PRESERVAZIONE DELLA FERTILITA’ NEL

MASCHIO

• Presentazione del PDT

Mirco Castiglioni

U.O. di Urologia

A.O. San Paolo, Polo Universitario - Milano

INTRODUZIONE

Il 5% delle neoplasie colpisce individui sotto i 35 anni d’età.

Con il miglioramento della diagnostica e della terapia in campo oncologico la sopravvivenza dei giovani affetti da tumore è significativamente migliorata negli anni recenti e progressivamente aumenta, tanto che oggi circa l’85% dei tumori del bambino e del giovane può essere aggredito con successo.

Si stima che 1/250 soggetti tra 20 e 29 anni sia sopravvissuto ad un tumore. (Blatt, 1999)

1 adulto su 3 sopravvissuto a un tumore dell’infanzia incontrerà difficoltà a procreare (Holoch, 2011)

[SEER, NCI]

Age Specific Incidence rates for childhood cancer all races, both sexes

Age at Diagnosis

LLA

*

LMA

*

Lym

*

CNS

*

Il cancro del testicolo è la più comune neoplasia maligna nei maschi di età fra 20 e 34 anni.

Lifetime risk 0,3-1 % (in alcune nazioni x 3-4 negli ultimi 50 anni )

• Huyghe et al, 2003; van der Horst et al, 2006.

L’incidenza di tumori testicolari nei maschi infertili è più elevata che nella popolazione generale

infertili

•230/100.000 fertili

6.7-10.6/100.000

(Kliesh, 1997; Botchan, 1997; Logarakis, 1998; Raman, 2005; Doria-Rose, 2005)

RISCHIO DI INFERTILITA’ DURANTE IL TRATTAMENTO

Danno alla spermatogenesi

Età e/o sviluppo

puberale al momento della

terapia

Tipo di terapia Dose di terapia

Sede della terapia

(Jaffe, 1988; Humpl, 1999)

RELAZIONE TRA PRESENZA DI K

& INFERTILITA’ MASCHILE

qualità seminale ridotta in

soggetti con tumore vs “sani”

parametri seminali anomali

fino al 64% dei soggetti con

tumore

30-70% dei soggetti con K

testicolare sono oligospermici

50-70% dei soggetti con LH

sono oligospermici

La fertilità può già essere compromessa prima del trattamento

Bahadur et al., 2002

van Casteren et al., 2010

Chung et al., 2004; van Casteren et al., 2010

Crueffer et al., 2001; van Casteren et al., 2010

I NOSTRI DATI

608 pazienti oncologici di età

compresa tra 13-63 aa

(30.6±8.5) afferiti negli ultimi

7aa presso il nostro centro per la

crioconservazione del liquido

seminale prima di qualsiasi

trattamento

PARAMETRO Mediana (25-75 P)

Vol (mL) 3 (2-4)

Conc (106/mL) 22 (6-36)

Tot (106) 57 (16-118)

Mot (%) 34 (20-43)

Morfo (%) 8 (4-12)

* Cooper et al., Hum Reprod Update, 2010

*WHO 2010 10° percent.

*WHO 2010 50° percent.

2 3.7

22 73

69 255

32 55

5.5 15

VALORI INTORNO AL 10°PERCENTILE WHO 2010

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Con

ta t

otal

e (

106)

Altro Hodgkin LNH Testicolo

P<0.05

0

20

40

60

80

100

Altro Hodgkin LNH Testicolo

Con

c (

106/m

L)

P<0.05

Median

25%-75%

Non-Outlier Range

PRESERVAZIONE DELLA

FERTILITA

PRIMA DEL TRATTAMENTO

• EIACULAZIONE PRESENTE

• SI/NO

• SPERMATOZOI NELL’EIACULATO

• SI/NO

RECUPERO DELLA

FERTILITA’

DOPO IL TRATTAMENTO

• RESCUE TESE/MICROTESE

Prima della pubertà non si

sono ancora formati i gameti

Lo spermarca (produzione di

spermatozoi) è un evento della

prima e media pubertà (stadio

P3/P4) , precede la capacità di

eiaculare e si associa ad una

adeguata produzione di

gonadotropine.

