RELAZIONE dell’ATTIVITA’ di RICERCA svolta dall’ …...spettrometria di massa a ioni secondari...

PROGETTO FIRB: “Tecnologie per la manipolazione su scala micro e nanometrica dei materiali e loro applicazione biomedica”. WORKPACKAGE 1: “Tessuti vascolari e tessuti connettivi non mineralizzati”. RELAZIONE dell’ATTIVITA’ di RICERCA svolta dall’ Unità di Ricerca CRISMA-Università di Siena OBIETTIVI del progetto: L’obiettivo del progetto riguarda la realizzazione di superfici micro/nanostrutturate a base di polisaccaridi su diversi tipi di substrati e la loro successiva caratterizzazione chimico-fisica e morfologia. Tali superfici verranno poi utilizzate come supporti per colture cellulari con il fine di studiare come la presenza simultanea di domini chimici e topografici sulla superficie influenzi la risposta cellulare. Da dati riportati in letteratura è noto che la presenza di stimoli topografici e chimici di superficie modulano la risposta cellulare; lo scopo del progetto è quello di verificare come la contemporanea presenza dei due stimoli (chimico e topografico) influenzano la risposta di cellule dei tessuti molli. Come substrati sono stati scelti film di materiali polimerici polietilentereftalato (PET), poli(tetrafluoroetilene) (PTFE) e film di PET ricoperti di carbonio pirolitico (PET/C). La scelta è ricaduta su materiali impiegati già da molti anni nell’industria del settore dei biomateriali. Inoltre sono stati anche utilizzati anche substrati di vetro con diversa composizione chimica ed infine un biomateriale riassorbibile: film di acido polilattico. Come polisaccaride è stato scelto l’acido ialuronico viste le sue note proprietà come polimero altamente bio ed emocompatibile. Appartiene alla famiglia dei glicosamminoglicani (GAGs) biopolimeri anionici, che comprendono le condroitine e i cheratani, caratterizzati da catene costituite da unità ripetitive unite da legami glicosidici. L’acido ialuronico è costituito da unità disaccaridiche di N-acetil-glucosammina e l’acido D-glucuronico. Mentre la maggior parte dei glicosamminoglicani a livello cellulare vengono sintetizzati nel complesso del Golgi, l’acido ialuronico è sintetizzato nella parete interna della membrana plasmatica e poi estruso al di fuori della membrana dove forma dei complessi con proteine specifiche. PREPARAZIONE dei MATERIALI Scelta dei substrati Sono stati utilizzati diversi tipi di materiali che possiamo suddividere in quattro categorie: I. film e “tessuti”di PET e di PTFE. I film commerciali sono stati forniti dalla ditta Good-

Fellow. I film di PET sono stati rivestiti con carbonio pirolitico mediante deposizione fisica da un target di C (PET/C) presso la ditta Sorin Biomedica (Saluggia- TO). La ditta Sorin Biomedica (Saluggia To) ha fornito anche dei tessuti di PET e di PTFE che sono stati caratterizzati, ma che in seguito si sono dimostrati non adatti come substrati per la microstrutturazione per la presenza delle fibre del tessuto già di per sé microstrutturate.

II. film di PET rivestiti con carbonio pirolitico (PET/C). Il rivestimento è stato effettuato presso la ditta Sorin mediante deposizione fisica da un target di C.

III. materiali in vetro a diversa composizione chimica (forniti dalla ditta Calp, Colle di Val d’Elsa Si)

IV. materiali bioriassorbibili - acido polilattico (preparati presso l’unità di ricerca CRISMA).

1

I tipi di substrato sono stati scelti a seconda delle finalità del progetto, in particolare nel caso di supporti da utlizzare nell’ambito dei tessuti molli la scelta è ricaduta su materiali polimerici che, come il PET, sono impiegati già da molti anni nel settore dei biomateriali. Considerando che tra i tessuti molli può essere considerato il sangue abbiamo dedicato la nostra attenzione al carbonio pirolitico, un materiale messo in commercio dalla ditta Sorin di cui sono note le caratteristiche. Durante l’attività di ricerca del progetto sono stati aggiunti altri due tipi di materiali il vetro e un biomateriale riassorbilile, l’acido polilattico. Le motivazioni derivano dei alcuni dati sperimentali ottenuti proprio nel merito del progetto riguardanti la capacità delle superfici microstrutturate di mantenere il fenotipo di condrociti che invece quando coltivati su supporti non strutturati si differenziano in fibroblasti. Tali prove sono state ottenute utilizzando superfici microstrutturate di Hyal su supporti di PET. Questi risultati hanno incoraggiato una possibile applicazione di tali superfici microstrutturate come costituenti di “devices” in vivo per la riparazione della cartilagine. Bisogna tenere conto, però, che il substrato di PET non risulta adatto per l’impianto in vivo nel distretto del ginocchio; è stato necessario quindi cercare di sostituire tale substrato con altri tipi di materiali più idonei. Sono state proposte due diverse strategie:

preparazione di superfici microstruttuare a base di Hyal su differenti tipi vetro con l’idea di passare alla realizzazione di dispositivi a base di biovetro ( già impiegato nel settore ortopedico) da inserire in vivo con il lato non microstrutturato a contatto con il tessuto osseo e la parte microstrutturata a contatto con la cartilagine.

preparazione di superfici microstrutturate a base di Hyal su polimeri riassorbibili quali acido polilattico o acido poliglicolico.

Alcuni di questi substrati sono stati abbandonati nel corso del progetto o per la difficoltà ad ottenere delle superfici microstrutturate con una buona riproducibilità o perché i risultati ottenuti non erano promettenti. I tessuti di PET e di PTFE sono stati abbandonati nel corso del primo anno del progetto perché nonostante i vari tentativi effettuati, ottenere anche semplicemente un coating omogeneo di acido ialurolico risultava piuttosto difficile e poco riproducibile e spesso il coating ottenuto disomogeneo. In Fig 1 sono riportate immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) dei tessuti di PET e di PTFE. Nei tessuti di PET, le fibre sono intrecciate in modo tale da formare una struttura a maglie irregolare mentre le fibre di PTFE si presentano come trecce regolari. a) b) c) Fig 1. Micrografie SEM del “tessuto SORIN” di PET a) e b) e di PTFE c). In Fig 2 sono riportate immagini SEM di superfici dei tessuti Sorin ricoperti con un coating di acido Ialuronico (Hyal). Il coating è stato realizzato tramite un processo di fotoimmobilizzazione di un derivato fotoreattivo dello stesso polisaccaride (per i dettagli del processo vedi dopo pag….). Come appare evidente dalle immagini il coating non si presenta omogeneo. La non omogenicità del coating di Hyal può essere dovuta all’elevata idrofobicità dei “tessuti”. In questo caso trattamenti plasmochimici finalizzati ad aumentare la bagnabilità di superficie si sono rivelati poco efficaci a causa della struttura a fibre. Gli stessi trattamenti sono stati impiegati con successo per aumentare la bagnabilità dei film commerciali di PET.

2

Fig 2. Micrografie SEM del “tessuto SORIN” di PET a) e di PTFE b) con un coating di Hyal Tutti substrati sono stati caratterizzati da un punto di vista chimico e morfologico servendosi di tutte le tecniche più opportune. Per l’analisi della chimica di superficie è stata impiegata la spettroscopia infrarossa di superficie (ATR FT-IR), la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) e la spettrometria di massa a ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS). Per l’analisi della morfologia (rugosità) di superficie è stata impiegata la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia a forza atomica. Preparazione delle superfici microstrutturate La strategia per ottenere superfici microstrutturate sfrutta la tecnica della fotolitografia. Il polisaccaride viene stampato sulla superficie come se fosse un fotoresist negativo che una volta esposto alla radiazione UV, rimane legato sulla superficie. L’intero processo può essere suddiviso in 4 steps: STEP 1: derivatizzazione del polisaccaride con una molecola fotoreattiva STEP 2: pulizia e pretrattamento del substrato se necessario STEP 3: deposizione del polisaccaride fotoreattivo STEP 4: irradiazione UV in presenza di una fotomaschera con una geometria definite L’intero processo è schematizzato in Fig 3. Questo approccio è economico semplice e applicabile adiversi tipi di substrati e polisaccaridi o comunque polimeri aventi gruppi carbossilici liberi. E’ in grado di replicare un area di (0.5cmx1.5cm) (dipende dalle dimensioni della maschera) con una buona riproducubilità da un campione all’altro.

3

2. Spin-coating of 1% w/v aqueous HyalN3 or HyalSN3

solution

3. Photoimmobilization of the spin-coated layer

1. Surface pre-treatment(silanization or ammonia

plasma)

4. Removal of unbound Hyalby rinsing with water

substrate

substrate

substrate

U.V. irradiation

substrate

substrate

2. Spin-coating of 1% w/v aqueous HyalN3 or HyalSN3

solution

3. Photoimmobilization of the spin-coated layer

1. Surface pre-treatment(silanization or ammonia

plasma)

4. Removal of unbound Hyalby rinsing with water

substratesubstrate

substratesubstratesubstrate

substratesubstrate

U.V. irradiation

substratesubstratesubstrate

substrate Fig 3. Schema di realizzazione delle superfici microstrutturate STEP 1: Sintesi dell’intermedio fotoreattivo Le microstrutture sui vari tipi di substrati sono state ottenute tramite un processo di fotoimmobilizzazione che prevede l’immobilizzazione per via fotochimica del polisaccaride sulla superficie. Lo Hyal di per sè non è molecola fotoreattiva, quindi è necessario coniugare allo Hyal una molecola fotoreattiva. Nel caso dello Hyal è stata scelta la 4-azidoanilina, la quale viene legata al polisaccaride attraverso la formazione di un legame amidico tra l’ammina primaria e lo ione carbossilato del polisaccaride. La reazione viene condotta in solvente acquoso a 4°C, pH 7.4 per 24h in condizioni di oscurità in presenza di una carbodimmide solubile in acqua (EDC) che funziona come attivante del gruppo carbossilato. Lo schema di reazione è riportato in Fig 4. Il polisaccaride fotoreattivo è riportato come HyalN3.

