Quando il cariotipo non ce la fa GENETICA MOLECOLARE INDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICA STRUTTURA,...

Quando il cariotipo non ce la Quando il cariotipo non ce la fafa

GENETICA MOLECOLAREGENETICA MOLECOLARE

INDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICAINDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICASTRUTTURA, PROPRIETA’ E FUNZIONAMENTO DEI GENISTRUTTURA, PROPRIETA’ E FUNZIONAMENTO DEI GENI

La Citogenetica La Citogenetica MolecolareMolecolare

Abbina la possibilità di un’analisi del DNA, propria delle tecniche di biologia molecolare, con la

struttura cromosomica il cui studio è oggetto della citogenetica classica.

La Citogenetica La Citogenetica MolecolareMolecolare

• Permette un’analisi mirata di una regione cromosomica consentendo di mettere in evidenza riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi.

Tecniche di citogenetica molecolare

• FISH (fluorescence in situ hybridization)

• PRINS (primed in situ labeling)

• PCR in situ (polymerase chain reaction in situ)

• CGH (comparative genomic hybridization)

• ecc.

FISH (Fluorescence in situ hybridization)

•È una tecnica di ibridazione che permette, dopo fissazione di metafasi e nuclei in interfase su vetrino, di identificare sequenze specifiche negli acidi nucleici.

•Tale identificazione avviene mediante sonde marcate in maniera non isotopica, impiegando fluorocromi che emettono a diverse lunghezze d’onda.

Nel cromosoma si distinguono:

TIPI DI SONDE

ABERRAZIONI

CROMOSOMICHE

IDENTIFICABILI

MATERIALE

IMPIEGATO

Sequenze ripetute- Trisomie

- MonosomieNuclei in interfase

Painting

- Riarrangiamenti

cromosomici

- Identificazione di

cromosomi marcatori

Metafasi

Sequenze uniche

- Microdelezioni e

duplicazioni

- Riarrangiamenti

cromosomici

Metafasi e

nuclei in interfase

LA FISH IN DIAGNOSI PRENATALE

• Da 15 ml di liquido amnioticometafase: - Cariotipo

- FISH per diagnosi di microdelezioni

- FISH per diagnosi di riarrangiamenti

cromosomici • Da 2 ml di liquido amniotico

nucleo: - FISH per diagnosi di sesso FISH per anomalie numeriche

DIAGNOSI DI ANEUPLOIDIE

FISH

SVANTAGGI

• costi elevati• diagnosi non

completa

VANTAGGI

• rapidità• identificazione di

microdelezioni e riarrangiamenti complessi

• diagnosi su nucleo

CHROMOSOME PAINTING

Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) è una tecnica semplice e rapida che consente la diagnosi molecolare delle aneuploidie più comuni (trisomia 21, 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali)

Questo tipo di approccio non richiede colture cellulari: la diagnosi può essere completata in 2 giorni

QF-PCR

Il metodo si basa sull'amplificazione di brevi sequenze del DNA che contengono blocchi ripetuti di 2-6 basi (marcatori STRs). Queste sequenze sono specifiche per il cromosoma che si intende analizzare. Usando marcatori per i cromosomi 21, 13, 18, X e Y è possibile diagnosticare le aneuploidie più frequenti.

Quantitative Fluorescent PCR

Trisomy detection in prenatal samples

Ratio: 1 : 1 : 1

Hypervariable region on chromosome 21 amplified by F-PCR

Ratio: 1 : 2

Quali sono i campioni biologici più frequentemente reperibili sulla scena di un crimine?

Ma anche da utilizzare per effettuare analisi genetiche?

REPERTI DA CUI E’ POSSIBILE ESTRARRE IL DNAREPERTI DA CUI E’ POSSIBILE ESTRARRE IL DNA

• sanguesangue

• liquido seminaleliquido seminale

• tessuti organicitessuti organici

• salivasaliva

• sudoresudore

• ossaossa

• dentidenti

• fibre piliferefibre pilifere

• urinaurina

• fecifeci

• sanguesangue

• liquido seminaleliquido seminale

• tessuti organicitessuti organici

• salivasaliva

• sudoresudore

• ossaossa

• dentidenti

• fibre piliferefibre pilifere

• urinaurina

• fecifeci

IL DNA fingerprinting è attualmente la tecnica più potente per identificare un campione biologico.

Viene utilizzata dal 1984 in medicina forense (medicina legale) per risolvere casi legali: attribuzione di paternità, casi di omicidi, casi di stupri, ecc.

