, 50 W, 200 mtorr, 60min): (2a) nanosfere ordinate su PS trattato via plasma con NH3 dopo l’etching (tilt 30°); (2b) lo stesso substrato dopo lift-off (tilt 20°).

A differenza dell’argon, plasmi di ossigeno reagiscono chimicamente con i polimeri provocandone l’etching chimico a formare prodotti volatili (es. H2O e CO2). Inoltre, sui polimeri esposti a plasma di O2 vengono introdotti gruppi funzionali ossigenati e può essere aumentato il grado di reticolazione. Come si nota dalla Figura 3 l’etching con ossigeno comporta effetti completamente differenti dall’argon nelle medesime condizioni sperimentali: le nanosfere si riducono visibilmente per ablazione chimica, soprattutto nelle dimensioni laterali, cosicché parte della superficie prima coperta dalle nanosfere risulta poi esposta al plasma. Dopo 15 min le nanosfere sono così ridotte da perdere, almeno parzialmente la loro funzione di maschera fisica (overetching); i trattamenti di etching di oltre 20 min, infatti, non producono risultati molto diversi da quelli ottenuti dopo 15 min. In Figura 3b sono mostrate le superfici di PS sottoposte a lift-off dopo il trattamento in plasma di O2. Si osserva una topografia superficiale piuttosto regolare costituita da strutture pressoché coniche. Le strutture si assottigliano all’aumentare del tempo di etching (dati non mostrati). Aumentando il tempo di etching a 20 min e 30 min si nota un effetto di rugosità superficiale, quasi sicuramente dovuto alla erosione e ri-deposizione di materiale a causa della prolungata esposizione al plasma. Dopo aver analizzato l’azione dei plasmi di argon e di ossigeno, è stato indagato l’effetto della miscela equimolare dei due gas sui substrati mascherati con le nanosfere. In alcune condizioni si ottengono strutture simili a quelle ottenuta in plasmi alimentati con solo Ar, solo più alte (Figura 4) probabilmente per l’effetto combinato sputtering/etching. In Tabella 2 sono mostrate le altezze medie delle strutture ottenute mediante etching in plasmi alimentati con Ar, O2 e con la miscela. Combinando opportunamente colloidal litography e processi plasmochimici di trattamento, deposizione e etching, si possono realizzare, in maniera controllata, substrati caratterizzati da superfici a topografia e chimica superficiale pre determinati. Tali substrati si potrebbero utilizzare come supporti per lo studio dell’adesione di cellule eucariote. Sviluppi futuri di questo lavoro prevedono infatti la realizzazione di colture cellulari sui materiali descritti sopra, per studiare separatamente gli effetti di topografia e chimica superficiale sull’adesione cellulare.

1µµµµm 1µµµµm

Figura 3: Foto SEM di campioni dopo etching in plasma di O2 (10 sccm, 50 W, 200 mtorr, 10min): (3a) nanosfere ordinate su PS trattato via plasma con NH3 dopo l’etching (tilt 30°); (3b) lo stesso substrato dopo lift-off (tilt 30°). Altezza media strutture 78±20nm (AFM).

Figura 4: Foto SEM di campioni trattati in plasma di O2/Ar (10 sccm, 50 W, 200 mtorr, 10min): (4a) nanosfere ordinate su PS trattato via plasma con NH3 dopo l’etching (tilt 20°); (4b) lo stesso substrato dopo lift-off (tilt 20°). Altezza media strutture 63±20nm (AFM). Tabella 2: misura AFM delle altezze medie delle strutture ottenute in differenti condizioni di etching con O2, Ar, e miscela equimolare O2/Ar.

Tempo di etching (min)

Altezza media strutture (nm)

O2 + Ar 5 30±10 O2 + Ar 10 63±22 O2 + Ar 20 84±28 O2 + Ar 30 84±20

O2 10 78 ±20 O2 20 93 ±15 O2 30 90 ±15 Ar 60 11±5

PUBBLICAZIONI E. Sardella, R. Gristina, D. Gilliland, G. Ceccone, G.S. Senesi, F. Rossi, R. d’Agostino, P. Favia; Plasma-deposited nanopatterned and nanocomposite coatings for biomedical applications; 17th International Symposium on Plasma Chemistry (ISPC-17) Toronto, Canada, Ago 2005.

