Regolazione della trascrizione I:sigma diversi → oloenzimi diversi → preferenza per

promotori diversi → tx geni diversi

Regolazione della trascrizione II:L' OPERONE del lattosio

TESTO: LEWIN’s GENES X, CAPITOLI 19 E 26

LEWIN IL GENE VIII CAPITOLI 9, 10 e un po’ di 11

Regolazione della trascrizione I:

sigma diversi → promotori diversi → geni diversi

E.coli ha sette sigma diversi

UNA POLIMERASI CHE CONTIENE UN SIGMA SPECIFICO RICONOSCE

LA PROPRIA SERIE DI PROMOTORI

QUINDI LA Tx DI UNA SERIE DI GENI ESCLUDE/SPEGNE IL VECCHIO

PROGRAMMA E NE ACCENDE (transientemente) DI NUOVI.

codice di riconoscimento sul DNA

l’azione dei sigma alternativi

deve essere regolata

controllando la sua concentrazione

sequestrando il fattore sigma

sintetizzando sigma con affinità crescente

per core enzima

producendo dei pro-sigma che vengono

attivati da taglio proteolitico

cascate

l’esempio della risposta al calore

due sigma s32 e sE (s24) finemente regolati

s32 è sottoposto a controllo a feedback (heat shock proteine citosol)

in condizioni normali il livello di s32 è mantenuto basso da proteasi (che si

occupano anche della degradazione di proteine malripiegate)

quando la temperatura aumenta e provoca la denaturazione delle proteine

le proteasi vengono indirizzate alla eliminazione delle proteine mal-

ripiegate s32 viene preservato

il livello di s32 aumenta,compete con s70 che viene spiazzato comincia la

trascrizione dei geni dell’Heat shock prinicalmente chaperoni e proteasi che

ripiegano o eliminano le proteine mal-ripiegate

quando il livello delle proteine mal-ripiegate si riduce, perché diminuisce la

temperatura e per il lavoro eseguito da chaperoni e proteasi, queste ultime

sono libere di degradare s32 il cui livello torna ai valori basali

l’esempio della risposta al calore

due sigma s32 e sE (s24) finemente regolati

sE è controllato da anti-sigma factor (heat shock proteine periplasma)

in condizioni normali sE è legato (sequestrato) ad una proteina della

membrana interna RseA

l’accumulo di proteine mal-ripiegate nello spazio periplasmico provoca

l’attivazione di una proteasi (DegS) che taglia il C-terminale di RseA .

questo taglio attiva un’altra proteasi (YaeL) posta sul lato

citoplasmatico che taglia l’N-terminale di RseA liberando sE

sE può trascrivere i geni dell’Heat shock prinicalmente chaperoni e

proteasi che ripiegano o eliminano le proteine mal-ripiegate

specificamente nello spazio periplasmico

Sigma E risponde a

modificazioni più

estreme di temperatura

di Sigma32

SigmaE è stabile ma

dormiente perché

sequestrato

Nota!! Fai un parallelo

con eucarioti!…

Si pensi alla cascata di

trasduzione di TGFb o

di Notch.

Segnale Accumulo di

proteine denaturate

fuori dalla cellula

Proteina di membrana con

dominio esterno e

citoplasmatico lega il fattore

sigmaE, sequestrandolo.

In questo caso SigmaE e'

stabile MA

DORMIENTE/LATENTE

Il taglio proteolitico di Notch richiede due diverse proteasi

che lavorano in serie

L’azione delle proteasi è attivata dal cambio conformazionale

di Notch indotto dall’interazione con i ligandi di tipo Delta

L’interazione ligando-recettore coinvolge anche la cellula

sorgente, in cui l’endocitosi di Delta è parte integrante

dell’attivazione di Notch (l’endocitosi “tira” su Notch

cambiandone la conformazione)

…… tornando ai batteri

fagi:

infezione litica

il fago di B.subtilis (SPO1) per

realizzare la transizione tra le diverse

fasi di infezione ( precoce, intermedia

e tardiva) a cui corrispondono

l’espressione di diversi gruppi di geni

utilizza sigma alternativi

Geni precoci trascritti dalla polimerasi

dell’ospite batterico

Geni intermedi trascritti utilizzando un

sigma prodotto di un gene fagico della

fase precoce

Geni tardivi trascritti utilizzando un

sigma prodotto da due geni fagici della

fase intermedia

una cascata di fattori sigma

coordina eventi complessi:

controllo temporale

gp28

gp33

gp34

s70

la mancanza di nutrimenti

innesca la sporulazione

due diversi destini

LA SPORULAZIONE comporta l’espressione

di geni specifici

coordinamento tra eventi così diversi che

avvengono nel batterio vegetativo (che si

liserà) e nella spora.

