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Genova, 7/09/2013

PROGETTO DI RICERCA SUI MECCANISMI MOLECOLARI DELLA FIBRODISPLASIA OSSIFICANTE PROGRESSIVA: aggiornamenti e proposte

Con il contributo dell’Associazione FOP ItaliaGruppo di Ricerca

Dott.ssa Renata Bocciardi, ricercatore universitario, Università di GenovaDott.ssa Francesca Giacopelli, assegnista di ricerca, Università di Genova

Dott.ssa Laura Tonachini, assegnista di ricerca, Università di GenovaSerena Cappato, dottoranda, Università di Genova

DiNOGMI - Università di Genova e CEBR

U.O.C. Genetica Medica - Ist. G. Gaslini

Direttore Prof. Roberto Ravazzolo

� FOP, infiammazione e sistema immunitario innatoRegolazione dell’espressione del gene ACVR1 nelle cellule del sistema immunitario

(sia in vitro in modelli cellulari selezionati che in vivo)Studio del differenziamento delle cellule del sistema immunitario innato (iPS pz vscellule di controllo)

� Screening di composti con potenziale effetto farmacologico, messa a punto saggi funzionali

� Studio dei fattori e dei meccanismi molecolari cheintervengono nella regolazione dell'espressione del gene ACVR1

Studio della regolazione genica di ACVR1

Regione del promotore

ATG STOP

5’UTR 3’ UTRRegione codificante la proteina

mRNA 1

mRNA 2

trascrizione

traduzione

proteina

Regolazione trascrizionale• Sequence 5’UTR• Promoter• Enhancers/silencers

Regolazione Post-transcriptionale�Splicing�mRNA stabilità�Small RNA�Effetto sulla traduzione

Ruolo del 3’UTR e dei microRNA

Identificazione del promotore & analisi funzionale

Ruolo delle sequenze5’UTR in corso

Progetto ENCODE

UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu

EGR1

PU.1/SPI1

ZBTB7A

HEY-1

Genova, 7 Settembre 2013 - Laura Tonachini

Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (luciferasi)

� Abbiamo generato una linea cellulare stabilmentetrasfettata esprimente il gene reporter dellaluciferasi sotto il controllo dell’intera regione del promotore di ACVR1.

� Linea cellulare utilizzata: ATDC5 (topo).

� Selezione di diversi cloni.

� Sistema adattato alle piastre da 96.

� Screening library Enzo-Life Sciences-The Screen-WellTMEpigenetics Library (43 composti in 10mM DMSO – a 80°C)

“Allenamento tecnico” indispensabile per affrontare lo screening su larga scala (Prestwick Chemical Library® 1200 composti)

Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (attività luciferasica)

Molecole candidate(curve dose- risposta)

Saggi di secondo livello(effetto sul differenziamentocellulare in coltura e sullaformazione di osso ectopicoin vivo in modelli murini)

Effetto sull’mRNA endogenodi ACVR1 (RT-qPCR)

Effetto sul BRE-LUC reporter gene (+/- BMP)

Schema di lavoro :

PROTOCOLLO EPI LIBRARY : CLONI ATDC5-Pr2.9 ACVR1

� Giorno 0 - Piastratura in terreno di deplezionesenza siero in piastra multi pozzetto da 96

� Giorno 1 - Trattamento:

Dalla piastra della library (conservata -80°C) prelevo 2 µl per ciascun composto (alla concentrazione scelta) e li aggiungo alla piastra da 96 pozzetti contenente 200 µl di terreno (diluizione 1:100).

Per ciascuna fila di composti preparo due file (ogni composto in doppio).

Rimuovo il terreno dalle cellule e lo sostituisco con quello fresco contenente i composti della library alla diluizione scelta. Lascio incubare i composti con le cellule per 24h.

