TECNICHE CENTRIFUGATIVE

Le tecniche di separazione mediante centrifugazione sfruttano il comportamento

delle particelle all’interno di un campo centrifugo applicato

Lo scopo di tali metodiche e’ quello di esercitare sulle particelle una forza maggiore

rispetto a quella esercitata dal campo gravitazionale terrestre, in modo tale da

aumentare la loro velocita’di sedimentazione

Grazie a tali metodiche, le particelle che differiscono per densita’, forma o dimensione possono essere separate tra di loro, poiche’

sedimentano a velocita’ diverse. Ogni velocità risulta direttamente proporzionale al campo

centrifugo applicato

PRINCIPI DI BASE DELLA SEDIMENTAZIONE

La velocita’ di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G) applicato, che e’

diretto radialmente verso l’esterno; esso e’ funzione della velocita’ angolare del

rotore (, in radianti/sec) e della distanza della particella dall’asse di

rotazione (r, in cm), in base all’equazione:

G= 2 r

Essendo una rivoluzione del rotore pari a

2 radianti, la velocita’ angolare del rotore,

in radianti al secondo, puo’ facilmente essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rpm),

ovvero:

= 2rpm/60

Il campo centrifugo (G) espresso in rpm diventa:

G= 2r 42(rpm)2r/3600

ed e’ generalmente espresso in multipli del campo gravitazionale terrestre, cioe’ come

rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa in

presenza della sola forza di gravita’

Quindi, “ G ” e’ definito in termini di

campo centrifugo relativo (RCF) o, piu’ comunemente, come “ numero di g”

(dove g è il campo gravitazionale terrestre, pari a 980 cm·s-2):

RCF= G/980

RCF= (1,1·10 –5 ) rpm2 ·r

Raggio del rotore mm

NOMOGRAMMA

Allineando due valori, ad es. il raggio del rotore e la forza centrifuga relativa si può leggere sulla terza colonna, direttamente come intercetta della retta, il valore in rpm cercato.

due valori noti terzo valore ottenuto

Forza Centrifuga Relativa RCF o x g

Velocità di rotaz. per minuto rpm

Si deve tener presente che la velocita’ di sedimentazione di una particella dipende non

solo dal campo centrifugo applicato, ma anche dalla sua massa, densita’ e forma, oltre che dalla densità e viscosita’ del

solvente in cui avviene la sedimentazione

Nel corso della sedimentazione, inoltre, la particella e’ sottoposta ad una forza netta verso l’esterno (F),

che e’ data dall’espressione:

F=4/3 rp 3

(p - m ) 2r

» 4/3 rp3=volume della sfera di raggio rp

» p =densita’ della particella

» m =densita’ del mezzo » r= distanza della particella dal centro di

rotazione

Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano attraverso la soluzione; se si assume che la

particella sia sferica e che si muova con velocita’ nota, allora la forza d’attrito che si oppone al moto

della particella e’ data dalla legge di Stokes:

ƒ0 = 6rp

» ƒ0= coefficiente d’attrito per una particella sferica

» = coefficiente di viscosita’ del mezzo

» = velocita’di sedimentazione della particella

Una particella di volume e densita’ noti, in un mezzo a densita’ costante, sara’ percio’ accelerata in un campo centrifugo fino a quando la forza applicata sulla particella stessa sara’ uguale alla forza d’attito,

cioe’ quando:

F = ƒ0

4/3 rp3(p- m)

2r= 6rp

In pratica, le due forze si eguagliano abbastanza rapidamente, con il risultato che la

particella sedimenta a velocita’ costante; quindi, la velocita’ e’ data da:

= dr/dt = 2/9 · rp 2

(p- m) 2r/

Integrando tale equazione, e’ possibile ricavare il tempo di sedimetazione di una particella sferica sottoposta ad un campo

centrifugo, in funzione delle variabili implicate e della lunghezza del percorso compiuto dalla

particella nella provetta da centrifuga:

t = 9/22

rp 2

(p- m) · ln rb/rt

» t =tempo di sedimentazione in secondi

» rt =distanza radiale dall’asse di rotazione al menisco del liquido

» rb = distanza radiale dall’asse di rotazione al fondo della provetta

La velocita’ di sedimentazione puo’ anche essere espressa in termini di velocita’ di

sedimentazione per unita’ di campo centrifugo applicato, comunemente detta

“coefficiente di sedimentazione” (s). Se il mezzo ha una composizione definita, la

velocita’ di sedimentazione e’ proporzionale a

2r, quindi l’equazione si semplifica in:

=s 2r

s= / 2r

Gli studi di velocita’ di sedimentazione possono essere eseguiti impiegando svariati sistemi

soluto-solvente; il valore misurato del coefficiente di sedimentazione, influenzato dalla temperatura,

dalla densita’ e dalla viscosita’ della soluzione, viene spesso corretto nel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fossero pari

a quelle dell’ acqua a 20ºC, espresso come “coefficiente di sedimentazione standard”

(S20,w)

N.B.:I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono

molto piccoli e, per comodita’, viene presa come unita’ di misura il valore di 10

-13 secondi,

che viene definito come “unita’ di Svedberg” (S)

1 S (Svedberg) = 10-13 sec

CENTRIFUGHE E LORO UTILIZZO

Le centrifughe possono essere classificate in quattro categorie principali:

piccole centrifughe da banco;

centrifughe refrigerate a grande capacita’;

centrifughe refrigerate ad alta velocita’;

ultracentrifughe

PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO

» Sono le piu’ semplici e le meno costose

» Impiegate solitamente per raccogliere piccole quantita’ di materiale che sedimenta rapidamente

