Valutazione della immunogenicità in studi clinici: strategie sperimentali e statistiche

Nuove frontiere nella bioanalitica e laboratorio clinico 3 Febbraio 2015

Claudia Getuli

INTRODUZIONE

• Il numero di farmaci biologici/proteine ricombinanti ad uso terapeutico è in costante aumento.

• Questi prodotti possono indurre una risposta immunitaria non voluta (ADA Anti Drug Antibodies).

• La presenza di ADA può avere effetti rilevanti nello sviluppo di un prodotto biotecnologico per problematiche di sicurezza ed efficacia.

IMMUNOGENICITA’ EFFETTI

L’immunogenicità può influenzare negativamente: • Farmacocinetica • Farmacodinamica • Biodisponibilità • Efficacia ADA possono causare la formazione di immuno-complessi che a loro volta possono causare:

• Reazioni allergiche • Gravi reazioni autoimmunitarie

ADA: POSSIBILI RISPOSTE

Basso

Alto

•Legame, “Binding”

•Alterazione della PK

•Neutralizzazione, “NAb”

•Ipersensibilità

•Cross-reazione

Ris

chio

clin

ico

Bassa

Alta

Freq

uen

za

La severità della risposta clinica è correlata alla frequenza in modo inversamente proporzionale

J A Pedras-Vasconcelos – FDA (2014)

Immunogenicita’ clinica: PRCA con Eprex

• 1998-2001: aumento delle segnalazioni di PRCA (Pure Red Cell Aplasia) • Pazienti trattati con Eprex presentavano autoanticorpi N. Casadevall et al. - Nephr. Dialys. Transplant. (2002)

Valutazione Immunogenicità

EMA (2006), Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-Derived Therapeutic Proteins FDA Final Guidance (2014), Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products FDA Draft Guidance (2009), Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins

Importanza di prevedere il potenziale immunogenico di una sostanza

E’ molto importante preparare una valutazione del rischio prima dell’inizio della fase clinica – “Risk Assessment”: •deve essere deciso caso per caso

•l’estensione della caratterizzazione degli ADA dipende dal rischio potenziale

Fattori che influenzano l’incidenza di ADA

Le variabili che possono incidere sull’insorgenza di ADA sono molteplici: •Caratteristiche della sostanza (e.g. dimensione, struttura, sequenza, modifiche come glicosilazione, ossidazione) •Natura del formulato (e.g. presenza di impurezze/ contaminanti, aggregati) •Popolazione Target (e.g. background genetico, cure concomitanti, immunodeficienza) •Regime di trattamento (e.g. via di somministrazione, frequenza , dose)

Fattori che influenzano la valutazione del rischio di ADA

Le variabili che possono aumentare il rischio di conseguenze: •Analogie con proteine endogene

•Esiste una proteina endogena identica o simile? •La proteina endogena ha attività unica o una funzione ridondante?

•Caratteristiche del paziente e della patologia •Pazienti immuno-compromessi? •Il paziente ha la proteina endogena?

•Trattamento •Prodotto per terapia sostitutiva? •Il prodotto è la sola terapia disponibile?

STRATEGIA GENERALE

Test di “Screening”

_ +

Report Test di

conferma

Caratterizzazione della risposta

(Titolo, NAb, isotipo, etc.)

_

+

Studi clinici

Campioni di

siero

METODO Determinazione degli ADA

I metodi normalmente utilizzati sono:

• Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

• Radioimmunoassay (RIA)

• Radioimmunoprecipitation assay (RIPA)

• Surface Plasmon Resonance (SPR)

• Electrochemiluminescence (ECL)

Selezione del formato

ELISA DIRETTO ELISA “BRIDGING”

FARMACO

AGGIUNTA ANTICORPI

FARMACO coniugato

Secondario anti-IgG coniugato

AGGIUNTA SUBSTRATO

Selezione del formato

VANTAGGI SVANTAGGI

ELISA DIRETTO

• Maggiore capacità di

legare anticorpi a bassa

affinità

• L’isotipo rivelato dipende dal

secondario coniugato

• Specie – specifico

• Reagenti per la rivelazione

possono essere diversi tra

controlli e campioni

ELISA

“BRIDGING”

• Determinazione di tutte le

classi di Ig comprese IgM

• Non specie-specifico

• Capacità ridotta di determinare

Ab a bassa affinità

• La coniugazione della sostanza

può mascherare gli epitopi o

modificare la struttura

• Maggiori problemi di interferenza

da prodotto circolante

Saggi quasi-quantitativi

I saggi immunologici per la determinazione degli ADA sono generalmente definiti come quantitativi relativi o quasi-quantitativi. Motivo: il Controllo Positivo (Reference Standard) normalmente non riflette le affinità/proporzioni degli Anticorpi presenti nei campioni dei pazienti. Finalità: determinare un cut point per definire un campione come negativo o reattivo (potenzialmente positivo).