O

H

H

OHH

OH

OO

H

H

COONaO

H

H

H

OH

HCH2OH

OHNH

OCH3

n

NH2

N

N+

N

Cl

O

H

H

OHH

OH

OO

H

H

CO

H

NHH

H

OH

HCH2OH

OHO

CH3

O

NH

N3

n

+

+

+4°C, 24hH20, EDC

H20

O

H

H

OHH

OH

OO

H

H

COONaO

H

H

H

OH

HCH2OH

OHNH

OCH3

n

NH2

N

N+

N

Cl

O

H

H

OHH

OH

OO

H

H

CO

H

NHH

H

OH

HCH2OH

OHO

CH3

O

NH

N3

n

+

+

+4°C, 24hH20, EDC

H20

Fig 4. Schema di reazione del processo di fotoattivazione dello Hyal

4

L’intermedio fotoreattivo è stato caratterizzato tramite spettroscopia infrarossa e spettroscopia UV-visibile. Come esempio, in Fig 5 è riportato lo spettro infrarosso dello HyalN3 in cui si nota un picco intenso a 2128cm-1 che viene attribuito al gruppo azidico -N3 e un picco a 1508cm-1 che appartiene all’anello aromatico dell’azidoanilina. Lo sdoppiamento della banda relativa allo stretching del C=O ammidico a 1650cm-1 così come quello della banda del bending del gruppo N-H ammidico a 1560 cm-1 è indice del fatto che sono presenti due ammidi: una appartenente al gruppo acetammidco del polisaccaride di partenza e l’altra si è formata durante la reazione. Nello spettro UV dello HyalN3 in cui è evidente la presenza dell’azide legata al polisaccaride vista la presenza di un picco di assorbimento a 271cm-1 attribuito al gruppo -N3.

Fig 5 Spettro FT-IR dell’intermedio fotoreattivo HyalN3. STEP 2: Pulizia e pretrattamento del substrato La procedura è riportata per ogni tipo di substrato nei paragrafi successivi. STEP 3: Deposizione del polisaccaride HyalN3La deposizione del polisaccaride fotoreattivo è stata effettuata secondo due diverse procedure:

a) “casting” cioè semplice deposizione di un volume noto (in genere 100ul dipende dalla superficie del campione) di una soluzione acquosa 1mg/mL di HyalN3

b) spin coating di una soluzione acquosa contenente 10 mg/ml di polisaccaride fotoreattivo Le microstrutture ottenute per casting non sono molto stabili nelle condizioni di coltura cellulare (37°C, terreno di coltura, 5%CO2, 95% O2). Infatti dopo 2, 3 giorni le microstrutture si idratano e infine si distaccavano dal substrato sottostante. Questo fenomeno è dovuto al fatto che durante il processo di fotoimmobilizzazione si ha un auto-crosslinking del polisaccaride oltre l’”aggraffaggio” del polisaccaride al substrato vista la non selettività dell’azide per il substrato. Quindi uno spessore maggiore del coating del polisaccaride rende più difficile l’aggraffaggio al substrato e contemporaneamente facilita l’autocrosslinking e di conseguenza il distacco del polisaccaride. Quindi per la preparazione di superfici microstrutturate nell’ambito del progetto è stata impiegata la tecnica di spin coating. STEP 4: Fotoimmobilizzazione Le superfici con depositato il polisaccaride sono state fatte asciugare e quindi poste sotto la lampada UV (Helios Italquarz GRE 400W, intervallo di λ: 200-320 nm) ad una distanza di 40 cm, per 20 secondi, utilizzando una fotomaschera di Cr-quarzo con una geometria a strisce con una larghezza nell’ordine dei micrometri. La maschera possiede finestre con strisce aventi larghezza diversa; in questo progetto sono state realizzate microstrutture aventi una geometria con strisce larghe 50, 25,10 e 5μm.

5

Le superfici ottenute consistono in microdomini alternati a strisce di polisaccaride e di substrato. Quando il polisaccaride è depositato per “casting”, si ottengono microstrutture con uno spessore di 150-250nm. Eseguendo invece la deposizione per “spin-coating” sono state preparate microstrutture aventi un’altezza in un intervallo tra 20 e 70nm variando la velocità di rotazione dello spin-coater. In Fig6, come esempio, è riportata un’analisi AFM di microstrutture a base di acido ialuronico su PET-NH2. Inoltre, è stata valutata la stabilità delle strutture nelle stesse condizioni in cui vengono effettuate le prove biologiche. Le microstrutture sono state osservate al microscopio ottico e analizzate all’AFM dopo 4, 8 e 12 giorni; non sono state riscontrate variazioni morfologiche.

Spin-coatingSpin-coating

Fig 6: Micrografia AFM non contact mode di un campione microstrutturato con strisce di Hyal su film di PET (larghezza delle strisce 5μm, spessore 40nm) Il polisaccaride è depositato per spin-coating. Di seguito sono riportati i risultati più significativi ottenuti per ogni tipo di materiale microstrutturato. Non verranno riportati i risultati iniziali ottenuti sui substrati che sono stati poi abbandonati. Superfici microstrutturate a base di Hyal su supporti di PET Pretrattamento delle superfici di PET: Per legare il polisaccaride sulle superfici di PET è stato necessario aumentare la bagnabilità di superficie attraverso un trattamento ai plasmi di ammoniaca. Il trattamento è stato messo a punto e effettuato presso l’unità di ricerca Università di Bari. In pratica le superfici sono state sottoposte ad un pretrattamento a idrogeno e poi ad un secondo trattamento ai plasmi di ammoniaca. Con questo processo è stato possibile aggraffare sulla superficie del PET gruppi polari –NH2 che aumentano l’idrofilicità della superficie. ll pretrattamento a H2 è stato necessario per rallentare il processo di invecchiamento della superficie che altrimenti diventa nel tempo meno bagnabile a causa del “recovery effect”dei gruppi polari che migrano verso il bulk del materiale quando la superficie è esposta all’aria. L’efficacia del trattamento è stata valutata mediante analisi XPS e misure dell’angolo di contatto (WCA). L’analisi ToF-SIMS è stata effettuata con lo scopo di investigare la chimica di superficie e l’eventuale presenza di contaminanti. Le superfici trattate ai plasmi di ammoniaca sono riportate come PET–NH2 - XPS e WCA L’analisi XPS ha dimostrato che la densità dei gruppi amminici sulla superficie diPET è in funzione della durata del processo plasma. La composizione chimica di superficie del PET nativo e del PET dopo il trattamento ai plasmi di ammoniaca insieme ai valori dell’angolo di contatto riportata in Tab 1.

6

Sample %C %O %N WCA Native PET (Good Fellow) 73.5 26.5 No detectable 72°±3 Plasma treated PET (1sec) 94.9 15.1 No detectable 84°±3 Plasma treated PET (1min) 72.5 18.4 8.9 53°±3

Tab 1: Intensità percentuale ( della composizione atomica di superficie del PET nativo e dopo trattamento plasma di 1 sec e 1min. I valori di WCA sono espressi come media± s.d di tre misure per ogni campione (n° di campioni per tipo = 3)

∑= %)100

Quando il PET è trattato per 1 sec non si hanno tracce sulla superficie di N2 mentr quando il trattamento con gli stessi parametri operativi è protratto per 1 min la percentuale di N arriva a circa il 9%. Il valore di WCA si abbassa notevolmente quando il trattamento è di 1 min indicando che la superfcie è più idrofilica. Inoltre l’elevata percentuale di C rivelata dall’analisi XPS per superfici trattate un solo sec. porta alla conclusione che in queste condizioni il fenomeno di etching, che si ha sempre durante i trattamenti ai plasmi, prevale sull’insersione dei gruppi amminici. Questo spiega l’elevata quantità di C dovuta a idrocarburi e la bassa bagnabilità delle superfici trattate 1sec. Per ridurre l’effetto dell’aging delle superfici, queste sono state sottoposte ad un pretrattamento a H2Quando il pretrattamento è effettuato con H2 che è una molecola altamente reattiva si formano dei gruppi –COO radicatici che reagiscono con l’idrogeno dando origine a gruppi –COOH terminali. La composizione chimica di tali superfici è riportata in Tab 2 insieme alle misure di WCA. .

Sample %C %O %N O/C O/N WCA native PET 68.6 31.4 ---- 0.46 ---- 72±3° Plasma treated PET 61.8 21.4 16.8 0.35 0.27 28±2°

Tab 2: Intensità percentuale ( della composizione atomica di superfici del PET nativoe dopo trattamento plasma di 1min preceduto da un pretrattamento a H

∑= %)1002. I valori di WCA sono

espressi come media± s.d di tre misure per ogni campione (n° di campioni per tipo = 3) Circa il 18% di azoto è stato trovato sulle superfici. In Fig 7 è riportato lo spettro XPS ad alta risoluzione del C1s prima e dopo il trattamento ai plasmi. Il picco risulta drasticamente modificato dopo il trattamento al plasma, il segnale (b) è sostanzialmente slargato. La diminuzione della componente a 289.5eV indica che i gruppi carbossilici sono drasticamente rimossi durante il processo sottoforma di molecole di CO2. Immediatamente subito il processo al plasma è stato misurato un WCA di 28±2° che indica che la superficie è estremamente idrofilia rispetto a quella del PET nativo (WCA 72±3°)

275280285290295300Binding Energy (eV)

a)

b)



a)

b)

7

Fig 8: Spettro XPS ad alta risoluzione del C1s di (a) PET-NH2 (b) PET nativo. - analisi ToF-SIMS

L’analisi ToF-SIMS ha evidenziato che la chimica di superficie è quella tipica di superfici di PET. I picchi a 104, 105, 149, 132, 191 and 193 m/z sono attribuiti a frammenti molecolari del PET: Non sono state osservate tracce di contaminanti particolari a parte la presenza di frammenti a basso peso molecolare che possono essere attribuiti sia al PET che a idrocarburi nell’aria. I picchi principali e la loro attribuzione sono riportati in Tab 3.Tracce di Fe (56m/z) sono state evidenziate Con l’analisi XPS non era stata osservata la presenza di Fe a causa della minore sensibilità della tecnica. Il Fe probabilmente deriva dall’anodo del reattore plasma (che è fatto di Fe) .

Peak (m/z) Molecular fragment assignment 104 . C6H4-C≡O+

105 C6H4-C≡O+

132 CO- C6H4-C≡O+

149 COOH- C6H4-C≡O+

191 Monomeric PET unit -H 193 Monomeric PET unit + H *56 Fe

Tab 3: Valori sperimentali (m/z) e assegnazione dei picchi principali del substrato di PET nativo e dopo trattamento al plasma.*rilevato solo dopo trattamento a lplasma Caratterizzazione delle superfici microstrutturate La topografia di superfici microstrutturate è stata caratterizzata mediante analisi AFM. Le superfici presentano lo stesso pattern della maschera. Come esempio sono riportate immagini AFM di una superficie con strisce di Hyal di 50 e 5um (Fig 9). In Tab 4 sono riportate le dimensioni delle microstrutture (larghezza e spessore) per ogni tipo di pattern.