La Genetica forense, ossia l’applicazione della Genetica nella risoluzione dei casi legali, si avvale della variabilità del genoma umano per identificare un individuo, o meglio per attribuire un campione biologico ad un unico individuo.

I marcatori polimorfici (soprattutto gli STR) sono stati estremamente utili per ottenere una prima mappa globale del genoma umano

L’utilizzo simultaneo della PCR e di traccianti fluorescenti consente l’analisi simultanea (multiplex) di

moltissimi polimoprfismi

È stato recentemente dimostrato che il Ritardo Mentale può essere causato da riarrangiamenti cromosomici subtelomerici

non evidenziabili mediante tecniche di citogenetica classicama mediante tecniche di citogenetica molecolare

a causa delle loro ridotte dimensioni.

Ritardo mentale

• Patologia eterogenea ad etiologia mista costituita da un numero molto elevato di entità nosologiche differenti, le cui cause sono solo in parte note.

• Prevalenza nella popolazione generale si aggira attorno al 2-3%; la grande maggioranza rientra in ritardi di modesta entità, mentre lo 0.3-0.4% della popolazione generale presenta un ritardo severo.

CGH convenzionale e microarray

CGH convenzionale• Risoluzione di circa 10 Mb

Array-CGH• Risoluzione teoricamente illimitata

Screening dell’intero genomaScreening dell’intero genoma

Array-CGH o Molecular Karyotyping

Caratteristiche generali• La risoluzione dipende dalla distanza genomica tra gli elementi

sull’array e dalla loro dimensione• La sensibilità è influenzata dal rapporto segnale/rumore• L’intensità del segnale è determinata dalla complessità del DNA

contenuto negli spot e dalla qualità del campione

Vantaggi• Indipendenza da cellule in divisione• Capacità di analizzare l’intero genoma in un esperimento• Elevata specificità, sensibilità e risoluzione• Rapidità

Array – CGH o Molecular KaryotypingSvantaggi• Incapacità di rilevare riarrangiamenti bilanciati e

poliploidie• Limitata abilità di individuare mosaicismi

Fattori tecnici influenti• Specificità e intensità dei segnali di ibridazione• Quantità e qualità del campione di DNA

Fattori biologici influenti• Sequenze altamente ripetute e disperse• Presenza di low-copy repeats (LCRs) • Presenza di polimorfismi del numero di copie (LCVs)

Applicazione dell’array-CGH ai casi di ritardo mentale

L’estensione dell’array dalla ricerca alla diagnosi richiede attendibilità e interpretabilità dei risultati

•Conferma degli esperimenti tramite FISH (BAC)•Estensione dell’analisi ai genitori•Cautela nell’interpretazione di singoli cloni (oligo)

Utilità dell’applicazione ai pazienti con RM:Descrizione del difetto molecolare Identificazione dei geni

Migliore classificazioneDiagnosiNuove terapie

E’ possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cmE’ possibile avere 500,000 probe in uno spazio di 1.28 cm22

Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi Ogni singolo probe è costituito da milioni di oligonucleotidi identiciidentici

Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) è presente un oligo Per ogni oligo che presenta un match perfetto (PM) è presente un oligo identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM) identico con mismatch per una sola base in posizione centrale (MM) La presenza di un MM consente di La presenza di un MM consente di stimare legami aspecifici e background stimare legami aspecifici e background locale e di sottrarli dal segnalelocale e di sottrarli dal segnale di PMdi PM

SNPs-array (Affymetrix GeneChip 250K)SNPs-array (Affymetrix GeneChip 250K)

•Risoluzione di 5 KbRisoluzione di 5 Kb•250,000 SNPs250,000 SNPs

Intensità di segnale rilevata da uno scanner e i dati elaborati da un Intensità di segnale rilevata da uno scanner e i dati elaborati da un softwaresoftware

DiagnosiDiagnosi

prenataleprenatale

• La diagnosi prenatale comprende l’insieme delle procedure che permettono di riconoscere o escludere la presenza nel feto di anomalie congenite.