� Giorno 2 - Lavo con PBS e liso con “Cell culture Lysis Buffer” (Promega) per il saggio luciferasico

Lettura luminometrica con Glomax

TrichostatinA

Pyridinecarboxylic acid

GarcinolSplitomi

cinBML-210

Apicidin

Suberoyl bis-

hydroxamic acid

Scriptaid

Nullscript

Azadeoxycytidine

Zebularine

SAHA

Isonicotinamide

ITSA-1Phenylbutyrrate

-Na

Tranylcyprominehemisul

fat

Valproicacid

EX-527Resvera

trolM-344

Nicotinamide

BML-266

Piceatannol

FluoroSAHA

Valproicacid

hydroxamate

AGK2Salermi

deMC-1293

Anacardic Acid

B2BIX-

01294-3HCl

Butyrolactone 3

CTPBOxamfla

tinSirtinol

Suramin-6Na

BML-278

NCH-51 CI-994NSC-3852

Aminoresveratrol sulfate

BML-281

Triacetylresvera

trolDMSO DMSO DMSO DMSO DMSO

Come si presenta la piastra…

Grafico risultati trattamento con Epigenetic Library

(20 µM)

Lista dei composti aventi un effetto sul nostro promotore

I composti da noi selezionati hanno un effetto sulla vitalità cellulare?

Sono tossici o ben tollerati dalle cellule?

One Glo + Tox (Promega)

ONE GLOControllando effetto sulla vitalità cellulare, API e TSA non hanno confermato effetto inibitorio mentre RESVERATROLO confermato sempre attivatorio :

Ci siamo concentrati su quest’ultima sostanza!

Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (attività luciferasica)





Schema di lavoro :

TOSSICITA’

RESVERATROLO

Curva dose risposta resveratrolo 3 cloni promotore (ONEGLO+Tox)

I tre cloni mostrano massimo effetto del resveratrolo sull’attività del promotore a 20µµµµM

Effetto sull’attività del promotore di ACVR1 (attivitàluciferasica)

Molecole candidate(curve dose-risposta)




Schema di lavoro :

Effetto del trattamento del RESVERATROLO sull’mRNA di ACVR1

Riassunto esperimenti RT/qPCR

In media 100µM attiva 3 volte, 10µM attiva 5/6 volte.

Anche il T-resveratrolo sembra promettente : curva dose risposta 3 cloni promotore (Kit ONEGLO+Tox)

Attivatorio da 10 a 200µM di circa 2 volte : proveremo l’effetto sull’endogeno

ResveratrolResveratrolA A PhytochemicalPhytochemical With Health Benefits With Health Benefits

Found in Red WineFound in Red Wine

��AntoxidantAntoxidant activityactivity

��Cancer inhibitionCancer inhibition

��CholestrolCholestrol regulation regulation

��AntiAnti--inflammatoryinflammatory

Osteogenic effects of resveratrol in vitro: potential for the prevention and treatment of osteoporosis

BRE : CASCATA DI SEGNALAZIONE DELLE BMP

Inibitori

extracellulari

Pseudo

recettori

BRE

LUCIFERASE

Inibitori intracellulari

Sono state generate ATDC5 stabilmente trasfettate con l’elemento BRE (BoneResponsive element) a monte del gene Luciferasico.(Serena)

Dei 52 cloni generati, 5 sono stati selezionati per:

�L’attività luciferasica in condizioni basali

�Il livello di attivazione in seguito a trattamento

con BMP2 (50 ng/ml)

�Segnale stabile nel tempo

BRE-Luc clones

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

NT

+ BMP2

NT 1 1 1 1 1 1

+ BMP2 3,59033831 6,01812938 2,91624767 9,39345709 4,74670565 6,09387091

H13 F2 H7 B3 g9 E7

I cloni H13 e B3 sono stati utilizzati per gli esperimenti successivi

Effetto sul BRE-LUC reporter gene (+/- BMP)Anche con il “sistema BRE”si conferma realmente attivatorio (kit ONEGLO) solo il RESVERATROLO !