Distance

Z D

ata

0

65.3

130.5

195.8

261 nm

0 20 40 60 80 100 µm

100 µm

0 µm

50 µm

100 µm0 µm 50 µm

0.00 nm

58.98 nm

a) b)

Distance

Z D

ata

0

29.5

59

88.5

118 nm

0 10 20 30 40 50 µm

e)

c) d)

Distance

Z D

ata

0

65.3

130.5

195.8

261 nm

0 20 40 60 80 100 µm

100 µm

0 µm

50 µm

100 µm0 µm 50 µm

0.00 nm

58.98 nm

a) b)

Distance

Z D

ata

0

29.5

59

88.5

118 nm

0 10 20 30 40 50 µm

e)

Distance

Z D

ata

0

65.3

130.5

195.8

261 nm

0 20 40 60 80 100 µm

100 µm

0 µm

50 µm

100 µm0 µm 50 µm

0.00 nm

58.98 nm

Distance

Z D

ata

0

65.3

130.5

195.8

261 nm

0 20 40 60 80 100 µm

100 µm

0 µm

50 µm

100 µm0 µm 50 µm

0.00 nm

58.98 nm

a) b)

Distance

Z D

ata

0

29.5

59

88.5

118 nm

0 10 20 30 40 50 µmDistance

Z D

ata

0

29.5

59

88.5

118 nm

0 10 20 30 40 50 µm

e)

c) d)

8

Fig 9: Immagini AFM in non-contact mode in aria di superfici microstrutturate con strisce di 50um a) e b) e con strisce di 5um c), d) e e). Le parti scure appartengono al substrato quelle gialle al polisaccaride.

Sample Pattern characteristics Width (μm) Separating space (μm) Step height (nm)

50μm 50.0±7.9 47.0±7,4 25.3±5.1 Hyal 25μm 25.8±3.1 23.5±2.9 31.8±1.2

5μm 4.1±0.2 4.7±0.1 22.0±3.8 Tab 5. Caratteristiche (larghezza, passo e spessore) delle superfici microstrutturate di Hyal/ PET-NH2 Le superfici microstrutturate su PET sono state inviate alle varie unità operative per i test biologici. Essenzialmente sono state distribuite microstrutture con strisce di 25um. Studio della risposta cellulare su superfici microstrutturate Hyal/PET-NH2 Endoteliali CVEC: Inizialmente sono stati ottenuti risultati discordanti sia sulle microstrutture sia sui substrati di controllo di PET-NH2. Le cellule aderivano solo al di fuori della zona microstrutturata sui bordi del dischetto, mentre sui substrati di PET alcune volte aderivano in scarso numero e mostravano una morfologia sofferente, altre aderivano in numero elevato e con una morfologia simile a quella delle cellule adese sulle piastre petri per coltura. Gli esperimenti hanno evidenziato un comportamento cellulare simile a quello osservato per altri tipi cellulari sulle stesse microstrutture: le cellule si dispongono lungo i domini del substrato evitando il polisaccaride. In Fig 10 sono riportate immagini al microscopio ottico di cellule endoteliali allineate sulle microstrutture. Sono stati condotti esperimenti finalizzati a valutare l’organizzazione delle fibre di actina, attraverso la marcatura con falloidina fluorescente, ma l’autofluorescenza del substrato di PET impedisce di ottenere delle immagini chiare al microscopio a fluorescenza.

PET-NH2 PET-NH2Hyal 2ggPET-NH2PET-NH2 PET-NH2Hyal 2ggPET-NH2Hyal 2gg

Fig 10: Immagini al microscopo ottico (10X) di CVEC su microstrutture di PET-NH2/Hyal. Condrociti e cellule staminali: Si osserva lo stesso comportamento delle cellule endoteliali.(vedi Fig 11a, 11b). Nel caso dei condrociti dopo 4 giorni si notano i tipici cluster di cellule.

9

a) b)

Fig 11: Microscopia ottica di cellule a) staminali b) condrociti su microstrutture di PET-NH2/Hyal. Le cellule si dispongono lungo i domini di PET. Fibroblasti embrionali di topo 3T3: Sul substrato di PET-NH2 si osservano cellule disposte in modo random con una morfologia simile a quella fisiologica. Sulle microstrutture si osservano le cellule allineate sui domini del substrato con la stessa disposizione osservata per gli altri tipi celulari impiegati (vedi Fig 12).

a) b) c) Fig 12: Immagini al microscopio ottico di fibroblasti adesi su a) substrato di controllo PET-NH2 , b) superfici microstrutturate di PET-NH2/Hyal e c) microscopia a fluorescenza di fibroblasti sulle superfici microstrutturate (actina staining) Fibroblasti umani primari (isolati da biopsie di derma): Sul substrato di controllo PET-NH2 le cellule sono distribuite random, con buona morfologia simile al controllo delle piastre petri. Sulle microstrutture presentano lo stesso comportamento osservato per gli altri tipi cellulari. L’actina si dispone in filamenti paralleli alla direzione delle microstrutture sia sulle strisce con una larghezza di 50μm che 25μm (vedi Fig 13). Sulle strisce larghe 50μm le cellule si dispongono su più file parallele, mentre su quelle larghe 25 μm si dispongono singolarmente all’interno del dominio del substrato. Questo ovviamente dipende dalle dimensioni del tipo cellulare impiegato.

50μm50μm

50μm50μm50μm50μm

Fig 13: Microscopia fluorescenza di fibroblasti allineati su superfici microstrutturate PET-NH2/Hyal dopo 24h di coltura (actina staining).

10

L’analisi SEM ha evidenziato la stessa disposizione delle cellule con una crescita lungo i domini di PET evitando le strutture di Hyal (vedi Fig 14).

Fig 14: Microscopia elettronica a scansione di fibroblasti su una superficie microstrutturate di PET-NH2/Hyal dopo 48h di coltura. Condrociti ovini:

microstrutture di Hyal su PET-NH2 aventi una larghezza di 25 e 5μm e con uno spessore di circa 50nm

superficie di controllo PET-NH2 superficie PET-NH2 con coating omogeneo di Hyal

Lo scopo dell’esperimento è stato valutare le capacità differenziative di condrociti coltivati su superfici microstrutturate a base di Hyal. E’ noto che i condrociti coltivati in un monostrato dopo qualche giorno perdono carattere del loro fenotipo e si sdifferenziano. Questo risulta essere uno dei principali problemi delle colture in vitro di condrociti, quindi superfici con proprietà chimiche e/o topografiche in grado di ridurre tale fenomeno potrebbero essere di notevole interesse nel settore dell’ingegneria dei tessuti. Per questo motivo le superfici microsturrurate a base di Hyal sono state impiegate come supporti per la coltura in vitro di condrociti. La cartilagine articolare è stata prelevata dalla superficie articolare tra femore ginocchio di pecore (Mongrel sheep). I condrociti sono stati isolati tramite digestione enzimatica con collagenasi II con l’aggiunta dello 0.25% di tripsina. Le cellule sono state coltivate in terreno di cultura Ham’s F12 con l’aggiunta del 10% di siero fetale bovino (FCS) e 1% di streptomicina e penicillina fino al momento della semina sulle microstrutture. Le superfici sono state “sterilizzate” in etanolo al 70% per 10min e poi lasciate asciugare sotto cappa a flusso laminare. Per ogni campione (Hyal/ PET-NH2 microstrutture 25 e 5μm, superfici di PET-NH2 e superfici di Hyal omogeneo) sono state seminate 2x104 cellule in 100μl di terreno di coltura. Lo stesso numero di condrociti è stato seminato su TCPS utilizzato come controllo interno. Sono stati aggiunti 900ul di terreno in modo da avere un volume totale di 1ml per campione. Il comportamento cellulare è stato monitorato per 14 giorni. A diversi tempi sperimentali (3, 7 e 14 giorni) il surnatante è stato prelevato per effettuare il dosaggio di diversi fattori: Inteleuchina I, aggregano, pro-collagene tipo II, metallo proteinasi 1, metallo proteinasi 13, transforming growth factor ß1 (TGF-ß1), catepsina B. Le concentrazioni misurate nel surnatante sono state normalizzate secondo il numero delle cellule. L’analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il software SPSS/PC+ statistic TM 7.5. I dati riportati sono espressi come medie ± deviazione standard a un livello di significatività p<0.05. In Fig 15 sono riportate immagini al microscopio ottico dei condrociti adesi sulle superfici microstrutturate di Hyal / PET-NH2 a diversi tempi.

11

Fig 15: Immagini al microscopio ottico di condrociti su: a) d) g) superfici microstrutturate di Hyal/ PET-NH2 con strisce larghe 25μm e b) e) h)superfici microstrutturate di Hyal/ PET-NH2 con strisce larghe 5μm c, f), i) su superfici di controllo di PET-NH2. a) b) c) dopo 3 giorni, d )e) f) dopo 7 giorni g) h) i) dopo 14 giorni. Dopo 14 giorni le cellule sono state fissate e colorate con la safranina. Sulle superfici di controllo di PET-NH2 le cellule aderiscono e mostrano una buona morfologia simile però più simile ai fibroblasti che ai condrociti. Sulle superfici microstrutturate i condrociti rispondono alla presenza delle strutture allineandosi lungo i domini del substrato di PET-NH2 evitando i domini del polisaccaride. Dopo 7, ma soprattutto dopo 14 giorni si nota la presenza dei tipici clusters dei condrociti che si dispongono a gruppi occupando più microstrutture adiacenti. La stessa situazione si osserva quando i condrociti sono coltivati su microstutture con strisce larghe 5μm. Sui coating omogenei di Hyal non si nota un adesione cellulare. Lo stesso risultato si ottiene anche utilizzando altri tipi cellulari. In Fig 16 (a-h) sono riportati i grafici sui dosaggi immunoenzimatici e sui test biochimici.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

3 7 14

DAY S

HYAL 25/PET HYAL 5/PET PET

*

**

**

a)

12

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

3 7 14

DAYS


b)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

3 7 14

DAY S


c)

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

3 7 14

DAY S


d)

13

0

1

2

3

4

5

3 7 14

DAY S


*

e)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

3 7 14

DAY S


***

c

f)

0

1

2

3

4

5

6

3 7 14

D A Y S


**

**

g)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

3 7 14

DA YS


*

**

*

h)