1µµµµm

1µµµµm

1µµµµm 1µµµµm

2. PROCESSI PLASMOCHIMICI PER LA DEPOSIZIONE DI FILM COMPOSITI ANTI-BATTERICI CONTENENTI CLUSTERS DI Ag DI DIMENSIONI NANOMETRICHE Pietro Favia, Elaisa Sardella, Marianna Casavola, Marco Morra (NobilBio Ricerche), Clara Cassinelli (NobilBio Ricerche), Roberto Gristina (IMIP CNR Bari), Annarosa Mangone, Riccardo d’Agostino

UNIBA ha realizzato coating nanocompositi in grado di un rilasciare in modo controllato ioni Ag+ che scoraggino adesione e proliferazione batterica sia sul materiale che nelle zone circostanti lo stesso. L’argento è uno degli antimicrobici più interessanti a causa del suo elevato potere antimicrobico e della sua aspecificità di interazione con differenti ceppi batterici. Un aspetto chiave nella realizzazione di questo progetto riguarda la scelta della matrice in cui disperdere i cluster di argento, in quanto da essa dipende la capacità del materiale di rilasciare in maniera più o meno controllata ioni argento. I film PEO convenzionali sono ampiamente utilizzati nel campo del rilascio controllato di farmaci perché sono un buon mezzo da cui il farmaco può essere rilasciato in modo controllato data la capacità dei poliglicoli di interagire con le molecole d’acqua e di assorbirla. Lo scopo ultimo di questo lavoro consiste nel produrre film in grado di rilasciare la minima quantità possibile di argento, non tossica per le cellule eucariotiche, ma con proprietà antibatteriche. A tal fine sono stati prodotti film depositati via plasma, in differenti condizioni sperimentali (Tabella 3), in cui i cluster di argento di dimensioni nanometriche siano distribuiti omogeneamente in una matrice simile al polietilene ossido (Ag/PEO-like). In scariche a radiofrequenza (RF, 13.56 MHz) alimentate con DiEtilGlicoleDiMetilEtere (DEGDME) e Ar è possibile modulare sia la quantità di argento inglobata sia la composizione e la reticolazione della matrice polimerica. Il metodo utilizzato per la sintesi dei film è un processo combinato sputtering/PE-CVD (Plasma Enhanced-Chemical Vapour Deposition), in cui la deposizione di film PEO-like è contemporanea allo sputtering di atomi di argento, e all’inglobamento di cluster del metallo nella matrice polimerica. Allo scopo si usa un reattore plasmochimico a piatti piani e paralleli asimmetrici, in cui l’elettrodo piccolo, RF, è ricoperto con una lamina di argento, e serve come sorgente di atomi di argento.

Tabella 3: Condizioni sperimentali di deposizione di coating PEO- e Ag/PEO-like

Film φφφφ argon φφφφ DEGDME Pressione Potenza

PEO 1 10 sccm 0.25 sccm 50 mTorr 10W PEO 2 20 sccm 0.25 sccm 50 mTorr 10W PEO 3 20 sccm 0.25 sccm 50 mTorr 20W

AgPEO1 10 sccm 0.25 sccm 50 mTorr 10W AgPEO2 20 sccm 0.25 sccm 50 mTorr 10W AgPEO3 20 sccm 0.25 sccm 50 mTorr 20W

L’effetto dell’argento, sia sulle caratteristiche chimico-fisiche dei film che sulle proprietà antibatteriche e citotossiche, è stato determinato paragonando film ottenuti nelle stesse condizioni sperimentali in presenza e in assenza di argento. Le proprietà chimico-fisiche dei materiali sintetizzati sono state studiate con le tecniche XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy) e WCA (Water Contact Angle). La citotossicità verso cellule eucariotiche è stata verificata con test in vitro con linee cellulari fibroblasti 3T3. L’effetto antibatterico, invece, è stato valutato con test di inibizione della crescita di Staphylococcus epidermis, svolto preso la NobilBio Ricerche, basato sulla misura del raggio di inibizione della crescita batterica. I campioni sono stati posti in una capsula di Petri con terreno agarizzato (Tryptic Soy Agar), con una concentrazione nota di colonie batteriche (1x108 cfu/ml). In assenza di effetto battericida i batteri crescono, opacizzando l’agar, fino a contatto con il campione; se il campione rilascia sostanze battericide, vi è una zona di agar in cui la crescita è inibita, che si presenta come una corona circolare trasparente intorno al campione. Le caratteristiche chimico-fisiche e quelle biologiche (effetto citotossico e antibatterico) dei film depositati sono state correlate con la quantità di argento rilasciata nello stesso mezzo di coltura dei