Le modulazioni inibitorie o attivatorie che osserviamo sul promotore di ACVR1 corrispondono

ad effetti biologici sul differenziamento condrogenico?

Necessario avvalersi di test di secondo livello per verificare una correlazione tra la modulazione del promotore del nostro gene e una reale modifica

del pattern differenziativo atteso.

Differenziamento condrogenico

Da provare : Pellet (tridimensionale)

� Cellule coltivate in adesione, si staccano con tripsina e si trasferiscono in provette da 15ml.

� Si centrifugano per favorire la formazione del pellet.

� Si coltivano in 1 ml di terreno condrogenico : DMEM/αMEM, 5%FCS, TGFβ3, dexametasone, ac.ascorbico, ITS per 21/28 giorni (in presenza/assenza sostanze selezionate)

� Estrazione RNA e valutazione espressione marker condrogenici

Saggi di secondo livello(effetto sul differenziamento cellulare in coltura e sullaformazione di osso ectopico in vivo in modelli murini

Blu di Blu di

toluidinatoluidinaCollageno Collageno

tipo IItipo II

COLORAZIONI ISTOLOGICHE/

IMMUNOISTOCHIMICA

REAL TIME PCR : espressione mRNA

marker condrogenesi

COLLAGENO II

SOX9

ALP

TEST

Serena Cappato

Dottorato di Ricerca in Genetica, Indirizzo: Clinica, genetica e Immunologia delle Malattie dell’Età EvolutivaProgetto

“Fibrodisplasia Ossificante Progressiva: meccanismi di regolazione del gene ACVR1 e approccio terapeutico”

� Screening di composti con potenziale effetto farmacologico

� FOP e sistema immunitario innato: generazione di cellule iPS da pazienti affetti da FOP e individui di controllo

Prestwick Chemical Library - 200 composti approvati dalla FDA (15 piastre da 96 pz alla concentrazione di 10 mM in un volume di 100 µl)

Obiettivo:Individuare composti chimici con potenziale effetto farmacologico

sull’espressione di ACVR1

COME ABBIAMO LAVORATO?

- Screening su cellule ATDC5 trasfettate stabilmente con il promotore di ACVR1 (PromACVR1/Luc)

- Analisi effettuata a due concentrazioni (20 µµµµM e 2 µµµµM)

- Valutazione della tossicità dei composti

Obiettivo:Individuare composti chimici con potenziale effetto farmacologico

sull’espressione di ACVR1

20µµµµM

DMSO

RESVERATROLODMSO

2µµµµM

DIPYRIDAMOLE

Schema di lavoro

Luc + Fluo

Z’ Factor

Lo Z’ factor è un parametro statistico utilizzato per valutare la qualità di un test HTS.

Nel nostro test abbiamo utilizzato il Resveratrolo come controllo positivo e il Dipyridamole come controllo negativo

z’= 1- (3σc+ + 3σc- )|µc+ - µc-|

σ = µ =

Z’ factor

Dipyridamole (c-)

z’ factor: 0,650 ± 0,127Resveratrol (c+)

z’ factor 0.631±0.104

� Parametri scelti:

� Normalizzazione

• Tutti i composti della libreria sono stati normalizzati con questa formula:

Composti individuati:

208 inibitori 61 attivatori

Composti attivatoriComposti inibitori

100Attività Luciferasica normalizzata su DMSO

Fluorescenza (AFC) normalizzata su DMSO *

≥≥≥≥ 190

≥≥≥≥ 130

≤≤≤≤ 50

≤≤≤≤ 75

� Classi farmacologiche

19 � ≥25%8 � ≥30%1 � ≥40%0 � ≥50%

Cortisonici35 � ≥25%28 � ≥30%

8 � ≥40%4 � ≥50%

25 � ≥25%9 � ≥30%0 � ≥40%0 � ≥50%

Classi farmacologiche a confronto

Dexamethasone e i suoi derivati, dexamethasone sodium phosphate e dexamethasoneacetate, sono glucocorticoidi di sintesi che vengono utilizzati per le loro proprietàantiinfiammatorie o immunosoppressive.