14

Fig 16: Sui grafici sono riportati i valori normalizzati dei vari fattori dosati sui condrociti coltivati sulle superfici microstrutturate di Hyal/PET-NH2 con strisce di 25 e 5μm. Il PET-NH2 èusato come controllo positivo. a) cell proliferation assay, b) interleuchina I, c) metallo proteinasi 1, d) metallo proteinasi 13 e) catepsina B, f) aggrecan g) procllagene type II, h) transforming growth factor ß. (Le differenze sono significative per * p<0.05). I condrociti sulle microstrutture di 25μm presentano un’alta proliferazione se comparati con i condrociti seminati sulle microstrutture di 5μm e sulle superfici di controllo di PET-NH2. I risultati sui dosaggi delle metallo proteinasi 1, metallo proteinasi 13 e interleuchina non mostrano differenze significative tra le varie superfici. La catepsina b è stata dosata per verificare se le microstrutture sono in grado di ri-differenziare i condrociti in quanto fornisce indicazioni sulla stabilità del fenotipo: livelli alti di catepsina indicano che la cellula è sdifferenziata, mentre bassi valori indicano che la cellula è differenziata. E’ stato dimostrato che alti livelli di catepsina sono prodotti da condrociti cresciuti in un monostrato. Dopo 14 giorni i valori della catepsina delle cellule coltivate sulle microstrutture (sia 25μm che 5μm) sono significativamente più bassi in confronto al substrato di controllo. Questo significa che le microstrutture sono in grado di indurre la differenziazione dei condrociti. Per quanto riguarda l’aggrecano, e il collagene di tipo II componenti principali della matrice extracellulare non si notano differenze significative tra i vari substrati dopo 3 e 7 giorni. Invece, dopo 14 giorni, sia l’aggrecano sia il collagene di tipo II hanno un valore più alto sulle superfici microstrutturate rispetto al controllo. I livelli di aggrega e di collagene sono notevolmente più bassi se le cellule crescono in monostrato cioè quando perdono il loro fenotipo differenziandosi in fibroblasti. Anche il TGF-ß1 presenta un valore più alto sulle microstrutture. Le superfici microstrutturate a base di Hyal non inducono citotossicità e promuovono la proliferazione, la migrazione e la re-differenziazione di condrociti. Conclusioni: Sono state preparate e caratterizzate con una buona riproducibilità superfici microstrutturate a base di acido Ialuronico su supporti di PET. Per tutte le linee cellulare testate le microstrutture si sono dimostrate efficaci nel guidare la risposta e la crescita cellulare. In particolare le cellule aderiscono e si orientano esclusivamente lungo i domini del substrato evitando quelli del polisaccaride. Il risultato piu promettente è stato lo studio riguardante i condrociti. In questo studio è stata sottolineata l’importanza delle superfici microstrutturate nell’influenzare il comportamento dei condrociti, evidenziando che microstrutture di Hyal con strisce di 25 e 5μm sono in grado di preservare il fenotipo dei condrociti. Al contrario quando le stesse cellule sono coltivate su superfici non microstrutturate di PET trattato ai plasmi di ammoniaca si differenziano e assumono la forma tipica dei fibroblasti. Questo risultato incoraggia una possibile applicazione di tali superifici microsrutturate per la riparazione della cartilagine in vivo. Superfici microstrutturate a base di Hyal su supporti di PET/C Caratterizzazione del substrato Il carbonio pirolitico si è dimostrato uno dei migliori biomaterali per il settore cardiovascolare. La sua inerzia e la bassa adesione piastrinica o rendono uno dei materiali più emocompatibili in commercio. La ditta Sorin ha sviluppato un metodo per la deposizione di C da un target. (i dettagli del processo sono riservati e non riportati in letteratura). Lo strato di C depositato ha uno spessore medio di 0.3-0.5μm.

15

-XPS e WCA La panoramica dello spettro XPS e le bande risolte per il C(1s) e O(1s) sono riportati in Fig. 17a e b, mentre le energie di legame l’assegnazione dei picchi principali sono riportati in Tab 5.

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Na 1s

O 1s

C 1s

Binding Energy (eV)

CarbofilmTM/PET

Inte

nsity

a.u.

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Na 1s

O 1s

C 1s

Binding Energy (eV)

CarbofilmTM/PET

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Na 1s

O 1s

C 1s

Binding Energy (eV)

CarbofilmTM/PET

Inte

nsity

a.u.

a) spettro panoramica

300 295 290 285 280

Model: Gauss Chi^2 = 974.87107R^2 = 0.99695 xc1 284.48377w1 1.5A1 4332.87846xc2 286.433w2 1.5A2 732.31711xc3 288.57294w3 1.5A3 302.44407

Inte

nsity

(a.u

.)

BE (eV)

C 1s

545 540 535 530 525

Model: Gauss Chi^2 = 3351.54648R^2 = 0.96897 xc1 531.9353w1 1.5A1 1665.47994xc2 533.25312w2 1.5A2 1184.79846

O 1sC-C

-C-O-C=O

C-O-C

O=C-

300 295 290 285 280


Inte

nsity

(a.u

.)

BE (eV)

C 1s

545 540 535 530 525


O 1sC-C

-C-O-C=O

300 295 290 285 280


Inte

nsity

(a.u

.)

BE (eV)

C 1s

545 540 535 530 525


O 1s

300 295 290 285 280


Inte

nsity

(a.u

.)

BE (eV)

C 1s

545 540 535 530 525


O 1s

300 295 290 285 280


Inte

nsity

(a.u

.)

BE (eV)

C 1s

545 540 535 530 525


O 1sC-C

-C-O-C=O

C-O-C

O=C-

b) spettri ad alta risoluzione

Fig 17: a) spettri panoramico XPS di PET ricoperto con C pirolitico, b) spettri ad alta risoluzione del picco dell’O(1s) e del C(1s)

Element Orbital Assignment Binding Energy (eV) Sodium Na 1s Na

Carbon C 1s(1) C 1s(2) C 1s(3)

CH2, CH3 C-C C=O C-O

285.0 288.5 286.5

Oxygen O 1s(2) O 1s(2)

O=C C-O-C

532.0 534.0

La composizione chimica quantitativa di superficie del PET/C così come il valore del WCA è riportata in Tab 6. Come riferimento, la composizione chimica e il valore di WCA del PET nativo sono riportati nella stessa tabella.

16

Sample %C %O %Na WCAPET/ CarbofilmTM 89.2 10.0 0.8 67±4°Native PET 73.5 26.5 ---- 72±3°

Tab 6: Composizione chimica ( intensity (%) delle superfici di PET/C for e di PET nativo. I valori di WCA sono riportati nella colonna a destra.

∑= %)100

Il componente principale è ovviamente il C. La presenza dell’O (10%) proviene da uno stato ossidato del C (rivelato come carbossilati o gruppi carbonilici). Parte dell’O può provenire anche da contaminanti di superficie. Il valore dell’angolo di contatto indica che la superficie è piuttosto idrofobica, il valore è simile a quello delle superfici di PET nativo.. -analisi ToF-SIMS Lo strato superficiale è stato investigato tramite ToF-SIMS. La chimicadi superficie del PET nativo (Good Fellow) è stata presa come riferimento. In Tab 11 sono riportati i picchi principali e la loro assegnazione. I picchi a 103, 115, 128, 152, 165, 178 m/z sono i tipici del polistirene. Le tracce di polistirene derivano dal processo di fabbricazione in quanto una volta che pezzi da 10x10cm2 of PET sono stati ricoperti da C, sono stati tagliati in pezzi più piccoli da un macchinario che ha parti in polistirene. La presenza di picchi a 104, 105 and 191 m/z attribuibili al PET evidenziano che il coating di C non è omogeneo. Diversi graffi sono presenti sulla superficie attraverso cui si ha il passaggio di luce quando osservati al microscopio ottico.

Peak (m/z) Molecular fragment assignment 23 Na+

53 C4H5+

55 C4H7+

57 C4H9+

104 . C6H4-C≡O+

105 C6H4-C≡O+

191 Monomeric PET unit -H 103, 115,128,152,165, 178 Polystyrene molecular fragments

Tab 7: Valori sperimentali (m/z) e assegnazione dei picchi principali di una superficie di PET/C. -Analisi AFM La topografia di superficie e la rugosità sono state valutate tramite AFM. Le immagini topografiche e quelle in lateral force mode (LFM) (advancing and receding) sono riportate in Fig 18 e Fig 19.

a) b) Fig 18: Immagini AFM di due are diverse della stessa superficie di PET/C. Scan size 5x5μm2.

17

a)

b)

a)

b)

Fig 19: Immagini AFM in LFM di due are diverse della stessa superficie di PET/C. Scan size 5x5μm2. I parametri di rugosità Ra e Rq (or RMS) sono stati calcolati con l’aiuto del SPLM-Lab software (version 5.01) su misure effettuate su cinque aree casuali per ogni campione (numero dei campioni per tipo = 3). Il valore di Ra è 45.2±10.2 nm e di Rq è 54.9±12.8nm. Quindi la superfcie del carbonio pirolitico risulta molto rugosa se paragonata a quela del substrato di PET nativo che molto più bassa (Ra 5.2±1.0nm, Rq 7.9±1.4nm). Confrontando le immagini topografiche e quelle effettuate in LFM possono essere notate alcune differenze indici del fatto che la topografia di superficie del materiale non riflette la sua composizione chimica: alcuni segni presenti nell’immagine topografica non sono presenti in quella ottenuta per LFM e viceversa. Caratterizzazione delle superfici microstrutturate: Le microstrutture sono state caratterizzate mediante analisi AFM. Le microstrutture hanno una geometria con strisce aventi una larghezza di 25μm e uno spessore di 30nm. Essendo il substrato molto rugoso non è stato possibile ottenere immagini con una buona risulzione tramite AFM. Di seguito è riportata, come esempio, un’ immagine SEM di una superficie microstrutturata di Hyal/PET/C.

Fig 20: Immagine SEM di una superficie mirostrutturata Hyal/PET/C. con strisce di 25 μm.