Test rapidi in diagnosi prenatale

• Identificano solo le aneuploidie dei cromosomi in analisi

• Non è in grado di diagnosticare traslocazioni e delezioni

• La contaminazione con DNA materno può rappresentare un problema

• La presenza di mosaicismo fetale è un problema

• La FISH non si può eseguire se è presente una piccola contaminazione da sangue materno

Svantaggi Vantaggi • Tempi rapidi di risposta

• Risultato entro 2-3 giorni

• Il rischio di falsi positivi e falsi negativi riportato in letteratura è basso

• E’ necessario poco materiale di partenza

• QF-PCR è meno costosa e laboriosa della FISH e della citogenetica classica

• QF-PCR può essere automatizzata

• La QF-PCR può essere eseguita anche se nel campione è presente una certa contaminazione da sangue materno

• Lo scopo della diagnosi prenatale (DP) è quello di offrire ai genitori e al medico le migliori informazioni possibili sui rischi di dare alla luce un bambino affetto da un'anomalia congenita o da una malattia genetica.

• Due tipi di tecniche di DP : invasive e non invasive.

DIAGNOSI PRENATALE

Dati recenti indicano che circa il 2-5% dei neonati è affetto da una malattia genetica

Esistono 4 gruppi di patologie per le quali esiste la possibilità di effettuare la DP:

- Anomalie cromosomiche;

- Malattie genetiche (errori del metabolismo, emoglobinopatie..);

- Infezioni fetali;

- Malformazioni fetali

LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO

Diagnosi preimpianto

Il materiale cellulare prelevato dagli oociti o dall’embrione coltivato in vitro è esaminato in relazione ad una determinata anomalia genetica. Dopo la diagnosi gli embrioni non affetti (ma non sempre…) sono selezionati e trasferiti nell’utero. 1990 prima applicazione per determinazione del sesso in malattie X-linked 1992 prima nascita di un embrione selezionato (fibrosi cistica)

Biopsia dei corpi polari l’oocita maturo è dotato di un primo corpo polare (meiosi I) che può essere prelevato per evidenziare l’assetto cromosomico o l’allele in un gene patologico il secondo corpo polare può essere prelevato dopo la fertilizzazione in vitro per confermare la diagnosi

Biopsia dell’embrione allo stadio di divisione di 8-12 cellule (3° giorno) una o due cellule possono essere prelevate senza arrecare danno all’embrione dopo la diagnosi, gli embrioni selezionati possono essere trasferiti in utero in alternativa biopsia allo stadio di blastocisti (300 cellule circa, 4°-5 giorno), ma è difficile coltivare in vitro l’embrione sino a questo stadio

• Efficacia nella diagnosi : 93-95% (non 100%)

• Eventuale contaminazione con materiale cellulare esterno

• Non si esclude la presenza di malattie cromosomiche non ricercate.

• Si consiglia conferma della diagnosi con Villocentesi / Amniocentesi

Legge 19 febbraio 2004, n. 40Art. 13 È vietata…ogni forma di selezione a scopo eugenetico degli embrioni e dei gameti… ad eccezione degli interventi aventi finalità diagnostiche e terapeutiche…volte alla tutela della salute e allo sviluppo dell'embrione stesso

Diagnosi genetica pre-impianto

Diagnosi genetica pre-impianto

Possibile già oggi per malattie monogeniche per cui sia nota la mutazione

In futuro, almeno in teoria, è probabile che questa tecnica, in combinazione con l’analisi simultanea di

moltissimi polimorfismi, possa permettere una valutazione di tratti genetici complessi.

Quali i vantaggi, e quali i pericoli?

LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO

• Negli ultimi 50 anni è aumentata in modo esponenziale la richiesta di indagini che durante la gravidanza permettano il riconoscimento di difetti o malformazioni fetali.(3% pop gen)

• Aumentate conoscenze scientifiche su malformazioni e difetti genetici e rischio genetico

• Aumentata capacità diagnostica • Riduzione del numero di figli/coppia nel mondo

industrializzato• Richiesta esplicita di “figlio sano”• Ricerca tardiva del primo concepimento• Legislazioni su IVG

LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO

• INVASIVA

• PRELIEVO VILLI CORIALI (CVS)

• AMNIOCENTESI

• CORDOCENTESI

• FETOSCOPIA

• NON- INVASIVA

• ECOGRAFIA (Soft markers)