Halcinonide viene utilizzato per uso topico nel trattamento di patologie cutanee.

Fluticasone propionate è un derivato corticosteroideo del fluticasone utilizzato per il trattamento di asma, riniti allergiche ed esofagiti eosinofiliche.

Medrysone è un corticosteroide utilizzato in optometria e oftamologia .

Dipyridamole è un medicinale che usato cronicamente inibisce la formazione di trombi e usato ad alte dosi ma per brevi periodi determina vasodilatazione (Persantine).

Chloroxine è un antibatterico utilizzato per patologie infiammatorie intestinali, diarrea, giardiasi. E’ utile anche per il trattamento della dermatite seborroica .

20 uM SD 2 uM SD

Dexamethasone acetate 66.7490 7.247298 55.67851 5.448318Halcinonide 55.23587 2.478615 70.17471 8.591271Fluticasone propionate 68.79206 0.426305 53.8373 3.466701Medrysone 55.07056 3.362713 68.5204 6.504571Dypiridamole 42.07355 2.510112 62.41078 4.868173Chloroxine 52.39477 5.534526 117.7919 2.669508

Gli inibitori più forti

4 cortisonici 1 vasodilatatore1 antibatterico

Gli Attivatori più forti

Nabumetone è un farmaco antiinfiammatorio non steroideo che viene utilizzato come in processi infiammatori di rilevante entità, soprattutto di origine articolare: ad esempio nella artrite reumatoide, nell'osteoartrosi, nella spondilite anchilosante, nella artropatia gottosa e nel reumatismo extrarticolare.

Rabeprazole Sodium salt è un inibitore delle pompe protoniche e viene utilizzato per il trattamento di ulcere gasstriche, duodenali e reflusso gastroesofageo.

Niclosamide è il farmaco di scelta per la maggior parte di infezioni da cestodi (tenie). La sua azione è stata attribuita alla capacità di inibire la fosforilazione mitocondriale anerobia dell'ADP che fornisce energia disponibile sotto forma di ATP.

Methiazole è un antielmintico ad ampio spettro efficace nei casi di poliinvasione, soprattutto contro Echinococcus.

Nocodaziole è un farmaco antineoplastico che a livello cellulare interferisce con la polimerizzazione dei microtubuli.

Tenatoprazole è un inibitore di pompa protonica non ancora in commercio con un’emivita 5/7 volte superiore agli altri PPI, utilizzato nel trattamento del reflusso esofageo e ulcera peptica .

20 uM SD 2 uM SD

Nabumetone Analgesic/FANS 240,0790 86,8879 169,8117 13,8166

Rabeprazole Sodium salt Antiulcerative 177,0269 38,6214 197,0995 15,2066

Niclosamide Anthelmintic 265,1190 177,2035 196,1296 47,4797

Methiazole Antiparasitic 290,5379 5,2073 194,4665 40,4670

Nocodazole Antineoplastic 242,5110 33,7128 127,1633 14,8248

TenatoprazoleReflux oesophagitis and

peptic ulcer treatment 204,7247 8,1037 151,5978 16,0624

Nalmefene hydrochloride Narcotic antagonist 294,4446 237,0054 99,0473 33,6878

Analisi degli inibitori individuati

I composti emersi dall’analisi HTS sono i candidati per analisi successive

1. Analisi dose-risposta

2. Analisi dell’effetto del trattamento sull’intera cascata di segnalazione delle BMP

3. Analisi dell’effetto dei trattamenti sull’espressione del gene ACVR1 endogeno

4. Analisi dell’effetto del trattamento sulla capacità differenziative delle cellule (saggi secondari � ATDC5/condrogenesi; C2C12/osteogenesi)