Non ci puo' essere sfasamento temporale tra

i due eventi..!

una cascata di fattori sigma coordina

eventi complessi:

controllo comunicazione cellula/cellula

NON SERVE SAPERE A MEMORIA TUTTI I NOMI DEI

GENI e MECCANISMI DELLA SPORULAZIONE !

COCETTI IMPORTANTI:

•la sporulazione e' controllata da due cascate di vari sigma

•in ciascun compartimento (batterio vegetativo e spora) vengono attivati

IN SUCCESSIONE DIVERSI SIGMA, ognuno dirige la trascrizione di

gruppi di geni specifici

•spesso tra questi geni ci sono i sigma della fase successiva

•il "trucco" per realizzare il coordinamento è la sintesi di un PRO-SIGMA

(latente, ma "ready-to-go", attivato da taglio proteolitico)

•il taglio è controllato dalla localizzazione (in membrana del setto) del

ProSigma e dagli eventi che avvengono nell'altra cellula..!!!. Cio' realizza

la COORDINAZIONE spazio-temporale nelle e tra le due cellule con

destini così diversi ….

In CONDIZIONI AMBIENTALI

AVVERSE…

Tx dei Geni della lisi

Regolazione della trascrizione II:

l' OPERONE del lattosio

i batteri vivono in un mare di nutrienti diversi e per

ottimizzare il dispendio energetico hanno evoluto dei

sistemi di percezione di segnali (quale metabolita è

presente) e hanno collegato questi segnali a precisi

programmi di regolazione genica

elementi trans attivi - elementi cis attivi

un regolatore è elemento trans attivo (diffusibile): RNA pol,

fattori di trascrizione, miRNA ecc.

agisce su qualunque copia del suo bersaglio

il sito di legame (bersaglio) sul DNA/RNA è elemento cis attivo

(promotore, operatore, enhancer ecc.)

ha effetto solo sul DNA adiacente

REGOLAZIONE NEGATIVA E POSITIVA

REPRESSORI E ATTIVATORI

basso livello di tx

costitutiva (non regolata)

basale

un repressore si lega alla

regione OPERATORE,

parzialmente sovrapposta

al promotore

un attivatore, si lega ad

una sequenza vicina al

promotore e recluta la

RNA pol al promotore:

esempio di legame

cooperativo

elementi cis attivi

start point

repressoreattivatore

elementi trans attivi: repressore

elementi trans attivi: attivatore/i

in altri casi, non è il legame della polimerasi ad essere limitante, ma la

sua attività. Attivatori e repressori legati nelle vicinanze possono

interferire a questo livello.

l’attivatore influenza la polimerasi

causando in essa un cambiamento

conformazionale con cui si passa

al complesso aperto

complesso chiuso, tx

inefficientemente bassa

elementi trans attivi: attivatore/i

i geni sono controllati da segnali extracellulari

come fa questa informazione ad arrivare ai promotori?

soluzione: questi segnali sono comunicati, attraverso dei mediatori

molecolari (piccole molecole, metaboliti, cataboliti, altre proteine) ai

regolatori trascrizionali

In molte proteine regolatrici

si distinguono due domini:

il sito di legame al DNA ed

il sito allosterico, che

spesso funziona come

INTERRUTTORE che

influenza il legame al DNA

predisponendolo in due

possibili configurazioni:

funzionale e NON

funzionale

= ALLOSTERIA

ALLOSTERIA vedi

definizione

visione d'insieme

di possibili circuiti

regolatori

Allosterismo e cooperatività

È importante precisare che il termine "allosterico" è spesso usato impropriamente per descrivere la cinetica cooperativa, esibita da alcuni enzimi multimerici.Il termine allosterico, in accordo con il significato originale, dovrebbe essere riservato per quegli enzimi la cui attività è regolata da ligandi (effettori o modulatori - che a loro volta possono essere proteine o piccole molecole) che interagiscono con un sito diverso da quello attivo o catalitico.Il termine fu infatti introdotto da Monod, Jacob e Changeux per descrivere il comportamento di enzimi inibiti competitivamente da composti strutturalmente (stereos) molto diversi (allos) dal substrato. Poiché la maggior parte di questi enzimi mostra anche una cinetica sigmoide, tipica dei catalizzatori oligomerici con siti multipli interagenti, il termine allosterico è spesso usato come sinonimo di cooperatività, pur in assenza di una reale regolazione allosterica.IN BIOCHIMICA, una macromolecola esibisce LEGAME COOPERATIVO SE LA AFFINITA' PER IL SUO LIGANDO CAMBIA CON LA QUANTITA' DI LiGANDO GIA' LEGATOLa cooperatività può essere positiva o negativa (a seconda che l'effetto sia di attivazione o di inibizione)