• BI-TEST• TRI-TEST

• RICERCA SANGUE FETALE NEL PLASMA MATERNO

LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO NON INVASIVA

• BI-TEST/ DUO-TEST.• Screening biochimico: dosaggio su sangue materno

BHCG e PAPP-A + esame ecografico per datazione• Si esegue alla 10°-14° settimana• Aumento HCG e diminuzione PAPP-A aumentato

rischio di SDR Down• Attendibilità al 60%• DUO TEST + NT 80%

LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO NON INVASIVA

• TRI-TEST:• Screening biochimico:dosaggio su sangue

materno di alfa fetoproteina+ BHCG+estriolo non coniugato

• Associato ad esame ecografico per datazione• AF ridotta (25-30%)+ BHG aumentata+estriolo

ridotto aumentato rischio SDR Down• Attendibilità al 60%

SCREENING PRENATALESCREENING PRENATALE

L’AFP ( alfa feto proteina) è prodotta nel sacco vitellino e nel fegato fetale ed una parte di questa sostanza si trova anche nel sangue materno. In tutte le lesioni di continuo della cute quali spina bifida aperta, gastroschisi, estrofia vescicale LPS etc. una maggiore quantità può essere rilevata nel sangue materno.

Questa indagine è pertanto utilizzata per verificare queste condizioni che potranno poi essere confermate anche con l’ausilio della indagine ecografica.

In presenza di un feto con S. di Down, l’AFP è ridotta nel sangue materno, presumibilmente perché sia il sacco vitellino che il feto sono più piccoli.

L’ESTRIOLO è un ormone prodotto dalla placenta che utilizza precursori derivati dal fegato e dalla surrenale. L’estriolo è ridotto in presenza di un feto con S. di Down

La GONADOTROPINA CORIONICA UMANA è prodotta dalla placenta ed il suo dosaggio è utile a confermare una gravidanza in atto. Una subunità di questo ormone, detta BETA aumenta in presenza di un feto con s. di Down.

L’elaborazione dei valori di questi parametri e le conclusioni debbono tenere conto però dell’età gestazionale che va definita mediante esame ecografico.

LE TECNICHE DI DIAGNOSI NON INVASIVE

E' importante tenere presente che QUESTE TECNICHE DI INDAGINE consentono di effettuare quasi esclusivamente una valutazione probabilistica, cioè, non permettono di identificare o di escludere direttamente le anomalie cromosomiche ma di selezionare pazienti a basso e ad alto rischio.

LE TECNICHE INVASIVE

- BIPOSIA VILLI CORIALI

- AMNIOCENTESI

- FUNICOLOCENTESI

- FETOSCOPIA

LE TECNICHE DI ANALISI

TECNICHE CITOGENETICHE

TECNICHE DI INDAGINE MOLECOLARE

TECNICHE IMMUNOLOGICHE

INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE CITOGENETICHECITOGENETICHE

• madri di età avanzata: superiore a 35 anni

• coppie con precedenti figli affetti da patologia cromosomica

• genitori con anomalie cromosomiche bilanciate

• riscontro ecografico di malformazioni fetali, ritardo dello sviluppo fetale, anomalie del la

• alterazione di alcuni parametri biochimici

• genitori portatori di aneuploidie non associate ad infertilità

• alcune malattie mendeliane

• gravidanze ottenute con fecondazione artificiale

INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE BIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARIBIOCHIMICHE E BIOMOLECOLARI

• malattie mendeliane, X-linked, mitocondriali per le quali è stato identificato il difetto metabolico

• malattie mendeliane, X-linked, mitocondriali per le quali è stato identificato il difetto genico

INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE INDICAZIONI ALLA DIAGNOSI PRENATALE IMMUNOLOGICHEIMMUNOLOGICHE

• malattie infettive a trasmissione verticale contratte o riacutizzatesi durante la gravidanza

Le più frequenti sono le malattie infettive del gruppo TORCH

Problemi nella diagnosi prenatale

• 1. Possibilità che le cellule in coltura non crescano in maniera adeguata e non sia possibile effettuare la diagnosi sul campione prelevato.

Presso i centri più qualificati questo problema si verifica eccezionalmente, in media in meno dell’1% dei campioni.

• 2. Possibilità che l’analisi fornisca un risultato ambiguo.

Questo può dipendere da una contaminazione materna, che dà quindi origine alla presenza di due linee cellulari, potenzialmente non differenziabili se il feto è di sesso femminile, mentre di solito sono facilmente evidenziabili se il feto è di sesso maschile. In altri casi può essere presente una seconda linea cellulare originata da una mutazione in vitro. È indispensabile riuscire a differenziare i campioni che contengono artefatti della coltura (pseudomosaicismo) dai mosaicismi veri, in quanto le implicazioni per il feto sono completamente diverse (rispettivamente sano e ammalato).


