Relazione della Dott.ssa Cinzia Mazzei relativa all’attività scientifica svolta 

presso l’Institute of Ophthalmology dell’UCL, London (UK) 

 “Coinvolgimento del Poro di Transizione Mitocondriale (PTP) nei meccanismi 

di neuroprotezione del coenzima Q10 in un modello cronico di glaucoma”

Introduzione

Il  glaucoma  è   una   neuropatia   del   nervo   ottico,   generalmente   associata   ad   un 

incremento   della   pressione   intraoculare   (IOP)   che   determina   morte   delle   cellule 

ganglionari retiniche (RGC), con conseguente progressivo deterioramento del  campo 

visivo che può portare alla cecità (Sommer A., 1989). Sebbene non siano ancora stati 

chiariti i meccanismi esatti che correlano l’incremento della pressione intraoculare con 

la   perdita   delle   RGC,   è   ormai   noto   che   la   morte   delle   RGC   in   diversi   modelli 

sperimentali   di   glaucoma   avviene   per   apoptosi   (Quigley   et   al.,   1995;   Garcia

Valenzuela et al., 1995). 

Sono state  identificate  diverse vie di   trasduzione del  segnale  che sono  in grado di 

mediare la sopravvivenza e la plasticità neuronale; tra queste una delle più rilevanti è 

la via che coinvolge la fosfatidilinositolo3kinasi (PI3K) (Brunet et al., 2001; Datta et  

al., 1997). Infatti, in seguito al legame di fattori di crescita, quali il fattore neurotrofico 

di derivazione cerebrale (BDNF) o il fattore di crescita similinsulina (IGF) al proprio 

recettore di membrana, l’attivazione della cascata della PI3K porta alla fosforilazione e 

conseguente attivazione della serintreonin kinasi Akt. Akt, quando fosforilata, è a sua 

volta   in   grado   di   inibire,   attraverso   fosforilazione,   alcuni   target   con   azioni 

proapoptotiche, come Bad (Datta et al., 1999) e la caspasi 9 (Cardone et al., 1998). 

Pertanto, l’Akt fosforilata potrebbe rappresentare un’importante via di sopravvivenza 

per   le  RGC   nelle  diverse   condizioni   patologiche   in   cui   si   osserva   la  presenza   di 

fenomeni apoptotici. 

L’apoptosi è la forma di morte cellulare programmata meglio caratterizzata. Le cellule 

dei mammiferi possiedono due principali vie apoptotiche che sono conosciute come 

via intrinseca e via estrinseca (Green & Evan, 2002).  I mitocondri giocano un ruolo 

cruciale   nella   via   apoptotica  intrinseca   poiché  l’aumento   di   permeabilità   della 

membrana   mitocondriale   esterna   induce   il   rilascio,   dallo   spazio   intermembrana   al 

citosol,   di   diverse   proteine   che   comprendono   molecole   proapoptotiche   come   il 

citocromo c, Smac/Diablo, HtrA2 (Omi) e AIF (Green & Evan 2002; Wang X. 2001). 

In   presenza   di   ATP,   il   citocromo   c   si   lega   ad   Apaf1   attivando   la   sua 

oligomerizzazione   in   seguito   alla   quale   la   caspasi   9  è   reclutata   e   va   incontro   ad 

autoattivazione.   Pertanto,   l’aumentata   permeabilità   della   membrana   mitocondriale 

esterna rappresenta un evento cruciale nel processo apoptotico (Desagher & Martinou,  

2000). E’ stato osservato che in varie condizioni, quali la presenza di Ca2+ insieme al 

fosfato inorganico, mitocondri isolati vanno incontro a transizione della permeabilità 

mitocondriale   (MPT)   (Kroemer  et  al.,  1995).  Tale  processo  è   caratterizzato  da  un 

incremento,   calcio   dipendente,   nella   permeabilità   della   membrana   mitocondriale 

interna   che   provoca   perdita   del   potenziale   di   membrana   ( ),   rigonfiamentoΔψ  

mitocondriale e rottura della membrana mitocondriale esterna (Zoratti & Szabo, 1995;  