"An allosteric effector is one that acts by binding to the enzyme at a site different from the active site. There is no necessary connection between allosteric effects and co-operative effects, though they often occur together in real systems." da Recommendations on Biochemical & Organic Nomenclature della International Union of Biochemistry (198

regolazione fine dell’espressione genica,

controllo integrato (postivo e negativo) per

l'operone lac

“adattamento” enzimatico dei batteri

curva di crescita di E. coli in terreno contenente glucosio e lattosio

preferenza per il glucosio

viene chiamata repressione da glucosio (o da cataboliti)

una strategia utilizzata dai batteri è quella di riunire

gruppi di geni funzionalmente collegati in modo che essi

possano ricevere regolazione coerente dalle stesse

sequenze regolatorie

un esempio classico: LacZ operon

3 geni in un messagero policistronico

gli elementi regolatori corrispondenti in 5' (a monte)

operoni

locus lac

lac Z = codifica b-galattosidasi

lac Y = codifica galattoside permeasi

lac A = codifica galattoside transacetilasi

lac I = codifica il repressore NON fa parte dell’operone

è un gene regolatore

operone lac

gruppo di geni che codificano gli enzimi coinvolti

nel metabolismo del lattosio

P/OCAP

permeasi

lattosio

transacetilasi

b-galattoside

b-galattosidasi

mutazioni

Sommario

regolazione negativa operone lac

la trascrizione del repressore è costitutiva

l'operatore lac è un palindromo, viene contattata

da DUE "TESTE" del repressore in due giri

consecutivi nel solco maggiore del DNA,

ogni testa si lega a mezzo sito

solo 26 paia di basi sono contattate "direttamente“

un piccolo numero di contatti specifici essenziali

all'interazione proteina DNA (come per RNA polimerasi)

l’operatore di Lac è un palindromo lega DUE repressori

principio universale: i fattori di trascrizione molto raramente

agiscono come singola molecola

quasi sempre agiscono in coppia, come tetramero etc.

questo si riflette nella struttura del loro consensus sul DNA.

ciascun monomero stabilisce contatti quasi identici

aumentando l'affinità di legame, in generale:

raddoppiare i contatti →2xG→costante di affinità al quadrato

Asse di simmetria

l’operone lac possiede tre sequenze operatore

la repressione si manifesta quando un TETRAMERO di

repressore si lega al DNA prendendo contatto con due siti

operatore

stabilità del legame aumentata dalle quattro interazioni

legame cooperativo

COOPERATIVITA’ NEI FATTORI DI TRASCRIZIONE

le interazioni molecolari deboli sono alla base della regolazione dei sistemi biologici;

regolazione =reversibilita’, come un semaforo; tanto piu’ fine e’ la frequenza on-off, tanto piu’ fine sara’ la

regolazione

Le molecole che lavorano assieme si contattano e si staccano continuamente.

Nelle molecole la interazione fisica (formazione complesso) e’ dettata da 1) affinita’ reciproca (valore

termodinamico); 2) dalla loro concentrazione

Tipicamente I fattori di trascrizione non agiscono da soli ma come dimero, tetramero, ottamero etc

Perche’?? ==> COOPERATIVITA’, legame cooperativo. Due ligandi si legano fra loro in modo tale che il

legame al DNA di uno di questi ligandi aiuti il legame al DNA dell’altro.

La cooperativita’ puo' anche essere percepita come aumento di affinita’ di una molecola al DNA se ce ne

un’altra gia’ legata.

C’e’ piu’ ordine=maggiore G.

Per es. Questo vale non solo nel caso del legame a sequenze palindrome di due teste del lac repressor…

ma anche per il contato di diversi operatori nel tetramero. Se il repressore di lac e’ legato al suo

operatore canonico, si potra’ legare con maggiore efficienza (cioe’ con migliore forza) ad un operatore piu’

prossimale (5’). NB la relazione tra energia di legame ed equilibrio chimico e’ di tipo esponenziale (2x

energia di legame = 10x di affinita’)

L’idea della cooperativita’ puo’ essere intuitivamente spiegata

ance come un aumento di concentrazione locale. Una molecola

trattiene quell’altra in vivinanza, aumentanto le probabilita’ di

incontrare il target.

PERCHE’ LA COOPERATIVITA’ E’ IMPORTANTE

Permette ad una proteina di legarsi meglio di quanto la sua affinita’ le permetterebbe.