18

Studio della risposta cellulare su superfici microstrutturate Hyal/PET/C E’ stato studiato il comportamento di fibroblasti primari umani e di cellule endoteliali del microcircolo (CVEC) sulle superfici precedentemente caratterizzate con strisce aventi una larghezza di 25μm e uno spessore di 30nm. Fibroblasti primari: I fibroblasti sono stati isolati da biopsie di derma e coltivati in Dulbecco’s Eagle Modified Medium (DMEM) con l’aggiunta del 10% di FCS e 1% di penicillina –streptomicina fino al momento della semina sui campioni. Sono state seminate 15000 cellule in 100ul di medium per ogni campione. Dopo che le cellule sono adese, 900ul di DMEM sono stati aggiunti in modo da avere un volume totale di 1ml di terreno per campione. Dato che i campioni non sono trasparenti si sono riscontrate notevoli difficoltà per monitorare il comportamento cellulare durante l’esperimento. Le cellule sono state fissate a tempi diversi (24, 48 e 72h) con glutaraldeide al 2.5% per l’analisi morfologica con la microscopia elettronica a scansione. L’esperimento è stato ripetuto più volte ottenendo risultati tra loro discordanti. In genere si può affermare che le cellule aderiscono con difficoltà sia sulle superfici omogenee di C pirolitico sia sulle superfici microstruttrate a base di acido ialuronico. In Fig 21 sono riportate immagini al microscopio ottico di fibroblasti su superfici omogenee e microstrutturate di PET/C pir. Le cellule mostrano una morfologia rotondeggiante indice di sofferenza e scarsa affinità per la superficie.

PET/Cpir PET/Cpir-Hyal 25μm Petri

PET/Cpir PetriPET/Cpir-Hyal 25μm

PET/Cpir PET/Cpir-Hyal 25μm Petri

PET/Cpir PetriPET/Cpir-Hyal 25μm

Fig 20: Immagini al microscopio ottico di fibroblasti su superfici omogenee e microstrutturate di PET/C.(ingrandimento originale 40x).

Endoteliali CVEC: Per quanto riguarda il comportamento delle cellule endoteliali su superfici microstrutturate e non, sono stati ottenuti risultati concordarti con quelli ottenuti su specifici microstrutturate e non su supporti di PET trattato ai plasmi di ammoniaca. Dai primi esperimenti risulta che le cellule aderiscono e si allineano esclusivamente lungo le microstrutture di PET/C evitando le zone ricoperte dal polisaccaride. Lo stesso tipo di comportamento era stato già osservato per la stessa linea cellulare su superfici microstrutturate di PET trattato ai plasmi di ammoniaca. Sono state marcate la β-actina e la tubolina due proteine strutturali del citoscheletro al fine di evidenziare la risposta delle fibre di stress in presenza di superfici con una geometria definita dell’ ordine dei micron. In fig 21 sono riportate le immagini al microscopio a fluorescenza che evidenziano la disposizione delle fibre del citoscheletro. Le cellule adattano la morfologia del citoplasma secondo la geometria e la larghezza delle microstrutture. Sono stati effettuati diversi

19

tentativi per monitorare il comportamento delle cellule in cultura tramite time lapse microscopy, ma si sono verificati problemi di adesione cellulare sia su superfici microstrutturate che sul substrato nativo di PET/C. Inoltre sono state marcate le integrine di membrana per valutare se l’adesione al substrato fosse specifica o aspecifica. Non è stata osservata l’espressione di integrine di membrana quindi si può dedurre che l’adesione segue un meccanismo di tipo aspecifico (per approfondimenti vedi relazione UniSi- Prof Ziche) β-actina

a) b) tubulina

c) d) Fig 21: Immagini al microscopio a fluorescenza di cellule endoteliali su a) e c) PET/ C; b) e d) su superfici microstrutturate di Hyal- PET/ C 25μm. Conclusioni: Il comportamento cellulare su superfici omogenee e microstrutturate di PET/C pir ha evidenziato risultati discordanti sia per quanto riguarda i fibroblasti umani. Le cellule aderiscono con difficoltà e in basso numero anche sul substrato nativo. Per quanto riguarda lo studio del comportamento cellulare di cellule endoteliali è stato osservato che le cellule aderiscono e proliferano esclusivamente lungo i domini del substrato evitando il polisaccaride. Tale tipo di risposta era del tutto prevedibile in quanto è noto da letteratura che il C pirolitico è un buon supporto per l’adesione delle cellule endoteliali mentre lo Hyal risulta essere antiadesivo come anche osservato nel corso degli esperimenti effettuati su superfici microstrutturate di Hyal/PET-NH2. Le cellule endoteliali adese anche dopo 4 o 7 giorni mantengono la capacità di esprimere le proteine della matrice e durante la fase di adesione seguono un meccanismo aspecifico.

20

Superfici microstrutturate a base di Hyal su vetri con diversa composizione chimica Caratterizzazione chimica e morfologica dei substrati di vetro Tipi di vetro:

• vetrino portaoggetti • vetro sodo calcico • vetro al quarzo

La composizione chimica dei vari tipi di substrato è stata fornita dalla ditta Calp. - Vetrino portaoggetti:

Elemento % Peso Formula Na 2.30 Na2O Al 1.29 Al2O3Si 43.77 SiO2K 0.46 K2O S 0.11 SO3O 52.07 Totale 100.00

- Vetro sodico-calcico

% Peso Formula SiO2 71.3% K2O 1.5% Na2O 13.5% CaO 9.0% MgO 2.0% Al2O3 1.4% BB2O3 0.8% Sb2O3 0.3% SO3 0.2%

- Vetro quarzo

SiO2 95%

Analisi AFM dei substrati di vetro- Misura della rugosità: Le misure sono state effettuate in aria in contact mode con scan size 5x5μm2. La rugosità è stata misurata utilizzando il SPLM lab software in 3 differenti aree del campione (scan size 5x5μm2) per n=3 campioni per tipo. Vetrino portaoggetti:

21

Rugosità media Ra= 6.30±1.7nm RMS=9.44±2.9nm Vetro sodo calcico

Rugosità media Ra=3.38±0.5nm RMS=4.82±1.0 nm Vetro al quarzo

Rugosità media Ra=3.35±0.4nm RMS=6.54±1.1nm Per realizzare le microstrutture di Hyal sulle superfici di vetro è necessario attivare la superficie con un processo di amminosilanizzazione finalizzato all’inserimento di gruppi NH2 sulla superficie. In seguito al trattamento, la chimica di superficie dei diversi tipi di vetro risulta identica. Il processo di amminosilanizzazione non induce una significativa variazione della rugosità di superficie. Di seguito è riportato il protocollo seguito per effettuare il processo di amminosilanizzazione. I: Pulizia delle superfici

a) immergere i vetrini nella soluzione di Caro (H2SO4/H2O2 1.1 vol/vol) per 20min a t.a. b) sciacquare i vetrini in acqua distillata c) immergere i vetrini in una soluzione 0.5M di NaOH per 20min a t.a. d) sciacquare i vetrini in acqua distillata e) asciugare con flusso di azoto

II: processo di silanizzazione

a) immergere i vetrini in una soluzione 1% di 3-ammino-propiltrimetossisilano in etanolo aceticopH=5

b) sciacquare i vetrini etanolo assoluto c) sciacquare i vetrini in acqua distillata d) conservare in acqua fino al momento del loro utilizzo Il vetro amminosilanizzato è riportato come vetro-NH2. La composizione chimica di superficie prima e dopo il processo è stata investigata tramite analisi XPS.

22

- Analisi XPS

Gli spettri panoramici di una superficie di vetro nativo, una superficie di vetro pulita e dpoil trattamento di amminosilanizzazione sono riportati in Fig 22. La composizione atomica percentuale ed i valori WCA sono riportati in Tab 8. La superficie di vetro nativo contiene Si, O, Na, K e C che proviene da contaminanti atmosferici. Il processo di pulizia si è dimostrato efficace in quanto la quantità di C e N sulla superficie pulita è significativamente inferiore rispetto al substrato nativo. Dopo il trattamento di silanizzazione una quantità di N pari al 2.5% è stata trovata sulla superficie indice del fatto che il trattamento ha indotto l’inserimento di un numero basso di gruppi -NH2 sulla superficie.Nonstante la bassa densità di gruppi amminici, la superficiè è notevolmente idrofilia; si ha un notevole abbassamento del valore del WCA rispetto alla superficie pulita e nativa (vedi Tab 8.) Il numero dei gruppi amminici

Survey [R3,1]

O K

LL

Na

KLL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

CPS

1000 800 600 400 200Binding Energy (eV)

O(1

s)

K(2

s)

C(1

s)K

(2p)

Si(2

s)

Si(2

p)

Na(

1s)

Survey [R3,1]

O K

LL

Na

KLL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

CPS


O(1

s)

K(2

s)

C(1

s)K

(2p)

Si(2

s)

Si(2

p)

Na(

1s)

a) superficie di vetro nativa

Survey [R3,1]

O K

LL

Na

KLL

O K

LL

Na

KLL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

CPS


O(1

s)

Si(2

s)

Si(2

p)

C(1

s)K

(2s)

Survey [R3,1]

O K

LL

Na

KLL

O K

LL

Na

KLL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

CPS


O(1

s)

Si(2

s)

Si(2

p)

C(1

s)K

(2s)

b) superficie di vetro pulita

23

Survey [R3,1]

O K

LL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CPS


O(1s)

N(1

s)

C(1

s)K(

2p)

Si(2

s)

Si(2

p)N

aKLL

K(2s

)

Survey [R3,1]

O K

LL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CPS


O(1s)

N(1

s)

C(1

s)K(

2p)

Si(2

s)

Si(2

p)N

aKLL

Survey [R3,1]

O K

LL

x 103

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CPS


O(1s)

N(1

s)

C(1

s)K(

2p)

Si(2

s)

Si(2

p)N

aKLL

K(2s

)

c) superficie di vetro silanizzata glass-NH2Fig 22: Spettri XPS panoramica di una superficie di vetro native a), di una superficie di vetro pulita b) e di una superficie silanizzata c).