Un esempio………….. il DIPYRIDAMOLE

120

100

80

60

40

20

0

Effe

ct o

n P

rom

2.9

DMSO 0.5 1 2 5 10 20 50 70 100 150 200 µM

Dipyridamole

120

100

80

60

40

20

0

Effect o

n B

RE

-Luc

DMSO 0.5 1 2 5 10 20 50 µM

Dipyridamole Il Dipyridamole ha un’azione inibitoria sia sul Promotore di ACVR1 che sull’intera cascata BMP (BRE-Luc)

Seguiranno i saggi funzionali di secondo livello (saggi differenziativi)

Dipyridamole: curva dose-risposta

Serena Cappato

Dottorato di Ricerca in Genetica, Indirizzo: Clinica, genetica e Immunologia delle Malattie dell’Età EvolutivaProgetto

“Fibrodisplasia Ossificante Progressiva: meccanismi di regolazione del gene ACVR1 e approccio terapeutico”

� Screening di composti con potenziale effetto farmacologico

� FOP e sistema immunitario innato: generazione di cellule iPS da pazienti affetti da FOP e individui di controllo

Cellule staminali pluritpotenti indotte o “Induced pluripotent stem cells ( iPS cellsor iPSCs)” sono cellule pluripotenti derivate artificialmente da cellule di tessuti adulti(cellue somatiche, es. Fibroblasti cutanei, cellule del sangue etc) mediante diverse metodiche basate sulla Ri-espressione forzata di alcuni specifici geni

Le iPS sono simili per alcuni aspetti alle cellule staminali vere e proprie (staminali

embrionali)� Espressione di geni e proteine cosiddetti di “staminalità”� Profilo di metilazione della cromatina� Tempo di replicazione� Capacità di formare teratomi

� Capacità differenziative in tipi cellulari diversi

Dr G. Uzan – M.C. LeBrousseINSERM U972

Hôpital Paul BrousseVillejuif (France)

Cellule iPS

Serena ha presentato un progetto ad hoc e ottenuto una Borsa di studio EFIS

Riprogrammazione cellule somatiche

Oct3/4

Sox2c-M

yc Klf4

Cellule iPS�possono essere coltivate�espanse indefinitamente�differenziate verso diversi tipi cellulari

Fibroblasti cutanei� 2 pz affetti da FOP

� 3 individui di controllo

iPS cells for Fibrodysplasia Ossificans Progressiva: a tool towards understanding the role of the innate

immune system

Studio del differenziamento mono/macrofagicoa partire da iPS dei pazienti

Cellule midollo osseo

Neuroni

Osteoblasti

Adipociti

Congresso Annuale della Società Europeadi Genetica Umana - ESHG 2013

8- 11 Giugno 2013, Parigi

Study of ACVR1 gene expression regulation: a way to discover a “druggable” target

towards Fibrodiysplasia OssificansProgressiva (FOP) treatment (Poster)

Congresso Annuale della Società Italianadi Genetica Umana - SIGU201325-27 Settembre 2013, Roma

Transcriptional regulation of the ACVR1gene: a target to drug discovery for

Fibrodysplasia Ossificans Progressiva(FOP)

Comunicazione orale

Identification and characterization of regulatory elements in the promoter of ACVR1, the gene mutated in Fibrodysplasia OssificansProgressiva

Francesca Giacopelli1, Serena Cappato1, Laura Tonachini1, Marzia Mura1, Simona Di Lascio2, Diego Fornasari2,3, Roberto Ravazzolo1,4

and Renata Bocciardi1,4

1Università degli Studi di Genova2Università di Milano3CNR- Istituto di Neuroscienze, Milano4Istituto Giannina Gaslini, Laboratorio Genetica Molecolare, Genova

Journal: Orphanet Journal of Rare Diseases

Che cosa abbiamo capito?