Pre-study assay validation

- Pre-study validation consisting in determination of:

* Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

6 e

xpe

rim

ents

at

leas

t 4

exp

eri

men

ts

Primo step – Immunogenicity Screening Assay Cut-point

Fattore cruciale: determinazione dello Screening cut point che permette la definizione dei campioni come negativi o reattivi (potenzialmente Positivi) I campioni reattivi dovranno essere ulteriormente analizzati con un Saggio di Conferma

La sensibilità del metodo è più importante della specificità Attesi 5% di falsi positivi

Immunogenicity Screening Assay Cut-point

Immunogenicity Screening Assay Cut-point

ISAC –Immunogenicity Screening Assay Cut Point

ISAC, programma generato con il software “R” v.3.0.2 del 25 Settembre 2013 Il tool è stato confrontato importando le formule in SAS versione 9.3

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Flow scheme

Immunogenicity Screening Assay Cut-point

Un disegno sperimentale bilanciato è raccomandato per la determinazione dello screening cut point e della precisione del test.

Lo schema consigliato è: 2 analisti x 3 esperimenti x 3 piastre Normalmente utilizzati 60 campioni che vengono

suddivisi in tre sottogruppi da 20 Ogni sottogruppo viene analizzato da entrambi gli

analisti una volta per esperimento e una volta per piastra.

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Balanced Experimental Design

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Assessment of normality

Shapiro-Wilk test p = 0.69811

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Outliers evaluation

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Assessment of Normality

Shapiro-Wilk test p = 0.88653

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Outliers evaluation

Confermata l’assenza di outliers

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Analysis of Variance (ANOVA)

Analyst A

La media delle letture risulta diversa in modo statisticamente significativo

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Analysis of Variance (ANOVA)

Analyst B

La media delle letture risulta diversa in modo statisticamente significativo

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Levene test per omogeneità della Varianza

Analyst A

Analyst B

Test a p-value

Levene classical 0.05 4.3E-06

Brown-Forsythe Levene 0.05 2.7E-05

Test a p-value

Levene classical 0.05 0.0396

Brown-Forsythe Levene 0.05 0.0382

… anche le varianze risultano diverse in modo statisticamente significativo

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Fixed Cut Point

Il Fixed Cut Point può essere applicato soltanto se: • Medie e Varianze non sono diverse in modo statisticamente significativo. Se entrambe le condizioni non sono soddisfatte sarà applicato un Floating Cut Point.

Immunogenicity Screening Assay Cut-point

Primo passaggio è comunque il calcolo del FIXED CUT POINT:

Mean OD values + 1.645 * SD

NORMALIZATION FACTOR

NF = Cut Point - Negative Control (NQC)

FLOATING CUT POINT è calcolato indipendentemente per ogni piastra:

NQC (plate specific) + NF (analyst specific)

Immunogenicity Screening Assay Cut-point Flow scheme

Pre-study assay validation

- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point

* Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

Cut point

Level of Assay Sensitivity

Ass

ay s

ign

al

Ab Concentration (ng/mL)

Assay Sensitivity

Si utilizzano anche in questo caso i dati dei primi sei esperimenti.

Assay Sensitivity

Calcolo effettuato sulla base dei dati di 6 esperimenti

Il livello di sensibilità del sistema raccomandato per trial clinici è 250-500 ng/mL (FDA Guidance for Industry - Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins”- Draft, December 2009).

Pre-study assay validation - Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity

* System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

System Suitability Controls

QCH: concentrazione che produce un segnale subito prima del plateau della curva QCL: concentrazione che produce un segnale riproducibilmente superiore al Cut Point Mean of OD values + t0.01,df * SD

NQC: matrice pool di sieri di controllo negativo per monitorare il background non specifico

0.5 5 50

Ris

po

sta

Conc

QCH

System Suitability Controls

I controlli qualità sono utilizzati per: Valutazione della Precisione; su sei esperimenti condotti con un disegno bilanciato (2 operatori * 3 esperimenti* 3 piastre) Determinazione dei Criteri di Accettabilità su tutti gli esperimenti disponibili poiché determinati statisticamente. Tali criteri garantiscono che il saggio rimanga valido anche nella fase “in study” ovvero durante lo studio clinico.

Pre-study assay validation

- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls

* Precision * Definition of test acceptance criteria

* Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

Selectivity Matrix interference QCL level

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

QCH level

Subject No.

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Subject No.

OD

val

ue

OD

val

ue

* 10 campioni di siero di diversi individui * Aggiunta di controllo positivo: QCH e QCL.

