Crescita batterica

Dott. Giovanni DI BONAVENTURALaboratorio di Microbiologia Clinica (5° livello, lab n. 27)

Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)

Università “G. D’Annunzio” di Chieti e Pescara

E-mail: gdibonaventura@unich.it

Crescita batterica – fissione binaria

Fissione binaria

E. coli può dividersi ogni 20 minuti.

Quindi, esso deve sintetizzare (duplicare) tutti I

suoi componenti cellulari entro questo tempo

Durante la divisione, l’aumento dei costituenti cellulari può tradursi in: aumento delle dimensioni cellulari

microrganismi cenocitici presentano divisioni nucleari che non sono accompagnate da divisioni cellulari

aumento del numero cellulare

La Microbiologa generalmente studia la crescita di una popolazione piuttosto che la crescita delle singole cellule

Crescita batterica – divisione cellulare

Microrganismi cenocitici

Rhodophyta spp. (alga rossa)

Cinetica della divisione cellulareLa curva di crescita

Osservata quando i microrganismi vengono coltivati in terreno liquido (brodo)

Misura la variazione della “quantità” (massa totale o concentrazione) di batteri nel tempo:

rappresentazione grafica di tipo “semilogaritmica”

Log10 (concentrazione cellulare espressa come CFU/ml, dove CFU= unità formanti colonie) vs tempo

Generalmente, si articola in 4 fasi (periodi) distinte e sequenziali

Fase di latenza (lag phase)

Fase di adattamento metabolico:

Sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare

Sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari

Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico

Durata variabile (specie-specifica):

in alcuni casi può essere di breve durata od assente

Fase esponenziale (log phase)

Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva Gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non

avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata)

Velocità di crescita costante nel tempo: Aumento del numero cellulare

Aumento della massa cellulare totale

Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche

Chiamata anche fase logaritmica

Coltura non sincronizzata:ogni cellula si riproduce a tempi leggermente differenti

La curva ha andamento lineare

Crescita cellullareModello matematico

Tempo di generazione:

tempo necessario perchè il numero cellulare raddoppi

Mean growth rate constant

numero di generazioni per unità di tempo

espresso come n. generazioni / h

Nt = No x 2n

Nt = No x 2 t

logNt = logNo + t

Nt = n. cellule al tempo tNo = n. cellule al tempo 0n= n. generazioni al tempo t

= n. generazioni nell’unità di tempot = tempo trascorso

k = n/t = velocità di crescitag = t/n = tempo di generazione

doubling time or generation time (g)

Log phase (fase esponenziale)Crescita bilanciata

Durante tale fase le cellule esibiscono una crescita bilanciata:

i costituenti cellulari vengono sintetizzati a velocità costante ed in maniera congiunta

Di contro, si osserva crescita non bilanciata, quando:

Modificazione del livello dei nutrienti

shift-up (terreno povero terreno ricco)

shift-down (terreno ricco terreno povero)

Modificazioni delle condizioni ambientali

Concentrazione di nutrienti vs crescita

Fase stazionaria

Numero totale di cellulare vitali rimane costante: Arresto della riproduzione

Tasso riproduttivo controbilanciato dal tasso di mortalità

Possibili cause: Raggiungimento di una densità critica di popolazione

Accumulo dei cataboliti (azione tossica)

Limitazione dei nutrienti

Limitata disponibilità di O2

Fase di morte (declino)

Morte cellulare a velocità esponenziale

Morte:

perdita irreversibile della capacità di riprodursi

In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta causa un accumulo di cellule resistenti

Tecniche per la determinazione della densità cellulare

Conta diretta cellulare

Conteggio in camera contaglobuli

Contatori elettronici

Filtrazione su membrana

Conta vitale cellulare

Metodo della semina su terreno agarizzato

Metodo di filtrazione su membrana

Semplice, economico e veloce

Adatto per la conta degli eucarioti e dei procarioti

NON fornisce informazioni sulla vitalità cellulare

Conteggio mediante contaglobuli

Passaggio “forzato” della sospensione microbica attarverso un orifizio di piccole dimensioni

Il batterio viene investito da una corrente elettrica applicata all’orifizio

Conteggio degli eventi “interruzione” della corrente elettrica

Veloce e di semplice esecuzione

Adatto per microrganismi di dimensioni rilevanti e per cellule ematiche

NON distingue le cellule vive dalle morte

Contatori elettronici

Conta vitale cellulare

Determina il numero di cellule vitali

La dimensione di popolazione viene espressa come unità formanti colonie (UFC oppure CFU: colony-forming units)

Diluizioni seriali (10-fold) del campione

Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione

Conteggio del numero di colonie (UFC)

Calcolo del numero di cellule nella popolazione

Conta vitale cellulare

Diluizioni seriali (10-fold) del campione

Semina (su terreno solido) delle diluizioni del campione

Conteggio del numero di colonie (UFC)

Calcolo del numero di cellule nella popolazione UFC/ml = n UFC x fattore diluizione

Particolarmente adatto per l’analisi dei campioni ambientali

Metodo delle membrane filtranti

Misura della massa cellulare

Peso secco

tempi lunghi

scarsamente sensibile

Quantità di un particolare costituente cellulare

proteina, DNA o ATP

adatto se la quantità del composto è costante in ogni cellula

Misurazione torbidimetrica (light scattering)

Veloce, semplice e sensibile

La densità ottica è la quantità di luce in grado di passare attraverso la sospensione batterica.

Tanto maggiore sarà il numero cellulare, tanto più densa sarà la coltura. Questo significa che una quantità minore di luce sarà in grado di passare attraverso il campione e la coltura viene considerata essere torbida all’esame visivo.

Colture continueChemostato

Coltura vecchia (in fase stazionaria)

Coltura giovane (in fase logaritmica)

Necessità di un modello che riproduca fedelmente la situazione in vivo

Chemostato:

Velocità del terreno in ingresso = velocità del terreno in uscita

Nutriente essenziale in quantità limitanti

Incremento costante del numero cellulare e della massa batterica