Grande variabilità nello stadio

di maturazione degli

spermatozoi tra 13 e 18 anni

Nielsen, 1986

Stadi puberali di

Tanner

PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE GONADICA PROCREATIVA NEL PREPUBERE

PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE GONADICA PROCREATIVA NEL PREPUBERE

Schermatura (radioterapia)

Manipolazione farmacologica o ormonale

Autotrapianto/xenotrapianto

Maturazione in vitro

Trapianto di cellule staminali

Crioconservazione di tessuto testicolare

PRESERVAZIONE DELLA FUNZIONE GONADICA PROCREATIVA NELL’ADULTO E NELLE ETA’

PIU’ AVANZATE

One out of five PCa

patients would bank

sperm before RP (Salonia et al, 2013)

Argomento di crescente

interesse

Congiuntura socio-

economica sfavorevole

ritardo ricerca primo

figlio

Instabilità coniugale

crescente ricerca di

prole con altre partners

Kidd et al., 2001; Kuhnert & Nieschlag, 2004; Lazarou et al.,,

2008; Parheentupa & Huhtaniemi, 2009; Stewart & Kim, 2011

PRESERVAZIONE DELLA FERTILITA’ PRIMA DEL TRATTAMENTO

Ad oggi l’unica reale possibilità di preservare la fertilità del paziente

oncologico è la CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI: Liquido seminale da MSS

Spermazoi da urine post MSS o vibrostimolazione

Recupero chirurgico (TESE/MicroTESE)

La crioconservazione degli agoaspirati testicolari è problematica per cui sono

sconsigliati

CRIOCONSERVAZIONE

La crioconservazione deve essere effettuata solo prima del trattamento antineoplastico per evitare l’alto rischio di effetti mutageni sugli elementi germinali in ultimo stadio. (Meistrich, 1993)

Nell’uomo è stato evidenziata una frequenza 5 volte più elevata di aneuploidia spermatozoaria sotto l’effetto della chemioterapia. Tale risultanza patologica non è più presente dopo 100 giorni dal termine del trattamento. (Robbins, 1997)

Il rischio di aneuploidie nella prole di pazienti trattati per cancro testicolare o linfoma non è superiore a quello della popolazione generale. Tuttavia in questi casi è altamente consigliato lasciar passare un periodo di 2 anni dalla terapia prima di ricercare il concepimento. (Thomas, 2004)

Accesso

Documentazione richiesta

Indicazioni

Logistica

Costi della crioconservazione

Procedura operativa

Stoccaggio

Archiviazione dati

Utilizzo del materiale crioconservato

• Utilizzo in “loco”

• Utilizzo presso un altro Centro

Attivazione della procedura di trasferimento

Distruzione

Organizzazione del personale

Strumentazione

I pazienti che accedono ad un programma di crioconservazione

prenotano telefonicamente al N°diretto del Laboratorio di

seminologia e crioconservazione dei gameti maschili 0281844417

attivo dal lun al ven dalle ore 13.00 alle ore 15.00.

Per i casi urgenti di pazienti oncologici viene fornito anche il

numero diretto della segreteria 0281844535-4428 e, in ultima

istanza, anche il numero di telefono cellulare del biologo

referente.

Le istruzioni vengono date telefonicamente direttamente dal

biologo al paziente (o al medico se il paziente in questione risulta

ricoverato). Il paziente che accede deve avere necessariamente

una indicazione clinica alla crioconservazione, riportata

sull'impegnativa o su carta intestata dell'Ospedale inviante nel

caso di pazienti ricoverati.

Tutti i pazienti che crioconservano devono fornire la documentazione

come da ultima revisione delle Normative in materia di PMA e crioconservazione di gameti ed

embrioni, con particolare attenzione al punto riguardante gli esami

infettivologici e la firma del consenso informato

1. Copia degli esami infettivologici:

• HbsAg, HbcAb, Anticorpi anti-HCV, Anticorpi anti-HIV, (data non anteriore a 3 mesi a quella

del congelamento)

2. Impegnativa rossa “spermiogramma per crioconservazione, eosin test,

citocentrifugato”

3. Attestazione della patologia in corso (diagnosi di infertilità, esame

istologico, dimissione, ecc.)