• 3. Diagnosi certa ma implicazioni fenotipiche incerte Questo costituisce attualmente un importante limite della diagnosi citogenetica fetale. In pratica, a fronte di un risultato diagnostico accurato a livello di laboratorio, non è possibile in certi casi predire con altrettanta accuratezza il fenotipo fetale. In queste situazioni viene attribuito un rischio empirico di patologia, che non è ulteriormente precisabile.


The future

• Fetal cells in the maternal circulation

• Free fetal DNA in maternal plasma

• If diagnostic – no need for CVS or amniocentesis to detect chromosome abnormality

• Persistenza di cellule staminali fetali nel sangue e tessuti materni per decadi postpartum (Bianchi, ‘96)

• Anticorpi monoclonali CD34 antigeni di superficie di HSCs fluorescent activated cell sorting+PCR amplification di Y isolamento di HSCs Y in 6 donne poratrici di feti femmine

• Isolamento di Y-DNA in cellule CD34+ di 6/8 donne non gravide di cui la più anziana aveva partorito un maschio 27 anni prima

Cellule ♂ nel sangue materno per lungo tempo dopo il partoMICROCHIMERISMO

Fetomaternal trafficking and maternal health Fetal cells graft versus host disease??

• Nelson (96): microchimerismo alcune malattie più comuni nelle donne che negli uomini. Nel sangue periferico di donne affette da sclerosi sistemica cellule fetali ♂

• Identificazione di cellule fetali ♀ nel sangue materno con polimorfismi familiari specifici o paterni

• Johnson () ha identificato con metodiche di FISH e sonde per Y e X cellule fetali nei tessuti clinicamente affetti di una donna deceduta per perforazione intestinale da LES : milza, tiroide, rene, grosso intestino, polmone, cuore, cute e piccolo intestino (> 500 cellule ♂)

• Successivamente in altre malattie: sclerosi sistemica, LES, cirrosi biliari primario, sind Sjogren, Hashimoto, Graves e lichen planus

Conclusioni da un ampio corpo di studi sul microchimerismo umano dimostrano un

transfer di cellule fetali multipotenti verso la loro madre

• Koopmans (05) con sonde Y-FISH ha identificato cellule ♂ in campioni istologici di donne sane (rene, fegato, cuore)

• Cellule di feti ♂♀abortiti persistono e ripopolano i tessuti materni (fegato, reni) a distanza di 17-19 anni Johnson (02)

Panel di 13 mutazioni usato per la diagnosi prenatale

F508 57%

N1303K 7%G542X 5%W1282X 3%2183AA-G 3%1717-1G-A 2% I148T 1%R553X 1%

L1065PG1244G4016insTR1158X711+1GT

86%

PECULIARIDEL SUD

( 7%)

• Precedente figlio con patologia cromosomica

Le coppie che hanno un figlio con sindrome di Down da trisomia 21 libera o con traslocazione robertsoniana de novo hanno un rischio dell’1% circa di ricorrenza della sindrome. Nelle coppie attempate il rischio è quello calcolato sull’età materna.

Indicazioni per la diagnosi prenatale

- Genitori eterozigoti per anomalie bilanciate

I genitori eterozigoti per una traslocazione bilanciata hanno un rischio di patologia fetale sbilanciata del 5-10%. Tuttavia tale rischio varia ampiamente in rapporto al tipo di riarrangiamento


• Identificazione ecografica di patologia fetale o della gravidanza

in presenza di difetti strutturali e/o dello sviluppo fetale o alterazioni del volume del liquido amniotico.In circa il 20% di queste gravidanze, soprattutto quando sono presenti difetti associati, il feto è affetto da una patologia cromosomica. Il riscontro di anomalie ecografiche costituisce perciò un’indicazione al monitoraggio del cariotipo fetale.


- Anamnesi familiare positiva per difetti del tubo neurale

- Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite

• Malformazioni e/o rimozioni chirurgiche dell’ovaio o parti di esso (RR DS + 9.6)

• Malattie mendeliane


Effetti delle mutazioni

• Letali• Subletali• Condizionali• Neutre• Silenti• Vantaggiose• Svantaggiose• Pleiotropiche

Il 100% muore prima dell’età riproduttiva

Il 50% muore prima dell’età riproduttiva

Restrittive e permissive

Non hanno effetti sul fenotipo

Inalterata la proteina genica (polimorfismi)

Favoriscono cambiamenti favorevoli

Effetti fenotipici malattia

Singole mutazioni diversi caratteri

counselling

•Indicazioni•Controindicazioni•Tecnica•Complicanze

“Early”: 10-14 sett“Mid”:15-18 sett“Tardiva”:II-III trim

Le fonti del liquido amniotico

•10 sett il volume medio di LA 30 ml •incremento di 20 ml/sett alla 14a sett

(accumulo di LA gradiente osmotico tra feto-cav amniotica)

•16 sett. volume medio di LA 200 mldopo la 14a sett la deglutizione e la minzione diventano

significative ed il volume medio di LA si raddoppia

Tessuti che contribuiscono alla popolazione cellulare del LA:•desquamazione di cellule da organi fetali, amnios e cordone.