�Una regione genica nel DNA , definita promotore, regola

l’espressione del gene e della proteina ACVR1

�Nella regione promotore esistono elementi che legano

proteine il cui legame al DNA potrebbe essere modificato da

eventuali farmaci

�Il sistema HTS (Laura, Serena) di ricerca di composti chimici che

è stato messo a punto sulla regione genica regolatrice è

assolutamente valido e promettente

�Le proteine capaci di regolare l’espressione di ACVR1 sono

altresì interessate nella regolazione di diversi processi:

infiammazione differenziamento osteogenesi

Quale sarà il nostro prossimo obiettivo?

Le conoscenze acquisite ci consentono di approcciare

altri aspetti importanti nella FOP, mediante:

•L’analisi dell’espressione di ACVR1 e delle proteine

regolatrici durante i processi di infiammazione e

osteogenesi

•La verifica dell’effetto dei composti ottenuti dallo

screening su questi processi

FOP -Infiammazione-Risposta Immunitaria

Domanda:

Quali stimoli causano i flare-up e la conseguente

ossificazione eterotopica nei pazienti che portano la

mutazione di ACVR1?

Risposta: infiammazione e risposta immunitaria

Numerose evidenze suggeriscono che l’infiammazione e la

risposta immunitaria hanno un ruolo determinante nella

progressione della malattia scatenando le riacutizzazioni post

natali.

Analisi tissutale delle lesioni di pazienti FOP

• Comparsa di gonfiori dolorosi

•Fase 1 infiammazione e distruzione del tessuto

•Fase 2 formazione nuovo tessuto (osso eterotopico)of

• Le riacutizzazioni episodiche della malattia possono essere innescate da traumi, infezioni virali ed immunizzazioni.

• Compaiono segni influenzali durante I processi di riacutizzazione (Flare Up) della malattia.

• Gonfiori, edemi sono presenti nella regione del flare-up.

• Presenza di infiltrati leucocitari ( Linfociti B, T, mastociti, macrofagi) nel muscolo affetto durante le fasi precosi della malattia.

• Distruzione tissutale del muscolo scheletrico durante il flare-up

• Intensa risposta clinica ai corticosteroidi nelle prime 24-36 ore dall’insorgenza del flare-up

• Variazione stagionale della progressione della malattia.

• Lunghi periodi di quiescienza tra I flare-up, reminescenti dei cicli di esacerbazione-remissione deipazienti con sclerosi multipla.

� Lunghi periodi di quiescienza in presenza di agenti immunosoppressivi usati in seguito a trapianto

del midoloo osseo.

EMATOPOIESI

Infiammazione e monociti-macrofagi

I monociti sono cellule mononucleate del sangue la cui percentuale varia tra il

2-10% della popolazione leucocitaria.

I monociti svolgono un ruolo molto importante nelle risposte immunitarie

naturali e specifiche. La loro funzione principale è la fagocitosi cioè la capacità

di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i microrganismi, e

di distruggerle.

La cellula progenitrice dei monociti, come peraltro di tutte le altre cellule ematiche, è la cellula staminale

multipotente. Nel midollo osseo questa cellula si differenzia in vari stipiti cellulari tra cui quello che dà origine al

monoblasto; maturando questa cellula lascia il midollo e si riversa nel torrente circolatorio sotto forma di

monocita.

I monociti migrano dal torrente circolatorio nei tessuti siti dell’infiammazione o nel tessuto leso, dove

differenziano (polarizzazione) seguendo un processo specifico, a seconda degli stimoli a cui il microambiente li

espone.

Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, definiti attivati classicamente o alternativamente, M1 o M2 con

funzioni biologiche differenti.

Gli M1 invadono il tessuto danneggiato e hanno funzione infiammatoria e di fagocitare.

Gli M2 hanno funzione antiinfiammatoria . Producono citochine antiinfiammatorie IL-4/16/12 e attivano la

componente staminale.

L’esito dell’evento infiammatorio è strettamente dipendente da uno sbilanciamento tra le due differenti

popolazioni, la loro attivazione e un differenza temporale nella loro comparsa.


I monociti sono cellule mononucleate del sangue la cui percentuale varia tra il 2-10% della popolazione

leucocitaria.