4. Documento d’identità del paziente (e dei genitori, entrambi presenti, nel

caso di pazienti minori)

5. Tessera sanitaria e/o di esenzione dal pagamento del Ticket

6. Nei casi in cui sia possibile, si richiede astinenza da rapporti sessuali o

comunque da eiaculazione di minimo 2 massimo 7 giorni

7. La procedura si attiva soltanto previa compilazione di un consenso

informato che il paziente firma al momento.

INDICAZIONE PER I PRELIEVI CHIRURGICI EFFETTUATI IN ALTRI CENTRI

• Si confermano i punti 1, 3, 4, 5, 7.

• Il chirurgo, inoltre, prende contatti con il Centro di Crioconservazione per pianificare: data dell’intervento

ritiro del terreno di coltura presso il Centro di Crioconservazione (che viene effettuato qualche giorno prima solitamente da un familiare del paziente)

ritiro dei moduli di Consenso e delega alla consegna (che viene consegnato dal Centro insieme al terreno)

modalità di trasporto del prelievo bioptico (sempre a carico di un familiare o comunque a carico dell’Ospedale inviante)

• Contatti telefonici: da lun a ven dalle 13.00 alle 15.00 al n°02.8184.4417 (Laboratorio)

fax: 02.8184.4149

• Costi della crioconservazione: 107 euro per i pazienti oncologici (esenzione 048)

Pazienti oncologici con spermatogenesi conservata in

nota per trattamenti, spesso imminenti, di chemio e/o

radioterapia, pertanto accedono in regime di urgenza,

a volte anche dall'oggi al domani, soprattutto i pazienti

con forme oncologiche ematologiche, spesso

minorenni.

Recupero chirurgico per pazienti azoospermici prima

del trattamento o resi azoospermici dal trattamento • Il biologo è presente in sala operatoria il giorno dell'intervento con

una postazione di microscopio mobile e fornisce in estemporanea ai

chirurghi informazioni circa il ritrovamento degli spermatozoi.

Terminato l'intervento il biologo torna in laboratorio per il trattamento

biologico e il congelamento del campione

Gli appuntamenti per crioconservazione vengono fissati in mattinata, in

coda agli appuntamenti per gli spermiogrammi, in modo da avere più

tempo a disposizione per l'espletamento delle pratiche burocratiche e per

far in modo che la raccolta del campione possa avvenire con maggiore

tranquillità.

Se il paziente oncologico accede da ricoverato presso altra Struttura, il

trasporto al nostro Centro è organizzato dall'inviante e avviene spesso in

ambulanza.

Verificata l'idoneità della documentazione il biologo procede

all'accettazione del paziente.

Ritirato il campione, si chiede al paziente di attendere circa 15' per

verificare l'idoneità biologica al congelamento. Se i parametri di quantità e

qualità del campione risultano nella norma, il paziente viene congedato

con una relazione di report definitivo per il Centro o medico inviante . Se il

paziente necessita di eseguire un altro deposito (compatibilmente con

l'urgenza di iniziare chemio e/o radioterapia) viene fissato un

appuntamento per altro deposito e il foglio di report viene consegnato a

procedura ultimata.

In fase di prenotazione e pianificazione di

accesso al programma di

crioconservazione dei gameti, il paziente

viene informato delle tariffe di pagamento

annuale per il mantenimento dei campioni

congelati . Il pagamento della prima

annualità viene effettuato in tutti i casi il

giorno della crioconservazione

direttamente alle casse dell'Ospedale; i

pagamenti degli anni successivi possono

essere effettuati di nuovo alle casse alla

scadenza dell'annualità oppure mediante

bonifico bancario. Il pagamento

dell'annualità costituisce in ogni caso un

tacito rinnovo del consenso alla

crioconservazione.