•20% di cellule viabili•fibroblasti maggiore capacità riproduttiva

“early” o “mid”•Cariotipo fetale

•Analisi genetiche molecolari•Dosaggio di analiti ( FP, etc)

•Diagnosi di malattie infettive fetali

“tardiva”•Maturità polmonare fetale•Evacuazione polidramnios

•Amnioinfusione

Amniocentesi : indicazioni (GU n.245 del 20/10/1998)

• Età materna avanzata 35 a• Genitore con precedente figlio affetto da patologia

cromosomica• Genitore portatore di riarrangiamento strutturale non

associato ad effetto fenotipico• Genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali

compatibili con la fertilità• Anomalie malformative evidenziate con USG• Rischio aumentato di feto affetto da s. di Down in base

al triplo test (1/250) o su screening USG attuati sulla base di specifici programmi regionali.

Controindicazioni

• Assolute: nessuna vera.

• Relative:

problematiche tecniche (sovrapposizione di anse intestinali, miomi etc.)

Infezioni materne (HIV, epatiti???)

Amniocentesi: fase preliminare

• Accurato counselling della gestante su tutti gli aspetti dell’esame per un consenso realmente informato

• Adeguato supporto psicologico• Paziente in posizione supina (adeguato stato

di riempimento vescicale) • Ecografia• Disinfezione dell’addome• Eventuale anestesia locale

Ecografia per l’amniocentesi

Viabilità fetale

Numero di feti

Eventuali anomalie

Topografia placentare

Età gestazionale

Volume di LA

Tasca di LA utile per il prelievo.

AmniocentesiAmniocentesi

Procedura1. Disinfezione cutanea;2. Infissione eco-guidata di un ago

sterile munito di mandrino (20-22G di diametro e 7-12 cm di lunghezza) mediante tecnica a “mano libera”, in cui l’operatore tiene in una mano la sonda e nell’altra l’ago in modo da dirigere il fascio d’ultrasuoni sul piano d’inserzione dello stesso e visualizzarlo in tutta la sua lunghezza, oppure “ago-guidata”, in cui l’ago è fissato al trasduttore e percorre una traiettoria fissa (l’operatore visualizza solo la punta dell’ago);

AmniocentesiAmniocentesi

PROCEDURA3. Giunto in cavità l’ago,

estrazione del mandrino ed aspirazione con siringa sterile di 15-20 ml di liquido amniotico

(è preferibile eliminare i primi 1-2 ml di liquido amniotico in quanto potenzialmente contaminati da tessuto materno);

4. Estrazione dell’ago e controllo del battito cardiaco fetale.

Complicanze immediate

Procedurali :• Prelievo difficile

(dry tap, bloody tap, ripetizioni)

Postprocedurali • Contrazioni dolorose• Bleeding• Perdite di LA

Rischi materni

Infezioni

Iso-RH

Ansia

Infezioni materne•Amnioniti : 1/8000 Crane (1983) 0.1% Turnbull (1983) 1/1000 Schemmer (1993)•Forme subcliniche ???•Complicanze mortali: rischio inesistentee non calcolabile

Procedura non sterile

Contaminazionesecondaria a

lesioni intestinali

Altri rischi materni• Iso-Rh : rischio di emorragia feto-materna in

amniocentesi non complicate è 11% (Tabor, 1986)

• Ansia : lo stress psicologico è comune ed è dipendente dalle indicazioni e dal counselling

Immunoprofilassi antiD<20 sett : 250 IU IgG anti D>20 sett : 500 IU IgG anti D

(raccomandazione grado B - RCOG, 1999)