Si calcola la concentrazione rispetto alla curva di riferimento (siero pool)

Selectivity Drug interference

* 10 campioni di siero di diversi individui * Aggiunta di: livello basso di controllo positivo. + concentrazioni crescenti di sostanza (drug).

Competizione

Inibizione del segnale

Drug

ADA

Biotin- Drug Falsi negativi

Selectivity Drug interference

Cut point

Drug Concentration (ng/mL)

Ass

ay s

ign

al

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150 200 250

Level of Drug Tolerance

Dalla curva che interpola i dati si calcola la DRUG TOLERANCE

Selectivity

Drug interference

Calcolo effettuato sulla base dei dati di 10 curve (= 10 diversi individui)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150 200 250

Pre-study assay validation

- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls

* Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference

* Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

Robustness La “Robustness” è una indicazione dell’affidabilità di un saggio ed è determinata dalla capacità dello stesso di funzionare adeguatamente in seguito a variazioni come: cambio della strumentazione, della temperatura di incubazione, del numero delle piastre etc...

Pre-study assay validation

- Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls

* Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness

* Stability * Ruggedness (if applicable)

Stability

La stabilità a lungo termine a temperature ≤ -20°C per 2 o più anni non è normalmente richiesta ed è supportata da dati di letteratura. L’analita negli studi di validazione immunogenicità è un ADA: Anti-drug X Oppure Anti-drug Y … comunque un anticorpo policlonale ed è ragionevole pensare che la sua stabilità sia la stessa se specifico per Drug X o Drug Y. L’approccio più corretto è quello di valutare la stabilità su campioni di studio risultati positivi andando a confrontare il titolo del conservato rispetto al fresco.

Ruggdness

Riproducibilità del saggio in laboratori diversi. Valutazione non necessaria quando è un solo laboratorio ad effettuare le analisi.

STRATEGIA GENERALE

Test di “Screening”

_ +

Report Test di

conferma

Caratterizzazione della risposta

(Titolo, NAb, isotipo, etc.

_

+

Studi clinici

Campioni di

siero

Confirmatory Assay

I campioni risultati positivi al Saggio di Screening devono poi essere analizzati con un Saggio di Conferma (Confirmatory Assay). Lo scopo è verificare se la reattività è dovuta ad ADA (anticorpi specifici per la sostanza). Anche in questo caso si stabilisce un Cut Point (valore percentuale).

Confirmatory Assay

Screening Assay Confirmatory Assay: Competition with unlabeled Drug

Avidin

Biotin

Plate

Drug

Drug

ADA

Avidin

Biotin

ADA

Confirmatory Assay

Lo schema sperimentale comprende: * 10- 20 campioni di siero di diversi individui * QCH e QCL * NQC Tutti i campioni sono testati in due forme con aggiunta di buffer o aggiunta di sostanza (drug)

Per ogni campione si calcola: % Signal inhibition = 100 * [1 – (Study drug inhibited sample / Uninhibited sample)] Specificity Cut Point = Mean % Signal inhibition + 3.09* Standard Deviation

Quantitation of Positive Samples - Titer Se un campione è confermato positivo si procede con la determinazione del titolo. Vengono preparate diluizioni seriali del campione.

Diluizione 1:2 1:4 1:8

Titolo 2 4 8

Il titolo del campione è il fattore di diluizione al quale la risposta interseca lo screening cut point. TITOLO = Fattore di diluizione Esempio:

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 50 100 150 200 250

Cut point

Diluizione

Anticorpi neutralizzanti (NAbs)

Gli Anticorpi Neutralizzanti sono generalmente determinati con due tipi di saggi: •Saggi biologici che utilizzano linee cellulari (saggi funzionali) •Saggi immunologici competitivi

La scelta del formato per determinare i Nabs dipende da: •Natura del prodotto •Rischio potenziale I saggi biologici sono preferiti per le terapie sostitutive (es. proteine), i saggi immunologici competitivi sono preferiti nel caso di proteine con funzione antagonista (es. mAb).

Strategia bioanalitica

Basso Medio Alto *

Rischio clinico

Saggio di screening

Saggio di conferma

Titolo

NAb anche con

saggi immunologici

NAb con saggi “cell

based” preferito

Test NAb contro

proteina endogena

Test NAb contro proteina

endogena

Determinazione Isotipi

* Analisi in tempo reale

Conclusioni

• Importanza di individuare/sviluppare precocemente i reagenti e il saggio

• Necessità di sviluppare saggi validati in una fase precoce (preclinica).

• Necessità di sviluppare una strategia per il

monitoraggio della immunogenicità per prevenirne le conseguenze Risk Assessment

• Decisione caso per caso basato sulle caratteristiche del prodotto e della popolazione

Grazie per la

Vostra

attenzione