Sample C(1s) O(1s) Si(2p) Na(1s) K(2p) N(1s) WCA Native glass 14.4 60.1 10.1 10.0 3.4 -- 42±3° Cleaned glass 1.7 81.3 12.1 2.3 2.6 -- ----- Glass-NH2 2.9 78.0 12.1 2.6 2.3 2.1 27±2°

Tab 8: Composizione atomica percentuale (∑= %)100 intensity (%))di una superficie di vetro nativa, di una superficie di vetro pulita e di una superficie silanizzata. I valoro di WCA sono espresso come media±s.d. di tre misure per campione (il numero di campioni per tipo è = 3) Studio del comportamento cellulare di condrociti su:

microstrutture di Hyal su vetro-NH2 aventi una larghezza di 25μm e uno spessore di circa 30nm

superficie di controllo vetro-NH2 microstrutture di Hyal su quarzo-NH2 aventi una larghezza di 25μm e uno spessore di circa

30nm superficie di controllo quarzo-NH2

Si tiene a precisare che la chimica di superficie dei diversi tipi di vetro è identica. Lo scopo dell’esperimento è stato valutare le capacità differenziative di condrociti coltivati su superfici microstrutturate a base di Hyal. E’ noto che i condrociti coltivati in un monostrato dopo qualche giorno perdono carattere del loro fenotipo e si sdifferenziano. Questo risulta essere uno dei principali problemi delle colture in vitro di condrociti, quindi superfici con proprietà chimiche e/o topografiche in grado di ridurre tale fenomeno potrebbero essere di notevole interesse nel settore

24

dell’ingegneria dei tessuti. Per questo motivo le superfici microstutturate a base di Hyal sono state impiegate come supporti per la coltura in vitro di condrociti. La procedura sperimentale adottata è la stessa precedentemente utilizzata per lo studio del comportamento e l’espressione dei markers dei condrociti coltivati su superfici microstruturate di Hyal/PET-NH2. Il comportamento cellulare è stato monitorato per 14 giorni. Sulle superfici di controllo di vetro-NH2 e quarzo-NH2 le cellule aderiscono e mostrano una buona morfologia simile però più simile ai fibroblasti che ai condrociti. Sulle superfici microstrutturate i condrociti rispondono alla presenza delle strutture allineandosi lungo i domini del substrato evitando i domini del polisaccaride. Dopo 7, ma soprattutto dopo 14 giorni si nota la presenza dei tipici clusters dei condrociti che si dispongono a gruppi occupando più microstrutture adiacenti. Lo stesso comportamento compresa la presenza di cluster di cellule era stato osservato per i condrociti seminati su superfici microstrutturate di PET trattato ai plasmi di ammoniaca. Sui coating omogenei di Hyal non si nota, come al solito, adesione cellulare. A diversi tempi sperimentali (3, 7 e 14 giorni) il surnatante è stato prelevato per effettuare il dosaggio di diversi fattori: Inteleuchina I, aggregano, pro-collagene tipo II, metallo proteinasi 1, metallo proteinasi 13, transforming growth factor ß1 (TGF-ß1), catepsina B. Le concentrazioni misurate nel surnatante sono state normalizzate secondo il numero delle cellule. L’analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il software SPSS/PC+ statistic TM 7.5. I dati riportati sono espressi come medie ± deviazione standard a un livello di significatività p<0.05. Di seguito sono riportati i tre markers più significativi: la catepsina B, l’aggrecano e il collagene di tipo II (vedi Fig 23a-c).

a) 3 e 7 giorni: differenze non significative 14 giorni: V+H e Q+H con p< 0.0001 versus Q e V

25

b) 3 giorni: differenze non significative 7 giorni: V+H p< 0.05 versus V e Q; V+H e Q+H con p< 0.0001 versus Q e V 14 giorni: V+H e Q+H con p< 0.0001 versus Q e V

c) 3 e 7 giorni : differenze non significative 14 giorni: V+H con p< 0.05 versus Q e V, Q+H con p< 0.001 versus Q e V Fig 23: Sui grafici sono riportati i valori normalizzati dei vari fattori dosati sui condrociti coltivati sulle superfici microstrutturate di Hyal/vetro-NH2 e Hyal/quarzo-NH2 con strisce di 25μm. I substrati non microstrutturati sono utilizzati come controllo positivo. a) catepsina b) aggregano c) collagene di tipo II. (Le differenze sono significative per * p<0.05). Legenda: V= vetro-NH2, Q= quarzo-NH2, V+H= Hyal/vetro-NH2, Q+H= Hyal/quarzo-NH2. La catepsina B è stata dosata per verificare se le microstrutture erano in grado di ri-differenziare i condrociti in quanto fornisce indicazioni sulla stabilità del fenotipo: livelli alti di catepsina indicano che la cellula è sdifferenziata (fibroblast-like cell), mentre bassi valori indicano che la cellula è differenziata (real chondrocyte). E’ stato dimostrato che alti livelli di catepsina sono prodotti da condrociti cresciuti in un monostrato. Dopo 14 giorni i valori della catepsina espressi da cellule

26

coltivate sulle microstrutture erano significativamente più bassi in confronto al substrato di controllo. Questo significa che le microstrutture sono in grado di indurre la re-differenziazione dei condrociti. Per quanto riguarda l’aggrecano, e il collagene di tipo II componenti principali della matrice extracellulare, non si notano differenze significative tra i vari substrati dopo 3 giorni. Invece, dopo 7 giorni si hanno differenze significative per i valori dell’aggrecano che risultano più alti nelle cellule coltivate sulle superfici microstrutturate , mentre le differenze relative al collagene di tipo II non sono significative tra i vari substrati. Dopo 14 giorni, sia l’aggrecan sia il collagene di tipo II hanno un valore più alto sulle superfici microstrutturate rispetto al controllo. I livelli di aggregano e di collagene sono notevolmente più bassi se le cellule crescono in monostrato cioè quando perdono il loro fenotipo differenziandosi in fibroblasti. I risultati sono in linea con quanto era stato precedentemente ottenuto per i condrociti coltivati su superfici microstrutturate e di PET trattato ai plasmi di ammoniaca. Test in vivo Sono stati impiantate superfici microstrutturate di Hyal/vetro-NH2 e Hyal/quarzo-NH2 con strisce aventi una larghezza di 25μm e uno spessore di 30nm in tasche paravertebrali nel tessuto cutaneo di ratti per valutarne la risposta infiammatoria. Substrati non microstrutturati di vetro (vetro-NH2) e di quarzo (quarzo-NH2) sono stati utilizzati come controllo. Dopo 4 settimane i campioni sono stati espiantati e le biopsie sottoposte ad analisi istologica. Come parametri della risposta infiammatoria è stato preso in esame lo spessore della capsula fibrosa formatasi in seguito all’espianto e il numero di vasi neoformati che dimostrano l’apporto di sangue. In tabella III sono riportati i risultati espressi come media per le superfici microstrutturate e le superfici di controllo.

Hyal/ vetro-NH2 vetro-NH2 Hyal/ quarzo-NH2 quarzo-NH2Spessore capsula

(μm) 44.4 43.6 88.7 58.4

Densità vasi (n/mm2) 5.06 3.70 5.05 3.47

Dopo 4 settimane le biopsie presentano una sottile capsula di tessuto fibroso che però non risulta tale da mostrare necrosi o risposta infiammatoria. La densità dei vasi neoformati in seguito all’impianto della superficie non evidenzia differenze significative tra le superfici microstrutturate e le superfici

Conclusioni: Superfici microstrutturate di Hyal aventi strisce con una larghezza nell’ordine dei micron (25 μm e 5μm) sono in grado di preservare il fenotipo dei condrociti indipendentemente dal tipo di substrato impiegato (PET trattato ai plasmi di ammoniaca, quarzo amminosilanizzato o vetro amminosilanizzato). Bisogna però considerare che la chimica del substrato è simile in quanto sia il trattamento al plasma che il processo di amminosilanizzazione inducono l’inserimento di gruppi –NH2 sulla superficie anche se in una percentuale diversa. Da analisi XPS risulta che la percentuale di azoto sul vetro amminosilanizzato è molto bassa (inferiore al 5%), mentre sul PET trattato ai plasmi di ammoniaca è intorno al 20%. Sui substrati non microstruttrati le cellule si de-differenziano e assumono la forma tipica dei fibroblasti. Quindi l’effetto di costrizione meccanica indotto dalle microstrutture di Hyal antiadesive per i condrociti, sembra il principale responsabile della morfologia delle cellule e dell’espressione dei marker biochimici e quindi del mantenimento del loro fenotipo. Questi risultatati hanno incoraggiato una possibile applicazione di tali superfici microsrutturate per la riparazione della cartilagine in vivo. Per questo motivo è stato deciso di realizzare superfici microstrutturate su materiali riassorbibili come il PLA più idonei per i test pre-clinici.

27

28

Preparazione di superfici microstrututrate a base di Hyal su polimeri bioriassorbibili: Acido polilattico Lo scopo dello studio riguardava la realizzazione di superfici microstrutturate a base di polisaccaridi su supporti riassorbibili quali l’acido polilattico con il fine di impiegarli come dispositivi per la riparazione della cartilagine in vivo. Sono stati effettuati una serie di tentativi per fotoimmobilizzare l’acido ialuronico su film di acido polilattico. La bagnabilità dell’acido polilattico è molto bassa (i valori dell’angolo di contatto (WCA) riportati in letteratura variano da 70-80° ). La fotoimmobilizzazione su superfici poco idrofiliche come il PET o il PE risulta difficile e soprattutto scarsamente riproducibile. Non si ottiene mai un film omogeneo del polimero, piuttosto diversi spot di dimensioni e spessori variabili. Per questo sono stati necessari trattamenti per aumentare la bagnabilità di superficie come nel caso del PET sulla cui superficie sono stati inseriti via plasma gruppi amminici. Anche nel caso del PLA non è stato possibile aggraffare lo Hyal senza un pre-trattamento della superficie. Nell’ambito del progetto sono stati impiegati due tipi diversi di acido polilattico Acido poli-DL-lattico (PDLA) (racemo del poli-L e poli-D-lattico) Acido poli-L-lattico (PLLA) Caratterizzazione chimica e topografica dei substrati Pre-trattamento di superficie Per aumentare la bagnabilità del substrato la superficie è stata esposta alla radiazione UV (potenza della lampada 400W, distanza sorgente-campione 40cm) immersa in una soluzione di H2O2 (30% peso) per 1h. La superficie è stata poi risciacquata in abbondante acqua distillata.

• esposizione della superficie alla radiazione UV dopo immersione in Sono stati effettuati diversi tentativi variando il tempo di esposizione alla radiazione UV. In letteratura sono riportati dei lavori in cui l’esposizione alla luce UV viene effettuato per aumentare la bagnabilità di membrane o film di PLA il tempo di esposizione si aggira sui 40min. Le superfici pre-trattate sono state poi ricoperte con il polisaccaride fotoreattivo (HyalN3) con il processo di spin coating precedentemente descritto (condizioni operative: 100ul di una soluzione acquosa di HyalN3 1% per campione, velocità di spin: 2000rpm, tempo di spin: 30sec). Le superfici sono state irradiate con una lampada UV (Helios Italquarz GRE 400W, intervallo di λ: 200-320 nm) ad una distanza di 40 cm, per 20 sec. Per ottenere le microstrutture è stata utilizzata la maschera precedentemente descritta. Analisi XPS dei substrati L’analisi XPS è stata effettuata presso il Dip. di Ingegneria dei Materiali dell’università di Trento (Prof. Migliaresi). Non sono state riscontrate differenze di composizione chimica sui diversi tipi di PLA (PLLA e PDLA) né dopo l’esposizione alla radiazione UV. Bisogna considerare però che sui film sono state riscontrate tracce di (polidimetilsilossano) PDMS come contaminate di superficie. La presenza del contaminante potrebbe aver alterato l’analisi. Le stechiometrie del C e dell’O sono in accordo con i dati riportati in letteratura. Analisi AFM La topografia delle superfici prima e dopo il pre-trattamento è stata investigata mediante analisi AFM. Sono state effettuate anche misure di rugosità con la stessa metodica riportata per gli altri substrati. In Fig 24 sono riportate le immagini AFM di una superficie di PLLA.