Rischi fetali

Danni diretti:perdite fetali,

traumi

Morbilità darimozione del LA:

respiratoria,ortopedica

esperienza dell’operatoreIn uno studio danese su 3000 gravidanze Leschot 1985 ha

trovato una FLR di 1.53% per le prime 1500 A e di

0.47% per le successive

Traumi fetaliTraumi fetali

• La reale incidenza di traumi diretti fetali è sconosciuta

• Studi di follow-up neonatale suggeriscono 2-9% di lesioni cutanee minori (Epler 79)

• Isolati gravi danni sono stati descritti: testa, porencefalia, cecità unilaterale, danni intestinali (atresia ileale con fistola ileocutanea), arti inferiori, infarto di un braccio, rottura del tendine patellare, lesioni di nervi periferici

Prelievo dei Villi CorialiINDICAZIONI:INDICAZIONI:

Determinazione del cariotipo fetaleDeterminazione del cariotipo fetale

• età materna avanzata (>35 anni);età materna avanzata (>35 anni);• genitore portatore di arrangiamento genitore portatore di arrangiamento • cromosomico strutturale;cromosomico strutturale;• genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali

compatibili con la fertilità; compatibili con la fertilità;

• precedente figlio con malattia cromosomica;precedente figlio con malattia cromosomica;• malformazioni fetali rilevate all’esame ecografico;malformazioni fetali rilevate all’esame ecografico;• test ecografico o biochimico che indichi un rischio test ecografico o biochimico che indichi un rischio

elevat elevat per sindrome di Down o altra anomalia per sindrome di Down o altra anomalia

cromosomica;cromosomica;

Esame del DNA fetaleEsame del DNA fetale

Studio di attività enzimaticheStudio di attività enzimatiche

Prelievo dei Villi Coriali

Prima del prelievo:• Effettuare un adeguato

counseling • Far firmare il modulo del

consenso informato;• Eseguire un controllo

ecografico per valutare numero e vitalità

dell’embrione/i, rilevarne la biometria (CRL), localizzare il chorion frondosum e scegliere il punto più idoneo per l’inserzione dell’ago.

Prelievo dei Villi Coriali

Modalità di esecuzione dell’esame:• Via transcervicale mediante catetere di polietilene con

mandrino di alluminio o pinza da biopsia rigida;

• Via transaddominale mediante ago di calibro di 20

Gauge e lunghezza adeguata.

Prelievo dei Villi CorialiPrelievo dei Villi Coriali

Prelievo dei Villi CorialiPrelievo dei Villi CorialiComplicanzeComplicanze

• Perdita fetale:Perdita fetale: Il prelievo dei villi coriali comporta un rischio Il prelievo dei villi coriali comporta un rischio

aggiuntivo di perdita fetale dell’3%, correlato a aggiuntivo di perdita fetale dell’3%, correlato a diversi fattori:diversi fattori:

età materna avanzata;età materna avanzata;

numero di tentativi di prelievo;numero di tentativi di prelievo;

assetto citogenetico della placenta assetto citogenetico della placenta (mosaicismo);(mosaicismo);

epoca di gravidanza; epoca di gravidanza;

esperienza dell’operatore.esperienza dell’operatore.RCOG, 2005

Prelievo dei Villi Coriali• Lesioni e malformazioni fetali: Il prelievo dei villi coriali eseguito primo della 10a

settimana si associa ad un aumentato rischio di malformazioni degli arti (soprattutto trasverse limb defects) e di anomalie della regione oromandibolare (ipoplasie oro-mandibolari).

• Altre complicanze: Complicanze settiche (più frequenti in caso di

CVS-TC, rare in caso di CVS-TA); Isoimmunizzazione Rh in caso di donne Rh

negative con test di Coombs negativo (è opportuno effettuare profilassi mediante iniezione di immunoglobuline anti-D).

RCOG, 2005

Prelievo dei Villi Prelievo dei Villi CorialiCoriali

Successo e accuratezza diagnosticaSuccesso e accuratezza diagnostica• Successo del prelievo nel 98% dei casi al primo

tentativo, nel 99,8% con due tentativi;• Fallimento dell’esame nello 0,5-1% dei casi per

scarsità del materiale prelevato;• Falsi positivi dell’esame citogenetico nell’1%

dei casi circa per la presenza di mosaicismi placentari (90%) e raramente per aneuploidie non a mosaico;

• Falsi negativi degli esami citogenetici sono rarissimi (1 su 3000) utilizzando la sola tecnica diretta, eccezionali (1 su 20.000) utilizzando l’analisi diretta insieme a quella colturale.