I monociti svolgono un ruolo molto importante nelle risposte immunitarie naturali e specifiche. La loro funzione

principale è la fagocitosi cioè la capacità di inglobare nel loro citoplasma particelle estranee, compresi i

microrganismi, e di distruggerle.

La cellula progenitrice dei monociti, come peraltro di tutte le altre cellule

ematiche, è la cellula staminale multipotente. Nel midollo osseo questa cellula

si differenzia in vari stipiti cellulari tra cui quello che dà origine al monoblasto;

maturando questa cellula lascia il midollo e si riversa nel torrente circolatorio

sotto forma di monocita.



espone.

Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, definiti attivati classicamente o alternativamente, M1 o M2 con

funzioni biologiche differenti.






EMATOPOIESI



leucocitaria.







monocita.

I monociti migrano dal torrente circolatorio nei tessuti siti dell’infiammazione

o nel tessuto leso, dove differenziano (polarizzazione) seguendo un processo

specifico, a seconda degli stimoli a cui il microambiente li espone.

Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, gli M1 o M2 con funzioni

biologiche differenti.

Gli M1 invadono il tessuto danneggiato e hanno funzione infiammatoria e di

fagocitare.

Gli M2 hanno funzione antiinfiammatoria . Producono citochine

antiinfiammatorie IL-4/16/12 e attivano la componente staminale.



Monocita Macrofago



leucocitaria.







monocita.



espone.

Esistono due distinte popolazioni di macrofagi, gli M1 e M2 con funzioni biologiche differenti.




L’esito dell’evento infiammatorio è strettamente dipendente da uno

sbilanciamento tra le due differenti popolazioni, la loro attivazione e un

differenza temporale nella loro comparsa.

L’infiammazione, attraverso l’attivazione dei macrofagi può :

• determinare il destino delle cellule staminali• coordinare il riparo tissutale• favorire il coinvolgimento dei macrofagi nel processo di ossificazione

Nostra ipotesi:

La proteina recettrice ALK2 mutata sulla superficie dei

monociti/macrofagi può

1.determinare una diversa risposta a citochine o fattori di

crescita secreti inizialmente nel sito dell’infiammazione?

2.influenzare la polarizzazione dei macrofagi e

conseguentemente la formazione di osso eterotopico.?

Esperimenti suggestivi…

Gli esperimenti della Dottoressa Brunelli e Zordan, del

Dipartimento di Scienze della Salute,Università di Milano-

Bicocca di deplezione di monociti sono a tal proposito molto

indicativi.

In breve……Effetto del clodronato sulla formazione di osso in un modello

murinoIl clodronato riduce la popolazione circolante di monociti (70% ca) determinando uno

sbilanciamento delle due popolazioni M1-M2

In seguito a deplezione la formazione di

osso nel muscolo in presenza di BMP2 è >

nei topi trattati.

Nostri prossimi obiettivi

1) Esperimenti in vitro, su monociti umani ottenuti da donatori e pazienti FOP

Scopo:

verificare il differenziamento a macrofagi (M1/M2)

analisi espressione ACVR1 e delle sue proteine regolatrici

2) Esperimenti in vitro, su linee cellulari stabili monocitarie (THP1, U937)

Scopo:

analisi funzionale della regione regolatrice di ACVR1

analisi espressione ACVR1 e delle sue proteine regolatrici

analisi di espressione in seguito a differenziamento

3)Caratterizzazione dell’immunofenotipo dei pazienti FOP

Scopo:

analisi delle popolazioni leucocitarie coinvolte nella risposta immunitaria

correlazione tra la popolazione leucocitaria e le diverse fasi della patologia

identificazione di marcatori cellulari

1 Donatori e Pazienti

3 Coltura Monociti

4 Differenziamento M1-M2

2 Selezione Monociti

5 Analisi popolazione differenziata e profilo espressione

Caratterizzazione dell’immunofenotipo dei pazienti FOP

Dott.ssa Genny Del Zotto Dott.ssa Francesca Antonini Dott.