Le ISTRUZIONI PER LA RACCOLTA (Sherman,

1990) del liquido seminale da crioconservare sono le stesse che si osservano per un esame standard (2-7 gg di astinenza da eiaculazione). • Il paziente dovrà produrre in SEDE il liquido

seminale da crioconservare. • Il campione viene valutato in tutti i suoi parametri. • In aggiunta viene eseguito un TEST DI VITALITA’

(EOSIN TEST) • Il campione viene diluito 1:1 con un terreno

crioprotettore e lasciato a temperatura ambiente per almeno 10 minuti quindi avviato allo stoccaggio

SPERMATOZOI RECUPERATI DALLE URINE

• E’ una metodica che permette di recuperare spermatozoi dalla vescica in pazienti affetti da eiaculazione retrograda.

Il paziente deve assumere del bicarbonato o altro alcalinizzante le urine per i 3 gg precedenti l’esame mantenendo il pH urinario tra 7,4 e 7.8

deve attenersi alle stesse istruzioni previste per un esame standard del liquido seminale

deve urinare un’ora prima della masturbazione (per ridurre il volume di urina presente in vescica)

dopo la masturbazione deve urinare in un contenitore sterile

le urine emesse vengono valutate in termine di aspetto, volume, pH e vengono centrifugate il prima possibile a 1600 rpm per 10 minuti

il pellet viene risospeso in 1 ml di terreno e valutato in camera di Makler

viene eseguito l’eosin test e lo striscio per la valutazione della morfologia

Il campione viene diluito 1:1 con un terreno crioprotettore e lasciato a temperatura ambiente per almeno 10 minuti quindi avviato allo stoccaggio

La metodologia di crioconservazione degli

spermatozoi è identica indipendentemente dal

loro “distretto di provenienza”.

Per raggiungere le bassissime temperature

necessarie a bloccare ogni attività biologica,

viene oggi largamente impiegato l’AZOTO

LIQUIDO ottenuto per distillazione frazionata

dell’aria liquida; si tratta di un liquido atossico,

chimicamente inerte e facilmente reperibile

anche a costi ragionevoli (Sherman, 1990).

Il possibile danno da squilibrio osmotico è ovviato dall’uso

del CRIOPROTETTORE (Stanic et al, 2000). Il principale

componente del crioprotettore è il GLICEROLO (Mortimer,

2004).

Il terreno crioprotettore rappresenta, quindi, per la cellula un

ambiente ipertonico. Essendo la membrana cellulare un filtro

attivo, essa impedisce la fuoriuscita dei soluti, ma non

dell’acqua che fuoriesce passivamente mentre il glicerolo

entra nella cellula.

Esso si sostituisce quasi completamente all’acqua

intracellulare evitando così: la disidratazione cellulare la

formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari con

conseguente rottura della membrana cellulare

L'organizzazione dello stoccaggio nel nostro Centro avviene in due fasi:

• - una sistemazione provvisoria in una Banca di piccole dimensioni dedicata al congelamento giornaliero

• - un trasferimento successivo (che avviene ogni 4-6 mesi circa) nella Banca grande di stoccaggio definitivo.

ANNO 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

N°

pazienti

30 23 42 73 83 92 87 71 91 119 120 143 154 128

Età

media

26,9 29,7 29,7 29,1 31,3 30,4 30,5 32

31,7 31

28,9 32,1 31,1 31,6

LH 5 0 4 5 9 9 8 6 22 18 24 18 22 27

LNH 0 0 5 2 3 1 4 9 7 7 2 1 8 0

K testis 8 17 12 40 34 39 50 42 39 60 58 77 83 71

Leucemie 1 2 1 4 4 1 3 0 3 0 3 0 1 0

altro 16 4 20 22 33 42 22 14 20 34 33 17 40 30

LABORATORIO DI SEMINOLOGIA E CRIOCONSERVAZIONE DEI GAMETI MASCHILI

OSPEDALE SAN PAOLO MILANO

UTILIZZO IN LOCO UTILIZZO PRESSO ALTRO

CENTRO

Valutato il caso, l’Embriologo

decide il numero di paillettes da

utilizzare.