» Velocita’ max compresa tra 4000-6000 rpm

» Operano generalmente a temperatura ambiente

CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA’

» Hanno una velocita’ max di 600 rpm

» Sono dotate di camere del rotore refrigerate

» Possono impiegare una varieta’ di rotori intercambiabili

CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA’

» Velocita’ max di 25.000 rpm

» Rotori intercambiabili

» Impiegate soprattutto nella raccolta di microrganismi,frammenti cellulari e organuli cellulari

ULTRACENTRIFUGHE

» Preparative: » Velocita’ max di 80.000 rpm;

» Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto;

» Sofisticato sistema di controllo della temperatura

» Analitiche: » Velocita’ max di 70.000 rpm;

» Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto;

» Dotate di un sistema ottico per l’osservazione del materiale

Tipi di centrifughe

Centrifughe da banco

Ultracentrifughe

centrifuga

VELOCITA' BASSA MEDIA ALTA ULTRA

Velocità (rpm) 7.000 14.000 26.000 100/150.000

Gravità (xg) 7.200 18.000 75.000 800/901.000

Capacità 9 litri 1 litro 3 litri 1.500/40 ml

Raffreddamento no alcune tutte tutte

Vuoto no no alcune tutte

Velocità di centrifugazione

SISTEMA DI ULTRACENTRIFUGA ANALITICA CON SISTEMA OTTICO

DI SCHLIEREN

PRINCIPALI TIPI DI ROTORI

» Rotori a bracci oscillanti;

» Rotori ad angolo fisso;

» Rotori per tubi ad alloggiamento verticale

ROTORI AD ANGOLO FISSO

» Le provette sono poste in cavita’ scavate nel corpo del rotore e formano un angolo fisso tra 14° e 40º rispetto alla verticale

# Coperchio del rotore (a tenuta d’aria)

Coperchio del tubo da centrifuga

Asse di rotazione

Rotori ad angolo fisso - hanno gli alloggiamenti per i tubi disposti circolarmente attorno all’asse di rotazione ad un certo angolo prefissato che varia in genere tra 20° e 40°. Quando le particelle sono proiettate contro le pareti, scivolano verso il fondo con la formazione del pellet.

ROTORI

ROTORE A BRACCI OSCILLANTI

» Possiede bracci che durante l’accelerazione del rotore si portano in posizione orizzontale, in modo tale che la provetta sia perpendicolare all’asse di rotazione e parallela al campo centrifugo applicato

Rotori oscillanti o ad angolo mobile - A riposo, i tubi rimangono in

posizione orizzontale, ma quando il rotore inizia a girare, per effetto della

accelerazione centrifuga, i tubi ruotano sui perni verso l’esterno,

disponendosi orizzontalmente. I rotori oscillanti consentono una

formazione di bande di sedimento ben differenziate e di pellet più

uniformi, ma hanno una maggiore delicatezza rispetto ai rotori ad angolo

fisso.

ROTORI

ROTORI PER TUBI AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE

» Rotore ad angolo fisso nullo, in cui le provette sono sempre allineate verticalmente al corpo del rotore

Tipi di rotori

Rotore ad angolo fisso

Rotore swing-out

• Rotore zonale

Metodi di separazione nell’ultracentrifugazione

preparativa

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE

» Il materiale che dev’essere diviso nelle sue componenti viene separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato

» N.B. :Alla fine di ogni centrifugazione solo il pellet viene lavato, risospeso e ricentrifugato

Centrifugazione differenziale

la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

Centrifugazione differenziale

» La centrifugazione differenziale e’ la tecnica piu’ usata per l’isolamento degli organuli cellulari da omogenati di tessuto

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

Metodo che viene usato quando e’ richiesta una separazione quantitativa di tutti i componenti di una miscela di particelle.

Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente, ma la densita’ massima non deve superare quella delle

particelle piu’ dense da separare.

Tipi di gradiente:

a) Continuo

b) Discontinuo

c) Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare

selettivamente una particella

Separazione isopicnica su gradiente di densita’

» Centrifugazione isopicnica: dipende unicamente dalla densita’ idrostatica della particella

SEPARAZIONE ISOPICNICA SENZA GRADIENTE PREFORMATO

» Il campione viene mescolato con il mezzo che costituisce il gradiente, anziche’ stratificarlo in un gradiente preformato

Centrifugazione isopicnica

Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio o il Ficoll creano dei gradienti durante la centrifugazione). Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti. Le particelle sedimentano in funzione della loro densità (si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo).

All’inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.

Cam

po c

entr

ifugo

Gra

die

nte

di densità

Campione

Particelle piccole

Particelle medie

Particelle grandi

A Z

Centrifugazione zonale

Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente)

MATERIALI PER GRADIENTI DI USO COMUNE E LORO APPLICAZIONI

La purificazione (e concentrazione) di macromolecole biologiche può essere effettuata mediante ultracentrifugazione in gradiente all’equilibrio di densità di cloruro di cesio-bromuro di etidio.

Le due differenti forme di DNA possono essere separate mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità di CsCl/EtBr, una tecnica di separazione che sfrutta le differenze di densità delle diverse molecole.

DNA circolare chiuso e superavvolto intercala una certa quantità di etidio limitata. In questo caso la molecola assume una forma più compatta, con il conseguente incremento della densità di galleggiamento. Molecole di DNA circolari rilassate e lineari sono invece in grado di intercalare una maggiore quantità di etidio che ne provoca un maggior srotolamento. Di conseguenza il DNA lineare sarà meno denso.

Isolamento e concentrazione di macromolecole