Andrea Petretto

Dipartimento di Medicina Sperimentale

Core Facilities

Direttore Lorenzo Moretta

Cosa è?

Immunofenotipo : insieme di molecole espresse sulla superficie delle cellule appartenenti al

comparto emopoietico.

Ogni tipo di cellula del sangue (es: linfociti T, linfociti B, monociti, etc.) può essere riconosciuto e

distinto dagli altri proprio in base al suo corredo caratteristico di molecole di superficie (fenotipo).

Il codice che permette di identificare univocamente ognuna di queste molecole è chiamato “Cluster

Differentiation” (abbreviato in CD seguito da un numero progressivo che identifica ogni molecola).

Come si determina?

Mediante anticorpi diretti contro le molecole sopra citate che servono per distinguere in modo

inequivocabile le popolazioni cellulari.

Su quali campioni si esegue?

L’immunofenotipizzazione può essere effettuata su: sangue, midollo, tessuti. E’ una tecnica che ha

permesso di compiere notevoli passi avanti nella diagnosi e terapia di molte malattie e attualmente

rappresenta la metodica d’elezione per la diagnosi di malattie ematologiche e autoimmuni.

Caratterizzazione dell’immunofenotipo dei pazienti FOP

ESEMPIO DI IMMUNOFENOTIPO

I linfociti sono divisibili in tre filiere (popolazioni) principali:

LinfocitiT

Linfociti B

Natural Killer

Ognuna di queste filiere è riconoscibile per l’espressione unica di molecole di superficie:

Esempio: i linfociti T sono tutti caratterizzati dall’espressione del CD3 .

Le due sottopopolazioni di T , i T helper e i T citotossici si distinguono in base

all’espressione di CD4 o CD8.

TIPO CELLULARE SOTTOPOPOLAZIONI MOLECOLE CARATTERIZZANTI

Linfociti T Citotossici CD3 e CD8

Helper CD3 e CD4

Linfociti B CD19 CD20

Natural Killer CD56 e CD235

Scopo

Poiché la tipizzazione completa della popolazione leucocitarie nei pazienti

FOP ad oggi non è stata mai fatta, si intende verificare :

1) se le caratteristiche delle cellule dell’immunità dei pazienti hanno o meno

caratteristiche diverse da quelle dei controlli

2) se esistono variazioni del fenotipo in relazione alle diverse fasi della

malattia (quiescienza-riacutizzazione)

Metodo sperimentale

Se possibile, la tipizzazione andrà effettuata a cadenze regolari, (per esempio

3 volte all’anno) per:

• correlare le variazioni del fenotipo a fasi di quiescienza e riacutizzazione• rendere le variazioni del fenotipo il più possibile indipendenti dalla terapia effettuata

Prelievo di un campione di sangue (circa 5ml in EDTA) di pazienti - donatori

Marcatura del campione con anticorpi fluorescenti (previsti nel nostro studio

l’uso combinato di anticorpi >30!!)

Lettura al citofluorimetro

Strumenti e Reagenti in maggior dettaglio

Le cellule presenti nel sangue vengono marcate con anticorpi (legati a molecole

fluorescenti) diretti contro le varie molecole presenti sulla superficie cellulare.

La lettura del campione viene effettuata mediante un citofluorimetro, in grado di analizzare

le cellule sia da un punto di vista quantitativo che qualitativo.

Lo strumento presente in Istituto è in grado di studiare in contemporanea la presenza sulla

superficie di una cellula di 10 molecole (legate a dieci diversi anticorpi con diverse

fluorescenze) più le caratteristiche fisiche delle cellule (dimensioni e granulosità)

Esempio di studio fenotipico effettuato al citometro:

i risultati di un analisi compaiono in un piano cartesiano come quello sottoriportato dove

sono evidenziate le percentuali delle diverse popolazioni.

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