fibroblasti 3T3. Le analisi sono state effettuate mediante ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectroscopy). Per esercitare un controllo più accurato sulla quantità di Ag rilasciata si è voluto applicare una strategia ampiamente utilizzata nel campo del rilascio controllato di farmaci (drug delivery): il ricoprimento con film barriera per costituire un ostacolo fisico al rilascio. I film Ag/PEO-like sono stati ricoperti con film PEO-like barriera di composizione e spessore variabile preparati nelle stesse condizioni sperimentali elencate in Tabella 3, ma usando un catodi di acciaio. Gli spettri XPS di film Ag/PEO-like mostrano un aumento del contenuto di argento dall’1% al 5% sia aumentando il flusso di argon che la potenza immessa. Gli spettri C1s (Figura 5) mostrano che il “carattere PEO” dei coating, ossia la percentuale relativa di gruppi etere, identificata con la componente C1s centrata a 286.5 eV B.E., diminuisce all’aumentare del flusso di Ar e della potenza, segno di una maggiore frammentazione del monomero nel plasma. Le analisi TEM mostrano che la dimensione dei cluster nella matrice organica varia, in funzione delle condizioni, da 3±1 a 20±7 nm. Presso NobilBio ricerche sono state condotte analisi AFM dei film PEO- e Ag/PEO-like in fase liquida (soluzione acquosa tamponata con PBS) sia a tempo zero che dopo due giorni di immersione. Test di coltura cellulare (fibroblasti 3T3) verificano che le cellule hanno comportamento completamente differente (Figura 6): su substrati contenenti Ag, indipendemente dalla quantità di metallo inglobato, si osservano cellule adese con morfologia tondeggiante; film PEO-like non contenenti Ag, invece, caratterizzati da carattere PEO tra il 40 e il 20%, risultano cell-adhesive. La scarsa adesione dei fibroblasti sui film contenenti Ag è stata attribuita al rilascio di ioni Ag+ nel terreno di coltura, come confermato dalle analisi ICP-MS (Figura 7). La quantità di Ag rilasciato e l’andamento del rilascio nel tempo sono strettamente correlati alla quantità di Ag contenuta nel coating: Film Ag/PEO-like contenenti il 5% di Ag rilasciano nel tempo la maggiore quantità di Ag, in maniera poco controllata. Per diminuire, ed al contempo controllare, la quantità di Ag rilasciata nel mezzo di coltura, si è proceduto alla ricopertura dei film contenenti Ag con film PEO-like cell-adhesive di differente composizione chimica (carattere PEO) e spessore. Come mostrato in Figura 8 la quantità di Ag rilasciato dipende sia dalla composizione chimica del film barriera che dal suo spessore.

Figura 5: spettri XPS C1s di film Ag/PEO-like depositati in differenti condizioni: 10W, 10sccm Ar (nero); 10W, 20sccm Ar (rosso); 20W, 20sccm Ar (blu). La deconvoluzione degli spettri conferma una maggiore frammentazione del monomero all’aumentare della potenza immessa e del flusso dell’argon: per film depositati a bassa potenza e basso flusso di Argon si nota un carattere PEO più elevato.

10/10 10/20 20/20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

20W; 20sccm Ar10W; 20sccm Ar10W; 10sccm Ar

Atom

ic C

once

ntra

tion

(%)

C-H (C) C-OH (C) C=O; O-C-O COOH (R)

Figura 6: foto al microscopio ottico di fibroblasti 3T3 (24 h) su film PEO-like depositati in differenti condizioni sperimentali, senza (a, b, c) e con (a’,b’,c’) argento incluso.

Figura 7 Risultati ICP-MS su terreni prelevati dopo 24, 48 e 72 h di coltura cellulare su campioni contenenti quantità variabili di Ag.

Test di coltura cellulare realizzati su questi campioni hanno mostrato che l’adesione di fibroblasti 3T3 sui film non migliora, nonostante la diminuzione del rilascio di Ag+ nel terreno di coltura ma aumenta l’adesione intorno al substrato, sui pozzetto di PS in cui i substrati sono posizionati. Il comportamento conferma che una diminuzione di Ag+ rilasciato nel terreno di coltura corrisponde ad una riduzione dell’effetto citotossico dei substrati.