Halestrap  et  al.,  2002).  E’   stato   ipotizzato  che   la  MPT possa  avvenire   in  seguito 

all’apertura di un complesso canale chiamato permeability transition pore (PTP) che è 

costituito da 3 componenti principali: 

1. il canale anionico voltaggiodipendente (VDAC),  localizzato sulla membrana 

mitocondriale   esterna,   che   è   considerato,   generalmente,   il   canale   primario 

attraverso cui i metaboliti diffondono nei mitocondri;

2. il   traslocatore   di   adeninnucleotide   (ANT),   localizzato   sulla   membrana 

mitocondriale   interna,   che   opera   come   porta   d’ingresso   del   poro.   Quando 

occupato da substrati trasportabili, esso si alterna tra 2 conformazioni in cui il 

sito di legame  ADP/ATP  può trovarsi o sul lato della matrice mitocondriale 

(mstate) oppure sul  lato citoplasmatico (cstate).   In particolare,  i   ligandi di 

ANT che si legano durante l’mstate inibiscono la transizione di permeabilità 

del poro, mentre quelli che si legano allo stato c la attivano. Questo suggerisce 

che per l’attivazione del PTP è necessaria la conformazione cstate del canale;

3. la ciclofillina D (Cyp D), una proteina solubile della matrice mitocondriale che 

agisce come regolatore positivo nell’apertura del MPTP. Infatti, ogni volta che c’è 

un   incremento  di   calcio  essa   interagisce  con  ANT  inducendo   il   cambiamento 

conformazionale di ANT stesso che porta ad apertura del PTP con conseguente 

incremento di permeabilità della membrana mitocondriale interna.

Lo   stimolo   principale   per   l’apertura   del   canale   è,   quindi,   l’incremento   della 

concentrazione   di   calcio   nella   matrice,   anche   se   la   concentrazione   richiesta   è 

altamente dipendente dalle altre condizioni all’interno della cellula (Bernardi, 1999). 

Sono stati identificati, infatti, diversi fattori in grado di aumentare la sensibilità del 

poro al  calcio ma,   tra  questi,   i  più  potenti  e  rilevanti  sono sicuramente:   lo stress 

ossidativo,   la   deplezione   di   ATP,   l’incremento   di   concentrazione   del   fosfato 

inorganico e la depolarizzazione mitocondriale (vd Tsujimoto et al., 2006).

La principale conseguenza dell’apertura del poro di transizione è il disaccoppiamento 

della fosforilazione ossidativa che impedisce ai mitocondri di produrre ATP e nello 

stesso   tempo   stimola   attivamente   l’idrolisi   dell’ATP   prodotto   mediante   glicolisi 

portando, inevitabilmente, la cellula a morte.

Il ruolo centrale svolto dall’attivazione del poro di transizione nella morte apoptotica, 

suggerisce un potenziale effetto neuroprotettivo per sostanze in grado di contrastare 

l’apertura del poro.

L’ubiquinone o coenzima Q10 (CoQ10) è sia un ben noto trasportatore di elettroni 

nei complessi I,  II e III della catena respiratoria mitocondriale,  sia uno scavenger 

ubiquitario  di   radicali   liberi.  L’effetto   antiapoptotico  del  CoQ10  dovuto   alla   sua 

azione antiossidante è stato ampiamente documentato (Tomasetti et al., 2001; Navas  

et al., 2002) ma, proprio recentemente, è emerso che esso potrebbe essere in grado di 

prevenire l’apoptosi anche mediante inibizione del poro di transizione mitocondriale 

(Papucci et al., 2003).

Pertanto, lo scopo del mio lavoro è stato quello di studiare i meccanismi molecolari 

attraverso cui il CoQ10 esplica la sua azione neuroprotettiva in un modello cronico di 

glaucoma nel ratto; in particolare, la mia attenzione si è rivolta allo studio degli effetti 

su Akt ed ANT, due proteine la cui modulazione potrebbe rendere conto dell’effetto 

neuroprotettivo del CoQ10 nel modello in esame.