Queste vengono individuate,

assieme al Seminologo,

all'interno della Banca di

Stoccaggio e vengono recuperate

per l'utilizzo. Entrambi i biologi

firmano la Scheda di

Congelamento in cui viene

riportato il N° di paillettes

recuperate e la data del recupero.

Contestualmente viene

aggiornato il file con la

variazione del numero di

paillettes residue.

Si procede allora al trasferimento totale o parziale delle paillettes, previa richiesta diretta del paziente.

• Il problema della movimentazione del materiale crioconservato in un Centro di PMA, viene menzionato dalla Legge 40/2004 "Norme in materia di Procreazione Medicalmente Assistita" e di seguito riportate nelle "Linee guida contenenti le indicazioni delle procedure e delle tecniche PMA (Art. 7 Legge 40/2004), trasferimento di gameti ed embrioni tra Centri (Art.14, comma 3). Il trasporto del materiale biologico stoccato viene affrontato dal D.L. N. 191/2007 ed, in seguito, dal D.L. N. 16/2010. Essi recepiscono le Direttive Europee (23/2004) e stabiliscono i criteri di qualità, trasparenza, tracciabilità e sicurezza per il trattamento di cellule e tessuti.

Il paziente effettua domanda di

ritiro (via fax o via mail) al Centro

in cui ha crioconservato il

materiale (INVIANTE) e domanda

di accettazione al Centro in cui

sposterà le paillettes

(RICEVENTE). In seguito a tale

richiesta, il Centro ricevente invia

(via fax o via mail) al Centro

inviante un documento di

"richiesta preliminare di

accettazione del campione" in cui

richiede una serie di informazioni

relative al paziente e al campione

biologico

Il Centro inviante risponde con un documento di "risposta alla

richiesta preliminare di accettazione del campione" in cui

risponde alle richieste del ricevente.

Quest'ultimo esegue il controllo del materiale in oggetto e

verifica la completezza e conformità della documentazione; se

tutto risulta conforme alle procedure e alle direttive vigenti,

esprime parere favorevole all'accettazione del materiale e, quindi,

al trasferimento.

Il ritiro del campione può essere effettuato soltanto dal diretto

interessato pertanto, quest'ultimo, concorda la data del

ritiro/consegna con i Centri inviante/ricevente.

Il trasporto avviene a totale carico del paziente (noleggio o

acquisto della banchetta di trasporto) e sotto la responsabilità

dello stesso .

Il giorno del ritiro il biologo procede a: • identificare il paziente mediante verifica e fotocopia del documento d'identità;

• verificare la documentazione di idoneità della banchetta di trasporto e verificare l'avvenuta refrigerazione della stessa (livello di riempimento, eventuale rabbocco di azoto, ecc.);

• trasferire le paillettes dalla Banca di stoccaggio alla banchetta di trasporto

• consegnare e far firmare al paziente il “documento di ritiro”

• compilare il modulo di "l‘etichetta di viaggio”

• far leggere, spiegare e far firmare al paziente il documento di "Informativa al trasportatore”

Congedato il paziente, si rimane in attesa di ricevere dal Centro ricevente (via fax o via mail) il documento di avvenuta consegna del materiale (o di presa in carico).

Tale procedura si attiva esattamente al contrario nel caso in cui un paziente decide di effettuare una procedura di PMA presso il nostro Centro utilizzando materiale crioconservato presso altro Centro

Si procede alla distruzione del campione crioconservato soltanto su richiesta scritta del paziente previa esibizione del documento d'identità.

In caso di morte del paziente, il parente più prossimo, munito di documento d'identità, comunica l'avvenuto decesso mediante consegna del certificato di morte e del documento d'identità del paziente deceduto. Il campione viene così distrutto.