Un fattore di tx, per essere funzionale, non solo deve legare il suo sito target (consensus) sul DNA

al alta affinita’ ma deve anche avere la una affinita’ piu’ bassa possibile per il resto del DNA ( un

“reagente” che e’ enormemente piu’ concentrato…) . In altre parole e’ il rapporto di affinita’

specifico/non specifico che conta!. Se si aumenta la affinita’ (rendendo la proteina piu’ grande e

sofisticata), si potrebbe aumentarla anche per I falsi bersagli==> inutile !! perche il ns fattore di Tx

rimarrebbe troppo tempo legato a siti non corretti. LA COOPERATIVITA’ RISOLVE IL PROBLEMA: e’

una strategia che si e’ evoluta per aumentare l’affinita’ senza pagarne I rischi. Legandosi a due siti

adiacenti in modo cooperativo, una proteina aumenta drasticamente la propria affinita’ senza

aumentare quella per gli altri siti aspecifici. Sono dei multimeri: e’ praticamente impossibile che due

molecole della stessa proteina si leghino a due siti sbagliati, per caso, nello stesso momento. La

cooperativita’ scatta sono nei loro siti consensus giusti.

con questo meccanismo l’operone lac è represso

quando è necessaria la trascrizione

dell’operone la repressione viene eliminata

induzione operone lac

le molecole di induttore

interagiscono con il tetramero

ne causano una modifica

conformazionale che riduce

drammaticamente l'affinità

delle teste del repressore per il

DNA.

il repressore è una

proteina allosterica

la repressione non è mai totale, trascrizione basale:

presenza di poche molecole di permeasi e di b-galattosidasi

induttore = allolattosio

prodotto da b-galattosidasi

come può entrare il lattosio e come si produce allolattosio

se l’operone è represso?

il paradosso dell’induzione

10 molecole

di repressore

tetramerico

per cellula

nella cellula batterica non c’è mai

repressore lac libero

i batteri sono aploidi (una sola copia ci ciascun gene)

Jacob e Monod hanno realizzato dei batteri parzialmente diploidi

(merodiploidi) per l’operone del lattosio (lacZ, lacY e lacA) e le sequenze

vicine (lacI) (locus lac) e osservato come cambiava il fenotipo quando i

merodiploidi contenevano una copia mutata e una wild type

LA FORZA DELLA GENETICA: gli esperimenti di Jacob e Monod

LA SCOPERTA DELL'OPERONE

mutanti di tipo diverso

Mutare il repressore o il sito operatore avrà lo stesso

effetto?

derepressione e trascrizione costitutiva dei geni lac

ma c'e' una differenza:

una mutazione nella sequenza dell'operatore non potrà

che agire in cis sullo stesso filamento di DNA

(mutazione cis-agente)

al contrario, LacI codifica una proteina, cioè un prodotto

solubile diffusibile e quindi avrà effetti anche su una

molecola di DNA separata (mutazione trans-agente)

concetto di mutazioni CIS e TRANS:

mutazioni costitutive cis agenti

mutazioni nell’operatore (Oc) causano l’espressione

costitutiva dei geni strutturali

il repressore non si può legare

agiscono in cis interferendo solo sui geni che si

trovano contigui ad esse, sullo stesso tratto di DNA

mutazioni nel promotore (che impediscono il

legame della RNA pol) operone mai inducibile

mutazioni dominanti

LA MUTAZIONE nell’operatore di lac, NON viene complementata da una

copia aggiuntiva del locus lac wild-type. L’espressione rimane costitutiva

nel cromosoma mutante.

Le mutazioni

nell'operatore sono

Cis-dominanti

preché l’operatore è

inseparabile dai

geni che controlla

mutazioni trans-agenti

mutazioni del repressore

lacI- impediscono la sintesi del repressore o

producono un repressore non funzionante

i geni strutturali sono sempre espressi

lacI-d il repressore non è in grado di legare

l’operatore

i geni strutturali sono sempre espressi

lacIs il repressore non è in grado di legare o

rispondere all’induttore

i geni strutturali sono sempre repressi

recessive

dominanti

negative

LA MUTAZIONE in lacI VIENE complementata da una copia aggiuntiva

del locus lac wild-type. Il repressore wild type diffonde e lega l’operatore

del cromosoma mutante e della copia aggiuntiva

questa mutazione trans è recessiva

TRANS-DOMINANZA e DOMINANZA NEGATIVA

Ovvero diversi domini

funzionali

controllo POSITIVO

dell'operone lac

CAP si chiama anche CRP: cAMP Receptor Protein

operone LacZ: ATTIVAZIONE

CRP provoca il ripiegamento del DNA

CRP

Le modalità di azione di attivatori diversi o dello stesso

attivatore su promotori diversi possono essere varie

Nota come possano agire

anche a distanza

CONTROLLO

INTEGRATO…

una visione

d'insieme

NO cAMP

NO cAMP

YES cAMP