50µm 50µm 50µm

50µm 50µm 50µm50µm50µm 50µm50µm 50µm50µm

a) b) c)

a’) b’) c’)

20 30 40 50 60 70 800.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

dMt/d

t (pp

m*h

-1*c

m-2)

t (hours)

Ag1% Ag3% Ag5%

t (ore)

20 30 40 50 60 70 800.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

t (hours)

dMt/d

t (pp

m*h

-1*c

m-2)

Ag5% Ag5%+bar PEO40% (15nm) Ag5%+bar PEO40% (60nm)

20 30 40 50 60 70 800.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14 Ag5% Ag5%+bar PEO20% (15nm) Ag5%+bar PEO20% (60nm)

t (hours)

dMt/d

t (pp

m*h

-1*c

m-2)

20 30 40 50 60 70 800.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

t (hours)

dMt/d

t (pp

m*h

-1*c

m-2)

Ag5% Ag5%+bar PEO40% (15nm) Ag5%+bar PEO40% (60nm)

20 30 40 50 60 70 800.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14 Ag5% Ag5%+bar PEO20% (15nm) Ag5%+bar PEO20% (60nm)

t (hours)

dMt/d

t (pp

m*h

-1*c

m-2)

Figura 8 Risultati ICP-MS su terreni prelevati dopo 24, 48 e 72 h di coltura cellulare su campioni contenenti 5% di Ag (XPS) e ricoperti con film PEO-like (carattere PEO 40% a sinistra, 20% a destra) di spessore variabile.

I test batterici effettuati su Staphylococcus epidermis presso la NobilBio Ricerche (Fig. 9) hanno mostrato che anche film contenenti minime quantità di Ag risultano anti-batterici, contrariamente ai substrati nativi (PET), e a quelli ricoperti con film PEO-like non contenenti Ag. La presenza della barriera PEO-like al 40% di carattere PEO spessa 15nm riduce l’effetto anti-batterico dei film Ag/PEO-like, ma anche l’effetto di citotossicità.

Figura 9 Dimensione della corona circolare attestante inibizione di crescita batterica intorno a campioni ricoperti con film Ag/PEO-like in assenza e in presenza di barriera. La barriera riduce ma non annulla l’effetto anti-batterico.

Native

PET

PEO(40%)

Ag PEO (A

g 1%; P

EO40%)

Ag PEO(A

g1%)+ B

ar PEO (4

0%)

0

1

2

3

4

5

6

7

r (m

m)

PUBBLICAZIONI E. Sardella; R. Gristina; A. Mangone, M. Casavola; P.Favia; R. d’Agostino; Plasma Deposition of Ag-containing Nano-composite coatings; Journal of Applied Biomaterials & Biomechanics, sottoposto 2005 E. Sardella, R. Gristina, G. Ceccone, D. Gilliland, A. Papadopoulou-Bouraoui, F. Rossi, P. Favia; R. d’Agostino; Bactericidal Silver containing nanocomposites deposited by Means of RF (13.56 MHz) Glow Discharges; 19th European Conference on Biomaterials (ESB-19), Sorrento, Sett 2005 P. Favia, E. Sardella, M. Nardulli, R. Gristina; R. d’Agostino; Plasma-deposited Silver Containing Nanocomposite coatings with Bactericidal properties; 52nd AVS Meeting, Boston, US, Nov 2005. E. Sardella, R. Gristina, P. Favia, R. d’Agostino, bactericidal silver containing composites deposited by means of RF (13.56MHz) Glow Discharges; National Congress on Biomaterials GIB-SIB, Milano, Ott 2005

3. PE-CVD DI FILM NANOSTRUTTURATI DA PLASMI ALIMENTATI DA GAS FLUORURATI Pietro Favia, Erica D’Aloia, Giorgio Senesi (IMIP, CNR Bari), Roberto Gristina (IMIP, CNR Bari), Riccardo d’Agostino