29

a) b)

Fig 24: Immagini AFM (non contact mode, aria) : visione 3D a) visione 2D) b) di una superficie di PLLA Si evidenzia la presenza di “bumps” irregolari con un diametro medio di 20μm ed un altezza media di 5μm. In Fig 25 sono riportate le immagini AFM di una superficie di PLLA prima e dopo il pre-trattamento di esposizione alla luce UV in H2O2. E’ stata misurata la rugosità di superficie prima e dopo il pre-trattamento. Si ha una rugosità di superficie di circa 2nm. La piccola variazione che si nota (rugosità media del PDLA nativo Ra= 2.11±0.48nm; rugosità media del PDLA trattato Ra= 2.75 ±0.31nm) rientra nell’errore sperimentale, quindi il trattamento effettuato non induce una variazione della topografia di superficie.

a) b) Fig 25: Immagini AFM (non contact mode, aria) di una superficie di PDLA nativo a) e di PDLA trattato b). Caratterizzazione delle superfici microstrutturate In Fig 26 sono riportati immagini al microscopio ottico di una superficie microstrutturata di Hyal su PLLA dopo colorazione della superficie con blu di toluidina. Il colorante avendo un azoto quaternario positivo ha la capacità di legarsi ai gruppi carbossilato negativi del polisaccaride e non al substrato. Le strisce viola quindi appartengono al polisaccaride, sono evidenti i bumps del substrato di PLLA. Sono state effettuate delle prove di stabilità del pattern ponendo le superfici nelle stesse condizioni adottate per colture cellulari (incubazione in Dulbecco Modified Eagle’s Medium a 37°C, 5% di anidride carbonica, 85% aria). Anche dopo 12 giorni il pattern rimane inalterato come evidenziato in Fig 27. L’analisi AFM ha evidenziato la presenza di strisce con le stesse dimensioni in larghezza della fotomaschera 25μm e uno spessore di ~40nm (vedi Fig 28).

30

Fig 26: Immagini al microscopio ottico (ingrandimento originale 10X e 40X) di una superficie microstrutturata di Hyal/ PLLA 25μm (colorazione con blu di toluidina)

Fig 27: Immagine al microscopio ottico (ingrandimento originale 40X) di una superficie microstrutturata di Hyal/ PLLA 25μm dopo immersione in DMEM per 12 giorni (colorazione con blu di toluidina)

Fig 28: Immagine AFM (non contact mode, aria) di una superficie microstrutturata di Hyal/ PLLA con strisce di 25μm. Studio del comportamento cellulare su superfici microstrutturate di PLLA e PDLA Sono stati effettuati esperimenti preliminari per testare l’efficacia di tali superfici nel guidare il comportamento delle cellule. E’ stato osservato che fibroblasti si allineano lungo i domini del polilattico ed evitano le strisce del polisaccaride, quindi rispondo agli stimoli di superficie nello stesso modo delle superfici microstrutturate realizzate su supporti di PET e vetro. E’ stato studiato poi il comportamento di tali superfici nei confronti degli osteoblasti e dei condrociti. Bisogna considerare che tali superfici sono state preparate su supporti di acido polilattico, un polimero bioriassorbibile, proprio con il fine di ottenere superfici da impiegare come

a b

100μm 50μm

c

50μm

100μm

40nm

31

dispositivi per la riparazione in vivo della cartilagine. Infatti uno dei materiali più impiegati come scaffolds per la cartilagine è proprio l’acido polilattico. Condrociti: Lo scopo dell’esperimento è stato quello di valutare le capacità differenziative di condrociti quando coltivati su superfici microstrutturate a base di Hyal su un polimero bioriassorbibile. In questo caso le strutture sono state preparate su due tipi di acido polilattico che presentano differenze da un punto di vista topofgrafico: PLLA che presenta “bumps” con un diametro di 20um e PDLA che ha una superficie liscia (rugosità media ~2nm). Con la stessa metodica sono state preparate superfici con strisce larghe 25 e 5μm per valutare l’influenza della larghezza delle strutture che induce un diverso stress meccanico alle cellule. Il comportamento cellulare è stato monitorato per 14 giorni. La procedura sperimentale adottata è la stessa precedentemente utilizzata per lo studio del comportamento e l’espressione dei markers dei condrociti coltivati su superfici microstruturate di Hyal/PET-NH2 e di Hyal/vetro-NH2.. Sulle superfici di controllo (i due tipi di polilattico PLLA e PDLA) le cellule aderiscono e mostrano una buona morfologia simile però più simile ai fibroblasti che ai condrociti. Sulle superfici microstrutturate i condrociti rispondono alla presenza delle strutture allineandosi lungo i domini del substrato evitando i domini del polisaccaride. A diversi tempi sperimentali (3, 7 e 14 giorni) il surnatante è stato prelevato per effettuare il dosaggio di diversi fattori: Inteleuchina 6, aggregano, pro-collagene tipo II, metallo proteinasi 1, metallo proteinasi 13, catepsina B. Inoltre è stata valutazione sulle superfici dopo 24 h di coltura. Le concentrazioni misurate nel surnatante sono state normalizzate secondo il numero delle cellule. L’analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il software SPSS/PC+ statistic TM 7.5. I dati riportati sono espressi come medie ± deviazione standard a un livello di significatività p<0.05. Di seguito sono riportati i due markers più significativi per quanto riguarda la valutazione della capacità differenziativi delle cellule: la catepsina B, il collagene di tipo II. Inoltre è riportato il grafico dell’adesione cellulare (vedi Fig 24a-c).

NHAC Catepsin B

0

0,5

1

1,5

2

2,5

PDLLA PDLLA+HY5 PDLLA+HY25 PLLA PLLA+HY5 PLLA+HY25 CTR

CA

teps

B (n

g/m

l)

** ****

*

a)

* p<0.05 PLLAHY25 versus CTR; PDLAHY25 versus PDLA e PLLA ** p<0.01 PLLAHY5 versus CTR

32

NHAC Collagen type II

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


CP

II (n

g/m

l)

**

**

*

b)

* p<0.05 PDLAHY5, PDLAHY25, PLLAHY25 versus CTR, PLLA, PDLA ** p<0.01 PLLAHY5 versus CTR, PLLA, PDLA

24 h Cell Adhesion

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

100


% s

eede

d ce

lls (2

0.00

0/w

ell)

** *****

c)

** p<0.01 PDLAHY25, PLLAHY25 versus PDLA, PDLAHY5, PLLA, PLLAHY5 *** p<0.001 CTR versus PDLA, PDLAHY5, PLLA, PLLAHY5

33

Fig 24: Sui grafici sono riportati i valori normalizzati dei vari fattori dosati sui condrociti coltivati sulle superfici microstrutturate di Hyal/PLLA e Hyal/PDLA con strisce di 25 e 5μm. I substrati non microstrutturati sono utilizzati come controllo positivo. a) catepsina b) collagene di tipo II c) adesione. (Le differenze sono significative per * p<0.05). Legenda: CTR controllo interno piastra Petri, PDLA o PLLA/HY5 microstrutture con strisce di 5um, PDLA o PLLA/HY25 microstrutture con strisce di 25um. La catepsina B è stata dosata per verificare se le microstrutture erano in grado di ri-differenziare i condrociti in quanto fornisce indicazioni sulla stabilità del fenotipo: livelli alti di catepsina indicano che la cellula è sdifferenziata (fibroblast-like cell), mentre bassi valori indicano che la cellula è differenziata (real chondrocyte). E’ stato dimostrato che alti livelli di catepsina sono prodotti da condrociti cresciuti in un monostrato. Dopo 14 giorni i valori della catepsina espressi da cellule coltivate sulle microstrutture sono significativamente più bassi in confronto alle superfici di controllo di PLLA e PDLA e al substrato di controllo interno (CTR). Questo significa che le microstrutture sono in grado di indurre la re-differenziazione dei condrociti. Per quanto riguarda il collagene di tipo II si hanno differenze notevoli tra le superfici microstrutturate e le superfici di controllo. Si ha una maggiore produzione di collagene per le cellule coltivate sulle superfici microstrutturate. I livelli di collagene sono notevolmente più bassi se le cellule crescono in monostrato cioè quando perdono il loro fenotipo differenziandosi in fibroblasti. Confrontando superfici con strisce aventi dimensioni differenti si può osservare che le strisce di 5um sono quelle che consentono una maggiore produzione di collagene e una minore produzione di catepsina e quindi sembra che mantengono meglio il fenotipo dei condrociti; ma le differenze evidenziate dai grafici anche se significative sono molto piccole, considerando questa prima serie di prove possiamo equiparare le performance dei due tipi di microstrutturazione. Le differenze più nette rimangono nei confronti delle superfici non microstrutturate. Per quanto riguarda l’adesione cellulare le superfii con strisce di 25um sono quelle che consentono una maggiore adesione a causa forse dello spazio maggiore tra le strutture che permette un miglior alloggiamento delle cellule. Osteoblasti : Lo scopo dell’ esperimento è stato di valutare la risposta di osteoblasti nei confronti della diversa topografia dei substrati di polilattico. A tale scopo è stata investigata l’adesione, la proliferazione, la produzione di osteocalcina e di fosfatasi alcalina di osteoblasti dopo 7 e 14 giorni di coltura. Sono stati seminati osteoblasti (linea MG63) 20000 per campione. Come controllo è stato utlizzato il polistirene delle piastre Petri. In figura 25(a-d) sono riportati i grafici relativi. Non ci sono differenze significative nè tra i due tipi di polittico né nei confronti della superficie di controllo; quindi il materiale risulta un buon supporto per gli osteoblasti come la piastra petri indipendentemente dalla presenza o meno di “bumps” delle dimensioni di scala micrometrica.