Materiali e Metodi

L’azione neuroprotettiva del CoQ10 è stata analizzata in un modello di ipertensione 

oculare cronica (OHT) indotta in ratti maschi adulti  Dark Agouti (DA) del peso di 

200300g mediante la somministrazione di una soluzione salina (1.80 M) in 2 vene 

episclerali. I ratti sono stati monitorati dopo 3 settimane dall’innalzamento della IOP 

(pressione intraoculare) tramite una tecnica non invasiva di imaging utilizzando un 

microscopio confocale a scansione laser che consente di visualizzare singole cellule 

apoptotiche, in vivo (Cordeiro et al., 2004). I trattamenti con il veicolo (n=10) e con 

il  CoQ10 0.1% (Visufarma)  (n=10) sono stati  effettuati,  per via topica,  30 minuti 

prima ed 1 ora e 1 settimana dopo l’innalzamento della IOP. L’analisi istologica è 

stata eseguita tramite saggi di immunoistochimica su sezioni sequenziali, incluse in 

paraffina,   dello   spessore   di  5   µm  ottenute   dagli   occhi   enucleati   e   fissati   in 

paraformaldeide (PFA al 4%), utilizzando i seguenti anticorpi: pAkt (1:100 in PBS), 

e ANT (1:1000 in PBS). L’intensità dello staining è stata valutata tramite un sistema 

ben noto di “grading” (da 4 a +4), in cui gli occhi controllo sono stati posti pari a 0 

(Shah et al., 1994).

Risultati

I dati ottenuti hanno confermato che il CoQ10, somministrato per via topica, è  in 

grado   di   ridurre   significativamente   la   morte   delle   RGC   dopo   3   settimane 

dall’innalzamento della IOP in tale modello cronico di glaucoma indotto tramite OHT 

(riduzione   dell’apoptosi   delle   RGC   del   95.6%   rispetto   al   controllo,   p<0.05). 

Dall’analisi istologica è emerso che ANT e pAkt sono espresse entrambe nello strato 

delle RGC sia degli occhi controllo che di quelli  trattati con il CoQ10; inoltre,  il 

trattamento   con   il   CoQ10   è   associato   ad   una   significativa   riduzione   (p<0.05) 

dell’espressione di ANT (2.50 ± 0.22 del controllo vs 1.83 ± 0.21 del CoQ10). Al 

contrario, l’espressione di pAkt risulta più elevata negli occhi trattati con il CoQ10 

(1.56 ± 0.50 del controllo vs  1.31 ± 0.31 del CoQ10) anche se tale incremento non è 

statisticamente significativo.

Sia pAkt che ANT sono due proteine coinvolte nella morte apoptotica: pAkt fosforila 

Bad,   interferendo   così   con   il   rilascio   di   citocromo   c   dai   mitocondri   e   con   la 

successiva attivazione della cascata caspasica, mentre ANT regola l’apertura del poro 

di   transizione   mitocondriale   e   conseguentemente   il   rilascio   di   fattori   apoptotici. 

Quindi, la significativa riduzione dell’espressione di ANT suggerisce che un possibile 

meccanismo alla base dell’azione neuroprotettiva del coenzima Q10 nel glaucoma 

cronico potrebbe essere mediato dall’inibizione dell’apertura del poro di transizione 

mitocondriale con conseguente blocco del processo apoptotico. Pertanto, ritengo di 

particolare interesse chiarire, con indagini future, il coinvolgimento di ANT e delle 

altre proteine che costituiscono il canale mitocondriale, VDAC e Ciclofillina D, nei 

meccanismi protettivi del CoQ10. 

Bibliografia

1. Green D.R., Evan G.I. (2002)  A matter of life and death, Cancer Cell (1) 19–30.

2. Wang X. (2001) The expanding role of mitochondria in apoptosis,  Genes Dev. (15) 2922–

2933.

3. Desagher S., Martinou J.C. (2000) Mitochondria as the central  control point of apoptosis, 

Trends Cell Biol. (10) 369–377.