SIEOG, 2006

CordocentesiCordocentesi

INDICAZIONIINDICAZIONI• Studio dei parametri ematologici del feto per la diagnosi

di: difetti dell’emostasi (emofilia, trombocitopenia alloimmune), patologia ematologiche (anemia fetale su base infettiva o per alloimmunizzazione materno-

fetale);

• Determinazione rapida del cariotipo fetale (48-72 ore) nei casi di: mosaicismo o fallimento di precedenti prelievi, positività di markers ecografici di

cromosomopatia, malformazione fetale potenzialmente associata a cromosomopatia; SIEOG, 2006


INDICAZIONIINDICAZIONI• Terapie mediche fetali, quali: somministrazione di sangue e/o piastrine, somministrazione di farmaci antiaritmici in feti con aritmie cardiache;

• Studio del DNA fetale;

• Ricerca di agenti infettivi.


Prima del prelievo:• Effettuare un adeguato

counseling; • Far firmare il modulo

del consenso informato;

• Eseguire un controllo ecografico per valutare la posizione del feto, rilevarne la biometria, localizzare la placenta e scegliere il punto più idoneo per l’inserzione dell’ago.

Diritti umani e bioetica

• Diritti di I generazione (diritti civili: vita, libertà), nati per difendere il cittadino dai poteri dallo Stato

• Diritti di II generazione (diritti sociali: salute, lavoro, istruzione, informazione, ecc.), che invece richiedono l’incremento degli interventi statali

• Diritti di III generazione (solidarietà, sviluppo, pace internazionale, ambiente protetto, comunicazione, ecc.)

• Diritti di IV generazione ( diritti delle generazioni future, diritto ad un patrimonio genetico non manipolato, ecc.)

Questi ultimi diritti toccano da vicino la bioetica che, tuttavia, li abbraccia Questi ultimi diritti toccano da vicino la bioetica che, tuttavia, li abbraccia tuttitutti (es. diritto alla vita nell’aborto, diritto alla libertà nella procreazione assistita, ecc.), pur nella difformità di vedute dei diversi orientamenti etici.

Il tema dei diritti è centrale in bioeticaIl tema dei diritti è centrale in bioetica, anche perché parlare di diritti significa elaborare un codice etico comune, in vista di un consenso condiviso

Chi ha diritto ai Diritti?Chi ha diritto ai Diritti?

• Ancora oggi “uomo” non è Ancora oggi “uomo” non è per tutti sempre per tutti sempre l’equivalente di “persona” l’equivalente di “persona” (cioè soggetto di diritti), (cioè soggetto di diritti), come vedremo nella come vedremo nella prossima lezioneprossima lezione

Modelli etici

Attualmente possiamo distinguere quattro modelli di riferimento in bioetica, ognuno dei quali si caratterizza per un differente criterio antropologico e, di conseguenza, per una diversa formulazione del giudizio etico:

MODELLO LIBERAL-RADICALE

MODELLO PRAGMATICO-UTILITARISTA

MODELLO SOCIO-BIOLOGISTA

MODELLO PERSONALISTA

Modello personalista

• Fondato sulla persona intesa come realtà singola ma anche come l’insieme delle persone

• Nasce dalla concezione filosofica dell’uomo come persona, nella quale l’universo raggiunge la massima espressione, mentre lo stesso mondo materiale acquista il suo significato. La persona umana ha, quindi, nel mondo un primato, perciò anche la società va considerata in funzione dell’uomo, non viceversa

• Poiché la natura ontologica dell’uomo è unità di corpo e spirito, la morale ed i principi di riferimento del modello personalista non possono non riferirsi al rispetto ed alla promozione di tutto l’uomo, senza trascurare né la corporeità, né la spiritualità

Modello personalista

Le dimensioni fondamentali che qualificano l'uomo in quanto persona sono:

• L'inscindibilità degli aspetti corporei - psichici - spirituali (il corpo non è solo un complesso di organi e funzioni, ma espressione visibile e luogo della realizzazione dell'uomo);

• La libertà e la responsabilità che nascono dall'intelligenza e dalla volontà;

• L'eticità che deriva dalla naturale apertura al Valore Assoluto;• Il diritto alla vita che è premessa indispensabile a tutti i diritti e i

valori;• La relazionalità che rende ragione della dimensione sociale di ogni

problema umano (il problema morale ha sempre una dimensione sociale)

Quando il cariotipo non ce la fa GENETICA MOLECOLARE INDAGA SULLA COMPOSIZIONE CHIMICA STRUTTURA,...

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