MG63 adhesion 4 hours

80

85

90

95

100

control flat bumps

adhe

sion

% o

f see

ded

cells

MG63 proliferation

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

control flat bumps

WST

1 (4

50/5

40nm

OD

)

7 14

a) b)

34

Alkaline phosphatase

0

2

4

6

8

10

12

control flat bumps

ALP

(mic

rom

ol p

NPP

/min

)

ALP 7 ALP 14

Osteocalcin

0

5

10

15

20

25

control flat bumps

OC

(ng/

ml)

OC 7 OC 14

b) d)

Fig 25: Sui grafici sono riportati i valori normalizzati dei vari fattori dosati sugli osteoblasti coltivati sulle superfici di PLLA e PDLA. La piastra Petri è stata presa come controllo. a) adesione b) proliferazione c) fosfatasi alcalina d) osteocalcina. (Le differenze sono significative per * p<0.05). Conclusioni: Sono state ottenute microstrutture su un supporto bioriassorbibile con una buona riproducibilità. Tali superfici si sono dimostrate efficaci nel guidare la crescita di fibroblasti e condrociti e dei buoni supporti per la crescita degli osteoblasti. Il risultato più interessante riguarda le colture dei condrociti in quanto tali strutture sono in grado di mantenerne fenotipo evitando il processo di de-differenziazione in fibroblasti. Lo stesso tipo di effetto era stato osservato per microstrutture di Hyal su supporti di PET trattato ai plasmi di ammoniaca e di vetro silanizzato. Il valore aggiunto di questo studio consiste nel fatto che il supporto è un materiale riassorbibile e quindi è possibile un’applicazione in vivo. Studio dell’adsorbimento di proteine Siccome il primo meccanismo che avviene quando un biomateriale è posto a contatto con un ambiente biologco è l’adsorbimeto di proteine che si trovano nei liquidi fisiologici, è stato valutato l’adosrbimento di proteine del plasma sui substrati impiegati come supporti per realizzare le superfici microstrutturate di Hyal. Lo scopo di tale studio è quello di mettere in relazione l’adsorbimento proteico con la risposta cellulare. Una particolare attenzione è stata data a superfici ricoperte in modo omogeneo con un film di Hyal. L’adsorbimento di proteine del siero umano è stato valutato su superfici ricoperte con un film omogeneo di Hyal ottenuto tramite il processo di fotoimmobilizzazione. Lo scopo dello studio è di trovare una correlazione tra l‘antiadesività delle superfici polisaccaridiche con il tipo di proteine adsorbite sulla superficie stessa. Le superfici sono state incubate con una quantità nota di siero umano per 2h a 37°C. Le superfici sono state poi eluite con diversi agenti in modo da distaccare step-by-step le proteine adsorbite sulla superficie. In particolare sono stati effettuati 6 eluzioni con acqua distillata, 6 con Laemmli buffer (SDS 2%+ 2-mercaptoethaol 5%) e 6 con Laemmli buffer modificato (SDS 2%+Urea 5M+2-mercaptoethaol 5%). La composizione proteica delle singole frzioni raccolte dagli step di eluizione è stata determinata effettuando un’analisi 1D-SDS-PAGE. Di seguito sono riportati i profili elettroforetici per i diversi eluenti (Fig 26). La colonna a sinistra rappresenta il controllo cioè le proteine del siero ed è indicata con HS. Come si può notare dai profili soltanto nei primi due lavaggi con acqua distillata si ritrovano delle bande corrispondenti alle proteine caratteristiche del siero, nelle eluizioni successive non vengono più distaccate proteine dalla superficie di Hyal. Questo sta indicare che si ha un basso adsorbimento proteico sulle superfici di Hyal e che le poche proteine adsorbite interagiscono debolmente con la superficie visto che

35

vengono eluite ai primi lavaggi. La composizione chimica di superficie è stata analizzata tramite ToF-SIMS per valutare l’eventuale presenza di proteine irreversibilmente adsorbite sulla superficie che permangono anche dopo tutte le eluizioni. La composizione chimica di superficie corrisponde a quella dello Hyal fotoimmobilizzato, quindi tracce di proteine risultano assenti alla fine di tute le eluizioni effettuate. I risultati concordano con gli studi di QCM-D, in cui si evidenziava un adsorbimento proteico pressoché nullo di proteine sulle superfici e un adsorbimento significativo di proteine anche se basso sulle superfici di HyalS ottenute con la stessa procedura.

HS I II III IV V VIH2O

HS I II III IV V VIH2O

HS I II III IV V VILaemmli

HS I II III IV V VILaemmli

HS I II III IV V VIModified Laemmli

HS I II III IV V VIModified Laemmli

Fig 26: Profili elettroforetici delle proteine del siero umano eluite da una superficie di Hyal ottenuta per fotoimmobilizzazione. I vari tipi di eluenti sono riportati nella figura. Lo stesso tipo di esperimento è stato eseguito sui substrati nativi di PET/C pirolitico e sui substrati di PET/C pir ricoperti di un film omogeneo fotoimmobilizzato di Hyal. Di seguito sono riportati i profili elettroforetici delle frazioni di acqua, Laemmli buffer e isopropanolo eluite da superfici di PET/C pir (Fig 27). I profili elettroforetici delle stesse superfici ricoperte con Hyal fotoimmobilizzato hanno le stesse caratteristiche di quelli sopra riportati (assenza di proteine).

a) b) c) Fig 27: Profili elettroforetici delle frazioni di acqua a), Laemmli buffer, soluzione A (Laemmli buffer modificato b) acqua e isopropanolo al 10%, 30%, 50% e 70% eluite dai substrati nativi di PET/ Cpir. Le uniche frazioni contenenti le proteine sono quelle relative al primo e al secondo lavaggio in H2O. La composizione di tali frazioni risulta simile a quella del siero umano utilizzato per incubare i campioni. Nessuna differenza è stata osservata tra i substrati nativi di C pir e quelli fotoimmobilizzati con Hyal. Si può concludere che si tratta di un eccesso di proteine rimasto sulla superficie dopo l’eluizione non rimosso per aspirazione meccanica con la pipetta che quindi non interagisce se non debolmente con le superfici. Nelle altre fazioni raccolte non è stata riscontrata la presenza di proteine del siero.

36

Lo stesso tipo di esperiemto è stato condotto sui vetri silanizzati a diversa composizione chimica (le caratteristiche dei substrati sono già state descritte). Le proteine del siero si adsorbono sia sul vetro che sul vetro quarzo; infatti sono state identificate diverse bande nei profili elettroforetico nella frazione acqua/10%isopropanolo. I profili elettroforetici per i due vetri (vetro-quarzo Q e vetro S) sono molto simili. Infatti si possono identificare tre bande: una a 210KDa, una a 70KDa e una a 60KDa (vedi Fig 28).

a) b) c) e)d) f) g)a) b) c) e)d) f) g)

Fig 28: Profili elettroforetici delle frazioni eluite dale superfici di vetro S e vetro-quarzo Q a) acqua bidistillata, b) laemmli buffer c) laemmli buffer modificato d) acqua/isopropanolo 10% 10% e) acqua/isopropanolo 30%, 50%, 70% g) profile elettroforetico del siero L’immunoblotting ha permesso l’identificazione della fibronettina (Fig 29), un’importante proteina adesiva che presumibilmente ha un ruolo fondamentale nell’adesione dei condrociti alle superfici di vetro. Le altre due bande a 70 e a 60KDa non sono state identificate. Altre proteine che sono state testate come IgG e il fattore del complemento C3b non sono state rivelate dai rispettivi anticorpi.

QSSerum QSSerum

Fig 29: Immunoblotting della fibronettina del siero, della frazione acqua/isopropanolo 10% sulla superficie S e Q.

37

Pubblicazioni

1. A. Chiumiento, S. Lamponi, R. Barbucci “Platelets Behaviour on bound and

Adsorbed Fibrinogen on Hyaluronan and Sulphated

Hyaluronan substrates” Biomacromolecules, 2006, in press.

2. Pasqui D., Rossi A., Barbucci R., Lamponi S., Gerli R. Weber E., “ Hyaluronan and

Sulphated Haluronan micropatterns: effect of chemical and topographic cues on lymphatic

endothelial cell alignment and proliferation” Lymphology, (2005), 38; 50-65.

3. Barbucci R, Torricelli P, Pasqui D,. Fini M, Favia P., Sardella E., d’Agostino

R.,.Giardino R, “Proliferative and re-differentitive effects of photoimmobilized

micropatterned Hyaluronan surfaces on chondrocyte cells” Biomaterials, (2005),26 (36);

7596-7605.

4. Rolando Barbucci, Agnese Magnani, Antonio Chiumiento, Daniela Pasqui, Iacopo

Cangioli and Stefania Lamponi “Fibroblast cell behaviour on bound and adsorbed

fibronectin onto Hyaluronan and Sulphated Hyaluronan substrates.”, Biomacromolecules,

(2005); 6(2); 638-645.

5. Barbucci R. Lamponi S., Magnani A., Piras F.M., Rossi A., Weber E. “Role of the

Hyal-Cu II complex on Bovine Aortic and Lymphatic Endothelial cells behaviour on

micropatterend surfaces.” Biomacromolecules, (2005), 5, 212-219.

6. Didier Falconnet Daniela Pasqui, , Sunggook Park, Rolf Eckert, Helmut Schift, Jens

Gobrecht, Rolando Barbucci and Marcus Textor, “A Novel Approach to Produce Protein

Nanopatterns by Combining Nanoimprint Lithography and Molecular Self-Assembly”

Nanoletters,(2004) 4,10: 1909-14.

7. Antonella Rossi, Elisabetta Weber, Stefania Lamponi, Daniela Pasqui, Rolando

Barbucci “ Micropatterned hyaluronan surfaces promote lymphatic endothelial cell

alignment and orient their growth” Journal of Limphology, (2004), 37: 15-21.

38

8. Rolando Barbucci, Stefania Lamponi, Agnese Magnani, Daniela Pasqui, Scott Bryan

"The use of Hyaluronan and its sulphated derivative patterned with micrometric scale on

glass substrate in melanocytes cell behaviour" Biomaterials, (2003), 24: 915-919.

9. Rolando Barbucci, Stefania Lamponi, Daniela Pasqui, Antonella Rossi, Elisabetta

Weber "Micropatterned polysaccharide surfaces via laser ablation for cell guidance"

Material Science and Engineering C, (2002), 1046: 1-7.

10. Rolando Barbucci, Stefania Lamponi, Agnese Magnani, Daniela Pasqui "

Micropatterned surfaces for the control of endothelial cell behaviour" Biomolecolar

Engeneering (2002), 19: 161-170.

RELAZIONE dell’ATTIVITA’ di RICERCA svolta dall’ …...spettrometria di massa a ioni secondari...

Documents

Transcript of RELAZIONE dell’ATTIVITA’ di RICERCA svolta dall’ …...spettrometria di massa a ioni secondari...