4. Zoratti M., Szabo I. (1995) The mitochondrial permeability transition, Biochim. Biophys. Acta 

(1241): 139–176.

5. Halestrap A.P., McStay G.P., Clarke S.J. (2002) The permeability transition pore complex: 

another view, Biochimie (84): 153–166.

6. Crompton M. (2003)  On the involvement of mitochondrial intermembrane junctional 

complexes in apoptosis, Curr.Med. Chem. (10): 1473–1484.

7. Navas P., FernandezAyala D.M., Martin S.F.,  LopezLluch G., De Caboa R., Rodriguez

Aguilera J.C., Villalba J.M. (2002) Ceramidedependent caspase 3 activation is prevented by 

coenzyme Q from plasma membrane in serumdeprived cells. Free Radic Res. (4):36974.

8. Tomasetti  M.,  Alleva  R.,  Borghi  B.,  Collins  A.R.   (2001)   In   vivo   supplementation  with 

coenzyme Q10 enhances the recovery of human lymphocytes from oxidative DNA damage. 

FASEB J.; (8):14257. 

9. Papucci L., Schiavone N., Witort E., Donnini M., Lapucci A., Tempestini A., Formigli L., 

ZecchiOrlandini S., Orlandini G., Carella G., Brancato R., Capaccioli S. (2003) Coenzyme 

q10 prevents apoptosis by inhibiting mitochondrial depolarization independently of its free 

radical scavenging property. J Biol Chem.; 278(30):282208.

10.Cordeiro M.F., Guo L., Luong V., Harding G., Wang W., Jones H.E., Moss S.E., Sillito A.M., 

Fitzke   F.W.   (2004)   Realtime   imaging   of   single   nerve   cell   apoptosis   in   retinal 

neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 101(36):133526. 

11.Shah M., Foreman D., Ferguson M. (1994) Neutralising antibody to TGFbeta 1,2 reduces 

cutaneous scarring in adult rodents. J Cell Sci.; (107):1137–1157.

12.Bernardi P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability 

transition, Physiol. Rev.; (79): 1127–1155.

13.Sommer A. (1989) Intraocular pressure and glaucoma. Am J Ophthalmol.; (107):186–188.

14.Quigley H.A.,  Nickells  R.W.,  Kerrigan L.A.,  Pease M.E.,  Thibault  D.J,  Zack D.J.  (1995) 

Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. 

Invest Ophthalmol Vis Sci.; (36):774–786.

15.GarciaValenzuela E., Shareef S., Walsh J., Sharma S.C. (1995) Programmed cell death of 

retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp Eye Res.; (61):33–44.

16.Brunet  A.,  Datta  S.R.,  Greenber  M.E.   (2001).    Transcriptiondependent  and independent 

control of neuronal survival by the PI3KAkt signaling pathway. Curr. Opin. Neurobiol. (11): 

297–305.

17.Datta S.R., Brunet A., Greenberg M.E. (1999) Cellular survival: a play in three Akts. Genes  

Dev. (13): 2905– 2927.

18.Datta S.R., Dudek H., Tao X., Masters S.,  Fu H., Gotoh Y., Greenberg M.E. (1997) Akt 

phosphorylation of BAD couples survival signals to the cellintrinsic death machinery.  Cell 

(91): 231– 241.

19.Cardone M.H., Roy N., Stennicke H.R., Salvesen G.S., Franke T.F., Stanbridge E., Frisch S., 

Reed J.C. (1998) Regulation of cell  death protease caspase9 by phosphorylation,  Science 

(282):1318– 1321.

20. Kroemer G., Petit P., Zamzami N., Vayssiere J.L., Mignotte B. (1995) The biochemistry of 

programmed cell death, FASEB J. (9): 1277–1287.

21.Tsujimoto Y., Nakagawa  T. and Shimizu S. (2006)  Mitochondrial  membrane permeability 

transition and cell death. Biochim Biophys Acta.; 1757(910):1297300.