MODULO PER DISTRUZIONE

COMUNICAZIONE DI

DECESSO

Quello criogenico è un locale ad accesso limitato al personale direttamente addetto al congelamento o alla movimentazione del materiale biologico, e quindi soltanto ai biologi dei Laboratori di Seminologia e di Embriologia. Entrambe le porte di accesso, sia quella dal laboratorio di seminologia che quella dal corridoio dell'embriologia, hanno l'apertura a badge; rimangono aperte ma sempre sorvegliate soltanto durante le fasi lavorative. Il personale addetto alle pulizie accede nel primo pomeriggio, quando sono ancora presenti i biologi, che supervisionano e provvedono alla chiusura non appena la pulizia è terminata.

Le Banche che ospitano gameti maschili

sistemate all'interno del locale criogenico

al momento sono le seguenti:

• - N° 1 Arpege 170 (denominato ARIEL) - 4 rach a 3

piani con arredi interni a cassetti

• - N° 2 Arpege 110 (denominati UGO e SID) - 6 rach a

4 piani con arredi interni a cassetti

• - N° 1 Bidone (Banca 9) - arredi interni a 6 canister

• - N° 1 Bidone (Banca 1) - arredi interni a 6 canister

• - N° 1 Bidone (Banca 7) - arredi interni a 6 canister

per il congelamento di campioni infetti HCV+

• - N° 1 Bidone (Banca 5) - arredi interni a 6 canister

per il congelamento di campioni infetti HbsAg+

• - N° 1 Bidone (Banca 8) - arredi interni a 6 canister

per il congelamento di materiale chirurgico in cui non

sono stati evidenziati spermatozoi. Tale congelamento

si effettua a scopo preventivo in attesa dell'esito

dell'esame istologico; qualora l'istologico confermasse

l'assenza di spermatozoi il paziente viene invitato a

recarsi in Laboratorio per firmare il documento di

distruzione (cap. 10 - Distruzione). Pertanto la Banca 8

viene utilizzata per il congelamento di materiale

destinato ad essere eliminato.

ONCOFERTILITA’ DI SALVATAGGIO

PAZIENTE AZOOSPERMICO

IN ESITI DI TRATTAMENTO PER CANCRO

MICROTESE

MicroTESE in azoospermici post CT o RT

Le possibilità di recupero di spermatozoi mobili sono riportate fino al 45% con delivery rate del 22% (relativo ai recuperi positivi)

Assenza di parametri clinici ed istologici predittivi

Non correlazione con il regime di CT o RT

Potenziale rischio genetico

Chan, 2001 ; Mesequer, 2003; Colpi, 2004

Instabilità genomica

dei tumori

dell’infanzia

• Rischio di trasmissione

alla progenie del

danno al DNA

spermatico

Questioni etiche

Romerius P et al. Clin Cancer Res 2010;16:3843-3850

Sperm DFI in CCS depending on the treatment given.

©2010 by American Association for Cancer Research

QUESTIONI ETICHE

Ricorso ad opzioni ad alta tecnologia per la preservazione della fertilità

Pazienti spesso giovani e non ancora in grado di decidere consapevolmente sulla propria salute riproduttiva o addirittura non ancora in grado di procreare.

La masturbazione Pazienti “vulnerabili” possono prendere decisioni “non

consapevoli” per compiacere i medici o i familiari Pazienti adolescenti con orientamento omosessuale non ancora

dichiarato ai familiari Genitori o tutori chiamati a decidere (a volte in poche ore) con

il rischio di interferire con le proprie convinzioni religiose e culturali strutturate con il vero interesse presente o futuro del minore.

Il destino del materiale biologico crioconservato (distruzione) in caso di morte.

Eiaculazione presente

Spermatozoi vitali

Crioconservazione

Criptozoospermia

Crioconservazione se idoneo

TESE se non idoneo

Eiaculazione

Retrograda

Recupero spermatozoi da

urine

Aneiaculazione

vibrostimolazione

Prima del trattamento- adulto

Ragazzi

Post-pubere

In grado di eiaculare

crioconservazione

non in grado di eiaculare

Vibrostimolazione

? TESE ?

Pre-pubere

TESE (spermatozoi immaturi o tessuto

testicolare ) ?

Prima del trattamento- ragazzo

Daniela Giacchetta (referente)

Sara Melis

Carla Pasquale