Superfici nanostrutturate con chimica fluorurata sono state prodotte per deposizione via plasma (PE-CVD) su PET (Goodfellow). La deposizione via plasma di film fluorurati “teflon-like” in determinate condizioni sperimentali permette di realizzare strutture “ribbon-like” casuali di lunghezze micrometriche ed altezze nanometriche. Le caratteristiche topografiche sono state utilizzate per valutare la capacità di queste strutture di influenzare il comportamento di differenti tipi cellulari rispetto a film piani con la stessa chimica superficiale. Sono stati prodotti campioni di PET ricoperti via plasma con film nanostrutturati e con film piani. I campioni sono stati caratterizzati dal punto di vista morfologico mediante microscopia ottica, SEM e AFM. La composizione chimica superficiale è stata analizzata tramite analisi XPS, e il carattere idrofobo/idrofilo del materiale è stato verificato con misure WCA. Molti dati, strutturali e di adesione cellulare ( fibroblasti 3T3 e osteoblasti MG63 presso UNIBA, 3T3 embrionali presso UNINA, CVEC presso UNISI) sono riportati nei precedenti report di attività (1°e 2° anno); la presenza di nanostrutture sembra, nella maggior parte dei casi, indurre una migliore adesione celulare. Nel terzo anno sono state effettuate ulteriori indagini di caratterizzazione chimica/strutturale mediante analisi XRD di diffrazione X, in collaborazione con l’unità di Bologna (UNIBO, Prof.ssa Adriana Bigi). Sono stati preparati tre differenti tipi di campioni strutturati, MD_20, MD_60 e MD_90, con differente altezza media e densità delle strutture, ottenuti variando il tempo di deposizione del processo plasmochimico (RF 13.56 MHz, C2F4 10 sccm, 100 W, modulazione D.C. 5%, 200 mTorr, 20-90 min). Sono stati produtti anche film non strutturati, piani, CW_5, da scariche non modulate (D.C. 100%, 5 min) nelle stesse condizioni. Sui film, depositati su substrati di silicio, sono stati ottenuti i seguenti risultati XPS, WCA e AFM della Tabella 4. All’aumentare del tempo di deposizione aumentano rapporto F/C, densità e altezza delle strutture, quindi la rugosità e l’area superficiale dei coating, nonché l’angolo di contatto WCA dei campioni strutturati (previsto dall’ equazione di Wenzel).

Tabella 4: Dati XPS, WCA e AFM dei campioni prodotti per le analisi XRD

CW_5 MD_20 MD_60 MD_90

WCA (°) 108 ± 4 115 ± 4 >150 >150

F/C (XPS) 1.38 1.45 1.56 1.69

RMS Roughness (nm) 10.9 ± 2.8 58.1 ± 4.4 146.1 ± 4.3 251.4 ± 9.1

Average Height (nm) 4.9 ± 0.7 33.5 ± 5.8 132.5 ± 4.6 268.0 ± 14.1

Surface Area (µm2) 2511.7 ± 0.6 2547.7 ± 9.2 2773.7 ± 25.2 2874.2 ± 20.9

Gli spettri XRD dei campioni MD_60 e MD_90, che presentano una maggiore densità di strutture, sono caratterizzati dalla presenza di un picco ben definito e centrato a 18°, che indica la presenza di unità cristalline con una orientazione preferenziale lungo il piano (100), tipica della struttura esagonale del politetrafluoroetilene (PTFE), mostrato come confronto. Gli spettro XRD del film depositato in condizioni continue (CW_5) e in condizioni modulate a bassi tempi di deposizione (MD_20), invece, caratterizzati rispettivamente da assenza e da pochissime nanostrutture ribbon-like superficiali, non mostrano alcuna componente cristallina. Questi risultati confermano che nei film nanostrutturati le nanostrutture ribbon-like superficiali sono costituite da catene –(CF2-CF2)n- organizzate in modo

ordinato, come nel PTFE, immerse in un background amorfo, a rapporto F/C chiaramente minore di 2. Gli spettri XRD in questione sono mostrati in Figura 10. Sono in programma altri esperimenti per valutare l’effetto della morfologia e della chimica superfciale e dei coating in vitro e in vivo.

XRDRelationship between composition and degree of crystallinity

PTFE cryst. 2θ~18°

2θ(°)15 20 25

MD_60MD_60

MD_90MD_90

CW_5 CW_5

MD_20MD_20

TeflonTeflon

XRDRelationship between composition and degree of crystallinity

PTFE cryst. 2θ~18°

2θ(°)15 20 25

MD_60MD_60

MD_90MD_90

CW_5 CW_5

MD_20MD_20

TeflonTeflon

Figura 10 Spettri XRD di coating teflon-like nanostrutturati e non, confrontati con lo spettro del PTFE (teflon).

PUBBLICAZIONI F. Rosso, G. Marino, L. Muscariello, G. Cafiero, A. Barbarisi, P. Favia, E. D’Aloia, R. d’Agostino, Adhesion and proliferation of fibroblasts on plasma-deposited nanostructured fluorocarbon coatings: evidence of FAK activation. Journal of Cellular Physiology. Accettato 2005. G.S. Senesi, E. D’Aloia, R. Gristina, P. Favia, R. d’Agostino, Surface characterization of plasma deposited nano-structred fluorocarbon coatings by scanning eletron and atomic force microscopies, Microscopy and Microanalysis, sottoposto 2005.